TD 1 Chromatographie
TD 1 Chromatographie
TD 1 Chromatographie
Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur
Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de
la colonne est de 5 ml / min) :
MM tr (min)
Aldolase 145000 10,4
Lactate déshydrogénase 135000 11,4
Phosphatase alcaline 80000 18,4
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6
Exercice N°2 :
Question :
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les
interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).
Exercice 3 :
Questions :
Exercice 4 :
Exercice 5 :
On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion.
La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.
L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les
volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132
Questions :
2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
Exercice 6 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut
Exercice 7 :
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi
= 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations.
L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.
Question :
Exercice 8 :
Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM =
67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).
Question :
Exercice 9 :
Fraction cpm/ml
1 100
2 150
3 700
4 1000
5 630
6 140
7 480
8 1200
9 1500
10 1300
11 750
12 470
13 130
Questions :
1 - Quel est le type de chromatographie employé ici ? Donner son principe (une demi-page).
Exercice N°1
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage
moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des
différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir
tableau), selon la relation :
La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer
préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite :
Le fait de visualiser une droite signifie qu'aucune protéine n'est exclue du gel.
2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x
21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit
une masse moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ.
Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).
Exercice N°2
Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).
Exercice 3 :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10-4.(A), on en déduit que (A) + 1,74 10-4. (A
= 100
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 13378(A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10-3 % et (B) = 99,994 %
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements
carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH).
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée
négativement (-CH2-COO-).
D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes :
On peut en déduire que :
Exercice 5 :
1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10-27 kg. La masse
moléculaire d'un composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol).
Noter que l'abréviation de dalton s'écrit avec un D majuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa.
2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au
préalable tracer la représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous
représente le tracé de log (MM) = f(Ve pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène,
Catalase et Lactoglobuline.
Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire :
Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un
log MM = 4,93, soit une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p.
- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances
exclues (ici, le dextran).
- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la
catalase, car le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une
protéine totalement incluse dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à
partir des points correspondant à la catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les
volumes d'élution encadrent celui de la protéine p).
Exercice 6 :
AS = (UE / g)
- Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une
étape de purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente :
- Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les
étapes, divisée par celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à
7000 / 20 = 350.
Exercice 7 :
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est
soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide
d'un tampon à pH = 6.
Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?
Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été
réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides
aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la
résine échangeuse de cations, chargée négativement.
Acide aminé : pHi Charge à pH < 2,87 Charge à pH 6
Asp 2,87 + -
Leu 6 + neutre (50%/50%)
Arg 10,76 + +
À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite
éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas
éluée.
Exercice 8 :
L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus
tard, avec un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine
Exercice 9 :
3 - Rappel : le volume mort est le volume d'élution des composés dont le diamètre
est supérieur à celui des pores du gel d'exclusion. Ici, cela correspond à la quatrième
fraction. Le volume mort est donc de 400 microlitres.