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COLE DOCTORALE : VEGETAL, ENVIRONNEMENT, NUTRITION, AGROALIMENTAIRE, MER
Anne 2012
THSE DE DOCTORAT
Discipline : Gnie des procds
Spcialit : Biochimie et biotechnologie des produits marins
Prsente
et soutenue publiquement par
Karine LE ROUX
Le 4 mai 2012, devant le jury ci-dessous
Rapporteurs
Examinateurs
Remerciements
Jadresse tout dabord mes plus chaleureux remerciements Jacques Desbrires, Gilles
Trystram, Antoine Hubert et Jack Legrand, pour avoir accept de participer ce jury de thse.
En premier lieu, je remercie et flicite les initiateurs de ce sujet de thse, pour lequel je garde
un grand intrt au-del de la dmarche formation et pour lequel comme tout doctorant, je
me suis investie corps et me ! Je remercie vivement Rgis Baron pour son encadrement,
ses critiques constructives, son regard mthodique et surtout sa patience pour me rendre plus
rigoureuse. Je tiens exprimer ma reconnaissance Abdellah Arhaliass pour sa confiance au
cours de cette tude, ses encouragements et les opportunits de prsenter ce travail de thse
lors de confrences et sminaires. Je tiens galement remercier vivement Jean-Pascal Berg
pour avoir accept dencadrer cette thse, pour mavoir guide techniquement et mavoir fait
partager ses connaissances, ainsi que davoir su maintenir le cap de ltude lorsque des voies
divergentes taient possibles. Jai galement bnfici de laide et du soutien dEric Leroy,
avec qui les changes ont toujours aboutis un bond en avant.
Merci Patrick Durand pour les informations quil a pu mapporter au dmarrage de la thse.
Il faut bien avouer que la chitine ntait plus beaucoup tudie lIFREMER et par
consquent, la fusion des connaissances de chacun a t trs prcieuse. En premier lieu, Alain
Domard ma transmis lessentiel des points conserver en mmoire lorsquon tudie ce
polymre, je lui en suis trs reconnaissante. Ainsi qu Dominique Gillet et Jean-Pierre Say,
des socits Mahtani et France Chitine, qui mont apport des notions prcieuses lies aux
applications de la chitine et ses drivs, et donc aux exigences concrtes du march. Jai
toujours souhait rechercher en lien directe avec la ralit des ressources disponibles et des
demandes du march. Stphane Trombotto est sans aucun doute la personne qui ma le plus
enseign sur les caractristiques de la chitine et sur ces mthodes danalyse. De plus je lui suis
reconnaissante davoir pris part ltude, via des rsultats de RMN, et jai beaucoup apprci
nos changes.
Parmi les rsultats prsents dans ce manuscrit, une partie non ngligeable naurait pu tre
obtenue sans lquipe du MC2 de lINRA de Nantes. Je tiens donc exprimer mes plus vifs
remerciements Denis Lourdin, Marion de Carvellho, Alain Bulon, Bruno Pontoire et
Arnaud Turbin. Certains rsultats proviennent dune autre unit de lINRA, merci Corinne
Rondeau pour les analyses de RMN en 13C.
Pour leur aide technique et scientifique, merci galement Michal Paris de lIMN, Virginie
Sylvestre du CEISAM, ainsi que Marie-Madeleine Giraud-Guille de lUniversit de Pierre &
Marie Curie, Emmanuel Belammie de Montpellier, le Dr Varm de Biopolymer, Yves
Grohens de LIMAB et George Choubert, spcialiste en astaxanthine. Je remercie vivement
lancienne quipe de S3D pour leur accueil et les changes humains.
Merci Guillaume Roelens pour son aide prcieuse en ATG et MEB. Merci mes complices
du GEPEA : Benjamin, PEF, Hlne & son mari, le voisin, Luc, Anthony, Julie, Franois,
Anne, JB, Abdul, Seb, Farid, et jen oublie des doctorants et des stagiaires ! Un grand merci
galement Sandrine, Carole & Arnaud. Il est une personne que jaurais tant aim remercier
de son vivant, Maryse, technicienne irremplaable du GEPEA, lincarnation de la bonne
humeur, de la volont et de lefficacit, une profondment belle personne qui sen est alle
trop vite, trop tt et sans crier garde. Merci pour cette leon qui est tombe un moment
crucial.
Un norme remerciement gnral mes collgues du btiment T du centre IFREMER de
Nantes. Plus prcisment, je tiens remercier Isabelle pour sa gestion parfaite, Sylvie pour
son attention, sa confiance et ses connaissances en bibliographie, Franoise pour son nergie,
Fred pour son calme et sa bonne humeur, Sandrine pour sa complicit et son efficacit
exemplaire, Claire pour son volontarisme et ses comptences, JP pour son humour, Camille
pour sa culture gnrale des produits marins et des pays, Monique, Laetitia & Aurlie pour
leur attention et les transmissions dinformations prcieuses, les Christine pour diffrentes
raisons (humaines et techniques), Sylvia, Corinne et Jacqueline pour leur aide, leurs
connaissances en sucres et leur sympathieJojo, triple-J, Marc & Vronique, Mireille, Anne
& Anne vous avez tous apport une pierre agrable mon environnement de travail, tant
pour la bonne humeur que pour les ides en R&D. Je suis galement reconnaissante Claire
Boisset, Christophe Bailly, Nadia Nour et Aurlie Lecolier pour nos diffrents changes.
Merci galement Vincent Lorcy, pour sa participation active aux rsultats au cours de son
stage.
La thse est une succession daventures dans laventure, de grandes victoires autant que de
dceptions et de frustrations, quil est difficile dexpliquer aux non-pratiquants, cest pourquoi
je tiens remercier trs spcialement mes soupapes de scurit, amis et compres : Papa,
Raoul, Emna, Zo et surtout Christelle, Anas, Sabrina, Gatan, Vincent... & lodie, mme si
elle n'est pas doctorante ! Pour nos partages de coup-de-gueule et coup-de-cur merci
Benot, Myriam, Thierry, Marie, David, Aurlien, Dung, Cdric et jen oublie !
Un grand bravo mon entourage qui na pas eu dautre choix que me supporter pendant ces
trois annes ! En particulier Alex, Marielle, mes parents et le reste de ma famille, ainsi que
Tatiana, Katia, Stef, Rachou, Delphine, Sophie, Emilie, Julie, Aurlia, la Dream Team de la
Dfense et celle de Guiss Beach ! Enfin, je mexcuse auprs de tous ceux pour qui je suis
devenue un fantme ces dernires annes c'tait pour cet ouvrage que je vous ddis !
vi
SOMMAIRE
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... xi
LISTE DES FIGURES........................................................................................................... xii
ABREVIATIONS .................................................................................................................. xvi
Introduction .............................................................................................................................. 1
Chapitre 1 Etude bibliographique ....................................................................................... 9
I. Contexte conomique.................................................................................................... 11
I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs ................... 11
I.2. Valorisation des coproduits marins : la chitine et ses drivs ........................... 14
I.3. Disponibilit de la chitine, ressource naturelle ................................................. 16
II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs ........................................ 17
II.1. Les applications dans le domaine agricole ....................................................... 18
II.2. Les applications dans le domaine du traitement de leau ................................. 18
II.3. Les films de chitine/ chitosan........................................................................... 18
II.4. Les applications dans les industries alimentaires et dittiques ...................... 19
II.5. Les applications dans le domaine mdical ....................................................... 20
II.6. Autres applications ........................................................................................... 22
II.7. volution des volumes de ventes par domaine dapplication .......................... 22
II.8. Conclusions sur les caractristiques de la chitine et ses applications .............. 23
III. Structure de la matrice chitineuse chez les crustacs ................................................. 23
III.1. La biosynthse de la chitine ............................................................................ 23
III.2. Lorganisation de la cuticule des crustacs .................................................... 24
IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine et ses drivs . 28
IV.1. La structure cristalline et lindice de cristallinit ........................................... 29
IV.2. Le degr de polymrisation ............................................................................ 31
IV.3. La masse molaire et la polydispersit des longueurs de chane ..................... 31
IV.4. La solubilit .................................................................................................... 32
IV.5. Le degr dactylation et la rpartition des groupes actyls ......................... 34
V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique ..................................... 35
V.1. Schma gnral ................................................................................................ 35
V.2. La dminralisation.......................................................................................... 36
V.3. La dprotinisation .......................................................................................... 37
V.4. Ltape de blanchiment .................................................................................... 39
V.5. La dsactylation et la dpolymrisation ......................................................... 39
VI. Les traitements biologiques ....................................................................................... 41
VI.1. La voie fermentaire......................................................................................... 41
VI.2. Dprotinisation et de dminralisation enzymatiques .................................. 43
VI.3. Dsactylation et dpolymrisation enzymatique .......................................... 46
VI.3.1. La dsactylation enzymatique.................................................................... 46
VI.3.2. La dpolymrisation enzymatique ou la chitinolyse ................................... 47
VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins .................................................... 48
VII.1. Valeur ajoute des coproduits marins ........................................................... 48
VII.1.1. Les composs protiques............................................................................ 49
VII.1.2. Les composs lipidiques ............................................................................ 50
VII.1.3. Les minraux .............................................................................................. 52
VII.2. Lhydrolyse enzymatique des coproduits marins .......................................... 53
VII.3. Les objectifs envisags par cette tude ......................................................... 53
vii
Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence .................... 55
I. Mthodes danalyse de la composition des produits..................................................... 57
I.1. Identification et prparation de la matire premire ......................................... 57
I.2. Matire sche ..................................................................................................... 57
I.3. Teneur en cendres .............................................................................................. 58
I.4. Teneur en lipides ............................................................................................... 58
I.5. Teneur en protines ........................................................................................... 59
I.5.1. Dosage de lazote par Kjeldahl (Crooke et Simpson, 1971) .......................... 59
I.5.2. Mthodes de dosages colorimtriques des protines ...................................... 60
I.5.3. Dosage des acides amins par chromatographie en phase gazeuse ................ 61
I.6. Teneur en rsidus glycosidiques simples .......................................................... 62
I.6.1. Dosage colorimtrique de Dubois et al. (1956) .............................................. 62
I.6.2. Mthode de dosage colorimtrique des osamines .......................................... 62
I.6.3. Dosage des rsidus glycosidiques par chromatographie en phase gazeuse .... 63
I.7. Teneur en chitines ............................................................................................. 64
II. Mthode dextraction de la chitine .............................................................................. 64
II.1. L'extraction chimique ....................................................................................... 64
II.2. L'extraction enzymatique par protolyse acide ................................................ 65
III. Caractrisation qualitative des produits ..................................................................... 66
III.1. Mesure du degr dactylation........................................................................ 66
III.1.1. Rsonance magntique nuclaire du liquide 1H .......................................... 66
III.1.2. Rsonance magntique nuclaire du solide en 13C et 15N............................ 67
III.1.3. Spectroscopie infrarouge transformation de Fourrier - FTIR ................... 67
III.2. Mesure du degr de polymrisation ................................................................ 68
III.3. Mesure de lindice de cristallinit................................................................... 69
III.4. Caractrisation des proprits thermiques ...................................................... 70
III.4.1. Analyse thermogravimtrique (ATG).......................................................... 70
III.5. Lanalyse lmentaire ..................................................................................... 71
III.6. Colorimtrie .................................................................................................... 71
IV. Application, comparaison et slection des mthodes................................................. 71
IV.1. Composition de la matire premire............................................................... 72
IV.1.1. Quantification des protines ........................................................................ 72
IV.1.2. Caractrisation complte de la composition de la matire premire ........... 74
IV.2. Composition des produits commerciaux ........................................................ 75
IV.3. Composition des produits de lextraction enzymatique ................................. 76
IV.3.1. Les rsidus insolubles de la cintique de rfrence ..................................... 76
IV.4. Estimation du degr de puret ........................................................................ 77
IV.4.1. Recoupement par lanalyse lmentaire ...................................................... 77
IV.4.2. Recoupement par lanalyse thermogravimtrique ....................................... 82
IV.4.3. Recoupement par RMN et FT-IR ................................................................ 87
IV.5. Estimation du degr dactylation .................................................................. 89
IV.6. Estimation de lindice de cristallinit ............................................................. 91
V. Conclusion sur le choix des mthodes ........................................................................ 92
Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide ............. 95
I. Introduction ................................................................................................................... 97
II. Le milieu ractionnel acide.......................................................................................... 97
II.1. Choix de lacide : lacide phosphorique .......................................................... 97
II.2. Effet de lacide sur la dprotinisation et de la dminralisation .................... 97
III. La protase acide ........................................................................................................ 99
viii
xi
xii
Fig.II.1 : Rpartition des parts de produits et coproduits de crevettes (en pourcentage de poids
humide) .................................................................................................................................................. 57
Fig.II.2 : Hydrolyse enzymatique d'exosquelette de crevette par la pepsine en milieu maintenu acide
par H3PO4.............................................................................................................................................. 65
Fig.II.3 : Spectre 1H RMN de chitosan, 600 MHz, en D2O, 65 C, (Yang et Montgomery, 2000) ... 66
Fig.II.4 : Viscosimtre capillaire dUbbelhode .................................................................................... 69
Fig.II.5 : Dispositif danalyse thermogravimtrique (Source Web, Wikipedia).................................... 70
Fig.II.6 : Composition en acides amins de l'exosquelette de crevette comparaison par laboratoires
............................................................................................................................................................... 73
Fig.II.7 : Principaux composs prsents dans la matire premire en fonction de la catgorie de taille
(n > 3).................................................................................................................................................... 75
Fig.II.8 : Cintique dhydrolyse enzymatique (25 % de pepsine/prot 40 C taille < 1mm)............ 76
Fig.II.9 : Variations de teneur en azote pour diffrents composs azots (P et Q)............................... 79
Fig.II.10 : Pourcentage de chitine (Q) et de protines (P), minimal (---) et maximal ( ) en fonction de
Nt ........................................................................................................................................................... 79
Fig.II.11 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan
massique ; en bleu, via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp
dtermin par CPG) .............................................................................................................................. 80
Fig.II.12 : Corrlation entre les mthodes de quantification de la chitine (NaOH= via le traitement
chimique, Bilan = via le bilan massique, N (AE) = via lanalyse lmentaire, Naa = via la
composition en acides amins ............................................................................................................... 81
Fig.II.13: Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique (25 % pepsine,
40 C) .................................................................................................................................................... 82
Fig.II.14 : Thermogramme de produits de diffrents degrs de puret (1 C/min) .............................. 84
Fig.II.15 : Relation entre la perte de masse de la 1re tape et la quantit de protines....................... 86
Fig.II.16 : Relation entre lestimation du taux de puret et la quantit de protines rsiduelles dune
part et ltendue de la premire plage de temprature de dcomposition dautre part ........................ 86
Fig.II.17 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la
matire premire, en rouge ................................................................................................................... 87
Fig.II.18 : Spectres de spectroscopie FT-IR de la chitine commerciale Sigma (en bleu), extraite par
voie chimique (en rouge) et enzymatique (en vert) au laboratoire. ...................................................... 88
Fig.II.19 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la
matire premire, en rouge ................................................................................................................... 90
Fig.II.20 :Spectre RMN 1H de la chitine commerciale.......................................................................... 90
Fig.II.21 : Spectre FT-IR sur le rsidu solide de 6 h lhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C, (analyse
mene par le laboratoire BMM) ............................................................................................................ 91
Fig.II.22 : Dconvolution du spectre de diffraction aux rayons X de la chitine commerciale Mahtani 92
Fig.II.23 : Comparaison visuelle entre le produit dextraction chimique (a) et le produit dhydrolyse
enzymatique(b) ...................................................................................................................................... 93
Fig.III.1 : Composition des produits traits par lacide phosphorique en fonction du temps .............. 98
Fig.III.2 : Reprsentation schmatique de la pepsine (Source Web, http://dwb4.unl.edu) ................... 99
Fig.III.3 : Mcanisme propos pour la protolyse par les aspartate-protases (Reginald et al. 1974)
............................................................................................................................................................. 100
Fig.III.4 : Conditions de pH (A) et T(B) optimales de protolyse ..................................................... 100
Fig.III.5 : Modle selon Michalis-Menten, de la vitesse de raction en fonction de la consommation
en substrat ........................................................................................................................................... 101
Fig.III.6 : Comparaison sur la chitosanolyse selon 3 protases diffrentes, effet de la concentration en
enzyme (A), du pH (B), de la temprature (C) et de la concentration en substrat (D), Kumar et
Tharanathan 2004 ............................................................................................................................... 102
Fig.III.7 : Reprsentation schmatique dun plan factoriel complet dexprience 2k ......................... 103
Fig.III.8 : Rponses du plan dexprience : analyses de caractrisation des produits dhydrolyse
tudies ................................................................................................................................................ 105
Fig.III.9 : Rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience ................ 106
Fig.III.10 : Quantit de minraux limins en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience
............................................................................................................................................................. 107
xiii
xiv
Fig.IV.6 : Indice de cristallinit des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique
............................................................................................................................................................. 153
Fig.IV.7 : Profils dATG de la chitine commerciale (Mahtani) et du produit de lextraction
enzymatique modle ............................................................................................................................ 154
Fig.IV.8 : Micrographies de MEB du produit de 6 h dhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C ....... 155
Fig.IV.9 : Organisation schmatique de la cuticule de homard, coupe transversale, Raabe et al. 2006
............................................................................................................................................................. 156
Fig.IV.10 : Micrographes de MEB dexosquelettes soit dminraliss (a) ou dprotiniss (b) par
traitement chimique ............................................................................................................................. 156
Fig.IV.11 : Schma de la cuticule des crustacs, ep = picuticule, pi = couche pigmentaire, pr =
couche principale, E = cellules pithliales, p.c. = canaux de ports transversaux, i.s. = septum
interprismatique, Giraud-Guille, 1984 ............................................................................................... 157
Fig.IV.12 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 25 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse..... 158
Fig.IV.13 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 41 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse..... 159
Fig.IV.14 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 25 % dASP en acide formique 40 C) selon la dure dhydrolyse ..................... 160
Fig.IV.15 : Quantits dacides amins rsiduels dans les produits insolubles de lextraction
enzymatique par 25% de pepsine 40C (petite taille) en fonction de la dure dhydrolyse ............. 161
Fig.IV.16 : Rpartition des catgories de rsidus glycosidiques dans la phase soluble des extractions
enzymatiques ....................................................................................................................................... 162
Fig.IV.17 : Carotnodes prsents dans la phase soluble de lhydrolyse 25 % de pepsine, 6 h 40
C......................................................................................................................................................... 164
Fig.IV.18 : Comparaison des coefficients de spectrophotomtrie ...................................................... 166
Fig.IV.19 : Chitine obtenue par lavage chimique, par hydrolyse par la pepsine et par lASP (de
gauche droite) .................................................................................................................................. 166
Fig.IV.20 : Schma rcapitulatif des tapes du procd de protolyse acide et des analyses
conscutives ......................................................................................................................................... 167
xv
ABREVIATIONS
AA
ABVT
ATG
BSA
CHOS
CPG
CS
CT
Da
DA
DCO
DD
DCl
DSC
DHA
DP :
EPA
FA ; FD
FID
GC/MS
HPLC
JO
LMWC
MES
Mdt
Mt
NMR
PA
PER
USD
Acide amin
Azote basique volatil total
Analyse ThermoGravimtrique
Srum albumine bovine
Chitooligosaccharides
Chromatographie en phase gazeuse
Chitine-synthtase
Coupe transversale
Dalton
Degr dactylation
Demande chimique en Oxygne
Degr de dsactylation
Deuterated hydrochloric acid
Differential scanning calorimetry
Acide docosahexanoque
Degr de polymrisation
Acide eicosapentanoque
Fraction des units actyles ; Fraction des units actyles
Dtection par ionisation de flamme
Chromatographie en phase Gazeuse-Spectromtrie de Masse
Chromatographie en phase liquide
Journal Officiel
Chitosan de trs faible masse molaire (oppos HMWC)
Matires en suspension
Milliard de tonnes
Million de tonnes
Rsonnance magntique nuclaire
Pattern of N-acetylation
Pourcentage defficacit des protines (Protein Efficiency Ratio)
United States Dollar
Abrviations chimiques
CH3COCH3
Actone
(COOH)2
Acide oxalique
Ca(H2PO4)2
Bis-dihydrognophosphate de calcium
CaHPO4
phosphate de calcium de formule (brushite)
Ca3(PO4)2
Tricalcium phosphate
CH3COOCH2CH3 thyle-actate
H202
Peroxyde dhydrogne
HNO2
Acide nitreux
KBr
Potassium bromide
KMnO4
Permanganate de potassium
KNaC4H4O6
Tartrate de sodium et potassium
Na2CO3
Carbonate de sodium
NaBH4
Sodium borohydride
NaClO
Hypochlorite de sodium
xvi
Introduction
Introduction
Gnralits
La chitine a t isole pour la premire fois, en 1811, par un chercheur franais, Henri
Braconnot, sur un champignon. Son driv, le chitosan a t dcouvert en 1859 par Charles
Rouget alors quil chauffait la chitine avec du KOH concentr.
Ce polymre est un des plus abondants sur Terre, la fois dans le milieu terrestre et marin. Il
est traditionnellement extrait partir des carapaces des crustacs depuis les annes 70, pour
des domaines dapplication varis, tels que la pharmaceutique, la cosmtique, la dittique et
le traitement des eaux. Il est compos dun squelette carbon linaire, des units de
glucosamine et de N-actylglucosamine (Fig.1).
Les principaux drivs de la chitine et les mcanismes pour les produire sont schmatiss par
Introduction
Nombre de publications
5000
4000
3000
2000
1000
2011
2009
2007
2005
2003
2001
1999
1997
1995
1993
1991
1989
1988
1985
1983
1979
1980
1977
1975
1972
1971
1970
1967
1957
1960
Fig.3 : Evolution du nombre de publication par anne traitant de chitine ou chitosan sur Web of Science
Introduction
Introduction
Introduction
Fig.4 : Schma du procd dextraction de linvention dcrite par le brevet FR 11 54580, 24 mai 2011.
I. Contexte conomique
I. Contexte conomique
I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs
Le march des produits aquatiques ne cesse daugmenter lchelle internationale. La forte
hausse de la demande est principalement lie laugmentation de la consommation humaine.
Elle reprsentait 0,7 Kg par habitant en 1970 tandis quelle a atteint 7,8 Kg par habitant en
2008, soit une augmentation de 6,6 % par an (FAO, 2010).
La consommation de produits marins est ingalement rpartie sur la surface de la plante,
comme le montre la figure I.1 (FAO, 2008).
Fig.I.1 : Rpartition de la consommation moyenne de produits marins par habitant de 2003 2005
11
Fig.I.2 : Secteurs approvisionns par la production de poissons dans le monde (sauf Chine) FAO 2009
Fig.I.3 : Contribution relative de laquaculture et des captures en mer dans la consommation humaine de PM
12
I. Contexte conomique
Fig.I.4 : Production de crevettes dans le monde, rpartition entre la pche (P) et laquaculture (A), FAO, 2006
Les crevettes sont gnralement traites aux mtabisulfites la sortie de leau, pour viter leur
dgradation et le noircissement des carapaces par oxydation, (Chantereau, 1991). Elles sont
vendues soit fraches, soit congeles, cuites ou marines. De plus, elles sont proposes
entires ou dcortiques. En 2010, la plus forte augmentation tait la part des crevettes cuites
et dcortiques. Gnralement, cette forme de produit est destine une post-transformation,
telle que la fabrication de brochettes de la mer ou de plats prpars.
Lune des espces de crevette les plus commercialises est la crevette tropicale, dite crevette
patte blanches, Penaeus vannamei. lorigine, elle tait cultive uniquement sur la cte
Pacifique de lAmrique latine. Depuis sa production sest tendue. Elle a atteint 67 % de la
production mondiale en 2008 (FAO, 2010), soit 70 % des pnides (Fig. I.5). La
consommation de P. vannamei est trs prise. Elle a augment de 58 % en Asie et de 211 %
en Amrique latine entre 2001 et 2006.
Fig.I.5 : Rpartition des pnides leves en aquaculture dans le monde, FAO, 2010
13
Les coproduits se dfinissent comme tant la matire issue du processus de fabrication dun produit principal.
Tout comme le produit fini principal, les coproduits doivent se soumettre une rglementation spcifique pour
tre utiliss directement ou indirectement dans lindustrie
14
I. Contexte conomique
USA
Canada
15000
Japon
Europe
10000
Asie-Pacifique
Reste
5000
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
Fig.I.6 : Ventes de chitine en fonction des zones gographiques (Daprs GIA, 2010)
Le principal critre qui dfinit le prix est le taux de puret, lui-mme li au procd
dextraction de la chitine. Einbu (2007a) rapporte des prix bien plus levs pour des drivs
de trs forts degrs de puret, de lordre de 10 000 USD/Kg pour des oligosaccharides ultrapurs et 50 000 USD/Kg pour le chitosan. Les prix de la N-actylglucosamine obtenue par voie
chimique et par voie enzymatique sont de lordre de 20 USD/Kg et de 100 140 USD/Kg
respectivement.
15
La production naturelle de chitine est estime plus dun milliard de tonnes par an, jusqu
2,3 milliard de tonnes par an selon Jeuniaux (1991). 1 328 Mt proviennent de ressources
marines (Cauchie, 2000), dont 29,9 Mt des crustacs, 1,4 Mt des mollusques et 0,7 Mt des
calmars (Synowiecki et Al-Khateeb, 2003).
Les ressources pour la production de chitine
Les sources privilgies pour la production de chitine sont les coproduits de crustacs, en
particulier les crevettes et les crabes. Cependant, le choix de la matire premire est li
lactivit locale. Certaines zones gographiques privilgient dautres ressources, telles que les
krills ou les bouquets. Les plumes de calmar sont parfois exploites pour extraire de la chitine
. Cette structure est diffrente de la chitine extraite des crustacs (Cf. section III). Leurs
proprits sadressent des applications technologiques spcifiques (Cf. section V). Des
tudes ont galement t menes sur la chitine des ponges telles que Verongula gigantea et
sur la chitine de tubes digestifs de vers telles que Riftia pachyptila (Ehrlich et al. 2007).
La biomasse des microorganismes constitue une quantit de chitine abondante. Parmi eux, on
peut citer les levures, les moisissures, certains ciliates, les algues appartenant aux
chrysophytes et certaines bactries dont les streptomyctes (Kim, 2010). Lavantage dune
telle production repose sur la matrise de la culture des microorganismes. La production de
chitine peut tre complmentaire la production dacide citrique de mycelium dAspergillus
niger (Cai et al. 2006). Une entreprise belge, Kitozyme, ne en dcembre 2000, propose des
drivs de chitine-glucanes (complexe de chitine ramifi avec des units de glucanes) obtenus
partir de paroi dAspergillus Niger (Fig.I.7).
16
I. Contexte conomique
17
18
dlongation. Ceux base de chitosan peuvent tre tirs deux fois seulement. Ces proprits
mcaniques peuvent tre amliores par modification du chitosan (par ramification) ou par
des ajustements de formulation. Par exemple, le chitosan-poly(vinyl-alcool) prsente une
meilleure rsistance mcanique, stabilit et capacit dlongation (Nakano, 2007).
Les produits cosmtiques
Beaucoup dapplications dans le domaine cosmtique reposent sur ces proprits filmognes.
Des principes actifs peuvent tre pigs dans des films ou des billes de chitosan. Ces principes
actifs sont librs au contact de la peau par leffet de la diminution du pH. Les produits le plus
couramment rencontrs sont des soins pour la peau, contre lacn et pour les cheveux,
notamment pour leur souplesse. Cette application repose sur les proprits lectrostatiques du
chitosan (Rinaudo, 2006)
Rle
Antimicrobien
Antioxydant
Structurant
Texturant, mulsifiant
Ajoute arme et couleur
Fibres
Hypocholestrolmiant
Contre lintolrance au lactose
Rduction de labsorption des lipides
Les films alimentaires base de drivs de chitine sont la fois une barrire physique et
biologique contre les flores daltration et les contaminations extrieures. Le chitosan serait
plus efficace que les CHOS dans ce domaine, cependant les tudes ne sont pas unanimes. Tsai
et al. (2004) montrent que le chitosan a un effet inhibiteur sur des pathognes tels que
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enterica
serovar Typhi. linverse, Kittur et al. (2005) et Kumar et al. (2005) ont montr que les
CHOS taient plus actifs. Lin et al. (2009) expliquent cette contradiction par le rle dominant
du degr dactylation par rapport celui du degr de polymrisation. Ceci illustre bien quel
point les caractristiques des drivs de la chitine influent sur leurs proprits.
Ces films alimentaires sont galement antioxydants (Jeon et al. 2002). Kim et Thomas (2007)
ont montr un rsultat positif contre loxydation des lipides. Cette proprit est lie la
prsence de deux groupes hydroxyles, en C-3 et C-6 (Cf. Fig.1). Ils attirent fortement les
atomes dhydrogne en les dtournant des lipides (Je et al. 2004 ; Park et al. 2004). Il est
19
possible de raliser des films alimentaires comestibles grce au chitosan (De Moura et al.
2009 ; Cardenas et al. 2008).
Le chitosan et la glucosamine sont commercialiss comme complments alimentaires. Les
proprits revendiques reposent sur leur pouvoir antioxydant et leur capacit faire perdre
du poids. Le chitosan agirait comme film intestinal et comme fibre. Il inhiberait labsorption
des lipides et des sucres (Ylitalo et al. 2002), ou activerait directement le dstockage des
lipides (Helgason, 2008). Les oligomres du chitosan semblent galement prvenir les risques
de diabte (Kumar et Tharanathan, 2004).
Les CHOS serraient galement intressants comme prbiotiques. Des rsultats prometteurs
ont t obtenus par Pan et al. (2009) avec des chitooligosaccharides de 90 % de DD et de 3
6 DP.
Les utilisations comme auxiliaires technologiques
Du point de vue technique, le chitosan constitue un agent de clarification, par exemple pour
lindustrie du vin (Chatterjee et al. 2004). Il permet dviter lemploi du collagne, qui suscite
la crainte des consommateurs depuis la crise de Creutzfeld-Jacob. Une rduction jusqu 95 %
de la turbidit a t observe aprs utilisation de la chitine-glucane (Kim, 2010). De plus, le
rle antioxydant des drivs de la chitine est exploit pour stabiliser les polyphnols du vin, et
ainsi prserver sa couleur et ses armes. Ils sont employs pour capter les mtaux lourds par
bio-adsorption, tels que le Cadmium, le Fer et le Plomb (Bornet et Teissedre, 2008). Dautres
applications existent, telles que lutilisation du chitosan pour recouvrir des fruits et lgumes
aprs leur rcolte ou lors du procd de fabrication du caf (Scheruhn, 1999).
Les limites et les risques dallergies
Des cas dallergies ont t rapports. Les procds de fabrication et le degr de purification de
la chitine peuvent tre mis en cause puisque les allergnes incrimins seraient des agents
chimiques tels que les mtabisulfites, des amines biognes ou des rsidus protiques tels que
la trompomyosine (Lopata, 2010). La chitine dclenche galement des ractions immunitaires
qui peuvent aboutir des ractions allergiques (Reese et al. 2007 ; Kim, 2012). Nanmoins,
certains auteurs, dont Muzzareli (2010), revendiquent linnocuit des complments base de
drivs de la chitine. De plus, le rle du chitosan contre les inflammations lies aux ractions
allergiques et lasthme a t dcrit. Lexplication de ces deux phnomnes antagonistes
dpend de la taille du polymre (Brinchmann et al. 2011).
La consommation de chitosan doit galement tre soumise des prcautions vis--vis du
calcium. Liao et al. (2007) ont montr quil limitait labsorption du calcium tandis que les
CHOS favoriseraient le phnomne inverse, et donc renforceraient les os (Jung et al. 2006).
20
4000
Cosmtique
Agroalimentaire
Sant / Mdecine
Agrochimie
Biotechnologie
2000
Pulpe / papier
Textile
Photographie
Applications diverses
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
Fig.I.8 : volution des domaines dapplication pour lesquels le chitosan est employ (Daprs GIA, 2010)
Les applications du chitosan sont largement domines par le secteur du traitement de leau,
22
qui atteint plus de 4 000 tonnes consommes en 2006. Ce secteur est suivi par celui de la
cosmtique, de lagroalimentaire, du mdical et de lagrochimie. Les autres secteurs tels que
la biotechnologie, la papterie, le textile et la photographie reprsentent de faibles volumes de
ventes. Les prvisions volueraient peu lhorizon 2015 (GIA, 2010).
Le premier pays consommateur de chitosan, notamment pour le secteur du traitement de leau
est le Japon, avec prs de 3 700 t en 2006. Les pays occidentaliss, tels que les tats-Unis,
consomment davantage le chitosan dans les domaines de la cosmtique, de lagroalimentaire,
du mdical et de la biotechnologie. La zone Asie-Pacifique est leader dans la consommation
du chitosan en agriculture/agrochimie (Tab.I.4).
Domaine dapplication
USA
Europe
Japon
Asie-Pacifique
Canada
Autres
Traitement de leau
450,3
368,6
2 900,8
245,8
74,9
101,0
Cosmtique
535,8
173,6
209,6
136,4
54,2
79,8
Agroalimentaire
352,0
209,6
197,2
72,2
67,8
33,1
Sant/Mdecine
306,5
84,9
156,2
200,5
31,1
13,9
Agrochimie
125,6
73,4
89,0
285,5
29,2
20,0
Biotechnologie
131,2
37,1
57,5
45,2
15,8
12,1
Pulpe/papier
39,1
28,9
36,1
29,6
11,2
6,8
Textile
23,47
17,8
25,5
19,9
6,3
4,3
Photographie
13,04
9,1
29,7
8,9
2,9
1,7
Applications diverses
28,89
18,9
54,1
19,1
8,3
4,1
TOTAL
2005,9
1021,9
3755,7
1063,1
301,7
276,8
Tab.I.4 : Rpartition des applications du chitosan, en tonnes, en 2006 (GIA, 2010)
Total
4141,4
1189,4
931,9
793,1
622,7
298,9
151,7
97,3
65,3
133,4
8425,1
23
Les trois constituants majoritaires, chitine, protines et CaCO3, forment un rseau dense. La
chitine y joue plusieurs rles structurels et fonctionnels vitaux. Elle forme une barrire
physique entre le corps de lorganisme et son environnement (Roer et Dillaman, 1984). Elle
participe sa protection contre les radiations, la chaleur, les agressions chimiques et
physiques. Elle est galement le site dattachement des muscles et le lieu dchange et de
transport de substances, notamment ladsorption de composs anioniques. Enfin, elle joue un
rle dans le systme immunitaire (Tokura et Tamura, 2007).
Lorigine du nom de la chitine est issue du grec khiton qui signifie tunique car elle
participe lenveloppe extrieure de nombreux organismes depuis des milliers dannes. ce
titre, la chitine ou ses units osidiques servent tudier les fossiles et la phylognie (Shen et
Jacobs, 1998). Par exemple, Furuhashi a utilis la chitine pour dterminer lanctre commun
des mollusques (Furuhashi, 2009).
La chitine forme, avec les protines, des microfibrilles cristallines. Llasticit de la carapace
dpend du degr de liaison entre la chitine et les protines, et de leur rpartition dans la
matrice. Ces protines peuvent tre des arthropodines2 (responsables de la rigidit), des
sclrotines3 (rle dans la pigmentation) ou des rsilines4 (attribues llasticit des cuticules
et permet les mouvements).
Protine associe la chitine dans l'endocuticule des arthropodes, elle se caractrise par une forte rigidit
Protine tanne entrant dans la composition de la cuticule des Arthropodes
4
Famille des protines lastiques (inclue llastine, le gluten). Chez les insectes elles participent la capacit de
sauter ou tout autre mouvement rapide ou rptitif qui ncessite du stockage dnergie
3
24
Lun des premiers avoir dcrit prcisment la structure de la cuticule des crustacs est Yves
Bouligand (1972), le motif de la structure porte donc son nom. Elle sorganise en plusieurs
tages (Fig.I.9), on peut distinguer sept niveaux hirarchiques qui vont tre dcrits ci-dessous.
Au premier niveau se trouve la structure molculaire de la chane linaire polysaccharidique
de la chitine. Au second, on distingue les trois formes darrangement gomtrique de ces
chanes, soit , ou (Cf. IV.1). Au troisime niveau, 18 25 molcules de chitine
sassemblent en units cristallines, troites et longues, enveloppes de protines. Ces
nanofibres ainsi obtenues mesurent 2 5 nm de diamtre et environ 300 nm de longueur.
Elles sassemblent ensuite en fibrilles plus importantes, de lordre de 50 300 nm de
diamtre. Lespace disponible entre les fibrilles est combl par les protines et des minraux,
principalement le carbonate de calcium, soit sous forme cristalline (calcite), soit amorphe
(Vincent, 2002 ; Raabe et al. 2005).
Fig.I.9 : Niveaux hirarchiques dans lorganisation de la cuticule de crabe H. americanus (Raabe, 2005).
Au niveau suivant, les microfibrilles sorganisent en plans. Enfin les plans se superposent,
chacun tant tourn dun degr de rotation constant par rapport laxe normal. On obtient une
structure hlicodale (Fig.I.10). Cette organisation particulire est appele motifs de
Bouligand (Bouligand, 1972 ; Giraud-Guille, 1984).
Fig.I.10: (a) Motifs de Bouligand, CT de cuticule de homard en MEB, Raabe, 2006 ; (b) reprsentations
schmatiques de lempilement des fibres, Pillai et al. 2009
cette structure est appele nids dabeilles (Fig.I.11). Les canaux sont forms de fibres de
chitine-protines minralises et ils sont flexibles (Fabritius et al. 2009).
Fig.I.11 : Structure en nid dabeilles de cuticule de homard en CT par MEB (a) Pillai, 2009 (b) Raabe, 2006
Daprs ltude de Raabe (2005), on peut distinguer deux parties dans lorganisation de la
cuticule. Lexo-cuticule est caractrise par une forte rigidit (8,5-9,5 GPa) et une forte
rsistance (130 270 MPa). Lendo-cuticule est plus dsorganise, moins rigide (3-4,5 GPa)
et moins rsistante (30-55 MPa).
La minralisation a t tudie par Giraud-Guille et al. (2004) partir de la cuticule du crabe.
Les cristaux de calcite sont produits la surface de lpicuticule par des enzymes pendant la
mue. La production stend en surface tels des disques plats, puis sinfiltre verticalement et
horizontalement, partout o lespace est libre entre les cellules pidermiques.
Ces travaux suggrent que la minralisation est initie par du carbonate de calcium analogue
du cristal liquide (phase dite cholestrique). Les molcules volueraient vers une phase
nmatique chirale (orientation dirige et arrangement hlicodal) en fonction de la teneur en
chitine dans le milieu. Ceci conduit la minralisation progressive, la formation de nouvelles
liaisons entre molcules et laugmentation progressive de la rigidit des carapaces. La figure
I.12 montre la structure de la cuticule normale et dcalcifie.
b
Fig.I.12 : Structure de la cuticule normal (a) et dcalcifie (b) par MEB (Raabe, 2005)
Lensemble du dispositif fibrillaire torsad confre la cuticule une grande cohsion rigide.
Les microfibrilles et les plans sont stabiliss par des liaisons hydrognes ou covalentes (Pillai
et al. 2009; Rinaudo, 2008). Parmi ces liaisons, lune des plus fortes, CONH, permet de
26
maintenir les chanes primaires de chitine une distance de 0,47 nm (Pillai et al. 2009).
La chitine et les protines sont lies indirectement (Neville et al. 1976). Leurs liaisons seraient
similaires celles qui soprent entre la cellulose et les protines (Tormo et al. 1996). Ces
liaisons reposent sur des noyaux aromatiques fixs dun cot au squelette carbon du
polysaccharide et de lautre la protine. Les noyaux aromatiques seraient lis aux carbones
C-1 et C-2 (Cf. Fig.1, p3) des N-actylglucosamines de la chitine dune part, laspartate et
lhistidine des protines dautre part. Plus de 50 % des protines seraient impliques dans
cette interaction (Diaz-Rojas et al. 2006). La prsence de phnol-o-dihydrique a galement t
rapporte (Roberts, 1992). Cette molcule serait situe entre les protines afin de les protger
contre les chitinases et de la dshydratation.
La relation entre les protines et la chitine a t tudie par pyrolyse et chromatographie
GC/MS par le biais de marqueurs (Stankiewicz et al. 1996). Un rsidu dhystidyle et un
groupe catchol serviraient de lien pour relier la chitine et les protines (Fig.I.13).
Fig.I.13: Proposition de structure entre chitine et protines, a) Stankiewicz et al. 1996 b) Hamodrakas, 2002
Les protines impliques dans cette interaction prsenteraient une surface plane, selon une
configuration en feuillet- (Iconomidou et al. 1999). Dun cot, les groupes aromatiques se
lient la chitine, de lautre des liaisons entre protines stablissent (Hamodrakas, 2002).
Lanalyse darthropodes fossiliss a rvl une structure soutenue par un polymre minral,
dit gopolymre. Il est similaire au squelette carbon de cphalopodes rcents sur lequel sont
fixes des molcules aromatiques (Gupta et al. 2008).
Certains peptides prsents dans les cuticules sont responsables de linhibition de la
calcification (Inoue et al. 2004). Lactivit repose sur une affinit du peptide avec les ions
calcium, qui sont ainsi dtourns. Des lipocalines5 sont galement prsentes dans la cuticule.
Elles jouent un rle dans le transport de substances et le maintien de la structure gnrale
(Grzyb et al. 2006). Hackman et Goldberg (1978) ont mis en vidence linfluence du pH sur
des liaisons non-covalentes entre les protines et la chitine.
5
Protines impliques dans le transport de petites molcules hydrophobes (strodes, sels biliaires, rtinodes).
Elles partagent des rgions de squences homologues et une architecture tertiaire commune
27
Dautres recherches se concentrent sur les gnes codant les protines de cuticules (Willis et al.
2010). Des protines sont prcisment identifies, rfrences et cibles pour une activit
spcifique. Elles intressent notamment le secteur mdical (Khoushab, 2010). Parmi ces
protines, la tachycitine est reconnue pour son activit antifongique (Suetake et al. 2002).
a)
b)
Fig.I.14 : Reprsentation idale de la chitine (a) et son driv obtenu par dsactylation, le chitosan (b).
La stabilit thermique de la chitine est tudie pour caractriser les diffrentes chitines et ses
drivs. Elle est value par analyse thermogravimtrique (ATG) et se situe entre 370 C et
600 C (Romano et al. 2007). Lorsquelle est complexe dans la matrice des cuticules, la
stabilit thermique est modifie, influence par les interactions avec les protines et minraux
(Zhou, 2010). Une approche dtaille de cette technique sera prsente ultrieurement, au
Chapitre 2. (Section III.5.2).
28
La distinction entre ces formes peut tre ralise par RMN, Rayons X ou spectrophotomtrie
6
29
Terme qualifiant un systme cristallin qui est un prisme droit, et dont la base est en forme de losange
30
chantillon. Cet indice traduit la proportion de zones cristallines au sein dune structure
(Jaworska et al, 2003). Il est important de noter que les traitements acides liminent les zones
amorphes et par consquent augmentent l'indice de cristallinit (Remol et Marchessault,
1993).
31
Le rapport Ip entre Mp et Mn est appel indice de polymolcularit. Plus celui-ci est lev,
plus la distribution est leve.
Ip
Mp
Mn
(I.1)
Par dfinition, la masse molaire Mn est lie au degr de polymrisation moyen en nombre,
DPn, selon la relation suivante :
Mn DPn m0 , avec m0 la masse molaired' une unit
(I.2)
Les deux grandeurs traduisent la longueur moyenne des polymres. En pratique, on a recours
des techniques telles que la chromatographie dexclusion strique pour estimer la masse
molaire moyenne en nombre. Cependant, cette technique serait trs difficile mettre en uvre
pour la chitine. On dtermine donc plutt la masse molaire viscosimtrique, daprs les
travaux de Staudinger (1881-1965) sur la viscosit des solutions de polymres.
Daprs lquation de Mark-Houwink-Sakura (MHS), la viscosit intrinsque est
proportionnelle Mv lorsque la concentration des polymres dissous tend vers zro. Or, la
viscosit intrinsque peut tre mesure laide dun viscosimtre capillaire.
[] = KMva (MHS)
(I.3)
IV.4. La solubilit
La solubilit dun polymre est lie aux interactions intra et inter molculaire entre les chanes
(Ravindra et al. 1998). La densit de charge de la chitine implique son caractre hydrophobe.
Par consquent, elle nest pas soluble dans les solvants classiques. Les acides concentrs, de
32
prfrence chaud, et certains solvants toxiques sont capables de solubiliser la chitine. Leur
utilisation est dangereuse pour loprateur et dgradent la structure de la chitine et du chitosan
(Hsiao et al. 2004). Le tableau I.6 dresse une liste non-exhaustive de ces solvants.
Chitine
Ceci constitue linconvnient majeur qui limite lutilisation de la chitine et rend difficile sa
caractrisation. Des recherches rcentes portent sur le potentiel des liquides ioniques pour
solubiliser la chitine dune part, et former un film dautre part (Wu et al. 2008 ; Kadokawa et
al. 2011).
Lacide phosphorique (H3PO4) est un acide alimentaire galement capable de solubiliser la
chitine. Hein et al. (2007) lutilisent pour la mise au point dune mthode de dtermination du
DA. La chitine est dissoute 55 C, par H3PO4 0,5 M, dans un ratio w/v de 1 :200 et
pendant 1 h. Wu et Zivanovic (2008) pratiquent la mme technique sous des conditions plus
fortes, 60 C et jusqu 3 h. Linconvnient de cette mthode est la production dions
glucofuranosyl oxazolinium (Vincendon et al. 1997), composs intermdiaires instables qui
peuvent nuire la mesure de DA par RMN (Einbu et al, 2007b).
Pour obtenir un quilibre entre la dgradation minimale et la solubilisation maximale de la
chitine, le solvant privilgi est gnralement le DMAc/LiCl. Un complexe se forme entre les
ions Cl- et les groupes protons OH- et NHCOCH3- de la chitine. La formation de ce
complexe polylectrolyte saccompagne de la rupture des liaisons hydrognes qui stabilise
la structure cristalline du polymre, favorisant sa solubilisation (Poirier et Charlet, 2002). La
viscosit intrinsque de la chitine solubilise est alors dtermine pour estimer sa masse
molaire moyenne en nombre.
La solubilisation du chitosan est davantage accessible par des solvants acides, un pH < 6,5,
correspondant au pKa du chitosan. La prsence des groupements protons NH3+ modifie la
densit de charge de la molcule. Par consquent, la solubilisation dpendra du DA, ainsi que
de la nature du solvant. Le tableau I.6 donne galement une liste non-exhaustive de solvants
du chitosan. Gnralement, les plus courants sont des mlanges base dacide actique et
dactate de sodium (Kasaai, 2007).
La masse molaire, la polydispersit et la solubilit de la chitine et ses drivs ont un impact
direct sur leur comportement rhologique. Par exemple, la viscolasticit et le volume molaire
sont affects. La concentration en polymre dans le solvant est galement importante. Il existe
une concentration critique, dite denchevtrement ou de recouvrement, au-del de laquelle les
pelotes de macromolcules sinterpntrent. Cette concentration dpend de la masse molaire
33
Fig.I.18: Schmas de distribution des groupes actyles le long de la chane carbone du chitosan, a) PA=0:
rpartition par blocs uniformes, b) PA=1: rpartition alatoire et c) PA=2: rpartition alterne entre A et D.
12
PA pour Pattern of N-acetylation correspond la rpartition des glucosamines actyles ou non le long
de la chane carbonne
34
En amont, la prparation de la matire premire est indispensable pour rduire les risques de
dgradation de la chitine. Les modes opratoires sont propres chaque entreprise, souvent
bass sur le schage pour viter lautolyse13 naturelle. France Chitine a fait le choix d'ensiler
et de saler les carapaces de crevettes et de crabes pour les conserver. Elles sont ensuite rinces
13
35
leau distille jusqu obtenir la conductivit dune eau pure, puis sches froid. Enfin
elles sont cryobroyes lazote liquide (Percot et al. 2003a). Cette mthode permet de stocker
la matire premire pour l'anne, ce qui lisse les variations saisonnires. De plus, les produits
extraits auront une couleur plus blanche, compar au produit obtenu aprs schage au soleil.
Les rendements en chitine dpendent du choix de la matire premire et des conditions du
procd dextraction. De plus, les travaux de Einbu (2007a) montrent des variations sensibles
dans la composition des coproduits de crevettes au cours des saisons. De manire gnrale,
partir des ressources industriellement exploites, le rendement est compris entre 20 et 40 %
(Cf. section III ; Charoenvuttitham et al. 2006). Tolaimate et al (2003) soulignent que
loptimisation des conditions est fonction de la matire premire. Par exemple, ltape de
dminralisation lHCl est accentue lorsque lextraction seffectue partir de crabe ou de
homard (HCl 2 M, Tamb, 5 48 h). Au contraire, pour le bouquet ou les calmars, la
concentration en acide et la dure du traitement doivent tre limites (HCl 0,6 M, Tamb, 2 h).
Ces conditions sont lies la quantit de carbonate de calcium prsente.
Le procd dextraction repose sur la dminralisation et la dprotinisation. Pour les raliser,
de nombreuses combinaisons de concentration en ractifs, dure, temprature et ratio
ractif/substrat ont t testes. Les entreprises privilgient la formule qui convient leur
propre cahier des charges.
V.2. La dminralisation
Le traitement acide limine les minraux, qui passent en solution sous forme de sels. Pour des
raisons conomiques, lacide hydrochloridrique (HCl) est privilgi.
La concentration minimale, pour mener cette tape, est dtermine par lquation chimique
(I.4) de la raction entre llment minral majoritaire, le carbonate de calcium, et le HCl. En
principe, la dminralisation est complte ds lors o les proportions sont stchiomtriques,
mais dans les faits, les entreprises utilisent des solutions en excs.
2 HCl (aq) + CaCO3 (s) CaCl2 (aq) + H20 (l) + CO2 (g)
(I.4)
%DM
(A0M0) (ArMr)
*100
A0M0
(I.5)
%DM est le degr de dminralisation, Mo et Mr sont les masses initiale et rsiduelle du produit hydrolys, Ao
et Ar les pourcentages de cendres dans le produit initial et rsiduel respectivement.
36
V.3. La dprotinisation
Lors de la description de la structure des cuticules (Chap.1.III), la forte interaction entre les
protines et la chitine a t dcrite. Ceci implique des conditions drastiques pour les sparer.
Un traitement basique permet dliminer les protines par solubilisation. Les ractifs
employs pour cette tape sont des bases fortes comme lhydroxyde de potassium (KOH). Le
plus courant, pour des raisons dconomie et technique, est lhydroxyde de sodium (NaOH).
Les concentrations utilises sont comprises entre 0,3 et 2,5 M, selon un ratio compris entre
1:10 et 1:40. La temprature est comprise entre 50 et 110 C et la dure peut varier de 1 h
plus de 24 h (Tolaimate et al 2003 ; Al Sagheer et al. 2009). Ces deux paramtres sont lis,
37
%DProt
(P0M0) (PrMr)
*100
P0M0
(I.6)
%DProt est le degr de dprotinisation, M0 et Mr sont les masses initiale et rsiduelle du produit hydrolys, P 0
et Pr sont les pourcentages de protines dans le produit initial et rsiduel respectivement.
Des travaux ont port sur ltude la cintique de dprotinisation Tamb et NaOH 1 M (Percot
et al. 2003a). Une formalisation de la cintique est propose suivant un modle du premier
ordre, dP/dt = -kt, caractris par trois tapes distinctes. Chacune prsente une constante k
diffrente. La premire tape sattaquerait prfrentiellement aux acides amins basiques. Au
cours de la seconde tape, llimination des acides amins acides rattrape celle des acides
amins basiques. Les constantes k diminuent au fur et mesure de la dprotinisation. Percot
et al. (2003a) se sont galement intresss lnergie dactivation14 associe la
dprotinisation. Elle diminue avec la dure du traitement. Ceci suggre que les composs
protiques rsiduels sont plus difficiles daccs ou protgs par des conformations chimiques.
Par exemple il peut sagir de lipoprotines, dont les liaisons hydrophobes les protgeraient de
lhydrolyse.
Il existe peu dtudes sur la nature et lorganisation des protines dans les cuticules des
crustacs (Percot et al. 2003a). Les compositions en acides amins sont mesures dans
certains coproduits de crevettes, tels que Parapenaeopsis stylifera (Percot et al. 2003a),
Penaeus vannamei (Armenta et Guerrero-Legarreta, 2009) et Penaeus monodon (Narayan et
al. 2010). La composition diffre dun substrat lautre. Gnralement, le glutamate et la
glutamine, doss ensemble, sont majoritaires. Lacide aspartique/laspargine, larginine,
lalanine, la leucine, la valine et la proline sont abondants. Tandis que le tryptophane, la
tyrosine, la cystine, lhistidine et la mthionine sont faiblement prsents. Mura et al. (1994)
comparent lvolution de la composition en acide amin entre ltape juvnile et adulte de
Chirocephalus kerkyrensis et C. diaphanus, deux branchiopodes. Ils nobservent pas de
modification sauf une augmentation darginine.
14
38
Des procds alternatifs ont t expriments pour remplacer ou tre combins avec la
dprotinisation chimique. Un couplage avec une mise sous pression 100 C et lutilisation
dun cuiseur (Boucher, 1991) a t propos, ainsi que la sonication (Kjartansson et al.
2006a,b ; Marquis Duval, 2008). Kjartansson et al. (2006b) ont obtenu une rduction de la
teneur en protines rsiduelles de 10,6 8,3 %, par 1 h de sonication, partir de crevettes
nordiques.
39
Le chitosan est obtenu par dsactylation de la chitine. Tout comme le procd dextraction
de la chitine, de nombreuses combinaisons de conditions de dsactylation sont dcrites dans
la littrature. Gnralement, la chitine est chauffe au-del de 80 C (jusqu 150 C), dans
une solution de NaOH (ou KOH) concentre entre 40 et 60 %, selon un ratio w/v entre 1:5 et
1:45, pendant au moins 10 h (Chang et al. 1997 ; Jaworska et Konieczna, 2001 ; Tsai et al.
2002 ; Synowiecki et Al-Khateeb, 2003). Le degr d'actylation obtenu est gnralement
compris entre 30 et 50 % (Kurita, 2006).
Il est possible d'amliorer la dsactylation par une alternance de traitements alcalins et de
rinages leau distille, rpte successivement le temps suffisant pour obtenir le DA vis
(Yaghobi et Mirzadeh, 2004). La dsactylation est homogne ou htrogne (Tsigo et al.
2000 ; Lamarque et al. 2004). Le chitosan est davantage soluble par dsactylation homogne
car le DD est plus lev ( 50 %). Cependant la raction dure plusieurs jours. Tandis que
lapplication de plusieurs tapes successives de dsactylation htrogne permet datteindre
un DD quivalent en quelques heures.
Galed et al (2005) ont tudi la dsactylation, par un traitement au NaOH 50 % (w) de 3 h
110 C, de trois crustacs Paralomis granulosa, Lithodes antarcticus et Palinurus vulgaris.
Les cintiques de dsactylation ont t formalises par une quation du premier ordre et
prsentent des constantes de vitesses lentes, autour de 0,04 min-1. Au contraire, Shahidi et
Abuzaytoun (2005) rapportent que la cintique de dsactylation est rapide dans la premire
heure puis peine abaisser le DA du chitosan. Aprs 5 h de raction, le DD naugmenterait
plus alors que le poids molculaire diminuerait. La taille des particules de chitine aurait
galement un impact sur le rendement de dsactylation. Enfin, il faut souligner que la
dsactylation est sensible loxydation. Le problme peut tre contourn en ralisant la
raction sous un gaz inerte ou en abaissant la pression. Lajout de NaBH4, un agent
antioxydant, protge le polysaccharide de la rduction des groupements aldhydes en alditols
(Tolaimate et al. 2003).
Lune des techniques traditionnellement employe, la mthode de Broussignac, consiste
prparer un milieu anhydre compos de 50 % dhydroxyde de potassium (KOH), 25 %
dthanol 96 % et 25 % de mono-thylne glycol. Le mlange est chauff 90 C avant
dajouter la chitine peu peu dans le racteur. La temprature est alors leve une consigne
qui dpend des adaptations ce procd, autour de 110 C (Rhazi et al. 2000).
La dpolymrisation se traduit par hydrolyse des liaisons O-glycosidiques. Comme cela a t
prsent prcdemment, les traitements acides favorisent cette lyse (Kurita, 2006). En gnral,
l'acide hydrochloridrique concentr est employ ou l'acide nitreux (HNO2) Cependant, il
provoque la dsamination de la glucosamine (Kumirska et al. 2009) et l'excs de HCl conduit
la destruction des oses. Einbu et Varm (2007) comparent la dpolymrisation selon
diffrentes concentrations en HCl, comprise entre 3 et 12 M, le taux maximal est atteint avec
6 M. L'nergie dactivation des liaisons O-glycosidique et N-glycosidique semblent similaires.
Le pH aurait galement un impact important sur la dpolymrisation tandis que la prsence
doxygne naurait pas deffet (Shahidi et Abuzaytoun, 2005 ; Holmes et al. 2001). Les
oligosaccharides peuvent ensuite tre spars sur colonne par fractionnement (Jeon et al.
40
2000). D'autres mthodes existent, telles que la sonication (Kasaai, 2008) ou les radiations
gamma (Min et al. 2004). Leur intrt varie selon le type matire premire.
41
appliqu. Aprs 3 h de raction, la dprotinisation atteint 88,8 %. Elle est suivie d'une
dminralisation chimique de 6 h Tamb. Le DA est alors de 89,5 %.
La fermentation par bactries lactiques est largement traite dans la littrature (Zakaria et al.
1998 ; Khanafari et al. 2008). Rao et Stevens (2005) testent le potentiel de Lactobacillus
planturum 541 des coproduits de crevettes. La fermentation dure 24 h et linoculum est fix
5% en w/w. Les expriences comparent la fermentation avec ou sans acide actique ajout
lautolyse. Les meilleurs rsultats sont obtenus lorsque la fermentation est soutenue par
lappoint dacide actique ajust pH 6. La dprotinisation et la dminralisation atteignent
66 % et 63 % respectivement partir des cuticules de crevettes, tandis quelles atteignent
83 % et 88 % respectivement partir de ttes de crevettes. Cependant, les teneurs en protines
et minraux sont initialement plus leves dans les ttes, par consquent le rendement en
chitine est plus faible. La composition en acides amins dans la fraction liquide a t tudie
et compare des rfrences alimentaires (buf, poudre de lait et ufs). Rao et Stevens
prouvent ainsi la haute valeur nutritive de cette fraction.
Les cocktails de ferment lactique sont trs priss. Par exemple, Beaney et al. (2005) ont
slectionn Lactobacillus salvarius, Enterococus facium et Pediococcus acidilactici. La
fermentation a lieu dans un bioracteur o le pH nest pas contrl. Le pH initial est de 11, il
diminue rapidement (24 h) jusqu 6, puis la baisse se poursuit lentement jusqu 3,5 aprs 7
jours. La temprature est maintenue 30 C. lissue de la fermentation, les teneurs
rsiduelles en protines et en minraux sont de 11,9 % et 19,6 % respectivement. La
dminralisation est amliore lorsque la taille des fragments de matire premire est rduite.
Jung et al. (2007) tudient un mlange de Lactobacillus paracasei subsp. tolerans KCTC3074 et Serratia marcens FS-3. Il est appliqu des coproduits de crabes. lissue de la
fermentation, le pH atteint 3,6. La dprotinisation et la dminralisation aboutissent 68,9 %
et 94,3 % respectivement. La fermentation par la souche Pediococcus acidolactici CFR2182,
72 h, atteint 97,9 et 72,5 % en dprotinisation et dminralisation respectivement. De plus,
elle permet de rcuprer 72,4 78,5 % dastaxanthine (Bhaskar et al. 2007). Xu et al. (2008)
dans une tude approfondie, comparent les rendements de dprotinisation et dminralisation
par Lactobacillus casei MRS1 avec d'autres fermentations (Cf. Chapitre 4.I).
Depuis, Phuvasate et Su (2010) ont utilis Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarium,
Lactobacillus acidophilus, pour mener la dminralisation. Lhydrolyse dure 5 jours 30C,
elle est suivie par un lavage basique de NaOH 0,5 M 25 C pendant 4 h. Dans ces
conditions, les teneurs rsiduelles en protines et minraux sont de 4,89 % et 1,44 %. Par
comparaison, un traitement acide par HCl ou acide lactique permet une dprotinisation
suprieure, tandis que la teneur en minraux rsiduels est ngligeable. La fermentation par
Lactobacillus plantarium a t applique des coproduits des crevettes Litopenaeus sp.
pendant 6 jours pour extraire de faon concomitante la chitine et lastaxanthine. Pacheco
(2010) obtient une dminralisation de 80 % et une dprotinisation de 91 % 35 C.
La difficult liminer les protines est rcurrente (Gagne et al. 1993 ; Wang et Chio, 1998 ;
42
Zakaria et al. 1998 ; Synowiecki et Al-Khateeb, 2000 ; Healy et al. 2003). Le rle prventif de
la fermentation vis vis des contaminations microbiennes est galement soulign (Sini et al.
2007 ; Phuvasate et Su, 2010). Il repose sur la diminution du pH. Cependant, lexcs dacide
dtruit les protines les plus sensibles dans la fraction liquide (Wang et Chio, 1998).
Beaney et al. (2005) comparent lextraction chimique une extraction par fermentation
lactique. partir de ses travaux, les teneurs en protines rsiduelles sont de 2,1 % et 11,9 %
par voie chimique et enzymatique respectivement, soit 5,6 fois moindre. Llimination des
minraux est quasi-complte par la voie chimique et de 68 % par fermentation lactique. Le
degr de dminralisation semble tre amlior par la rduction des tailles. De plus, aprs
dsactylation, le poids molculaire et le degr dactylation ne prsente pas de diffrences
significatives (Beaney et al. 2005).
Ds les annes 60, des investigations se sont orientes vers les protases pour extraire la
chitine, entre pH 5 et 8 (Wang 1998). Roussina a test la dprotinisation par la papane, la
pepsine et la trypsine en 1968. Gagne et Simpson (1993) ont dtermin les conditions
optimales de dprotinisation par la chymotrypsine et la papane, autour de pH 8 40 C.
partir de coproduits de crevettes prtraits, les teneurs en protines rsiduelles sont de 1,3 %
et 2,8 % respectivement.
43
Parmi les protases tudies pour leur capacit dprotiniser les coproduits de crustacs, les
alcalases ont intress Synowiecki et Al-Khateeb (2000). Les conditions optimales dactivits
se situent autour de pH 8,5 et 55 C et le substrat (exosquelette de crevettes) est prdminralis. Aprs 4 h dhydrolyse enzymatique et des tapes de rinage/blanchiment, la
fraction chitineuse rcupre prsente des teneurs rsiduelles en protines et cendres de
4,45 % et 1,56 % respectivement.
Un argument en faveur de la dprotinisation enzymatique est galement sa capacit
prserver les peptides passs dans la fraction liquide lissue de lextraction. Synowiecki et
Al-Khateeb (2000) exploitent ce potentiel et obtiennent une fraction liquide contenant 64,3 %
de protines (en poids sec), caractrises par un PER15 de 2,99. De plus, lindice en acide
amins essentiels est de 125,4. Ces rsultats sont suprieurs la capeline (protine du capelan,
poisson dAtlantique nord, utilise comme rfrence de haute valeur nutritive), 2,64 et 99
respectivement.
De Hollanda et Neto (2006) procdent la mme dmarche en cherchant extraire des
coproduits de crevettes, la chitine, les protines, ainsi que lastaxanthine. La dprotinisation
est ralise avant la dminralisation, selon un degr dhydrolyse de 6 %. La fraction liquide
contient 77,58 % de protines et 1,79 % de lipides. Lautre fraction contient de la chitine
associe 9,19 % de protines et 2,44 % de cendres rsiduelles. Puis lexprience a t mene
en utilisant une autre protase, la pancratine. La fraction qui contient majoritairement la
chitine prsente une composition similaire. Celle de lhydrolysat montre un taux de
rcupration des protines infrieur au prcdent (39,5 % contre 49,5 % avec lalcalase). Ces
rsultats ont montr quune augmentation du degr dhydrolyse avait un effet controvers.
Le complexe enzymatique propos par Novozyme, Protamex, a t utilis pour valoriser des
coproduits de crabes (Beaulieu et al. 2009). Les conditions de protolyse sont fixes 40 C
pH 8, le ratio d'enzyme/substrat est de 1 g/1 kg et celui de la dilution est de 1 :1. Aprs
hydrolyse enzymatique, le procd dvelopp consiste tout d'abord sparer la fraction solide
de la fraction liquide par dcantation, puis centrifuger cette dernire fraction, afin d'obtenir
des phases spcifiques (Fig.I.21).
15
Protein Efficiency Ratio : indicateur bas sur le gain de poids (en g), par quantit de protines ingres (en g)
44
45
46
47
Fig.I.22: Voies enzymatiques de conversion de la chitine en drivs dsactyls et dpolymriss (Jeon et al.
2000)
Plusieurs modes opratoires sont disponibles selon la nature des produits obtenir (Fig.I.22).
La littrature dcrit la spcificit des activits de plusieurs enzymes. Ainsi il est possible de
combiner plusieurs enzymes, sous contrle des conditions environnementales, afin de tendre
vers des caractristiques de DP, DA et PA prcis. Les connaissances en gnie enzymatique
acquises depuis 2000 augmentent le potentiel dcrit par la figure I.20. Le cot de la
dsactylation et la dpolymrisation enzymatique tant suprieur celui des traitements
chimiques, elles sont rserves la production de drivs de chitine spcifiques.
Hydrolysats
protiques
21%
1% Armes
farine/huile
52%
3% Autres
(cuir, glatine,
collagne,
engrais, )
Fig.I.23 : Parts (en tonnage) des voies de valorisation de coproduits marins en France, Andrieux, 2004
48
49
Bougl (2007) tudie les activits biologiques des peptides marins, par exemple leur rle dans
la dfense immunitaire, contre les infections et dans la prvention du cancer, ainsi que des
complications cardio-vasculaires et mtaboliques lies lobsit.
De plus, certains acides amins sont responsables de notes aromatiques spcifiques aux
crustacs (Narayan et al. 2010). Par consquent, ils constituent des ingrdients intermdiaires
pour lagroalimentaire, comme complments aromatiques incorpors dans des plats prpars,
des soupes, etc. Ces composs peuvent tre valoriss partir de jus de cuisson issus des
procds de transformations des produits marins (Cros et al. 2004).
De nombreux peptides activit antimicrobienne ont t identifis chez les crevettes
(Randriamahatody, 2011). Parmi eux, on citera les crustines et les pnaeidines. Les premires
sont volumineuses, autour de 10 kDa et constitues de 84 144 acides amins (Fleury et al.
2008). Les secondes sont cationiques, de 5,5 et 6,6 kDa et formes de 50 67 acides amins.
Elles doivent leur nom leur isolation, pour la premire fois, dans P. vannamei, par un
laboratoire IFREMER (Brevet Destoumieux, 2000). De plus, leur activit antimicrobienne est
lie la prsence de chitine (Destoumieux et al. 1997, 2000a, 2000b). Les microorganismes
principalement viss sont les Gram + et en moindre mesure, les champignons.
VII.1.2. Les composs lipidiques
Les organismes marins sont capables de synthtiser des acides gras insaturs de la famille des
3 et 6, contrairement aux organismes terrestres. Cette capacit est lie la temprature de
leur milieu de vie. Les acides gras assurent llasticit des membranes basse temprature.
Ces acides gras sont galement ncessaires aux organismes terrestres qui nont dautres choix
que lapport alimentaire. ce titre, les organismes marins constituent une source intressante,
50
avec une teneur en acides gras jusqu 40 %, parmi lesquels lEPA et le DHA (Berg et
Barnathan, 2005). Ces acides gras polyinsaturs sont conseills pour rduire les risques de
maladies lies au mauvais cholestrol et aurait des effets contre les inflammations, les ulcres
et lathrosclrose (Dumay, 2006)
La figure I.25 schmatise la membrane cellulaire. Les phospholipides sont prsents dans les
membranes cellulaires de tous les organismes mais seraient en proportion suprieure dans les
ttes de poissons. Ils sont souvent nomms lcithines lorsquils sont utiliss comme
additifs en agroalimentaire. Ils ont un rle texturant grce leur pouvoir mulsifiant. De plus,
ils prsentent des activits biologiques, telle que lactivit antimicrobienne (Tamehiro et al.
2002).
Il existe dautres composs lipidiques dintrt, tels que les sphingolipides, les squalnes ou
les strols, prsents dans les produits marins. Cependant, leur proportion est ngligeable chez
les crustacs, lexception des terpnes. Une quantit importante de pigments issus de cette
famille est prsente dans lexosquelette des crustacs. Ces pigments sont responsables du
changement de couleur lorsque les crustacs sont ports haute temprature (Fig.I.26). La
conformation des molcules est modifie ainsi que sa frquence dabsorption.
Fig.I.26 : La cuisson des crustacs modifie la conformation des pigments et donc change leur couleur
51
52
FigI.27 : Cristal de calcite, support de nanocristaux de brushite (Maity et al. 2011) et ciment de phosphate de
calcium appliqu (Callos Bone)
Les calcium-orthophosphates sont indiqus comme ciment de reconstruction des tissus car ils
sont biocompatibles et donc vitent les risques de rejets par lorganisme. Ainsi, ils sont
indiqus pour les cas dathrosclrose et de dcalcification dentaire. Enfin, il faut galement
signaler quils sont dexcellents engrais (Dorozhkin, 2007). Des instituts tels que le British
Calcium Carbonates Federation au Royaume-Uni se sont ddis aux voies dapplications de
ces biomatriaux.
53
des peptides actifs dans la phase soluble dune part, et de la chitine purifie dans la phase
insoluble dautre part. Ces rsultats ont inspir deux perspectives de valorisation :
- La premire est lapplication de lhydrolyse enzymatique acide par une protase telle
que la pepsine. Le procd repose sur une seule tape cl. De plus, la pepsine est une
enzyme industrielle dj utilise en agroalimentaire (produits laitiers notamment) et sa
cintique dactivit est rapide.
- La seconde est lexploitation des composs solubles de lextraction. Habituellement
dtruits par les traitements chimiques, la voie biologique est plus douce et peut donc
prserver leur structure.
Cette tude est loccasion de confronter deux mthodes, le traitement chimique et le
traitement biologique. Les liaisons entre chitine, protines et minraux, comme cela a t
voqu prcdemment, sont fortes et font obstacle la purification de la chitine. Avec les
pigments se forment des complexes glycoprotiques, lipoprotiques ou glycolipidiques quil
est difficile de sparer (Fig.I.28). Le traitement doux par hydrolyse enzymatique, sera-t-il
suffisant pour concurrencer lextraction chimique dont les conditions svres favorisent
lobtention de chitine de haut degr de puret ? Le cas chant, lhydrolyse enzymatique
prservera-t-elle les caractristiques physico-chimiques (DA, DP, Icr) de la chitine,
contrairement lextraction chimique ? Ceci reprsentera-t-il une valeur ajoute ? Les
conditions svres de lextraction chimique dtruisent les autres composs disponibles dans
les coproduits de crustacs, telle que lastaxanthine. La protolyse acide sera-t-elle capable de
prserver lintgrit de ces composs?
Fig.I.28 : Hypothse de liaison entre chitine et protines proposes par Armenta et Guerrero-Legarreta (2009)
54
Lobjectif gnral est destimer les performances de ce nouveau procd et de les comparer au
procd classique. Pour atteindre cet objectif, la composition et les caractristiques physicochimiques des produits doivent tre dtermines. Rappelons-le, la matire premire est
initialement constitue dun rseau dense o chitines et protines sont imbriques. La
principale difficult est de quantifier distinctement ces deux polymres. Pour dterminer les
critres de qualit de la chitine, la prsence des protines constitue galement un obstacle. Ce
chapitre compare les mthodes disponibles dans la littrature et justifie les choix
mthodologiques qui ont t slectionns. Ces choix reposent sur des rsultats danalyses
biochimiques et physico-chimiques appliqus aux produits de rfrence pour notre tude : la
matire premire, les produits commerciaux et les produits dhydrolyse enzymatique modles.
Fig.II.1 : Rpartition des parts de produits et coproduits de crevettes (en pourcentage de poids humide)
57
ES %
M2M0
* 100
M1 M 0
(II.1)
ES % est la part d'extrait sec, M0 le poids de la coupelle, le poids humide est ajout, M1, et le poids sec final est
de nouveau pes, M2. La teneur en humidit correspond la part complmentaire.
Lipides %
M2 M0
M1
(II.3)
Lipides% est la teneur en lipides, M0 le poids du ballon, M1 est la prise dessai et M2 est le poids du ballon
contenant les lipides schs aprs lextraction.
La phase huileuse sche peut tre conserve dans du chloroforme pour subir des analyses
approfondies, sur la nature des acides gras qu'elle contient, en chromatographie.
58
(II.4)
Un changement de couleur vers le vert ple ou le bleu indique la fin de la raction. L'tape
dure au minimum 2 h. Elle est suivie d'une neutralisation. Aprs refroidissement, 20 ml d'eau
distille sont ajouts pour stabiliser le milieu, puis suffisamment de NaOH 10 M pour
atteindre un volume final de 80 ml. La forte alcalinit convertie l'ammonium en ammoniac
gazeux (II.5):
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
(II.5)
Le tube est plac dans une unit de distillation (Modle K-314, Bchi Labortechnick AG,
Suisse). La distillation transfert l'ammoniac gazeux vers une solution de 20 ml d'acide borique
(H3BO3, 2 %, w/w) en formant un complexe ammonium-borate (II.6):
NH3 + H3BO3 (en excs) NH4 + H2BO3
(II.6)
La dernire tape est la titration de lazote, sous sa forme complexe avec le borate, par
l'acide hydrochlorhydrique 1 M. La solution titrer contient un indicateur color qui vire au
vert lorsque le pH est l'quilibre. Le volume de HCl est alors identique celui de NH4+
(II.7) :
NH4+ + 2H2BO3- + HCl (NH4)Cl + 2H3BO3
(II.7)
%N
1.4 *V * [ HCl ]
M
(II.8)
V est le volume de HCl vers (en ml), [HCl] sa concentration (gnralement gale 1 g/l), M est la masse
dchantillon introduite dans les tubes (en g) et 14 correspond la masse atomique de lazote. La relation
intgre le facteur 0,1 qui comprend la conversion du volume de HCl en litre et la conversion en pourcentage
Enfin, la teneur en protines dans l'chantillon est dduite de la formule suivante (II.9) :
59
% P N * 6.25
(II.9)
Principe
Interfrences
Biuret
Formation d'un complexe cuivre/ liaison peptidique/ biuret
(Gornall et al. 1949) (NH2-CO-NH-CO-NH2 compos issu de la condensation de
l'ure) en milieu alcalin. Formation dun complexe violet rose,
lecture 545 nm
Glycrol, certains
peptides, saccharose
Lowry
(Lowry et al. 1951)
Forte influence de
certains peptides,
glycrol, saccharose,
EDTA, dtergents
BCA: acide
bicinchoninique
Bradford
(Bradford et al.
1976)
Tab.II.1: Caractristiques des principaux dosages colorimtriques des protines (Tyr=tyrosine, Cys=cystine et
Trp=tryptophane, His=histidine, Arg=arginine et Lys=lysine)
La protine de rfrence utilise pour ces dosages est un srum base dalbumine bovine
(BSA). La gamme talon s'tend de 12,5 300 g/ml pour nos exprimentations. Le choix de
cette protine de rfrence est li son accessibilit.
(a) Lowry: Ce dosage repose sur une double raction. Dune part, un complexe cuivreprotine est form partir des atomes dazote des liaisons peptidiques, en condition alcaline
60
(II.10.a). Ce complexe est oxyd (II.10.b). Dautre part, les ions Cu+ et certains radicaux
dacides amins rduisent le complexe acide phosphotungstique/ acide phosphomolybdique
contenu dans le ractif F-C pour Folin-Ciocalteau (II.11). Le produit obtenu dveloppe une
coloration bleue mesure 750 nm.
Cu2+ + protines [Cu2+-protines]
(II.10a)
(II.10b)
(II.10c)
Au pralable, deux ractifs sont prpars partir d'un kit Sigma. Le premier est un mlange
d'une solution 2 % de Na2CO3 (dans du NaOH 0,1 N), dune solution 1 % du CuSO4
(dans de l'eau distille) et dune solution de KNaC4H4O6, 2 % (dans de l'eau distille). Les
proportions du mlange se rpartissent respectivement entre 1:1:100 et il n'est plus stable
lorsqu'il se trouble. Le second ractif est le ractif de Folin-Ciocalteu (F-C) base dacide
phosphotungstique et de cuivre.
La prise d'essai pour chaque chantillon ou standard est de 0,5 ml, auquel on ajoute 2,5 ml du
premier mixe de ractifs. Les tubes sont agits et maintenus Tamb 10 min. On ajoute ensuite
25 ml de ractif de Folin-Ciocalteu. Les tubes sont nouveau agits. L'absorbance peut tre
lue aprs 30 min Tamb 745 nm. L'chantillon est reproduit en triplicat.
(b) BCA sur microplaques: les dosages ont t effectus sur des microplaques. Deux ractifs
sont fourmis par Sigma. Le premier correspond l'acide bicinchoninique et le second au
CuSO4, 5H2O. Au pralable, 1 ml du premier ractif est mlang 50 ml du second. La prise
d'essai pour un dosage sur microplaques est de 25 l pour 200 l du mlange des ractifs. Les
microplaques sont places 37 C pendant 30 min. Aprs refroidissement, l'absorbance est
lue 555 nm. L'chantillon est reproduit en triplicat.
Les autres mthodes n'ont pas t testes sur nos produits, de mme que le dosage du
tryptophane 280 nm. En effet, le tryptophane n'est pas un acide amin majoritaire dans la
cuticule de crustacs (Narayan et al. 2010). Chaque mthode colorimtrique est caractrise
par sa sensibilit, son seuil de dtection et ses risques dinterfrence avec d'autres espces.
Des prcautions doivent tre prises en ce sens (Peterson, 1979).
I.5.3. Dosage des acides amins par chromatographie en phase gazeuse
La composition en acides amins est analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPGFID). La premire tape consiste d'abord dgrader compltement les protines en acides
amins par hydrolyse acide. Un chantillon lyophilis d'environ 10 mg est pes dans une
ampoule dans laquelle est ajout 200 l de HCl 6 N. L'ampoule est scelle sous vide et place
24 h 110 C dans un bain sec. Puis l'chantillon hydrolys est sch sous azote et dilu
dans 2,5 ml deau milliQ. L'analyse des acides amins est ralise en utilisant la procdure
EZ:Faast (Phenomenex, Etats-Unis) qui consiste en une tape d'extraction de la phase solide,
suivie dune drivatisation et d'une extraction liquide/liquide. La phase organique qui contient
les acides amins drivs est introduite dans une aliquote et analyse par un systme CPG-
61
FID (Perkin Elmer Autosystem XL). Les acides amins sont identifis selon leur temps de
rtention et quantifis d'aprs une courbe dtalonnage et leur facteur de rponse par rapport
au standard interne (la norvaline ajoute une concentration de 200 mol/l dans chaque
chantillon).
Lchantillon est reproduit en triplicat et labsence dinterfrences par la prsence de NacGlu
a t vrifie. La technique ne permet pas de quantifier tous les acides amins. Le tryptophane
est dtruit par ltape dhydrolyse acide. Lasparagine et la glutamine sont respectivement
convertis en acide aspartique et glutamique. Larginine nest pas dtecte et la cystine lest
faiblement. Selon lquipement et leur capacit se volatiliser, le taux de recouvrement des
acides amins peut varier. Adams (1974) note un degr de recouvrement de 90 99 % par
CPG, except pour larginine dont le recouvrement nexcderait pas 78 %.
Une hydrolyse est ralise en ajoutant 50 l de ractif A 250 l de solution ou d'talon. Les
tubes sont chauffs 3 min 100 C, puis refroidis rapidement sous leau courante. 1,5 ml de
ractif B sont ajouts, puis les tubes sont agits et incubs 20 min 37 C. L'absorbance est
mesure 585 nm (ou 550 nm en microplaques) aprs refroidissement des tubes. L'exprience
est ralise en triplicat.
(b) Mthode de Belcher et al. (1954). Les ractifs prparer sont lacide hydrochloridrique 8
N (66,6 ml de HCl 12 N dans 33,4 ml de H20), lhydroxyde de sodium 4 N ( partir de 40 ml
de NaOH 10 N dans 60 ml de H20), dactylactone (avec 2 ml dactylactone + 48 ml de
carbonate de sodium 0,625 M, solution elle-mme prpare partir de 6,62 g de Na2CO3
pur dans 100 ml deau) et de ractif dEhrlich, qui consiste un mlange de 1,6 g de paradimthylaminobenzaldyde dans 30 ml de HCl 12 N.
La gamme talon est prpare partir de 2 mg/ml de N-actylglucosamines ou galactosamine,
les concentrations stalent entre 0,1 et 1 mg/ml. Il est ncessaire de procder une tape
pralable dhydrolyse, 500 l dchantillon ou de standard sont introduits dans des tubes en
verre avec 500 l dHCl 8 N, lesquels sont placs dans un bain sec 100 C une heure. Puis,
la neutralisation est obtenue par ajout de 850 l de NaOH 4 N.
Le dosage consiste prlever 250 l de produit hydrolys, les introduire dans un tube en verre
avec 250 l de ractif dactylactone et 500 l deau distille. Une fois vortxs, les tubes
sont placs en bain-marie 100 C une heure (prendre soin de recouvrir les tubes de papier
daluminium pour la lumire). La temprature du bain est ensuite abaisse 75 C tandis que
les tubes sont refroidis dans la glace. On ajoute alors 1,25 ml dthanol absolu dans les tubes,
puis ils sont voxtxs et placs 75 C. Aprs 5 min, on ajoute doucement 250 l de ractif
dEhrlich. Aprs 30 min, les tubes sont refroidis avant dy ajouter 1,25 ml dthanol absolu.
Labsorbance 520 nm est lue aprs une attente de 30 min o les tubes sont maintenus
lobscurit.
I.6.3. Dosage des rsidus glycosidiques par chromatographie en phase gazeuse
Le dosage des rsidus glycosidiques par CPG est pratiqu selon la mthode de Kamerling et
al. (1975), modifie par Montreuil et al. (1986). Lappareil utilis est un chromatographe HP5890 (Hewlett-Packard), quip dune colonne capillaire apolaire en silice fondue CPSil-5CB
(Chrompack). Les polymres subissent une mthanolyse. Les rsidus glycosidiques sont
ensuite trimthylsilyls afin de leur rendre plus volatils. Enfin, ils sont identifis par CPG
sous forme de glycosides de mthyle O-trimthylsilyss.
Ce dosage ne permet pas de distinguer les glucosamines des N-actylglucosamines, cause de
ltape de mthylsilylation.
63
Ym %
Mf
* 100
Mi
(II.11)
(II.12)
La prise d'essai de matire premire est de 5 g environ, ce qui reprsente 1,125 g de CaCO3.
Le solvant est ajout selon le ratio 1:5 (w/v). Par consquent, 25 ml d'acide phosphorique
0,9 M sont ajouts au 5 g de matire premire, dans un erlenmayer pralablement pes. Le
mlange est chauff 40 C. Gnralement, les paramtres du procd sont stabiliss autour
de 40 C, concernant la temprature, et autour de 2 pour le pH, en 7 2 min. L'enzyme est
alors introduite dans le milieu ractionnel. Ce moment correspond au dmarrage de
l'hydrolyse enzymatique (t=0). Ds lors, l'erlenmayer est plac sous agitation magntique, en
tuve (Fig.II.2). Diffrentes concentration en enzyme et diffrentes dures d'hydrolyse seront
appliques. Puis le contenu de l'erlenmayer est filtr sur toile filtrante (0,45 nm) et rinc
abondamment l'eau distille.
Fig.II.2 : Hydrolyse enzymatique d'exosquelette de crevette par la pepsine en milieu maintenu acide par H 3PO4
Le rsidu solide retenu par la toile filtrante est transfr dans une coupelle de poids connu,
laquelle est place dans une tuve 90 C pendant une nuit. Le poids est alors nouveau pes
et permet de connatre la masse de produit rcupr. Cette partie correspond la chitine et aux
ventuels protines et minraux rsiduels, qui n'ont pu tre limins. Enfin, le rendement
massique est mesur par gravimtrie.
D'autre part, la phase soluble filtre est neutralise par de la soude 10 M. Le volume ajout
pour atteindre la neutralisation est not. Lchantillon est ensuite lyophilis pour des analyses
postrieures.
65
FA
*100
FD FA
(II.13)
Le degr dactylation de la chitine correspond la fraction molaire moyenne des units de Nactyl D-glucosamine par rapport au nombre total dunits (II.13). De nombreuses mthodes
ont t dveloppes pour dterminer le DA. Kasaai (2010) compare les avantages et
inconvnients de chacune et cible les gammes de DA auxquelles elles sappliquent.
III.1.1. Rsonance magntique nuclaire du liquide 1H
La RMN aide comprendre comment les structures molculaires sont organises. Lorsque les
noyaux sont soumis un champ magntique, produit par un aimant, les interactions entre eux
provoquent des rsonnances. Elles sont lies au spin, I , qui est une grandeur intrinsque
des noyaux atomiques. Les noyaux retrouvent leur stabilit au bout dune dure appele temps
de relaxation. La RMN mesure lintensit des frquences mises pendant le temps de
relaxation. Or ces frquences sont caractristiques de lenvironnement du noyau. Les atomes
voisins causent un dplacement chimique spcifique, not (Rouessac et al. 2004).
20 mg de chitine sont solubiliss dans 1 ml de DCl (7,6 N dans D2O, Euriso-top) sous
agitation magntique temprature ambiante pendant 12 h. Lanalyse RMN 1H est ralise
300 K laide dun spectromtre Bruker ALS300 (300 MHz, rfrence TMSP 0,00 ppm). Le
DA est dtermin selon la mthode de calcul dcrite par Einbu et Varm (2008).
DA(%)
( IH 1 A I H 1 A H 1D I H 1 A ) I H 2 D
( IH 1 A I H 1 A H 1D I H 1 A )
*100
(II.14)
Un groupe datome est identifi par son , connue grce des produits de rfrence (Tab.II.2).
Type de proto ou carbone
H1 (GluNAc)
H1 (GluNH2)
H2 (GluNH2)
H2 (GluAc)
H3 (GluNH2)
H3 (GluNAc)
H3, H4, H5, H6, H6
HN-COCH3
CH3COOH (AcOH)
C1
C2
C3
C4
C5
C6
N-CH3 (C7)
N-C=O (C8)
Position (, ppm)
4,62 - 4,85
4,85 4,97
3,18 3,24
3,38 3,65
3,52 3,87
3,52 3,65
3,74 4,34
1,95 2,09
2,09 2,11
102,7 105,7
55,2 57,6
73,1 75,7
80,9 85,7
73,1 75,7
59,6 60,8
22,8 23,3
173,6 173,8
66
La figure II.3 montre le spectre de RMN 1H du chitosan. Labsence de proton mthyle entre
1,0 et 1,5 ppm serait un gage de puret (Al Sagheer et al. 2009). Lintensit des frquences est
lie la quantit dudit groupe datomes, lanalyse qualitative est donc possible. De plus, cette
technique peut tre utilise pour distinguer les allomorphes de la chitine et (Cardenas et al.
2004).
III.1.2. Rsonance magntique nuclaire du solide en 13C et 15N
Les mesures de degr dactylation par RMN du liquide 1H sont compares des mesures
effectues en RMN du solide 13C et 15N. Le temps dacquisition est plus long pour la RMN du
solide, en particulier celle du 15N. Le spectromtre utilis est un DRX AVIII 400 MHz,
accompagn dune sonde 4 mm CPMAS H/X. La temprature est de 20 C et la rotation de 9
KHz. La rfrence externe de dplacement chimique est la glycine (13CO = 176,03 ppm,
15NH = 110 ppm). En RMN du 13C, le temps de contact est de 1 ms (AQ= 44 ms, D1= 5 s,
Ns= 8 192). En RMN du 15N, il est de 2 ms (AQ= 44 ms, D1= 1 s, Ns= 31 7440 pour la
chitine commerciale et 256 000 pour le produit dhydrolyse).
III.1.3. Spectroscopie infrarouge transformation de Fourrier - FTIR
Cette technique simple mettre en uvre, est largement utilise pour tudier la composition
et la structure de la chitine, pour distinguer la forme de la forme (Duarte et al. 2002 ;
Cardenas et al. 2004) et parfois pour dterminer le degr dactylation (Einbu, 2007 ; Ng et al.
2006). Le principe de la spectroscopie infrarouge se base sur les missions de vibrations entre
deux atomes. Elles sont spcifiques chaque environnement atomique. Ces vibrations sont
identifies selon leurs frquences.
Pour la chitine pure, ces frquences ont t identifies et commentes par de nombreuses
tudes, dont lune des premires est celle de Pearson et al. (1960). Le tableau II.3 situe les
absorbances des principales bandes caractristiques de la chitine :
-1
Absorbance (cm )
3450
3360
2920, 2880, 1420,
1275, 1245
1730
1660
1560
1590
1415, 1320
1380
1255
1150-1040
850, 838
Structure
OH, groupe hydroxyle
NH, vibration tendue
CH2 (symtrique ou asymtrique)
du cycle pyranose
Groupe carbonyle
C=0 du groupe amide (I)
NH du groupe amide, vibration
replie
NH2 de groupe amine
OH et CH du cycle
CH3 du groupe amide
Groupe C-O
-C-O-C- de la liaison glycosidique
Groupe CH3COH
Il faut ajouter ce tableau la prsence systmatique du doublet 1 626 cm-1 et 1 663 cm-1,
associ la chitine et attribu aux vibrations entre les groupes C-N et C=O de lamide 1aire,
67
lis par un pont hydrogne aux groupes OH. Lapparition dun pic 1 656 cm-1 correspond
un tat amorphe, o les vibrations dtectes correspondent aux liaisons entre lamide 1aire et le
groupe C=O. Les bandes 3 474 et 3 434 cm-1 indiquent les vibrations de groupes hydroxyles.
De larges bandes entre 3 500 et 1 650 cm-1 indiquent que ces groupes sont soit libres, soit
impliqus dans des liaisons hydrognes faibles. Des bandes 1345 et 1344 cm-1 peuvent
correspondre respectivement aux vibrations de CO-NH et CH3 dformes symtriquement.
Une bande 1 557 cm-1 indiquerait la vibration entre N-H dun amide 2aire dform. Enfin,
lintensit 1159 cm-1 est modifie lorsque les chanes sont rduites par dpolymrisation.
(Ravindra al. 1998 ; Duarte et al. 2002 ; Al Sagheer et al. 2009).
La spectroscopie FTIR permettrait de dterminer le degr dactylation. Le principe repose
sur le rapport des aires entre bandes caractristiques de la N-actylglucosamine, de la
glucosamine ou de la chitine. Plusieurs formules sont proposes, selon les tudes (II.4) :
Formule
A1550/A2878
A1655/A2867
A1655/A3450
A1554/A897
A1554/A3450
(A1655 + A1630)/A3450
A1626/A2877
Source
Sannan et al. 1978
Miya et al. 1980
Moore et al. 1980 ; Domszy et al. 1985
Miya et al. 1985
Baxter et al. 1992, Roberts et al. 1992
Shigemasa et al. 1996
Duarte et al. 2002
(II.15)
68
(II.13)
La seconde se base sur le rapport entre la somme totale des aires des zones cristallines
sur la somme totale des aires.
Jaworska et al. (2003) comparent les deux mthodes et mettent en vidence leur manque de
corrlation. La fiabilit de la premire mthode semble dpendre la structure de
69
lchantillon tandis que la seconde semble plus cohrente (Osorio-Madrazo et al. 2010).
70
LATG est ralise sous azote afin dviter loxydation des produits (Gartner & al. 2010). Les
rsidus secondaires produits sous azote sont carbons tandis que loxygne produit des gaz
simples (Aggarwal et Dollimore, 1998).
III.6. Colorimtrie
Lintensit de la coloration des produits obtenus a t observe par un spectrocolorimtre
CM-2500d, de source de lumire D65, 10 C (Konica Minolta). La calibration repose sur le
blanc et le noir. Daprs les recommandations de la Commission Internationale de lEclairage
(CIE, 1976) les facteurs de rflexions L*, a* et b* sont mesurs de 400 700 nm. L* traduit la
clart de la lumire (L* = 0 pour le noir et L* =100 pour le blanc). Les valeurs a* et b*
indiquent respectivement lintensit vers le rouge et de jaunes lorsquelles sont positives et
vers le vert et le bleu lorsquelles sont ngatives (Valente et al. 2011). Le facteur WI indique
galement lintensit vers le blanc.
71
Lowry
BCA
CPG
Kjeldahl
Moyenne cart-type
36,7 0,1 %
14,8 1,1 %
30,3 4,0 %
42,9 2,9 %
Lors de la description des mthodes, les limites de chacune ont t souleves. Le dosage par
Kjeldahl est indirect. Il doit tenir compte de lestimation de la quantit de chitine et des
coefficients de conversion entre la proportion dazote associe aux protines dune part et
celle associe la chitine dautre part. Des interfrences biaisent le dosage au BCA et dans
une moindre mesure le dosage de Lowry. Enfin le dosage des acides amins par CPG sousestime la quantit de protines totale car tous ne sont pas dtects par cette mthode.
Cependant, il est possible d'estimer la proportion manquante par comparaison avec une
mthode de rfrence.
Une analyse de la composition en acides amins a t ralise par un laboratoire extrieur,
Lareal (Saint-Nolff, 56). Ces rsultats ont t compars ceux obtenus au laboratoire STBM
(Tab II.6).
La mthode employe par le laboratoire Lareal ne dtecte pas la quantit d'alanine,
contrairement celle du laboratoire STBM. Il faut galement tenir compte des incertitudes
lies aux mesures et l'htrognit de la matire premire. L'cart-type atteint jusqu
4,0 g/100 g au laboratoire STBM et 0,2 g/100 g au laboratoire Lareal. Par consquent, les
diffrences de quantits en acides amins observes entre les deux mthodes ne sont pas
significatives.
72
Acides amins
STBM
g/100g (poids sec)
Arginine
Alanine
Glycine
Valine
Leucine
Isoleucine
Thronine
Srine
Proline
Aspartique ac.
Mthionine
Glutamique ac.
Phnylalanine
Lysine
Histidine
Tyrosine
Cystine
hydroxyproline
Tryptophane
SOMME
/
3,05
2,79
2,10
2,45
1,48
1,64
1,16
2,57
3,81
0,22
5,26
2,40
0,73
0,00
0,61
0,00
/
/
30,27
Lareal
% (acides amins)
/
10,1
9,2
6,9
8,1
4,9
5,4
3,8
8,5
12,6
0,7
17,4
7,9
2,4
0,0
2,0
0,0
/
/
100
% (acides amins)
2,25
/
2,62
1,98
1,98
1,26
1,59
1,87
2,32
3,48
0,47
4,56
1,94
1,62
0,90
1,59
0,32
<0,2
0,23
31,18
7,2
/
8,4
6,4
6,4
4,0
5,1
6,9
7,4
11,2
1,5
14,6
6,2
5,2
2,9
5,1
1,0
0,6
0,7
100
Tab.II.6 : Composition en acides amins dans la matire premire comparaison entre laboratoires
Au regard de la comparaison entre ces deux analyses (Tab.II.6 et Fig.II.6), chacune est
incomplte. Le laboratoire Lareal quantifie mieux la cystine et la mthionine (les acides
amins soufrs), le tryptophane, lhistidine et l'arginine, contrairement au laboratoire STBM.
L'arginine reprsente plus de 7 % des acides amins, tandis que les autres acides amins
prcdemment cits sont moins prsents, entre 1 et 3 %. linverse, lalanine nest pas
dtecte par le laboratoire STBM, alors quelle reprsente prs de 10 %. En compltant
l'analyse de Lareal par les rsultats du laboratoire STBM pour lalanine, la somme dacides
amins atteint 34,2 g/100 g. Cette quantit est encore sous-value. Par exemple, les acides
amins soufrs ne supportent pas lhydrolyse acide, un traitement par lacide performique
serait mieux adapt selon Armenta et Gueretto-Lagarreta (2009).
Le tableau II.6 et la figure II.6 illustrent les diffrences de quantit entre chaque acide amin
dans les exosquelettes de crevettes. Lacide glutamique et la glutamine regroups, ainsi que
73
Protines
Chitine
Minraux
Lipides
Oses totaux
C/N
Gamme
Moyenne
30 50 %
40 %
24 32 %
28,2 %
19 28 %
24,7 %
/
3,6 %
/
2,7 %
4,3
Les compositions dtermines par des tudes similaires (Shahidi et al. 2003 ; Waldeck et al.
2006 ; Kurita, 2006) montrent galement une grande variabilit des proportions. Elles varient
en fonction des espces, de lge, du genre et peuvent fluctuer en fonction des saisons et des
conditions environnementales.
Lidentification de la nature des minraux et leur quantification na pas t ncessaire pour
cette tude. Ces informations sont parfois voques (Percot et al. 2003 ; Cho et al. 1998).
Lanalyse lmentaire indique que llment majoritaire est le calcium (15,3 30,5 % en
74
poids sec), le second est le magnsium (1,0 2,0 %), le reste est constitu de traces de
phosphore, sodium et potassium (Tolaimate, 2003).
Composition par catgorie de taille
Pour les besoins des expriences suivre, les cuticules de crevettes sont broyes et tries par
catgorie de taille. Linfluence de la taille des fragments sur la composition de la matire
premire a t vrifie. Deux tamis de 2,5 mm et 1 mm sparent les fragments. La figure II.7
prsente la composition des fragments. Au regard de leurs variances, les compositions des
deux catgories de taille de fragments ne sont pas significativement diffrentes. Toutefois, la
part de minraux semble plus leve parmi les gros fragments. Pour cette catgorie, la
variance est plus importante, tous composs confondus. Ceci sexplique du fait que le tamis
de 2,5 mm retient des fragments plus htrognes.
50
fragments
< 1mm
Quant en %
40
fragments
> 2.5mm
44,4
30
33,5
42,2
34,2
20
22,1
23,7
10
0
Minraux
Reste
Fig.II.7 : Principaux composs prsents dans la matire premire en fonction de la catgorie de taille (n > 3)
Ces rsultats ne remettent pas en cause la composition gnrale de la matire premire. Bien
que faibles par rapport la moyenne en minraux et en protines, les proportions de ces
chantillons respectent la gamme prsente dans le tableau II.7. Elles montrent galement
lhtrognit du substrat, notamment pour les plus gros fragments.
Cendres (%)
Protines (%)
Osamines (%)
Couleur
96,4 0,1
95,3 1,7
97,1 0,3
2,7 0,1
0,5 0,4
4,2 0,0
0,9 0,2
0,2 0,0
0,9 0,1
70,7 2,9
71,0 5,7
/
Crme
Blanc
Ivoire
Le tableau II.8 indique que la teneur en eau atteint jusqu 5 %, celle des protines est
infrieure 1 % et celle des cendres varie dun produit lautre. Le dosage des osamines,
incluant la glucosamine qui constitue la chitine, a t test pour estimer le taux de puret du
75
polymre. Les teneurs mesures se situent autour de 70 %. Ces rsultats sont suprieurs aux
rendements obtenus dans les travaux de Plassard et al. (1983) sur des ectomycorhizes16, dont
les teneurs taient comprises entre 50 et 60 %. Au contraire ces rsultats sont infrieurs aux
teneurs atteintes par Rao (1987), dont le rendement avoisine les 90 %. En effet, les tudes de
Chen (1983) expliquent que lhydrolyse acide occasionne la perte dunit de NacGlu et Glu.
Cette dgradation a t estime entre 7 et 10 %. Bien que les produits analyss prsentent une
puret de plus 95 %, les rsultats des teneurs en osamines montrent une perte de plus de 10 %.
De plus la reproductibilit de la technique sest rvle peu prcise. Par consquent, ce dosage
na pas t retenu pour estimer le taux de puret.
La figure II.8 prsente lvolution au cours du temps des quantits rsiduelles de minraux et
de protines dans la fraction insoluble.
40
minraux
35
protines
30
autres
25
20
15
10
5
0
MP
10
20
30
60
120
180
240
360
Les cintiques dlimination des minraux et des protines sont mises en vidence. Le produit
solide final, 6 h dhydrolyse, se caractrise par la prsence de 3,5 g et 0,3 g (pour 100 g de
produit) de protines et minraux rsiduels respectivement. Daprs la composition de la
matire premire en protines et en minraux, leur degr dlimination atteint respectivement
91 % et 99 %. La cintique de dminralisation semble plus rapide que la cintique de
dprotinisation (Cf. Chapitre 3). Pour estimer la quantit de chitine, deux mthodes sont
compares :
16
76
(a) daprs le bilan massique. Si la partie insoluble est compose uniquement de protines,
de minraux et de chitine. Ds lors que les quantits de protines et de minraux sont
connues, celle de la chitine peut tre dduite. Cette mthode est valable en considrant que la
quantit des autres composs (les glucolipides, glucoprotines ou lipides rsiduels) est
ngligeable. La partie autres de la figure II.8 quivaut alors la quantit de chitine dans le
produit. Cependant, le graphique montre que lhypothse nest pas valable pour les dures
courtes dhydrolyse. Lvolution de la teneur en lipides est difficile suivre en raison de leurs
faibles quantits par rapport limportance de lcart-type. Ds 10 min dhydrolyse, la teneur
en lipide dans le rsidu solide est de 1,8 % et elle atteint, jusqu 0,6 0,4 % pour le produit
de 6 h dhydrolyse. La littrature rapporte que les pigments rsiduels sont trs difficiles
sparer (Percot et al. 2003a). Concernant les rsidus glycosidiques, du fait de leur taille, ils
sont rapidement limins suite au rinage et la filtration. Ils ninterfrent donc pas dans cette
mthode. La question se pose davantage pour les glycoprotines. Au regard de la figure II.8,
la part des autres composs se stabilise partir de 60 min dhydrolyse. Avant cette dure,
la composition du rsidu solide semble tre trop riche en impurets. La mthode
sappliquerait donc aux produits au-del de 60 min dhydrolyse et serait dautant plus lgitime
mesure que la dure augmente.
(b) la purification par lavage au NaOH. Le principe de cette technique repose sur
lextraction chimique en considrant que les impurets majoritaires sont les protines. Ltape
de dprotinisation chimique est applique. Un volume 10 fois suprieur de NaOH 1,25 N est
ajout lchantillon dans un tube plac 1 h 90 C. Daprs la figure II.8, les protines sont
effectivement les impurets majoritaires. Cependant, les minraux sont prsents en moindre
mesure. Pour ces produits, la teneur en minraux est comprise entre 4,8 et 0,9 %. La perte en
minraux aprs le traitement au NaOH est de 29 1 %. La teneur rsiduelle en minraux dans
les produits nettoys est donc comprise entre 1,4 et 0,4 %. Comme la mthode prcdente,
celle-ci est donc davantage lgitime lorsque les produits contiennent peu dimpurets, c'est-dire pour les produits issus de plus longues dures dhydrolyse.
La description de ces deux mthodes met en vidence leur limite vis--vis de la composition
des produits. Pour les produits les moins hydrolyss, donc moins purs, lestimation de la
quantit de chitine est biaise. Dautres mthodes sont donc requises pour suivre lvolution
du degr de puret.
Les cuticules de crustacs sont riches en azote, issu la fois des protines, de la chitine et de
ses drivs. Lanalyse lmentaire et les mthodes de type Kjeldahl mesurent lazote total
sans distinguer lazote associ aux drivs de la chitine (Nq) de celui associ aux protines
(Np). Lazote total (Nt) peut tre exprim selon lquation II.17 :
Nt = Np + Nq
(II.17)
Les rsidus solides issus de lhydrolyse enzymatique sont composs de chitine (Q), protines
(P) et du reste (K), cest--dire des lipides (L), des matires inorganiques (I) et de leau (W).
Lcriture en teneurs relatives dans ses produits scrit (II.18) :
100 = Q + P + K
(II.18)
(o K = L +I + W)
Les facteurs de conversion entre lazote dun compos et la quantit dudit compos sont nots
Cq et Cp pour la chitine et les protines respectivement. Il est donc possible dutiliser
lexpression II.19 :
Q = Nq*Cq
(II.19)
dans II.17 :
Nt = P/ Cp + Q/ Cp
et den dduire :
Q
(NtCp K - 100) * Cq
Cp Cq
(II.20)
(NtCq K - 100) * Cp
Cq Cp
(II.21)
Ces quations sont utilises par Diaz-Rojas et al. (2006) pour dterminer les teneurs en chitine
et en protines. Une prcaution doit tre prise concernant Cq et Cp qui varient respectivement
en fonction du degr dactylation et de la nature des produits. Cq est compris entre 14,5
(produit 100 % actyl) et 12,1 (produit 100 % dsactyl). Gnralement, le facteur de
conversion des protines, Cp, est de 6,25. Cependant des tudes montrent quil ne convient
pas tous les produits, notamment aux produits marins, riches en azote (Gnaiger et Bitterlich,
2001 ; Diaz-Rojas et al. 2006). Le facteur propos pour les animaux aquatiques, les algues et
bactries est alors de 5,8. Dautres facteurs de conversion sont galement prsents, tels que
5,51 ; 3,59 ; 5,64 ; 3,24 pour les vgtaux. Pour les macroalgues, le facteur de conversion
voluerait de 3,75 5,72 (Gonzalez Lopez et al. 2010). La figure II.9 illustre la part dazote
dans la chitine et les protines, en tenant compte des variations de Cq et Cp. Pour Cp, lcart
tudi se limite de 6,25 5,8 (Diaz-Rojas et al. 2006).
78
Pour un produit compos uniquement de chitine et de protines (K = 0), les quations II.20 et
II.21 sont simplifies. Lazote total, en respectant la stchiomtrie, est rparti entre celui de la
chitine et celui des protines. Les teneurs des deux composs, peuvent alors tre dduites de
la mesure de lazote total (Fig.II.10) :
0
20
40
20
40
%P
60
80
100
60
80
100
18
16
% Nt
14
12
10
8
6
%Q
Fig.II.10 : Pourcentage de chitine (Q) et de protines (P), minimal (---) et maximal ( ) en fonction de Nt
Les proportions de chitine et de protines varient entre les droites reprsentes sur la figure
II.10, selon les variations de Cq et Cp. Ceci est valable uniquement lorsque K est nul. Pour ces
carts de Cq et Cp, lerreur associe aux proportions de chitine et de protines peut atteindre
14 %. Cette approche est utilise par Diaz-Rojas et al (2006) qui fait lhypothse de se
conformer aux Cq et Cp classiques, 14,51 et 6,25 respectivement. Dans ce cas, deux droites
uniquement demeurent sur la figure II.10, lune rciproque de lautre, dont les quations
permettent de dterminer la teneur en chitine et en protines (II.22) :
Nt = -0,091*Q + 16
et
Nt = 0,091*P + 6,89
(II.22)
La mme expression sous sa forme littrale et qui tient compte de la prsence dimpurets est
galement dveloppe (II.23) :
79
Nt = -
(Cq Cp)
1
Q (100 K)
CqCp
Cp
et
Nt =
(Cq Cp)
1
Q (100 K)
CqCp
Cq
(II.23)
La relation II.23 est applique aux produits de la cintique de rfrence (hydrolyse par 25 %
de pepsine/protines 40 C), partir des mesures de Nt fournies par lanalyse lmentaire.
La quantit de chitine ainsi obtenue est ensuite compare celles dtermines par le lavage au
NaOH et par le bilan massique (Fig.II.11).
Sur le mme principe, la relation II.23 devrait tre affine en prcisant davantage les facteurs
Cq et Cp. Par exemple, le facteur Cq peut tre confirm par la dtermination du degr
dactylation et Cp peut tre prcis par une analyse complte des acides amins. En effet, la
teneur en azote Np peut tre dtermine via le dosage par CPG, qui fournit la proportion de
chaque acide amin. Par connaissance de la composition lmentaire de chaque acide amin,
la proportion en azote protique peut tre tablie. La teneur en azote total, Nt, tant donne
par lanalyse lmentaire, il est possible den dduire, par diffrence entre Nt et Np, la quantit
en azote Nq. Enfin, on peut dduire la quantit de chitine Q (via Cq = 14,51, car le DA tend
vers 100 %). Une nouvelle quation est donc tablie et galement compare aux prcdentes
mthodes (Fig.II.11).
50
40
y = -0,03x + 35,1
y = -0,01x + 28,8
30
y = -0,01x + 28,3
20
y = -0,01x + 28,5
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
La figure II.11 montre trois droites de tendance proches, celles qui correspondent aux trois
premires mthodes dcrites, via le bilan massique, le traitement chimique et lanalyse
lmentaire (respectivement rouge, bleu et vert). Au regard de la figure II.12, la corrlation
entre les mthodes est importante car les coefficients R sont compris entre 0,77 et 0,91. De
plus, la pente des trois droites est proche de 1 (Fig.II.12).
Par ailleurs, ces trois mthodes saccordent sur une volution de la quantit de chitine qui
varie de prs de 28,5 g/100 g environ 23 g/100 g aprs 6 h dhydrolyse enzymatique
(Fig.II.11).
80
32
30
NaOH vs Bilan
y = 0,99x - 0,21
R = 0,77
NaOH vs Naa
y = 2,2x - 28,5
R = 0,74
28
NaOH vs N (AE)
N (AE) vs bilan
y = 0,96x + 0,79
R = 0,83
y = 2,21x - 29,63
R = 0,65
26
N (AE) vs Naa
y = 0,89x + 3,24
R = 0,91
24
22
20
20
22
24
26
28
30
32
81
quelle est convertie en chitosan. Donc, la gamme des rapports C/N des protines couvre celle
des drivs de la chitine. Cependant une tendance peut tre observe au fur et mesure de
lhydrolyse par la pepsine (Fig.II.13) :
6
Rapport C/N
5
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
La figure II.13 dvoile une augmentation du rapport C/N mesure que lhydrolyse progresse.
Les valeurs de la cintique atteignent 5,73 6 h et tendent vers 6. la fin de la raction, le
rapport C/N est infrieur celui de la chitine pure. Ce rapport correspond aussi bien celui
dun chitosan que dun mlange de chitine et de protines. Cependant, il est davantage
conforme aux objectifs.
IV.4.2. Recoupement par lanalyse thermogravimtrique
Lanalyse thermogravimtrique est applique aux produits dhydrolyse enzymatique comme
outil de caractrisation. Cette approche originale se base sur les diffrences de comportements
thermiques des principaux constituants des carapaces de crevettes. Lobjectif de cette partie
de ltude est de comparer lATG avec les mthodes destimation de la quantit de chitine et
du degr de puret. Laugmentation de la temprature entrane des modifications de la
structure des molcules et des pertes de masse, associes leur volatilisation. Chaque
compos est caractris par une stabilit thermique spcifique, il peut donc tre identifi. Les
principaux composs rencontrs dans nos produits sont leau, les minraux, les protines et la
chitine.
-
82
la matire premire, P180 le produit dhydrolyse de 180 min, P360 le produit dhydrolyse de
360 min et PP ce mme produit purifi par lavage au NaOH.
Les profils ATG ont t obtenus par le programme suivant : tout dabord, un palier de
stabilisation thermique de 10 min a t appliqu 125 C, puis la temprature est leve
vitesse constante de 1 C/min. Une ultime tape de stabilisation thermique est enfin applique
700 C afin dassurer llimination complte des composs organiques. La figure II.14
illustre les profils ATG des quatre produits de diffrents degrs de puret et le tableau II.10
rsume les caractristiques de leurs comportements thermiques.
er
1 pic caractristique
Plage 1 : masse perdue
Plage 1 : tendue T
Plage 2 : masse perdue
Plage 2 : tendue T
Plage 3 : masse perdue
MP (cuticule de
crevettes)
340 C
42 %
196 C
28 %
280 C
10 %
P180
(180min)
295 C
56 %
130 C
42 %
272 C
/
P360
(360min)
298 C
60 %
110 C
38,50 %
325 C
/
PP (lavage chimique
de P360)
315 C
70 %
98 C
29 %
370 C
/
Tab.II.10 : Caractristiques des comportements thermiques des produits de diffrents degrs de puret
Les plages de temprature de chaque tape sont dlimites par les flches sur la figure II.14.
Elles correspondent une vitesse de perte de masse minimale lie la fin dun processus de
dgradation. On considre le dmarrage de la perte de masse lorsque le seuil de 99 % est
dpass.
Le comportement thermique gnral des quatre profils (Fig.II.14) montre un dcalage des pics
84
de dgradation (TabII.10). La matire premire prsente trois pics 340 C, 525 C et 613 C.
On peut distinguer trois tapes. Au cours de la premire, le produit perd 42 % de sa matire,
les protines et la chitine sont dgrades en rsidus secondaires. la fin de ltape suivante,
autour de 550 C, 28 % du poids est limin. La dernire tape sachve vers 620 C,
temprature laquelle il ne reste que les minraux. Les 10 % de matire limine lors de la
dernire tape correspondent probablement aux rsidus secondaires des protines. Cette ATG
est similaire celle dcrite par Gartner et al. (2010), applique la mme matire premire.
P180 et P360 prsentent des pics 295 C et 298 C respectivement. la premire tape,
P180 perd 56 % de masse entre 200 et 330 C, tandis que P360 en perd 60 % entre 207 et
317 C. Le pic de dgradation thermique du produit PP se situe 315 C et 70 % du poids est
limin entre 232 et 330 C.
Les quatre profils ATG sont confronts aux rsultats pralablement acquis par lanalyse de la
composition des produits. Le tableau II.11 dcrit ces compositions. Le degr de puret
augmente de 30 % dans la cuticule de crevette (moyenne estime partir de 4 chantillons)
plus de 99 % dans le produit PP.
MP (cuticule
P180
P360
PP (lavage chimique de
crevettes)
(180 min)
(360 min)
P360)
Rsidus ATG (%)
19,6
1,7
1,3
1,0
Minraux (%)
19-28
1,5
0,7
0,2
Protines (%)*
30-50
16,5
10,3
0,3
D de puret (%)**
~ 30
82
93
99
Tab.II.11 : Composition des produits de diffrents degrs de puret (estimation par *CPG, **lavage au NaOH)
Un dcalage du dmarrage de la premire tape est observ. Elle commence ds 146 C pour
MP, 200 C et 207 C pour P180 et P360 respectivement. La perte de matire du produit PP
ne commence qu partir de 232 C. On note que la temprature initiale de perte de masse est
dautant plus retarde que le produit est pauvre en protines. Ce qui confirme les observations
dtudes antrieures (Alonso et Vega, 1990). Le tableau II.10 montre galement que la plage
de temprature de la premire tape est dautant plus courte que lchantillon est pauvre en
protines, tandis que la quantit de matire limine lors de cette tape augmente. La figure
II.15 reprsente les mesures des quantits de masse perdues la premire tape en fonction
des quantits de protines dans lchantillon.
85
80
y = -0,5927x + 67,157
R2 = 0,9321
70
60
50
40
30
20
1st set
10
0
0
10
15
20
25
30
35
40
Un autre produit a t ajout, il sagit de P30 (34 % de protines aprs 30 min dhydrolyse).
Une rgression linaire dcrit convenablement, sur le domaine observ, le lien entre la
quantit de masse perdue lors de la premire tape et la quantit de protines dans
lchantillon. Compte tenu des incertitudes de mesures lies lhtrognit des produits, le
R observ, de 0,93, est satisfaisant. La premire tape est donc fortement lie la
dcomposition dune partie des protines en drivs carbons secondaires.
Un lien est tabli entre la plage de temprature de la premire tape de dcomposition, la
quantit de protines et lestimation du taux de puret par lavage au NaOH (Fig.II.16).
100
200
Protines (%)
80
160
Plage de
tempratures
60
120
40
80
20
40
y = -0,70x + 74,28
R = 0,94
y = -1,40x + 241,62
R = 0,98
Protines
0
0
20
40
60
80
100
Dune part, lestimation du degr de puret, via le traitement chimique des produits, repose
prcisment sur llimination des protines. On retrouve donc une corrlation linaire leve
entre le degr de puret et la quantit de protines rsiduelles. Dautre part, une bonne
86
corrlation linaire est galement observe entre le degr de puret et ltendue de la plage de
dcomposition thermique de la premire tape. La prsence de protines rsiduelles allonge
cette tape de dcomposition thermique.
LATG ne permet pas la quantification directe des protines et de la chitine. Un modle
pourrait tre envisag pour dterminer la quantit de protines partir de ltendue de la
premire plage de dgradation thermique. Cependant il devra alors tenir compte dautres
paramtres, tels que le DA et DP, qui modifient certainement les comportements thermiques
des polymres. En revanche, lATG se rvle tre un bon outil pour comparer la prsence ou
non de protines entre deux chantillons de chitine.
IV.4.3. Recoupement par RMN et FT-IR
(a) Rsonance magntique nuclaire
Des mesures de RMN en 13C sont effectues lINRA de Nantes (plateforme BIBS), la fois
sur la chitine commerciale, considre comme pure (< 1 %), et la matire premire. Le degr
dimpurets a t tudi selon deux mthodes. La premire a consist superposer les
spectres de RMN (Fig.II.17) et dterminer le facteur de conversion entre les deux spectres
(en tenant compte de la diffrence de masse des prises dessais). La seconde repose sur le
rapport entre les intgrations des signaux du carbone CO, 173,7 ppm, de la chitine
commerciale et du produit dhydrolyse.
CO
Fig.II.17 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la matire
premire, en rouge
87
Fig.II.18 : Spectres de spectroscopie FT-IR de la chitine commerciale Sigma (en bleu), extraite par voie
chimique (en rouge) et enzymatique (en vert) au laboratoire.
Au regard de la figure II.18, il semblerait que la chitine extraite par voie enzymatique soit
plus pure que celle obtenue par voie chimique tant les similarits sont importantes avec la
rfrence commerciale. Cependant, les rsultats de lanalyse de leur composition dmontrent
le contraire puisque le produit extrait contient moins de 1 % de protines et de minraux
tandis que celui extrait par voie enzymatique natteignait pas ce niveau de puret ( peine
60 % de degr de puret estim partir du nettoyage chimique). La prsence de protines
dans lchantillon provoque une augmentation dintensit dabsorbance des pics communs
la chitine, notamment entre 2 800 et 3 500 cm-1.
88
Le rapport des aires par rapport au profil de la chitine commerciale, indiquerait le degr de
puret en chitine. Daprs cette mthode, la chitine extraite par voie chimique serait pure
87,3 % et celle extraite par voie enzymatique 94,7 %. Ces rsultats ne concordent pas avec
lanalyse de la composition, ni avec les rsultats obtenus via la RMN 1H.
Linconvnient majeur de la spectroscopie FTIR apparat lorsque des protines rsiduelles
sont prsentes dans lchantillon. Elles prsentent des groupes en communs avec la chitine.
Falini et al. (2003) mettent en vidence les bandes spcifiques aux protines et la chitine qui
se chevauchent. Par ailleurs, dans son tude, Furuhashi et al. (2009) ont compar les spectres
de protines pures (la BSA), un mannane et un glucane pur comme polysaccharides. Enfin,
ces standards sont compars la chitine dexosquelette de crabe. Ils montrent que les bandes
caractristiques de la chitine concident la fois avec celles des oses et des protines. Paulino
et al. (2006) montrent que certains rendements dapparence levs, taient dus la prsence
dimpurets rsiduelles, visibles par FT-IR. Les protines provoquent donc des interfrences
et biaisent lestimation du degr de puret en chitine.
(II.24)
En 15N, les spectres ne prsentent quun seul signal, directement li au degr dactylation.
89
Fig.II.19 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la matire
premire, en rouge
Le degr dactylation obtenu est de 65,0 5,3 %. Par cette mthode, le temps dacquisition a
t trs long et le rapport signal/bruit lev. Le DA observ est faible, ceci tend confirmer
quen prsence dimpurets protiques, les RMN du solide 13C et 15N sont perturbes. En
effet, les protines modifieraient les intgrales des signaux (Kasaai, 2010).
La RMN 1H est galement applique la chitine commerciale selon la technique dcrite la
section III.1.1. Le spectre rsultant de cette analyse est illustr par la figure II.20.
Actone
90
Le degr dactylation observ est de 95,5 1,0 %, ce qui correspond lensemble des
donnes de la littrature. La mesure est valable uniquement lorsque la production dacide
actique/actone, issu de la dsactylation de la chitine, est ngligeable. Daprs la figure
II.20, la flche noire montre la faible proportion dactone.
(b) Spectroscopie FT-IR
La spectroscopie FT-IR est galement utilise pour dterminer le degr dactylation. Elle a
donc t applique au produit de 6 h dhydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine, 40 C
(Fig.II.21).
Fig.II.21 : Spectre FT-IR sur le rsidu solide de 6 h lhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C, (analyse mene
par le laboratoire BMM)
91
92
Fournisseurs
Sigma
Mahtani
DA (%)
DP
C/N
ICr (%)
95,5 1
/
7,0 0,1
/
5
5
95,5 1
5,7*10 0,5*10
7,3 0,1
53.9
Tab.II.12 : Comparaison des DA, DP, C/N et ICr entre chitine commerciale
Le degr de polymrisation de la chitine fournie par Mahtani est plus faible que celui
gnralement exprim dans la littrature (Pacheco, 2010 ; Ito et al 2000). Cependant, il faut
souligner limportance de lincertitude de mesure, de lordre de 0,5*105 g/mol. Le degr
dactylation est conforme aux donnes que la littrature communique (Cf. Chapitre 1, V.2).
Visuellement, laspect gnral du produit constitue galement un critre dapprciation. Le
produit obtenu par hydrolyse enzymatique est plus ros que celui obtenu par voie chimique
(Fig.II.23) :
Fig.II.23 : Comparaison visuelle entre le produit dextraction chimique (a) et le produit dhydrolyse
enzymatique(b)
La diffrence de couleur est clairement visualise sur la figure II.23 et laisse deviner la forte
prsence dimpurets dans le produit dhydrolyse enzymatique (5 % de pepsine, 6 h de
protolyse et 42 C, partir fragments > 2,5 mm). Nous avons observ que la couleur des
produits de lhydrolyse enzymatique sestompait avec le temps, probablement du fait de la
dgradation des carotno-protines. Au contraire, le produit dextraction chimique prsente un
bel aspect blanc, de texture plastique, convenable pour sa commercialisation.
93
I. Introduction
Comme cela a t dcrit prcdemment, le principe du procd dextraction de la chitine,
dvelopp dans cette tude, consiste procder la dprotinisation et la dminralisation
simultanment. Cette fusion est permise grce une protase dont lactivit protolytique est
optimale pH acide. Ainsi, lacidit du milieu ractionnel favorise la fois la
dminralisation et la dprotinisation. Le chapitre 3 traite des rsultats concernant leffet du
milieu acide seul, puis les cintiques dhydrolyse enzymatique applique aux coproduits de
crevettes. Les facteurs qui influencent les cintiques de dprotinisation et de
dminralisation sont analyss. Cette tude conduit une optimisation des conditions
dextraction, via un plan dexprience, et la modlisation des cintiques.
obtenus. Le premier point 7 min marque le moment o lenzyme sera introduite lors des
prochaines hydrolyses enzymatiques (t0).
La figure III.1 illustre les compositions des produits traits lacide phosphorique. Elle rvle
que la quantit de minraux diminue rapidement tandis que celle des protines ne varie pas
compte tenu de lcart type des mesures.
100
poids final
minraux
protines
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
350
98
< 1 mm
64 %
45 %
29
10 %
6
1 2,5 mm
71 %
49 %
35
14 %
10
> 2,5 mm
78 %
54 %
38
18 %
14
99
Fig.III.3 : Mcanisme propos pour la protolyse par les aspartate-protases (Reginald et al. 1974)
La premire tape (a) consiste en deux transferts de protons, ce qui facilite (b) lattaque
nuclophile du carbone du carbonyle de la liaison peptidique par leau. Puis (c) un rsidu
aspartate accepte un proton de lun des deux groupes hydroxyle de lamide dshydrat de la
liaison peptidique. Lamine libre de la liaison est comble par un proton donn par un autre
rsidu aspartate (d).
III.1.1. Activit protolytique
La pepsine lyse prfrentiellement les extrmits N-terminales des acides amins polaires
aromatiques, qui sont la phnylalanine, le tryptophane et la tyrosine.
Gnralement les conditions de protolyse par la pepsine se situent entre pH 1,8 et 4,4 et entre
37 C et 50 C (Fig.III.4) :
17
18
100
Nanmoins cette gamme est nuancer car les conditions optimales de protolyse sont
spcifiques un couple enzyme-substrat donn. Lactivit protolytique est mesure via
labsorbance 280 nm de la phase soluble, cette mesure est lie la quantit de tryptophanes
librs. Lunit dactivit protolytique est fonction du temps et de la quantit de protines
prsentes initialement (Fig.III.4).
La pepsine porcine est inactive lorsque le pH dpasse 6. Les constantes kcat (constante de
catalyse dans la relation Vmax = kcat[E]t) et kM (constante de Michalis, quivalent la
consommation en substrat lorsque Vmax = 1/2) caractrisent les ractions enzymatiques
(Fig.III.5). Le rapport optimal kcat/kM, utilis comme indicateur, se situe autour de 3,5 (Lin et
al. 1992), cependant il dpend galement du couple enzyme-substrat. Pour lhmoglobine, le
pH optimal de la protolyse est 2.
Outre la pepsine porcine, celles extraites destomac de poissons, principalement du thon, ont
t tudies. Par exemple (Nalinanon et al. 2010), cette pepsine a t utilise pour purifier des
composs protiques de haute valeur ajoute, telles que des molcules aromatiques. Ses
conditions dactivit optimales sont proches de celles de la pepsine porcine, bien que de
temprature lgrement plus faible. La cause provient du fait que les poissons sont adapts
pour des environnements plus froids. Le rapport kcat/kM de la pepsine de thon, de lordre de
0,6, est infrieur celui de la pepsine porcine.
La pepsine est dj employe industriellement en agroalimentaire. Elle est utilise dans la
fabrication de boissons et en fromagerie. Son activit protolytique est galement exploite
pour liminer des impurets protiques. Furuhashi et al. (2009) lemploient pour traiter au
pralable des carapaces de mollusques, avant dtre analyses en spectroscopie IR et
CP/MAS. Le cas chant, ces impurets protiques interfrent et biaisent lanalyse. La
digestibilit de la pepsine vis--vis de lazote a t estime 78,9 % par Rehbein et al. (1981)
sur du krill.
101
Fig.III.6 : Comparaison sur la chitosanolyse selon 3 protases diffrentes, effet de la concentration en enzyme
(A), du pH (B), de la temprature (C) et de la concentration en substrat (D), Kumar et Tharanathan 2004
Lactivit chitinolytique est mesure pour 1 % denzyme par rapport la quantit de chitosan,
lui-mme dissous dans de lacide actique 1 %. La raction est stoppe par du NaOH 2N,
jusqu neutralit, puis le mlange est centrifug. Le culot est lav et dialys. Enfin les
groupes extrmits rductrices sont quantifis pas HPLC. Lunit est exprime en
moles/min /mg de protines initiales. La chitosanolyse optimale a t obtenue avec un pH de
5,0 et une temprature proche de 44 C (Fig.III.6). Avec 4,98 units, la pepsine de porc
prsente lactivit chitinolytique la plus leve, par rapport la papane et la pronase (protase
extraite de Streptocymes griseus). Cependant, elle reste infrieure celle dune chitosanase
standard, dont lactivit se situe autour de 50,0 units (Kumar et Tharanathan, 2004).
La chitine, protge par son groupement actyle, est suppose tre moins sensible
lhydrolyse des liaisons glycosidique par rapport au chitosan. Ce risque devra tre vrifi par
la suite.
Le plan dexprience est un outil indiqu lorsque plusieurs facteurs sont susceptibles
103
dinfluencer un procd. Son intrt est destimer leurs effets, leurs poids et leurs interactions,
par un nombre minimal dexpriences. Il existe une vaste gamme de plans dexpriences
disponibles, qui sadaptent selon les phnomnes tudis. Pour cette tude le choix sest port
sur un modle simple, un plan factoriel complet deux niveaux, dcrit par la formule 2k. La
premire tape consiste tablir les bornes du domaine dtude qui sont les valeurs minimales
et maximales des facteurs tudier. Les extrmits du plan sont notes (-1) et (+1). Les
bornes du domaine peuvent tre reprsentes par les points rouges de la figure III.7.
Les variables tudies sont la temprature, la concentration en pepsine par rapport la
quantit de protines dans la matire premire et la taille des fragments dexosquelette de
crevette P. vannamei. Leffet de la dure dhydrolyse enzymatique est galement suivi. Les
bornes du plan dexprience sont dcrites par le tableau III.2 :
Dure
6h
Temprature
[pepsine]/[protines]
Taille des fragments
-1
0
+1
-1
0
+1
-1
0
+1
37 C
40 C
43 C
5%
10 %
15 %
<1 mm
>2,5 mm
Tab.III.2 : Conditions du plan dexprience : bornes des paramtres tudis
Ce plan dexprience mise en uvre est un plan factoriel complet deux niveaux (23) dont
chaque exprience correspond 10 dures dhydrolyse diffrentes et indpendantes. Les
dures sont comprises entre 10 et 360 min. Le plan est complt par trois expriences aux
conditions moyennes, dites des points centraux et notes (0, 0, 0). Ces trois expriences
permettent destimer la variabilit associe aux exprimentations. Le nombre dexpriences
du plan est dfini par la formule (23 + 3)*10, soit 110 expriences indpendantes.
Les bornes minimales et maximales du plan, notes (-1) et (+1) ont t tablies grce a des
expriences pralables et la littrature. La temprature minimale est fixe 37 0,5 C et la
temprature maximale 43 0,5 C. Dans ce rapport, nous avons fait le choix dexprimer la
concentration en enzyme par rapport la quantit de protines dans la matire premire. Ceci
facilite la transposition du procd dautre type de matire premire. Pour les bornes (-1) et
(+1) du plan dexprience, la concentration est fixe 5 % et 15 % respectivement. La
matire premire broye et trie sur des tamis constitue trois catgories de taille de fragments,
infrieure 1 mm, suprieure 2,5 mm et entre ces deux limites. Ces fractions constituent
respectivement les bornes (-1) et (+1) et le point central (0). La rpartition des expriences est
dcrite par le tableau III.3.
Les rsultats des expriences, dites rponses , servent ensuite tablir un modle sur une
base polynomiale dordre 1 (III.1) :
N
N 1 N
n 1 : Y 0t iXi
i 1
XX
ij i
(III.1)
i 1 j i 1
Une fois le modle de prdiction tablit, il est confront aux mesures observes grce la
mthode des moindres carrs.
Ce plan dexprience est conu pour tudier les caractristiques de la cintique de protolyse
104
acide, en fonction des paramtres qui linfluencent. Lexploitation plus approfondie de ces
cintiques sera aborde la section V.
Facteurs
Temprature
[Pepsine]
Taille
+1
-1
+1
II
+1
+1
+1
III
-1
-1
-1
IV
-1
+1
-1
VI
+1
-1
-1
VII
+1
+1
-1
VIII
-1
-1
+1
IX
-1
+1
+1
XI
0
0
0
Tab.III.3 : Description des conditions du plan dexprience
Les rponses du plan correspondent aux analyses de caractrisation dcrites au Chapitre 2.II,
appliques aux produits issus de chaque exprience (Fig.III.8). Le poids final est mesur et
rapport au poids initial de matire premire. Il traduit donc le rendement massique de
lextraction. Les principales impurets lies la chitine sont les protines et les minraux.
Leur quantit est mesure via le dosage des acides amins et par incinration respectivement.
De plus, elle est rapporte la quantit initialement prsente dans la matire premire, afin
den dduire leur degr dlimination (degr de dminralisation et de dprotinisation). La
mesure des lipides rsiduels a t nglige. Elle est rapidement confondue avec lincertitude
lie la mthode. Enfin, le degr de puret est estim par deux mthodes, le nettoyage des
produits par traitement au NaOH 1,25 N et par le bilan massique. Le rapport C/N est
galement analys et observ. Il constitue un indicateur complmentaire pour confirmer les
deux prcdentes mthodes.
Rendement en poids
Quantit de
minraux
rsiduels
Produit
d'hydrolyse
enzymatique
acide
Estimation
du degr
de puret
- purification
chimique
- bilan massique
- analyse
lmentaire
Quantit de protines
rsiduelles (aa)
Fig.III.8 : Rponses du plan dexprience : analyses de caractrisation des produits dhydrolyse tudies
105
Temprature
[pepsine]
Sans contour
Contour
Taille fragments
Bleu
Jaune
Vert
Tab.III.4 : Lgende des rsultats du plan dexprience
106
4,4 et 34,5 2,6 g/100 g pour les tailles (+1) et (-1) respectivement. Seul leffet de la taille est
clairement visible sur la figure III.9.
107
Une dmarche analogue est applique pour tudier la dprotinisation (Figure III.11). La
courbe rouge illustre la moyenne des pertes en protines loccasion de lacidification seule,
pour des tailles intermdiaires. Aucune limination significative de protines na t constate
partir de t0 (Fig.III.1). Lintroduction de la pepsine est donc ncessaire pour initier la
dprotinisation. La distinction entre les points bleus (grande taille) et jaunes (petite taille) est
nouveau trs visible. En moyenne la dprotinisation atteint 63,6 5,7 % et 86,4 3,8 %
pour les tailles (+1) et (-1) respectivement, aprs 6 h dhydrolyse. Leffet de la taille semble
donc dominer le contrle de la dprotinisation.
Enfin, lanalyse lmentaire est exploite. Elle fournie plusieurs informations, dune part le
pourcentage de carbone, celle de lazote et donc le rapport entre les deux. Les teneurs en azote
et les rapports de C/N permettent de dgager certaines tendances. La figure III.12 illustre
lvolution du rapport C/N. La moyenne observe pour les points centraux, 6 h dhydrolyse,
est de 5,1 0,3. Celui de la matire premire est de 4,3 0,2. Les rapports C/N des points
bleus, voquant la grande taille de fragments, ne semblent pas varier significativement. Leur
moyenne se situe 4,3 0,4. Elle est proche de celle de la matire premire. Tandis que les
points jaunes, associs la petite taille de fragments, prsentent une augmentation relative du
rapport C/N. Leur moyenne est de 5,63 0,26 et il atteint jusqu 5,89 avec lexprience VII.
La part de lazote est un indicateur important. Le chapitre 2.V.4.1, voque que la gamme
thorique de teneurs en azote associs aux protines couvre celle de la chitine. Sur la base de
leur composition lmentaire, le pourcentage de N des acides amins est compris entre 7,73 et
32,16 %. Il se situe entre 6,89 et 8,26 % pour les drivs de la chitine. Ceci ce traduit par un
rapport C/N de 1,29 7,72 pour les protines et de 5,33 6,86 pour le chitosan et la chitine
respectivement. Le rapport C/N mdian des protines est de 4,5. Or les mesures effectues sur
la matire premire se situent autour de 4,3 0,2.
Le rapport C/N du produit solide de lhydrolyse enzymatique doit donc thoriquement crotre
et tendre vers 6,86. Les rapports C/N des rsidus solides du plan dexprience augmentent
progressivement jusqu un maximum de 5,89. Ceci montre une tendance vers la purification
108
Lestimation du degr de puret des produits, via le lavage chimique au NaOH, est prsent
en figure III.14.
Fig.III.14 : Estimation du degr de puret de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience
109
La lgende est identique aux prcdents graphiques. Une nette distinction entre les points
jaunes et les points bleus est nouveau constate. Lestimation du degr de puret en chitine
est faible lorsque la taille des fragments est grande, la moyenne 6 h dhydrolyse est de 57,6
6,5%. linverse quand la taille des fragments est plus petite, lestimation du degr de
puret est plus leve, avec 74,5 6,3 % de moyenne, aprs 6 h dhydrolyse. Lcart type
observ est important.
La quantit de chitine est galement dtermine partir du lavage chimique, elle est donc
associe aux mmes cart-types. La figure III.15 montre une variation de 20 30 g/100 g de
chitine. Cette amplitude semble dissocie des conditions dexpriences. En effet, la moyenne
des hydrolyses de 6 h, pour les plus petits et les plus grands fragments, atteint respectivement
25,4 1,8 et 22,5 0,9 g/100 g. Lcart est trs peu significatif. Par ailleurs, les cintiques
prsentent des estimations de quantits de chitine relativement constantes. Ceci semble
indiquer que le procd ninduise pas ou peu de pertes de chitine.
Fig.III.15 : Estimation de la quantit absolue de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience
Pour conclure sur les rsultats bruts de ces expriences, intressons-nous aux caractristiques
des produits obtenus aprs 360 min dhydrolyse enzymatique (Fig.III.16a et b).
100
90
100
80
70
60
50
90
80
70
60
50
I
II
III
IV
VI
VII
VIII
IX
II
III
IV
VI
VII
VIII
Fig.III.16 : Degrs dlimination (%) des minraux (a) et des protines (b) en fonction de lexprience
110
IX
Sur la figure III.16, lexprience M correspond la moyenne des trois produits des cintiques
intermdiaires (0, 0, 0). Lcart-type associ ces cintiques est report chaque exprience.
Il est estim 1,8 et 3,3 % pour le degr de dminralisation et de dprotinisation. Les
expriences illustres en jaune, pour les petites tailles, se distinguent par leurs meilleurs
degrs dlimination. Parmi ces expriences, la IV (-1, +1, -1) et la VII (+1, +1, -1) prsentent
les meilleurs rsultats, respectivement 99,5 et 98,5 % pour la dminralisation, 86,3 et 92,4 %
pour la dprotinisation. Elles ont en commun lemploi dune forte concentration en pepsine,
applique aux petites tailles des fragments.
Le degr de dminralisation est satisfaisant compar au rendement obtenus par dautres
procds extraction biologique (Cf. chapitre 4, section I ; Xu et al. 2008) et au regard des
objectifs qualitatifs industriels. linverse, la teneur en protines rsiduelles est encore
leve, bien que ces degrs de dprotinisation se situent dans la mme gamme des rsultats
des tudes similaires (Cf. chapitre 4, section I ; Xu et al. 2008).
100
Rapport C/N
80
60
40
20
0
EXP I
EXP II
EXP III
EXP IV
EXP 0
EXP VI
EXP I
EXP II
EXP III
EXP IV
EXP 0
Fig.III.1 : Estimation du degr de puret (a) et rapport C/N (b) en fonction de lexprience
La figure III.17 montre lestimation du degr de puret par le lavage au NaOH (a) et le
rapport C/N (b) des produits aprs 6 h dhydrolyse par la pepsine. La lgende est identique
la prcdente figure. Les expriences IV et VII prsentent des estimations de degr de puret
et de rapport C/N plus levs. Ces expriences ont galement en commun la concentration en
pepsine la plus leve, applique aux plus petits fragments. En plus de leffet taille, dj
signal, la concentration en pepsine semble donc amliorer les performances de lhydrolyse
enzymatique.
111
-4
D dminralisation (%) = 53,4 + 0,2*Tps + 0,6*T 10,4*Taille + 2,5*10 *Tps*Taille - 3,8*10 *Tps (III.2)
Coefficients
Ratio-F
p-value
Dure
0,2
121,01
0,0000
Temprature
0,6
5,10
0,0258
Taille
10,4
92,59
0,0000
15,45
0,0001
Dure*Taille
-2
2,5*10
-4
Dure
3,8*10
40,64
0,0000
Tab.III.5 : Statistiques appliques au degr de dminralisation
Lanalyse des p-values valide leffet de la dure dhydrolyse, de la taille des fragments et,
dans une moindre mesure, celle de la temprature dont la p-value est plus leve. De plus, il
existe un effet de linteraction entre la dure dhydrolyse et la taille des fragments, ainsi quun
effet quadratique de la dure dhydrolyse. Le coefficient le plus important est celui associ
la taille des fragments de substrat, dmontrant le poids de ce facteur. linverse, leffet de la
concentration en pepsine na pas deffet significatif sur la dminralisation.
La figure III.18 reprsente le degr de dminralisation estim par lquation III.2 en fonction
de la taille de fragments et de la dure dhydrolyse :
112
Degr de
dminralisation (%)
Facteurs
Dure
Coefficients
Ratio-F
p-value
0,2
91,64
0,0000
[pepsine]
0,5
5,85
0,0173
Taille
12,1
158,15
0,0000
(III.3)
-4
Dure
4,1*10
29,33
0,0000
Tab.III.6 : Statistiques appliques au degr de dprotinisation
Le tableau III.6 montre un incontestable effet de la taille des fragments. De mme, la dure de
lhydrolyse a un impact et montre un effet quadratique sur la dprotinisation. La temprature
na pas deffet significatif, sa p-value dpasse 0,05. La concentration en pepsine prsente un
effet moins significatif que celui des autres facteurs. Lquation III.3, prdit de meilleures
performances de dprotinisation lorsque la dure dhydrolyse et la concentration en pepsine
augmentent dune part, et la taille des fragments de substrat dcrot dautre part. Leffet
quadratique de la dure dhydrolyse est galement prsent. Le R associ lquation est de
82,1 % et le R ajust de 81,5 %. La figure III.19 du modle estim par lquation III.3, en
113
-2
Facteurs
Dure
[pepsine]
Coefficients
Ratio-F
p-value
-3
85,05
0,0002
-2
9,28
0,0029
2,0*10
1,9*10
(III.4)
Taille
0,4
182,90
0,0000
Tab.III.7 : Statistiques appliques au rapport C/N
Contrairement aux prcdentes rponses, leffet quadratique nopre pas significativement sur
le rapport C/N. Leffet de la dure dhydrolyse est confirm, bien quil soit moins marqu que
prcdemment. La temprature est sans impact (sa p-value dpasse largement 0,05), tandis
que la concentration en pepsine a un effet limit. Le facteur qui se distingue est nouveau la
taille des fragments de matire premire. Daprs lquation III.4, le rapport C/N augmente
lorsque la concentration en pepsine et la dure de lhydrolyse augmentent, et que la taille des
fragments de substrat est rduite au-del de 1 mm. Le R et le R ajust du modle atteignent
respectivement 70,3 % et 69,56 %. La rponse du modle, illustre par la figure III.20, se
distingue des prcdentes du fait de sa surface plane, associe labsence deffet quadratique
et dinteractions.
114
C/N
Fig.III.20 : Reprsentation du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des
fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C
Quant lestimation de la quantit de la chitine, aprs traitement chimique par NaOH, elle
semble correctement dcrite par la relation III.5 :
-4
(III.5)
Le R de lquation III.5 est de 68,1 % et le R ajust est de 67,0 %. Comme pour le rapport
C/N, la temprature na pas dimpact sur lhydrolyse (la p-value est suprieure 0,5) et celui
de la concentration en pepsine est faible (p-value de 0,235), comme le montre le tableau III.8.
Contrairement au rapport C/N, leffet quadratique de la dure dhydrolyse est significatif.
Facteurs
Coefficients
Ratio-F
p-value
Dure
0,2
44,21
0,0000
[pepsine]
0,4
5,27
0,0235
Taille
7,7
81,39
0,0000
-3
Dure
2,5*10
13,35
0,004
Tab.III.8 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH
Laugmentation de la masse rsiduelle aprs traitement chimique au NaOH est favorise par
laugmentation de la dure dhydrolyse, de la concentration en pepsine et par la rduction de
taille des fragments de substrat.
IV.2.4. Rcapitulatif des analyses statistiques
Le rendement massique est une combinaison des prcdentes rponses, tous les facteurs
interviennent (III.8). Cependant, limpact de la concentration en pepsine est moindre par
rapport aux autres facteurs, sa p-value est de 0,0092 et son ratio-F est de 7,02. Leffet de
linteraction entre la dure de lhydrolyse enzymatique et la taille des fragments est galement
limite, la p-value et le ratio-F sont de 0,005 et 8,19 respectivement. Le tableau III.9 dtaille
les rsultats du traitement statistique associ au modle de prdiction III.6
115
-2
-4
Rdt massique = 87,8 - 0,2*Tps - 0,6*T - 0,2*[pep] + 6,9*Taille 1,1*10 *Tps*Taille + 2,9*10 *Tps (III.6)
Facteurs
Coefficients
Ratio-F
p-value
Dure
0,2
181,94
0,0000
Temprature
0,6
14,73
0,0002
[pepsine]
0,2
7,02
0,0092
Taille
6,9
109,79
0,0000
8,19
0,0050
-2
Dure*Taille
1,1*10
-4
Dure
2,9*10
67,15
0,0000
Tab.III.9 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH
Rendement
massique (%)
Afin de vrifier la cohrence entre les rponses, le tableau III.10 rsume et compare quels
facteurs ont un effet sur chacune des rponses, et indique si cet effet est positif ou ngatif.
Rponses
Dure
Temprature
Concentration
Taille
en pepsine
fragments
D de dminralisation
D de dprotinisation
Rapport C/N
Nettoyage chimique
Rendement massique
+
Tab.III.10 : Comparaison des effets sur les diffrents aspects de lhydrolyse par la pepsine
116
qui correspond la mme quantit de chitine de 26,5 g/100 g. Les diffrentes mthodes de
quantification de la chitine convergent bien vers le mme rsultat (Cf. Fig.II.11). Bien que les
performances de dprotinisation et dminralisation soient amliores par rapport au plan
dexprience, le rapport C/N, non illustre ici, atteint 5,7. Cette valeur est lgrement
infrieure au rapport C/N de lexprience VII, soit 5,9. Ceci montre le manque de sensibilit
de lanalyse par rapport la faible amlioration de la purification de la chitine.
Comme cela avait dj t observ pour le plan dexprience, les cintiques du rendement
massique et de la dprotinisation semblent sattnuer lentement. Celle de la dminralisation
est rapide les 10 premires minutes, puis ralentit. Au-del de 30 min, la quantit de minraux
rsiduels volue peu. Les mmes constatations sont valables pour lhydrolyse suivante, par
41 % de pepsine (Fig.III.23).
118
Aprs 6 h dhydrolyse, le rendement massique est de 28,2 g/100 g. Le rsidu solide contient
0,2 et 2,9 g/100 g de minraux et protines respectivement. Le degr de puret, obtenu par
lavage au NaOH, est estim 93,2 % et le rapport C/N atteint 6,2. Ces valeurs indiquent une
meilleure purification de la chitine par rapport aux prcdentes cintiques. Les mthodes de
quantification de la chitine ne convergent pas toutes vers la mme valeur (Fig.III.24),
contrairement la cintique 25 % de pepsine (Fig.II.11), ce qui confirme les limites de
chacune. Nanmoins, elles semblent indiquer une stabilisation de la quantit de chitine autour
de 26,5 g/100 g aprs 6 h dhydrolyse enzymatique.
50
40
y = -0,034x + 36,78
y = 0,003x + 28,83
30
y = -0,002x + 27,15
20
y = -0,010x + 30,80
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Quantit en g/100g
30
6h
25
12h
20
15
10
5
0
Rdt massique
Minraux
Protines
119
La figure III.25 montre que le degr de dminralisation nest pas amlior par lallongement
de la dure dhydrolyse. La quantit de protines rsiduelle semble diminuer, toutefois
lanalyse de variance invite rester prudent sur ce point. En revanche, le rendement massique
aprs 12 h dhydrolyse est nettement amlior, avec 26,4 g/100 g, il gagne 4,3 g/100 g par
rapport lextraction de 6 h. Cette perte de masse est-elle lie une augmentation de la puret
en chitine ou une perte de chitine ? Le degr de puret en chitine est estim via le lavage au
NaOH 88,1 2,0 %, ce qui correspond une quantit de chitine de 22,9 g/100 g. Le bilan
massique indique une quantit de chitine de 24,3 0,2 g/100 g. Dans les deux cas, ces valeurs
sont significativement plus faibles que celles atteintes aprs 6 h dhydrolyse. Le rapport C/N
est de 6,33 0,04, peu diffrent du rapport C/N aprs 6 h dhydrolyse. Ceci semble aller dans
le sens dune faible augmentation de la puret en chitine mais dune perte possible de chitine.
V. Modlisation
V.1. Introduction
Les cintiques du plan dexprience et celles hors du plan dexprience (25 et 41 % de
pepsine) sont exploites pour modliser la dminralisation et la dprotinisation. Les
expriences sans enzymes sont galement utilises. Ceci reprsente au total 316 rsultats par
rponses tudies. Lensemble de ces donnes est trait laide du logiciel MATLAB 6,5.
Les simulations et estimations paramtriques sont crites par des routines spcifiques. Des
exemples de modles de rfrence, qui peuvent inspirer notre tude, vont tre dcrits
maintenant.
(a) Modle de rfrence
Le modle classique, gnralement admis pour les cintiques enzymatiques, est lquation de
Michalis-Menten (III.7) :
v max * S
(III.7)
vi
Km S
vi : vitesse initiale, vmax : vitesse maximale, S : concentration en substrat, Km : constante de Michalis-Menten
(III.8)
120
V. Modlisation
1 S
dTaille des fragments
Ke *Vr * Cs
dt
s V P
(III.9)
Ke est une constante, Vr est le volume du racteur, Cs et s sont respectivement la concentration et la densit
dD
KD( D D min)
dt
(III.10)
D reprsente le diamtre moyen des morceaux dalgues (en mm), Dmin et D0 sont les diamtres moyens finaux et
initiaux respectivement. KD est le facteur associ la cintique de dstructuration des algues.
Dans ces deux exemples, la taille est une variable en rponse la raction et non un facteur. Il
est galement possible de modliser la rduction des DP des polysaccharides. Il faut
distinguer le rapport S/V et laccs aux sites de coupures, les deux sont lis et ont
gnralement un effet sur la cintique. De plus, pour lhydrolyse des polymres, telle que la
chitine, on sait que des zones amorphes et cristallines se rpartissent dans la matire premire.
Les zones amorphes sont davantage accessibles aux enzymes et donc plus rapidement
hydrolyses. Lorsque cette zone est hydrolyse, lindice de cristallinit augmente. Puis les
enzymes hydrolysent les zones cristallines (Bansal et al. 2009). Par consquent, le temps
dadsorption entre lenzyme et son substrat (Fig.III.26) est diffrent pour ces deux tapes et
complexifie la modlisation.
Adsoption
E-S
Hydrolyse
Adsorption
Dsorption
H2O
ES
(III.11)
121
Cette quation sadapte en fonction des spcificits des ractions. Daprs Bansal et al. (2009)
les hydrolyses enzymatiques constituent un systme de ractions htrognes qui rpondent
une combinaison de cintiques. Cest gnralement le cas pour des hydrolyses enzymatiques
appliques une matire premire complexe telle que lexosquelette de crustacs. Bansal et al
(2009) rapportent que ces systmes constituent un ensemble de cintiques qui respectent un
ordre n, dont les constantes de vitesse dpendent du temps et dont la production nest pas
uniforme. La nature fractale de ces systmes augmente mesure que les obstacles laccs
aux sites de coupures apparaissent. Valjamae et al. (2003) modlisent la production de P
(III.12) :
1 h
P(t ) = P0 (1 e kt )
(III.12)
(III.13)
M M1 M 2
dM 1
km1(T , Pep, Ta) M 1
dt
et
dM 2
km 2(T , Pep, Ta) M 2
dt
(III.14)
(III.15)
Le premier modle propos, nomm MA, (Fig.III.27) tient compte de tous les facteurs
(taille des fragments, concentration, temprature), travers deux compartiments (III.16). Les
valeurs exploites ont t normalises :
(III.16)
Facteurs
Cintique rapide (M1)
Cintique lente (M2)
Taille des fragments
0,31
0,79
Temprature
0,15
0,07
Concentration en pepsine
0,13
0,01
Tab.III.11 : Impact relatif des variables sur les deux composantes du modle M A
Ce modle explique que la vitesse de disparition des minraux est suprieure au cours de la
122
V. Modlisation
premire tape M1, par rapport la seconde M2. Par exemple, pour les expriences aux
conditions intermdiaires (0,0,0), le km1 est suprieur km2, soit 16,8 et 1,2 h-1 respectivement.
De plus, le tableau III.11 montre que la taille des fragments agit sur les cintiques de faon
marque. Son impact relatif domine ceux des autres facteurs, avec 31 % et 79 % pour les
composantes M1 et M2 respectivement. linverse, limpact relatif de la concentration en
pepsine est trs faible, 13 % et 1 % respectivement.
Fig.III.27 : Confrontation entre le modle MA et les mesures observes, sse = 136 et rmse = 1,01
Sur la figure III.27, laxe des abscisses reprsente la dure dhydrolyse enzymatique. Pour
cinq cintiques (sans enzyme, lexprience VII et intermdiaire du plan dexprience, avec 25
et 41 % de pepsine), le modle MA est compar aux valeurs observes. On observe une bonne
concordance entre les deux. Elle se rvle plus leve pour lexprience VII (petite taille de
fragments, forte concentration et temprature 43 C) et lorsque la concentration en pepsine
atteint 41 %.
Ce modle peut tre perfectionn en considrant une transition plus progressive entre
la composante rapide et la composante lente de la dminralisation. Pour dcrire ce
phnomne, il est possible de retenir un modle du premier ordre (III.17) :
(III.17)
Ce modle, MB, prsente un sse et un rmse plus levs, 205 et 1,21 respectivement. La figure
III.28 montre une meilleure concordance entre le modle et les mesures rellement observes.
Pour ce modle, les cinq expriences tmoins ne semblent pas tre reprsentatives de
lensemble des donnes traites. Par ailleurs, ce modle ne fait intervenir que le facteur taille
car le prcdent modle indiquait leur faible impact.
Enfin, la structure modle MB est lie lvolution de la quantit de minraux dans le milieu.
Par consquent, la courbe associe au modle MB dcrot moins rapidement que celle du
modle MA, du fait de la rarfaction de la quantit de minraux.
123
Fig.III.28 : Confrontation entre le modle MB et les mesures observes, sse = 205, rmse = 1,21
Un autre modle, MC, est tabli en intgrant nouveau lensemble des facteurs. La
structure conserve le principe du polynme associ la quantit de minraux. En ralit il
sagit de trois polynmes, un par facteur tudi. Le dernier terme M indique galement
que la cintique de dminralisation est lie la quantit de minraux prsents (III.18) :
dM
0.05 (1 4.53M ) (1 1.65 Ta 0.89 Ta 0.19 T 1.33 T 0.02 [ pep] 0.68 [ pep]) M
dt
(III.18)
La figure III.29 compare le modle de prdiction aux valeurs mesures. Le sse et le rmse sont
meilleurs, respectivement 118 et 0,93. Cependant, les cintiques observes sont davantage
loignes du modle par rapport au prcdent modle MB, pour les cinq cintiques tmoins.
Fig.III.29 : Confrontation entre le modle C et les mesures observes, sse = 118 et rmse = 0,93
124
V. Modlisation
Lquation III.18 et le tableau III.12 montre le poids de chaque facteur. La taille initiale des
fragments est le facteur dominant, suivi de la temprature. Linfluence de la concentration est
trs faible. Tous sont directement dpendants de la quantit de minraux prsents. Lorsquelle
diminue, la cintique ralentie.
Facteurs
Pondration
Taille des fragments
2,54
Temprature
1,33
Concentration en pepsine
0,70
Tab.III.12 : Impact relatif des variables sur le modle MC
Pour conclure, le meilleur modle pour prdire la dminralisation semble tre le modle MC.
Il confirme les conclusions apportes par lanalyse statistique du plan dexprience
concernant limpact ngligeable de la concentration en pepsine et le faible impact de la
temprature. La taille initiale des fragments constitue le principal effet sur la cintique de
dminralisation.
(III.19)
La vitesse km peut tre affine par des fonctions spcifiques cette raction. Les modles
simples un seul compartiment ont prsents des sse trs levs, autour de 2 130 (Tab.III.13).
Des fonctions sigmodes ont t ajoutes. Ce type de fonction, de forme xn/(xn+an) et dordre
n, est souvent li au comportement denzymes allostriques. Ces enzymes sont sensibles
une modulation de leurs activits par des molcules appels des effecteurs. Le sse est alors
amlior, il atteint 1 585. Par la suite, les recherches se sont orientes vers un modle deux
compartiments P1 et P2 :
P P1 P2
(III.20)
125
Conception du modle
Sse
1 compartiment : f polynomiales (T, [pep] et Taille)*P
2133
1 compartiment : f polynomiales (T, Taille) et f ([pep] et P) dordre 1
2135
1 compartiment : f polynomiales (T, Taille) et f sigmodes ([pep] et P) dordre 0,5 2,7 pour P
2126 1276
2 compartiments : f linaires (T, [pep] et Taille)*P
1796
2 compartiments : f linaires (T et Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1443
2 compartiments : f polynomiales (T et Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1108
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1127
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P, sigmodes [pep] (n=1) et P (n1=2,5 et n2=1,6)
1087
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P, sigmodes [pep] (n=1) et P (n1=1,1 4,3 et n2=0)
1072
Tab.III.13 : Description dtaille des recherches de modlisation de la dprotinisation
Le tableau III.13 montre une amlioration du sse par des modles deux compartiments et par
lintroduction des fonctions sigmodes, appliques la concentration en pepsine et la
quantit de protines. Le tableau III.13 ne montre quun chantillon des modles tests
partir de nos observations, qui ont permis de prciser les constantes des fonctions sigmodes.
Le modle retenu comporte deux compartiments, chacun constitu :
- dune fonction polynomiale, associe la taille,
- dune fonction de type Monod, associe la concentration en pepsine,
- dune fonction sigmodes dordre n1=1,5 et n2=1,6, associe la quantit de protines.
Soit (III.21) :
2 .5
dP1
[Pep]
0.35 0.33 Ta 0.10 Ta
2 .5 P1 2 .5 P1
dt
[Pep] 0.45 P1 5.88
1.6
dP2
[Pep]
10.91 10.73 Ta 0.80 Ta
1.6 P1 1.6 P 2
dt
[Pep] 0.10 P1 5.88
P1(0) 20.05 , P2( 0 ) 12.24 , donc P(0) 32.29
(III.21)
La temprature sest rvle tre ngligeable pour cette modlisation. La quantit de protines
linstant t0 de lhydrolyse enzymatique est estime 32,29 g/100 g par le modle, tandis que
les mesures observes en laboratoire se situent entre 29 et 38 g/100 g. Le modle semble donc
satisfaisant. Il est illustr par la figure III.30 :
Fig.III.30 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1087 et rmse = 3,14
126
V. Modlisation
Fig.III.31 : Effets inhibiteur et activateur selon laffinit avec les effecteurs forte (a) ou faible (b)
Lexistence de sites modulateurs proximit du site actif est illustre par la figure III.32.
Lorsque leffecteur comble le site modulateur, des changements de conformation modifient
lactivit de lenzyme. Atkins (2005) dcrit la reprsentation classique de la vitesse de
raction enzymatique en fonction de la concentration en substrat comme tant une hyperbole.
En prsence deffecteurs allostriques, la cintique est reprsente par une sigmode. Bien que
certains inhibiteurs de la pepsine soient connus, telle que la globuline-11S (Rassam et Laing,
2006) et la pepstatine (Fruton, 1976), peu dtudes font part des effets allostriques. Turk
(2006) voque le rle des glycosaminoglycanes sur la rgulation de protases telle que
lhparine sur des thrombines20. Or ces composs sont galement des polysaccharides.
19
20
127
Daprs la comparaison entre nos rsultats et les modles classiques, nous sommes en
prsence deffets allostriques faibles lencontre de la protolyse. Nous ne connaissons pas
la nature des effecteurs. Lhypothse la plus vraisemblable est dtre en prsence deffecteurs
de nature protique. Leur conformation partagerait des similitudes avec les acides amins
aromatiques reconnus par la pepsine. Par consquent, le modle slectionn parmi tous les
modles tudis est celui qui favorise leffet allostrique associ la quantit de protines P,
dans les deux compartiments. En poursuivant les investigations, un nouveau modle bas sur
la prsence de lallostrie uniquement dans le premier compartiment, a prsent un meilleur
sse. Notons, lorsque la concentration en pepsine augmente de 15 % 41 %, que le degr de
dprotinisation, aprs 6 h dhydrolyse, augmente peu, de 91,3 % 92,8 %. Ceci confirmerait
lhypothse selon laquelle lajout de pepsine, au-del dun seuil, ne permette plus damliorer
la dprotinisation. Le modle scrit alors :
2 .1
dP1
[Pep]
P
1
12.96 14.9 Ta 6.54 Ta
P1
dt
[Pep] 9 P12 .1 5.882 .1
dP 2
[Pep]
20.74 19.68*Ta
P2
dt
[Pep] 2
P1(0) 21.28 , P2(0) 11.01, donc P(0) 32.29
(III.22)
Fig.III.33 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1072 et rmse = 3,08
Lquation III.22 savre conforme aux mesures observes (rmse = 3,08), notamment lorsque
la concentration en pepsine augmente (Fig.III.33). Au regard des incertitudes de mesures, la
dprotinisation est donc correctement modlise par une structure qui repose sur deux
composantes. Chacune tient compte de leffet de la taille des fragments de matire premire
daprs une structure polynomiale du 1er et du 2nd ordre, et de la concentration en pepsine,
daprs une structure de type Monod. La fonction allostrique apparat uniquement dans la
premire composante.
128
Lune est lie au prix de vente de la chitine, D, qui dpend de son degr de puret.
Cette fonction repose sur les deux modles de dminralisation et de dprotinisation
slectionns prcdemment (quations III.18 et III.22).
129
D
fD[( fdmin fdprot) frdt]
(III.23)
P
100
R
%M
M
100
R
(III.24)
C est la somme des termes associs chaque cot : elle tient compte de la dure dhydrolyse,
de la concentration en enzyme, de la granulomtrie des fragments de matire premire et le
reste des paramtres est regroup en un terme global (comprenant le prix des ractifs, de la
matire premire, des diverses consommations, etc.). D correspond deux fonctions arctangentes, associes la dminralisation et de la dprotinisation. Lensemble est multipli
par le rendement en chitine (Equation III.23). La fonction J est dcrite par le graphique
suivant:
Nous avons fait le choix doptimiser directement le paramtre taille en slectionnant les
fragments de cuticule infrieurs 1 mm. La figure III.34 illustre en rouge les conditions pour
optimiser la fonction J. Par consquent, les conditions qui concilient les deux objectifs,
requirent 6 h dextraction enzymatique par 25 % de pepsine 40 C (temprature non
illustre ici). Cette hydrolyse enzymatique servira de rfrence pour la suite de ltude.
lissue de lhydrolyse enzymatique, la phase liquide est filtre, neutralise par de la soude
pure, lyophilise et stocke. Lanalyse de la composition des produits rvle une teneur en
humidit comprise entre 2 et 7 %. Lextrait sec est essentiellement compos de minraux et
des drivs protiques. La composition est analyse partir des produits issus de lhydrolyse
de rfrence (25 % de pepsine, 40 C, fragments infrieurs 1 mm). La part de sels minraux
dcrot au cours du temps de 75 65 %. Celle des protines, estime galement par le dosage
des acides amins par CPG, crot de 7 13 % (Fig.III.35). Le reste est compos de glucides et
de lipides.
Les minraux dissous lors de la raction sont lorigine dune partie de la part minrale.
Lajout de soude pour la neutralisation de la phase soluble, constitue une seconde source de
sels minraux. Daprs les quations des ractions chimiques (III.24 a c), partir de lacide
phosphorique et du carbonate de calcium, se forme soit du bis-dihydrognophosphate de
calcium (Ca(H2PO4)2), du phosphate de calcium de formule CaHPO4 (brushite) ou Ca3(PO4) 2
(tricalcium phosphate).
CaCO3 + 2H3PO4 Ca(H2PO4)2 + CO2 + H2O
(III.25.a)
(III.25.b)
(III.25.c)
(III.26)
131
Lorsque 1 g de CaCO3 est initialement prsent dans la matire premire, la quantit despces
minrales atteint 2,6 g aprs neutralisation. Pour cette quantit de CaCO3, seulement 0,1 ml/g
de NaOH est ncessaire pour accomplir la raction III.25. La quantit de soude ajoute est
gnralement suprieure, de lordre de 0,4 0,8 ml/g. Lexcs de NaOH se trouve galement
dans la phase liquide. La quantit des minraux accumuls dans la phase soluble (produits par
lhydrolyse enzymatique, la neutralisation et lexcs de NaOH), est largement suprieure la
celle des minraux rsiduels dans la phase insoluble. La figure III.36 illustre dune part lcart
dordre de grandeur entre les deux phases et dautre part, la diffrence de comportement des
quantits de minraux au fur et mesure de lextraction.
5
minraux
rsiduels
minraux
solubiliss
0
0
50
100
150
200
250
300
350
La figure III.36 montre un facteur 40 entre la quantit de minraux dans la phase soluble et
insoluble. Elle semble stable, autour de 4,1 g. Les apports en minraux lis aux diffrentes
ractions masquent lvolution lie lhydrolyse enzymatique.
Toutefois les quantits mesures en minraux dans la phase soluble sont en accord avec les
quantits attendues. Pour une prise dessais de lordre de 5 g, soit prs de 4,3 g sec, on attend
0,9 1,1 g de CaCO3 dissoudre dans la phase soluble. Dautre part, lapport en minraux
associs lacidification du milieu et la neutralisation, est estim prs de 3,1 g, si les
conditions stchiomtriques sont respectes. Enfin, lexcs de NaOH pur (10 N) sajoute au
bilan des minraux. Il est gnralement de lordre de 0,8 1,1 g. Par consquent, la quantit
accumule de minraux dans la phase soluble devrait tre comprise entre 3,9 et 4,2 g. Les
valeurs observes corroborent celles calcules.
132
1,5
1,5
acides amins
rsiduels
acides amins
solubiliss
0,5
0,5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
La quantit de protines dans la phase soluble, estime par CPG, augmente avec la dure de
lextraction enzymatique de la chitine. Tandis que la quantit de protines dans le rsidu
insoluble suit lvolution inverse, elle dcrot avec la dure de la raction (Fig.III.37). La
somme des deux parts protiques est relativement constante et correspond approximativement
la quantit de protines prsentent dans la matire premire. Pour la quantit de prise dessai
introduite, la quantit totale de protines devrait tre autour de 1,7 g. Les rsultats observs
sont proches de cette valeur.
Minraux
Protines
Composition (%)
65,27
Lipides
60
Sucres
40
23,52
20
2,71
5,65
133
La figure III.38 montre que la part la plus importante est celle des minraux, qui atteint
65,3 %. Suit celle des acides amins avec 23,5 1,0 %. La teneur en rsidus glycosidiques
totaux atteint 5,7 0,8 %. La composition exacte de ces rsidus a t dtermine par
chromatographie et leur rpartition sera discute dans le chapitre 4 (section IV.3). La quantit
totale de rsidus glycosidiques serait trois fois suprieure dans la phase soluble aprs 6 h
dhydrolyse, par rapport la quantit prsente dans la matire premire. Dautres mesures par
dosage de Dubois, non illustres ici, indiquent que cette quantit doses est produite ds les
premires minutes de lextraction enzymatique, puis demeure stable. Enfin, la proportion de
lipides reprsente 2,7 0,3 %. Lanalyse dtaille de la part lipidique est galement
approfondie dans le chapitre 4 (section IV.4).
La somme des quantits mesures dans la phase soluble prsente un cart de prs de 2,8 %
avec le poids observ. Cette valeur est considre comme inclue dans lincertitude, ce qui
signifie que le bilan sur la phase soluble est vrifi.
Fig.III.39 : Caractristiques techniques de lAcide Stable Protase, analyses par Bio-Cat Inc
134
Le mme principe deffet tampon entre le carbonate de calcium prsent dans le substrat et
lacide est exploit pour stabiliser le pH du milieu. Lacide formique qui ragit avec le CaCO3
est un acide faible, contrairement lacide phosphorique qui tait un acide fort. Pour tablir la
quantit dacide formique ncessaire, on utilise la formule III.27 :
(III.27)
La formule III.27 sert calculer la concentration dacide formique introduire pour obtenir le
pH souhait. En effet, le pKa de la raction III.28 se situe autour de 3,8. Par consquent, nous
ne cherchons pas atteindre les conditions stchiomtriques. Un pH plus acide pour favoriser
la dminralisation est recherch.
CaCO3 + 2HCOOH Ca(HCO2)2 + CO2 + H2O
(III.28)
Le pH vis est de 2,7 et la concentration en base est assimile la quantit de CaCO3 dans
la matire premire. La mise en uvre de lextraction enzymatique est identique au protocole
antrieur. Pour la mme prise dessai de 5 g, la concentration en HCOOH est de 2,7 M (pour
rappel, elle tait de 0,9 M pour lacide phosphorique).
Leffet de lacide seul, sans incorporation denzyme, est dabord valu et compar celui de
lacide phosphorique, de 7 360 min (Fig.III.40. a, b et c).
a)
c)
25
50
H3PO4
HCOOH
20
15
10
0
0
100
200
300
b)
40
30
20
10
0
0
100
200
300
Fig.III.40 : Comparaison du rendement massique (a), de la quantit de minraux rsiduels (b) et des protines
rsiduelles (c) en fonction de lacide employ
135
La masse finale aprs traitement par lacide formique est similaire celle obtenue par le
traitement lacide phosphorique, 58,2 et 59,5 g/100 g de matire premire respectivement.
Cependant les cintiques observes sont diffrentes.
Pour lacide formique, la vitesse de perte de masse est plus rapide. 7 min dacidification, la
masse limine par le H3PO4 est de 27,6 % tandis que le HCOOH limine 38,2 % de la
matire. Cette diffrence est due llimination des minraux daprs la figure III.40.b.
7 min dacidification, les quantits rsiduelles de minraux sont de 10,2 et 1,0 g/100 g
respectivement par H3PO4 et HCOOH. Pour 360 min dhydrolyse, les valeurs observes sont
proches (0,5 et 0,6 g/100 g respectivement). Au contraire les pertes de protines, dtermines
galement par CPG, prsentent des cintiques similaires. 7 min dacidification, les produits
contiennent respectivement 28,7 g/100 g et 30,7 g/100 g. Cependant, le traitement par lacide
formique semble favoriser davantage la dprotinisation ( 20 g/100 g de protines
rsiduelles) contrairement lacide phosphorique qui semble stabiliser la quantit de
protines autour de 28 g/100 g.
Les meilleurs rsultats offerts par lacide formique sont probablement lis sa forte
concentration. En effet, elle est trois fois suprieure la concentration en acide phosphorique
(2,7 M contre 0,9 M). La composition des produits 7 min sert de point de dpart pour
ltude de la cintique dhydrolyse (t = 0).
Qt de matire en g/100g
Les rendements massiques et les compositions des produits issus de la cintique dhydrolyse
enzymatique, par 25 % dASP en milieu maintenu acide par HCOOH, sont illustrs par la
figure III.41. La raction a t applique aux fragments de matire premire < 1 mm, 45 C,
pH 2,7 :
100
Rdt massique
90
Qt minraux
80
Qt protines
70
D chitine
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Le rendement massique dcrot en deux heure de 61,8 30,7 g/100 g. Puis la perte de matire
devient extrmement lente, jusqu atteindre 27,0 g/100 g aprs 360 min dhydrolyse. La
dminralisation est extrmement rapide, ds 10 min dextraction, la quantit rsiduelle de
minraux est infrieure 1 g/100 g. La cintique de dprotinisation est plus lente et limite
136
donc celle du rendement massique. La quantit rsiduelles de protines est de 1,0 g/100 g
aprs 360 min dextraction enzymatique. Par le lavage chimique la soude, lestimation du
degr de puret montre une augmentation au fur et mesure de lextraction, pour atteindre
90,4 % 360 min. La figure III.42 compare cette composition celle obtenue par son
hydrolyse homologue, par 25 % de pepsine. Chaque exprience a t ralise en triplicat.
100
b)
Quantit en g/100g
a)
80
60
40
20
0
60
H3PO4
50
HCOOH
40
30
20
10
0
Minraux limins
Protines limines
Rdt massique
Qt chitine
Fig.III.42 : Comparaison des performences dextraction enzymatique selon lacide employ, de part les degrs
de dminralisation et de dprotinisation (a), le rendement massique et la quantit de chitine (b), n=3
La figure III.42.a montre que la dminralisation nest pas significativement diffrente par
lacide phosphorique et lacide formique, aprs 6 h dextraction enzymatique, elle atteint
respectivement 98,9 0,3 % et 98,8 0,3 %. La dprotinisation aboutit une meilleure
performance par le HCOOH avec 97,4 0,5 % des protines soutires de la phase insolubles,
contre 93,9 0,8 % par le H3PO4. On constate galement une diffrence de rendement
massique en fonction de lacide employ. Elle peut sexpliquer par la diffrence de degr de
dprotinisation et par une ventuelle perte de chitine. Selon la figure III.42.b, la quantit de
chitine dans le produit de 6 h, estime par le lavage chimique, est lgrement infrieure par
lacide formique, avec 25,2 0,2 g/100 g, contre 26,8 0,2 g/100 g par laction de lacide
phosphorique. Pour approfondir ltude de limpact de lacide formique, lextraction est
prolonge jusqu 12 heures (Tab.III.14).
Produits
Dhydrolyse
pep25%
6h
pep25%
12 h
ASP25%
6h
ASP25%
12 h
- H3PO4
- H3PO4
HCOOH
HCOOH
Rdt massique
%
(g)
Minraux
% limin
(g)
Protines
% limin
Degr de puret
Bilan
NaOH
30,7
0,4
0,3
0,3
98,9
3,3
0,8
91,7
88,0 %
87,2 %
1,5
26,4
0,5
0,4
0,3
98,5
1,0
0,1
95,0
94,5 %
88,1 %
2,0
27,9
0,7
0,3
0,1
98,8
1,0
0,5
97,4
95,2 %
90,4 %
1,2
27,3
0,9
0,2
0,0
99,3
0,9
0,1
97,7
95,2 %
91,7 %
1,9
Tab.III.14 : Comparaison des caractristiques des produits insolubles obtenus par hydrolyse enzymatique, par
la pepsine et par lASP, aprs 6 h et 12 h de raction
La diffrence de rendement massique entre laction de H3PO4 et HCOOH est rattrape lorsque
la dure de lhydrolyse est poursuivie 12 h. Le rendement massique 12 h, par le H3PO4, avec
26,4 g/100 g, demeure infrieur celui obtenu par le HCOOH, qui atteint 27,3 g/100 g.
La dminralisation nest pas amliore par laugmentation de la dure dhydrolyse de 6 h
12 h lorsque lacide phosphorique est utilis. En revanche avec lacide formique,
137
138
Plan d'exp
(15%; <1mm)
Rdt massique
37,9 1,5 %
32,9 - 33,5%
30,7 %
28,0 %
Dminralisation
97,2 1,8 %
99,5 - 98,5 %
98,9 %
99,3 %
Dprotinisation
85,5 3,3 %
86,3 - 92,4 %
91,7 %
92,8 %
68,9 2 %
76,5 - 83,9 %
87,2%
93,1 %
5,1 0,3
5,8 - 5,9
5,7
6,2
lavage au NaOH 88,1 2,0 % et le rendement massique est de 26,4 g/100 g. La puret en
chitine est donc faiblement amliore par rapport lhydrolyse de 6 h, tandis que la perte de
matire est plus importante. Les protines semblent tre davantage limines, daprs le degr
de dprotinisation qui est de lordre de 95 %.
partir de lensemble des donnes, un travail de modlisation a t entrepris pour affiner les
tendances indiques par les prcdents rsultats. La dmarche a consist construire des
modles partir de nos connaissances et les confronter aux rsultats rellement mesurs.
Le modle retenu pour la dminralisation est une addition de structures polynomiales
associe chaque facteur, multiplie par la quantit de minraux et par une fonction linaire
associe aux mmes minraux :
dM
0.05 (1 4.53M ) (1 1.65 Ta 0.89 Ta 0.19 T 1.33 T 0.02 [ pep] 0.68 [ pep]) M
dt
(III.18)
P1
dt
[Pep] 9 P12 .1 5.882 .1
dP 2
[Pep]
20.74 19.68*Ta
P2
dt
[Pep] 2
P1(0) 21.28 , P2(0) 11.01 , donc P(0) 32.29
(III.22)
partir de ces modles et en tenant compte des contraintes conomiques du procd, un outil
a t dvelopp pour dterminer ses conditions optimales. Elles consistent trouver un
quilibre entre la purification maximale de la chitine et le cot minimal de sa production.
J
D
fD[( fdmin fdprot) frdt]
(III.23)
Les conditions retenues pour la suite de cette tude correspondent donc lhydrolyse conduite
par 25 % de pepsine 40C partir de taille de fragment infrieurs 1 mm. La phase liquide
rcupre aprs 6 h dhydrolyse contient 65,3 % de minraux, 23,5% de protines, 2,7 % de
lipides et 5,7 % de sucres.
Devant la difficult dprotiniser, une nouvelle enzyme a t teste, lAcide Stable Protase.
Un autre acide a t employ pour obtenir galement un pouvoir tampon proche du pH
dactivit optimale de lASP. Il sagit de lacide formique. Leffet de lacide seul aboutit des
cintiques de dminralisation et dprotinisation plus rapides. La protolyse acide de 6 h
permet datteindre un degr de puret en chitine de 90,4 % daprs le lavage au NaOH et un
degr de dminralisation de 98,8 %. Ces performances sont proches de celles obtenues par la
140
141
40
40
32,3
30
protines
31,6
minraux
28,2
25
25,3
26,0
20
10
0,4
0
Matire initiale
Dminralisation
0,5
Dprotinisation
La figure IV.1 exprime les quantits des principaux composs (chitine, protines et minraux)
dtermines suite lapplication de chacune des deux tapes de lextraction chimique,
ralises indpendamment. Le traitement acide seul, par HCl 1 M temprature ambiante,
dminralise 98,5 0,1 % des minraux initialement prsents. cette tape, 36,8 4,3 % des
protines sont galement limines. Le traitement alcalin chimique seul, par NaOH 1,25 M
90 C, est responsable de la perte de 98,8 0,3 % des protines et 8,9 1,6 % des minraux.
La composition finale, suite aux deux tapes successives, se caractrise par des degrs de
dminralisation et de dprotinisation de 99,6 0,1 % et 99,5 0,4 % respectivement.
145
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
100
99
98
97
96
95
10% pep
H3PO4 6h
15% pep
H3PO4 6h
25 % pep
H3PO4 6h
41% pep
25% pep
25% ASP
25 % ASP extraction
H3PO4 6h H3PO4 12h HCOOH 6h HCOOH 12h chimique
La figure IV.2 montre que toutes les conditions dhydrolyse permettent datteindre un degr
de dminralisation lev. La dminralisation la plus faible est observe avec lhydrolyse
enzymatique de 6 h par 10 % de pepsine, dont le degr de dminralisation est de 97,2 %.
linverse, lextraction chimique prsente le meilleur degr de dminralisation, avec 99,6 %.
Cette performance constitue un objectif pour nos procds, cependant une tolrance peut tre
accorde. Au regard de la littrature et de cahiers des charges de chitine commerciale, le seuil
est de 1 % de minraux rsiduels. Pour nos produits, cette quantit correspond un degr de
dminralisation de 99,0 0,2 %.
Compte tenue des incertitudes, presque toutes les hydrolyses remplissent cet objectif,
exception faites des extractions par 10 % et 15 % de pepsine. Lhydrolyse de 12 h par 25 %
de pepsine affiche galement une faible dminralisation, 98,3 %, par rapport aux autres
hydrolyses, notamment par rapport son homologue de 6 h. Ceci semble contradictoire et
montre que la comparaison entre ces performances est limite par les incertitudes de mesures
et les faibles carts entre les hydrolyses.
Le tableau IV.2 souligne galement le potentiel de lhydrolyse par lASP en acide formique.
Les degrs de dminralisation atteignent 98,8 % et 99,3 %, aprs 6 h et 12 h dextraction
enzymatique respectivement. Lexprience de lhydrolyse par la pepsine en acide formique a
galement t mene. Cependant, les rsultats (non dcrits ici) se sont rvls moins
intressants.
146
100
95
90
85
80
10% pep
H3PO4 6h
15% pep
H3PO4 6h
25 % pep
H3PO4 6h
41% pep
25% pep
25% ASP
25 % ASP extraction
H3PO4 6h H3PO4 12h HCOOH 6h HCOOH 12h chimique
La figure IV.3 prsente des degrs de dprotinisation compris entre 89,3 et 97,7 % lorsque
lextraction de la chitine est mene par voie enzymatique. Tandis que lextraction chimique
aboutie 99,5 % de protines limines. Contrairement la dminralisation, le seuil de 99 %
nest atteint par aucune hydrolyse enzymatique.
Comme les modles prcdemment tablis le soulignaient, la dprotinisation est favorise
par laugmentation de la concentration en enzyme. La figure IV.3 illustre ce phnomne avec
une volution du degr de dprotinisation de 89,3 94,7 lorsque la concentration en pepsine
varie de 10 41 %.
Les degrs de dprotinisation de trois hydrolyses se dtachent nettement des autres. Il sagit
de lhydrolyse de 12 h par 25 % de pepsine et les deux hydrolyses par lASP. Elles ne
prsentent pas de diffrences significatives entre elles et offrent les meilleures performances
de dprotinisation, suprieures 97 %. Nanmoins, les contraintes de cots invitent viter
les longues dures de production (Chapitre 3.VI). En effet, le doublement de la dure
dhydrolyse double galement la consommation nergtique. Par consquent, lhydrolyse de
6 h par lASP est la plus intressante et la plus proche des performances de lextraction
chimique.
Lacide formique est galement autoris comme additif alimentaire. Il est nomm E 236 dans
147
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
la nomenclature europenne. Comme pour lacide phosphorique, le contact avec une matrice
alimentaire est autoris. Par exemple, des fournisseurs chinois et indiens proposent de lacide
phosphorique et formique des prix de lordre de 850 1000 USD/tonnes et de 100 800
USD/tonnes respectivement (Source Web, comparaison de plusieurs fournisseurs).
Pour les hydrolyses de 12 h par 25 % de pepsine et de 6 h et 12 h par lASP, la quantit de
protines rsiduelles est infrieure 6 %. Bien que cette quantit soit au-dessus des seuils
gnralement fixs pour commercialiser la chitine, elle est relativement faible. De plus, le
chitosan et la glucosamine sont davantage commercialiss que la chitine. Or ils subissent
dautres ractions, au cours desquelles il est possible dabaisser encore la charge protique.
Ractifs, enzyme,
microorganismes
Dure
Littrature
7 jours
Healy et al
(1994)
85 %
87,6 %
6 jours
Cira et al
(2002)
75 %
86 %
94 %
97,2 %
3 jours
81,5 %
91,2%
2,1 jours
93,8 %
7 jours
Rao et al.
(2000)
Cremades et
al. (2001)
Bautista et
al. (2003)
Healy et al.
(2003)
ENSILAGE
Nephrops norvegicus Stabsil,
dminralis
S. faecium M74
P. acidilactici,
Penaeus sp.
Lactobacillus sp. B2
FERMENTATION
Shrimp
148
Degr dlimination
Dprotinisation
Dminralisation
40 %
Chionoecetes
japonicus
Penaeus monodon
52,6 %
97,2 %
7 jours
Jung et al.
(2006)
Waldeck et
al. (2006)
Bhaskar et al.
(2006)
Sini et al
(2007)
98,1 %
98,9 %
2 jours
Penaeus monodon
P. acidolactici CFR2182
97,9 %
72,5 %
3 jours
Metapenaropsis
dobsoni
Bacillus subtilis
84 %
72 %
15 jours
Chionoecetes
japonicus
68,9 %
94,3 %
12 jours
Jung et al.
(2007)
Penaeus monodon
97,4 %
99,6 %
4,8 jours
Crangon crangon
prtait
90,8 %
99,7 %
4 jours
Xu et al.
(2008)
Xu et al.
(2008)
Penaeus vannamei
Bactries lactiques
91 %
94 %
6 jours
PROTEOLYSE
+ chimie
Penaeus vannamei
Papane
Pacheco et
al. (2009)
Gartner
(2010)
Tab.IV.1 : Comparaison des performances dextraction de la chitine par voies biologiques, Xu et al. 2008
149
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
150
100
95,1
95
95,6
95,2
95,5
95,5
Sigma
Mahtani
93,8
90
85
80
15% pep H3PO4 25 % pep H3PO4 41% pep H3PO4 25% ASP HCOOH
6h
6h
6h
6h
Fig.IV.4 : Degr dactylation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique
Comme lexplique le chapitre 2 IV.5, la RMN 1H seffectue sur des produits sans protines,
pour viter quelles ninterfrent sur la mesure de DA. Cest la raison pour laquelle le DA de
la matire premire nest pas prsent. La plupart des tudes lestime suprieur 95 % dans
les coproduits de crustacs (Aranaz, 2010).
Les degrs dactylation des produits dextraction enzymatique ne sont pas significativement
diffrents entre eux, ni diffrents des chitines commerciales. Les DA sont de lordre de 95 %,
sauf pour lhydrolyse par 15 % de pepsine. Elle prsente un degr dactylation infrieur, soit
93,8 %. Les conditions du procd sont pourtant plus douces. On peut alors supposer que ce
rsultat est le fruit dune interfrence avec des protines rsiduelles ou linverse dun
nettoyage chimique trop drastique.
Au regard de ces rsultats, les DA de la chitine dextraction chimique comme enzymatique ne
prsentent pas de diffrences significatives. Ceci permet de conclure que les deux procds
ont le mme impact sur le degr dactylation de la chitine.
Rares sont les tudes qui analysent les qualits physico-chimiques de la chitine produite par
extraction biologique, ce qui limite la possibilit de comparer les qualits de notre produit.
Gartner et al. (2010), mesurent le DA du chitosan obtenu suite lextraction enzymatique de
la chitine par la papane. Le DA est mesur par titration 19,1 % tandis que le chitosan
obtenu par extraction chimique prsente un DA de 31,4 % (estim par RMN). La papane
semble donc avoir un fort pouvoir de dsactylation. La chitine obtenue par laction de la
pepsine na pas t convertie en chitosan et ne peut donc pas tre compare ces rsultats.
151
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
5.E+05
5.7E+05
5.6E+05
5.4E+05
4.4E+05
4.3E+05
5.7E+05
4.2E+05
4.E+05
3.E+05
2.E+05
1.E+05
0.E+00
15% pep
H3PO4 6h
25 % pep
H3PO4 6h
41% pep
H3PO4 6h
25% pep
H3PO4 12h
25 % ASP
HCOOH 12h
extraction
chimique
Mahtani
Fig.IV.5 : Degr de polymrisation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique
Comme pour le degr dactylation, la mesure du poids molculaire na pas dintrt sur la
matire premire car la chitine doit tre purifie pour tablir la mesure. La prsence de tout
autre compos perturbe la mesure de la viscosit, ainsi que la prsence dhumidit.
Quel que soit le produit, la masse molaire se situe entre 4,2 et 5,8*105 g/mol. Celle des
chitines de rfrence varient entre 4,2 et 5,7*105 g/mol pour la chitine extraite au laboratoire
et celle fournie par Mahtani respectivement. Cette dernire est produite par une longue
extraction chimique, plus de 24 h, une temprature plus faible que celle fixe au laboratoire
(90 C contre 50 C par Mahtani). Ceci illustre bien limportance des conditions de
production sur la qualit de la chitine finale et rend difficile la comparaison entre les
diffrents modes de production.
Les poids molculaires des chitines issues des trois hydrolyses de 6 h, par 15, 25 et 41 % de
pepsine en acide phosphorique, sont de 5,4*105 ; 4,3*105 et 5,6*105 g/mol respectivement. La
concentration en enzyme ne semble donc pas responsable de la diminution du degr de
polymrisation. Aprs 6 h et 12 h dhydrolyse par 25 % de pepsine, le poids molculaire de la
chitine atteint respectivement prs de 4,3 et 4,4*105 g/mol. Ces valeurs sont proches. On ne
152
peut donc pas conclure que laugmentation de la dure dhydrolyse entrane une diminution
du degr de polymrisation. Enfin, lemploi de lenzyme ASP en acide formique confirme son
potentiel pour la production de chitine. Le poids molculaire demeure lev et similaire
celui de la chitine fournie par Mahtani. ce niveau, le procd enzymatique ne prsente donc
pas davantage par rapport son homologue chimique.
50
41,6
40
33,1
34,9
30
20
10
0
Matire premire
25 % pep H3PO4 6h
Mahtani
Fig.IV.6 : Indice de cristallinit des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique
La chitine commerciale, telle que celle fournie par Mahtani, prsente un indice de cristallinit
lev par rapport la cristallinit de la matire premire. Ces indices atteignent 53,9 et 33,1 %
respectivement pour la chitine commerciale et la matire premire (exosquelettes de crevette).
Les produits des hydrolyses par la pepsine en acide phosphorique sont nettoys au NaOH, 1 h
90 C. la suite de cette tape, les indices de cristallinit mesurs sont de 34,9 % et 41,6 %
pour 25 % et 41 % de pepsine respectivement. Laugmentation de la concentration en pepsine
semble augmenter lindice de cristallinit de la chitine. Les mesures sur les autres produits
nont pas t effectues, ce qui limite les conclusions sur limpact de lhydrolyse enzymatique
sur ce critre de qualit. Au regard de ces rsultats, il serait intressant de les approfondir afin
de valider ce qui semble tre un avantage de lextraction enzymatique par rapport la voie
chimique.
Gartner et al. (2010) ont compar les degrs de cristallinit du chitosan issu de la conversion
153
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
de chitine chimique et enzymatique (par la papane). Ils montrent que lindice de cristallinit
du chitosan biologique est plus bas que son homologue chimique, mais suprieur la
rfrence commerciale. Les conditions dextraction de la chitine ont un impact important sur
son indice de cristallinit, y compris au sein dun mme procd. Ds lors, il est difficile
dopposer la voie enzymatique la voie chimique.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Temprature (C)
Fig.IV.7 : Profils dATG de la chitine commerciale (Mahtani) et du produit de lextraction enzymatique modle
La figure IV.7 illustre les similitudes et les diffrences de stabilit thermique entre les deux
produits. Jusqu prs de 300 C, les deux profils ne prsentent pas de diffrences. La perte de
masse est ngligeable jusqu 210 C. Puis une dgradation thermique importante est
constate. Ainsi plus de 68 % de la masse sont perdus entre 325 C et 335 C pour le produit
de lextraction enzymatique et chimique respectivement. ce stade de la temprature, les
154
carts de pertes de masse entre les deux produits sont minimes. Ensuite, le produit
dextraction enzymatique prsente une stabilit plus importante, sa dgradation thermique est
lente jusqu 620 C. Tandis que son homologue est compltement dgrad avant 450 C.
Seule persiste la masse rsiduelle des minraux. La mme dmarche a t applique par
Gartner et al. (2010) pour comparer leur produit dextraction chimique celui de lhydrolyse
par la papane. La perte de masse de la chitine enzymatique ncessite galement une
augmentation plus importante de la temprature. On constate galement une moindre quantit
de minraux rsiduels.
Cette meilleure stabilit thermique du produit enzymatique pourrait sexpliquer par leur
diffrence de cristallinit. Pour des applications industrielles, le critre dterminant est
principalement la temprature initiale de dgradation thermique. ce titre, les deux produits
ne prsentent pas de nettes diffrences.
Sur la figure IV.8, la zone encadre dsigne une structure en nids dabeille comparable celle
155
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
dcrite dans la littrature (Raabe et al. 2007). Lorganisation semble donc tre maintenue
malgr la raction enzymatique. Cependant les produits issus de la protolyse acide prsentent
une rgularit des angles de rotation des plans de chitine-protines moins ordonne que celle
dcrite dans les cuticules (Fig.IV.9).
Fig.IV.9 : Organisation schmatique de la cuticule de homard, coupe transversale, Raabe et al. 2006
On peut galement observer une zone o la structure des plans de chitine-protines nest plus
maintenue (zone encercle). En revanche, on y observe toujours la prsence de fibres (en
clair) davantage allonges, probablement des fibres de chitine. Bien quaucune donne ne
prcise le degr de reprsentativit de cet chantillon, lorganisation de la structure de la
cuticule semble donc partiellement maintenue par la protolyse acide. titre de comparaison,
Gartner et al. (2010) ont conclu une dstructuration complte de la matrice par lhydrolyse
la papane. Daprs leurs prises de microscopie lectronique balayage, la dstructuration de
la cuticule des crevettes est plus importante par laction de la papane 2 % (w/w de
coproduits humide) que par lextraction chimique. Nous nous sommes galement intresss
limpact des deux tapes cl de lextraction chimique sur la structure des cuticules de
crevettes (Fig.IV.10).
a)
b)
Fig.IV.10 : Micrographes de MEB dexosquelettes soit dminraliss (a) ou dprotiniss (b) par traitement
chimique
Bien que les micrographes prsents par la figure IV.10 soient de qualit moyenne, ils
permettent dapprcier les consquences des diffrents traitements chimiques sur les cuticules
de crevettes.
156
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
(filtre de 0,45 l). Le volume inject dans la colonne est de 80 l et le dbit dlution est de
0,5 ml/min. Les composs sont dtects par une lecture de la densit optique 214 nm.
La colonne employe est spcifique aux peptides dont le poids molculaire est compris entre
7000 et 100 Da, ce qui couvre une large gamme de peptides prsents dans la phase solubles.
Bien quelle ne soit pas complte, cette couverture suffit estimer limpact de la protolyse.
Le graphique suivant illustre lvolution de la rpartition des catgories de poids molculaires
selon la dure dhydrolyse enzymatique pour la cintique de rfrence (25 % de pepsine et
40C) :
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
180 min
240 min
360 min
720 min
20
18
16
14
Quantit de peptides
(%)
12
10
8
6
4
2
0
> 7200
7200 - 5400
5400 - 3000
3000 - 2100
2100 - 1000
1000 - 460
460 - 260
< 260
Fig.IV.12 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
25 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse
La lgende de la figure IV.12 exprime laugmentation des dures dhydrolyse par lintensit
de couleur dcroissante. Les peptides volumineux tels que ceux dont le poids molculaire est
suprieur 5400 Da, diminuent au fur et mesure que la dure dextraction enzymatique
augmente. linverse, les catgories de peptides de 3000 2100 Da et 2100 1000 Da
stoffent mesure que le temps dhydrolyse sallonge.
Les quantits de peptides des catgories poids molculaires de 1000 460 Da et 460 260 Da
nvoluent quasiment pas. On peut nanmoins remarquer une tendance leur augmentation
lorsque la dure dhydrolyse est de 12 h. Enfin, lvolution des catgories de poids
molculaires de 5400 3000 Da et infrieurs 260 Da nest pas constante. Elle suggre une
rduction de taille des peptides dabord vers la catgorie de 5400 3000 Da, jusqu 120 min
dhydrolyse. Puis, au-del de 180 min, la rduction des peptides enrichie les catgories de
3000 1000 Da.
158
La masse molaire de la pepsine est de lordre de 34,5 kDa (Chapitre 3, III.1) c'est--dire dans
la premire catgorie. Elle est responsable de la protolyse et par consquence sa masse
molaire ne devrait pas voluer. La prsence de pepsine ninterfre donc pas lvolution des
catgories de poids molculaires tudis.
Lactivit antimicrobienne des peptides est reconnue pour ceux dont les poids molculaires
sont gnralement compris entre 5 et 1 kDa (Zo, 2011). Pour nos produits, ces catgories
couvrent entre 33 et 48 % des peptides, ce qui renforce le potentiel de valorisation de la phase
soluble. Le poids molculaire des pnaedines, protines de crevettes P. vannamei, forte
activit antimicrobienne (Destoumieux et al. 2000), est de lordre de 6 kDa. Cette catgorie
est estime entre 4,3 et 6,9 % des peptides. Un test dactivit antimicrobienne a t ralis sur
une gamme de microorganismes qui est dcrite dans le tableau suivant :
Rfrences
Espces
Conditions
RF 151
RF 173
RF 174
RF 182
RF 186
RF 36
EU 2183
EU 2185
EU 2189
EU 2206
EU 2202
Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Vibrio parahaemoliticus
Salmonella
Carnobacterium divergens
Photobacterium phosphoreum
Shewanella putrefaciens
Pseudomonas
Brochothrix thermosphacta
Lactobacillus sakei
BHI, 20 C
BHI, 37 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI+2,5 % NaCl, 15 C, 48 h
BHI, 25 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
MRS, 26 C
Tab.IV.2 : Liste des bactries utilises par les tests dactivits antimicrobienne de la phase soluble
Quantit de peptides
(en %)
Pour prparer la solution, la prise dchantillon est dilue au 1:2 (poids/volume). Des spots de
10 l ont t dposs sur les boites de ptri o les bactries se dveloppent. Aucune activit
antibactrienne na t observe.
20
30 min
18
1h
16
2h
3h
14
4h
12
6h
10
8
6
4
2
0
> 7200
7200 - 5400
5400 - 3000
3000 - 2100
2100 - 1000
1000 - 460
460 - 260
< 260
Fig.IV.13 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
41 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse
La figure IV.13 prsente lvolution des poids molculaires lorsque lhydrolyse enzymatique
159
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
est mene par 41 % de pepsine. On observe galement une domination des catgories de
peptides de poids molculaire compris entre 2 100 et 460 Da, avec puis de 5 400 3 000 Da.
la diffrence de la prcdente analyse, les poids molculaires sont assez stables en fonction
de la dure dhydrolyse enzymatique. On note une faible diminution de 16 % 14 % pour la
catgorie de 5 400 3 000 Da, tandis que celle de 460 260 Da prsente une augmentation de
6 % 7 %. Ces faibles variations semblent indiquer que la protolyse exerce par la pepsine
est limite. Ceci confirmerait leffet dallostrie ngative voque au chapitre 3, section V.3.
Par ailleurs, la part des peptides potentiel dactivit antimicrobienne, de 5400 1000 Da,
atteint prs de 45 % en moyenne.
Les poids molculaires des peptides de la phase soluble issue de lhydrolyse enzymatique par
lASP en acide formique ont galement t observs au cours du temps (Fig.IV.14).
10 min
40
20 min
35
30 min
60 min
Quantit de peptides
(en %)
30
120 min
180 min
25
240 min
360 min
20
15
10
0
> 7200
7200 - 5400
5400 - 3000
3000 - 2100
2100 - 1000
1000 - 460
460 - 260
< 260
Fig.IV.14 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
25 % dASP en acide formique 40 C) selon la dure dhydrolyse
160
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
La figure IV.15 montre que la part respective de chaque acide amin semble converger vers
zro sans latteindre. On nobserve pas de phase de stabilisation et la plupart des cintiques
semblent prsenter une vitesse constante diffrente en fonction de lacide amin.
Les regroupements acide glutamique/glutamine dune part et acide aspartique/asparagine
dautre part, sont majoritaires. La serine, la lysine, lhistidine et la tyrosine sont les moins
reprsents. La cystine et la mthionine sont toujours faiblement dtectes. Lanalyse de la
matire premire prsentait les mmes caractristiques (Chapitre 2, Fig.II.1). Ces
comparaisons traduisent que la pepsine limine indiffremment les acides amins prsents
initialement dans la matire premire, sans prfrence pour les acides amins aromatiques.
Les acides amins essentiels prsents dans la phase soluble reprsentent en moyenne 36,3
0,7 % du total des acides amins doss (daprs la cintique modle 25 % de pepsine). Il est
difficile de comparer ce rsultat aux autres tudes dextraction biologique de la chitine car les
modes opratoires sont trs diffrents. partir de coproduits de P. vannamei, Armenta et
Gueretto-Lagarreta (2009) ont mesur une composition en acides amins essentiels de 46,6 %
161
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
et 48,7 % respectivement dans la matire premire non fermente et fermente par des
bactries lactiques. Lanalyse a t ralise par HPLC. Dans une autre tude, Rao et al. (2005)
mesurent 32,1 % dacides amins essentiels dans les hydrolysats de coproduits de crevettes
(ttes et carapace).
50
Glucose
Galactose
40
30
20
10
0
25%Pepsine-H3PO4-6h
41%Pepsine-H3PO4-6h 25%Pepsine-H3PO4-12h
25%ASP-HCOOH-6h
Fig.IV.16 : Rpartition des catgories de rsidus glycosidiques dans la phase soluble des extractions
enzymatiques
Dans le cas de lextraction modle, la teneur totale en rsidus glycosidiques atteint 5,7 0,8 g
pour 100 g de la phase soluble. Ils se dclinent en 2,6 g/100 g de galactose, 3,0 g/100 g de
glucose et 0,1 g/100 g de glucosamine, actyles ou non. Ceci reprsente respectivement prs
de 46 %, 53 % et 1 % des rsidus glycosidiques. La part des glucosamine et N-actylglucosamine est trs faible, ce qui indiquerait une absence de dpolymrisation.
Daprs la figure IV.16, suite laugmentation de la concentration en pepsine jusqu 41 %,
la teneur totale en rsidus glycosidiques atteint 6,3 0,2 g/100 g de phase soluble. Bien que
lgrement suprieure la teneur en rsidus glycosidiques de lhydrolyse par 25 % de
pepsine, cette augmentation est comprise dans lincertitude des mesures. La composition en
rsidus glycosidiques se rpartit entre 59 % de galactose, prs de 40 % de glucose et moins de
1 % de glucosamine actyle ou non.
La mme rpartition est constate lorsque la dure dextraction est allonge jusqu 12 heures.
162
La teneur total en rsidus glycosidiques atteint alors 5,8 0,5 g/100 g de phase soluble. Cette
quantit est similaire aux prcdents rsultats. La part de glucosamine/N-actyl-glucosamine
demeure toujours trs faible, infrieure 1 %.
Lextraction par 25 % dASP 6 h, produit une teneur totale en rsidus glycosidiques de 46,0
1,1 g/100 g de phase soluble. Elle comprend plus de 98 % de glucose puis prs de 1 % de
galactose et Glu/NacGlu chacun. Ceci montre que lemploi du couple ASP/acide formique
une action diffrente du couple pepsine/acide phosphorique sur la dprotinisation. Par
consquent, la composition de la phase soluble est compltement modifie.
IV.4. Pigments
IV.4.1. Quantit de lipides et dastaxanthine dans la phase soluble
Parmi les pigments dorigine marine (Chapitre 1, VIII.1.2), les carotnodes sont majoritaires
dans les exosquelettes des crustacs, dont principalement lastaxanthine (Babu et al, 2008).
La proportion de lipides dans la phase soluble, rcupre aprs 6 heures dextraction par 25 %
de pepsine, reprsente 2,7 0,3 %. Cette quantit correspond plus de 100 % de la quantit
de lipides initialement prsente dans la matire premire. Compte tenu des incertitudes lies
aux mesures, ceci signifie que tous les lipides passent en phase soluble.
Daprs Aurioles-Gamboa et al. (2004), la quantit dastaxanthine est corrle celle des
lipides totaux dans lexosquelette de crabe selon la relation suivante :
[Astaxanthine] = - 0,9849 + 0,08499*[Lipides]
(IV.1)
Lanalyse qualitative des carotnodes a t ralise par le laboratoire Agrobio (Rennes), par
HPLC couple la spectrophotomtrie UV/VIS (Fig.IV.17). La quantit dastaxanthine a t
mesure 8,0 g par gramme de phase soluble lyophilise. Lastaxanthine est le carotnode
majoritaire, cependant dautres sont visibles sur le spectre de la figure IV.17, certainement des
xanthophylles. Les autres lipides nont pas t identifis, ils peuvent tre des phospholipides
ou des acides gras complexs sous forme de glycolipidiques et lipoprotiques. Gartner et al.
(2010) font part de la prsence de palmitate, olate, linolate et esthrate de mthyle. Par
ailleurs, la teneur total en lipide, mesure dans cette tude, est suprieur celle dtermine
dans notre matire premire, 8 % contre 3,3 % respectivement.
163
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
La teneur en astaxanthine observe correspond 1,17 g/g de substrat initial. Cette teneur est
faible compare celle obtenue par Gildberg et al. (2001). Leur hydrolyse enzymatique par
alcalase (pendant 2 h 40 C) partir de crevettes nordiques, Pandalus borealis, est suivie
dune centrifugation. Dans le culot, 1 500 g dastaxanthine est rcupr. Ainsi, leur
rendement en astaxanthine atteint prs de 40 %. Pour comparer le rsultat de Gildberg et al.
(2001) au ntre, une centrifugation de la phase soluble devrait tre applique.
La teneur en astaxanthine de nos coproduits de crevette na pas t mesure, cependant, la
littrature offre cette donne. Dans les exosquelettes de crevettes, selon lespce, la teneur en
carotnodes totaux varie de 59,8 104,7 g/g (Sachindra et al. 2005). Ce qui nous mnerait
un rendement autour de 1 2 % lissue de lextraction par 25 % de pepsine 40 C.
La comparaison avec les autres tudes similaires est difficile due aux diffrences de procds
dextraction. Lhydrolyse, par la pepsine, de quatre coproduits de crevettes diffrentes (P.
monodon sauvage et daquaculture, P. indicus et P. monocerous), mene par Babu et al.
(2008), aboutie des quantits de 120 jusqu 705 g/g de carotnodes totaux rcuprs. Les
conditions dhydrolyse taient de 45 C et le pH proche de 4. La fermentation lactique
exprimente par Bhaskar et al. (2006) partir de coproduits de P. monodon atteint jusqu
78,5 2,3 % de rendement en astaxanthine. Ils montrent galement Daprs Armenta et al.
(2009), sur Pandalus borealis, lastaxanthine libre reprsente seulement 4 % du total des
astaxanthines, tandis que les mono-esters et di-esters constituent respectivement 20 et 76 %.
Des mesures complmentaires nous sont donc ncessaires pour identifier tous les carotnodes
de nos produits.
No et al (1989) montrent que la rduction de taille de fragment de matire premire rduit le
degr de rcupration de lastaxanthine lors de lextraction chimique de la chitine partir de
164
coproduits de crabe. Leurs expriences portaient sur des fragments compris entre 2 et 0,2 mm.
Ces rsultats nous invitent poursuivre lanalyse de la composition en astaxanthine de nos
produits en fonction de la taille initiale des fragments dexosquelette de crevettes.
La teneur en astaxanthine dans la phase soluble issue de lextraction par 25 % dASP en acide
formique a t mesure 4,2 g/g. Cette quantit est quasiment la moiti de la celle obtenue
par la prcdente hydrolyse. Cependant, dans les deux cas, les teneurs en astaxanthine sont
suprieures celle observes dans la phase soluble issue de lextraction chimique. Dans le cas
du procd traditionnel, la teneur en astaxanthine est infrieure 2 g/g. Ces donnes sont
rsumes dans le tableau IV.3 :
Extraction
Extraction chimique
8,0
Pepsine + H3PO4
4,2
ASP + HCOOH
<2
Tab.IV.3 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction
Couleur
Blanc
Plastique, lectrostatique
Rose ple
Rugueux, friable
Rose-orange
Rugueux, friable
Tab.IV.4 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction
165
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
L* traduit la clart de la lumire (L* = 0 pour le noir et L* =100 pour le blanc). Les valeurs a*
et b* indiquent respectivement lintensit vers le rouge et de jaunes lorsquelles sont positives.
Le facteur WI indique galement lintensit vers le blanc. La comparaison entre ces facteurs
est illustre par la figure IV.18 :
70
Intensit
20
L*(D65)
a*(D65)
b*(D65)
WI (CIE)
-30
-80
-130
La figure IV.18 confirme et complte les observations du tableau IV. Le coefficient L* est
plus lev pour la chitine chimique, avec 84,8 0,2. Puis il diminue, dans lordre, pour la
chitine obtenue par la pepsine et lASP. Les valeurs observes sont de 75,5 0,4 et 72,0 0,3
respectivement. Le facteur a*, qui exprime lintensit vers le rouge, est plus lev lorsque la
chitine est extraite par la pepsine, 8,4 0,5, puis par lASP, 7,4 0,2. Aprs le traitement
chimique, la chitine les facteurs a* et b* sont plus faibles. En revanche, elle prsente le
coefficient WI le plus lev, de lordre de 37,1 0,7. Lorsque la voie enzymatique est
emprunte, ce facteur est ngatif, ce qui exprime que la couleur des produits sloigne du
blanc. Ces caractristiques sapprcient visuellement sur les photographies de la figure IV.19 :
Fig.IV.19 : Chitine obtenue par lavage chimique, par hydrolyse par la pepsine et par lASP (de gauche droite)
166
V. Conclusions du chapitre 4
Les tapes du procd dextraction de la chitine partir des coproduits de crevettes P.
vannamei et les analyses qui suivent sont rappeles dans le schma IV.20 :
Matire premire
Acide
-Nettoyage
-Schage
-Broyage
-Stockage
-Concentration en
fonction de la teneur en
minraux
Enzyme
-Solubilisation dans leau
-Concentration en fonction
de la teneur en protines
Prparation
Homognisation
Inoculation
Protolyse acide
Raction
Filtration/ rinage
soluble
Phase insoluble
Voie fermentation
Extraction chimique Phase
Analyses
Compose de
CHITINE
principalement
Compose de rsidus
glycosidiques,
protines, minraux
et de pigments
Protolyse acide
GLUCOPEPTIDES
CHITOSAN
CALCITES
OLIGOProduits
ASTAXANTHINE
CHITOSAN
Fig.IV.20 : Schma rcapitulatif
des tapes du procd de protolyse acide et des analyses conscutives
Les performances de ce procd sont compares celle de lextraction chimique et aux
meilleures performances proposes par la littrature avec la voie fermentaire (Cf. Tab.IV.5).
Pour liminer les minraux, la protolyse acide est quasiment aussi performante que
lextraction chimique. Cette conclusion est valable ds lors o la concentration en pepsine et
en ASP dpasse 25 %. La voie fermentaire donne des rsultats variables selon le nombre
dtapes et les microorganismes slectionns. Xu et al. (2008) obtiennent moins de 1 % de
minraux rsiduels aprs 4 jours de fermentation lactique. En termes de dprotinisation, ils
atteignent une teneur en protines rsiduelles de lordre de 6 %. La protolyse acide a permis
167
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction
<1%
<1%
<1%
<1%
~6%
~9%
6 30 h
> 48 h
6 12 h
Dure
Extraction chimique
Voie fermentation
Protolyse acide
95,5 1%
94%
95,1 1%
4,2 5,7x105
1,2x106
4,3 5,7x105
53 %
86%
35%
Lun des objectifs de ltude consistait mettre en uvre un procd plus respectueux des
enjeux environnementaux. La production deffluents chimiques de la protolyse acide est
compare lextraction chimique (Tab.IV.7).
Extraction chimique
Protolyse acide
1 :10
1 1,5 N (rpt 2 fois)
1 :5
<1N
169
171
dterminer la quantit de chitine. Pourtant, cest une pratique courante qui se traduit par des
diffrences de teneurs dcrites dans la littrature, y compris pour une mme espce
biologique. Certains auteurs font le choix de ne prsenter quune seule catgorie de composs
incluant la chitine et les protines. Pour notre tude, cette distinction est ncessaire. Il savre
donc important dappliquer un recoupement dau moins deux mthodes distinctes
prometteurs. Par consquent, nous pouvons supposer quune tude oriente vers le potentiel
de ce couple puisse augmenter les performances du procd.
Enfin, ce procd biologique prsente un potentiel accru en raison dune valorisation de la
phase soluble. Ce point a galement t explor dans ce manuscrit.
Principales perspectives
Ce procd peut tre tendu dautres couples denzyme et dacide. De plus, il pourrait tre
appliqu dautres substrats tels que les cphalopodes (seiches et calamars), dont la chitine
est de nature diffrente, dautres crustacs (comme les crabes et les crevisses), et aux
insectes.
De part la multiplicit des mthodes, nous disposons dun nombre important de donnes
cintiques. Il serait probablement enrichissant dapprofondir lexploitation de leur
recoupement par lemploi de la thorie de rconciliation des donnes dynamiques. Une telle
approche devrait alors contribuer affiner simultanment la prcision des mesures et des
modles proposs.
En dernier lieu, une tude conomique approfondie permettrait de comparer la rentabilit de
ce procd par rapport lextraction chimique traditionnelle.
173
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Annexes
Annexes
A.
Dnomination INCI
CHITIN
CHITIN GLYCOLATE
CHITOSAN
CHITOSAN ASCORBATE
CHITOSAN FORMATE
CHITOSAN GLYCOLATE
CHITOSAN LACTATE
CHITOSAN PCA
CHITOSAN SALICYLATE
CHITOSAN SUCCINAMIDE
SODIUM CARBOXYMETHYL CHITIN
Fonctions
Agent de foisonnement
Entretien de la peau
Agent filmogne
Antioxydant/agent filmogne/
entretien de la peau
Agent filmogne
Antioxydant/ agent
entretien de la peau
Agent filmogne
filmogne/
Humectant
Antioxydant/agent filmogne/
entretien de la peau
Agent filmogne
Agent de foisonnement
Humectant/conditionneur
capillaire/
agent filmogne
201
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202
Annexes
C.
White
or
Yellow
Pharmaceutical
Food industry
Technical
Pharmaceutical
Food industry
White
White
Translucent/pale -
White
White
flake/powder
flakes/powder
flakes/powder
12%
8%
8%
or
Yellow
or
Yellow,
translucent
translucent
Powder
Powder or flake
Powder or flake
Density
Moisture Content
10%
10%
10%
Protein Content
0,3%
0,2%
0,2%
Ash Content
0,5%
0,3%
0,3%
2%
1%
1%
DA
70 - 100%
70 - 100%
70 - 100%
80 95%
95 99%
85 95%
Viscosity
50-500cps
5 50 mpa.s :low
50 800 mpa.s
5 300 mpa.s
0,72%
50-300 :middle
>800 mpa.s :high
Insolubles
1%
1%
1%
2%
0,32%
Heavy metals(As)
10 ppm
10 ppm
10 ppm
< 0,0005%
< 0,0005%
Heavy metals(Pb)
10 ppm
10 ppm
10 ppm
pH
7-9
7-9
7-9
7-8
7-8
7-8
Odor
<1000 ufc/g
<1000 ufc/g
Total bacterial
Salmonelle
none
E.coli
40
203
Purification of chitin by enzymatic hydrolysis from shrimp Penaeus vannamei byproducts. Products characterization and process optimization
The objective of this study was to optimize the extraction of chitin by acid proteolysis. The novelty of
the method is based on the stabilization of pH by the balance between substrate composition and the
acid solvent. This principle allows a simultaneous demineralization and deproteinization, the two main
reactions associated with the purification of chitin. To evaluate the performance of this purification,
the composition of the substrate and products was characterized. Different methods of quantification
of chitin and proteins have been compared. As traditional assays were not satisfaying, a direct method
of amino acids determination by gaz chromatography was selected to estimate the amount of protein.
The estimate of chitin amount was based on indirect methods, mainly gravimetry, elemental analysis
and thermogravimetric analysis (TGA). Kinetics of demineralization and deproteinization were
examined to optimize the purification of chitin. Mass balances confirmed the consistency of results.
The quality of chitin extracted by enzymatic or chemical techniques was compared with the degree of
acetylation and depolymerization and the crystallinity index of chitin. The structure of chitin was also
observed by scanning electron microscopy (SEM). Finally, compounds solubilized by enzymatic
hydrolysis were identified and quantified.
Key-words: crustacean by-products, enzymatic hydrolysis, proteolysis, chitin, extraction, kinetic,
demineralization, deproteinization.