Criofractura y Criograbado

CRIOFRACTURA Y CRIOGRABADO
Lacriofracturaes una tcnica utilizada en microscopia electrnica,

consistente en la congelacin de muestras biolgicas con nitrgenoliquido
(-165c), seguido de un corte o fractura y el sombreado metlico o
recubrimiento con carbono de la superficie de la muestra. Luego
procediendoalaeliminacindeltejidobiolgicosubyacentealsombreadoy
la observacin de esta rplica de la muestra mediante el uso de un
microscopioelectrnico
Latcnicadelacriofracturafuedesarrollada
de manera temprana en la dcada de 1950
porelcientficoRussellSteere,sinembargo
no fue hasta 1960, cuando Daniel
Brantoncomienza investigar mediante
criofractura y a exhibir las imgenes
obtenidas, demostrando que posean la
claridadnecesariaparaconvenceralmundo
cientfico de su utilidad en la investigacin.
Estatcnicallegasuaugecomofuentede
investigacincelularenlasdcadasdel70y
80, al proporcionar avances en la
comprensin de la organizacin estructural
de membranasy organelos imposibles de
identificarmedianteelusodeotrastcnicas
existentes.
Microscopioelectrnicodebarrido.
Herramientautilizadaenlavisualizacin
demuestrasobtenidasmediante
criofractura
Existen4pasosesencialesparalarealizacindeunareplicaporcriofractura
1. Congelacin rpida de la muestra:
Estoselograsumergiendorpidamentelamuestra(previamentetratadaconun
crioprotectorparaevitarlaformacindecristalesdehieloalinteriordelamuestra,
comoelglicerol)ennitrgenoliquido,aunatemperaturacercanaalos-165C.
2. Fractura de la Muestra
Sellevaacaboencondicionesdevaco,bajounacuchilladediamanteoromperla
enunadispositivodebisagra.Tambinexistelavariantesimpledelatcnica,enque
lafacturacinseefectaenunaatmsferadenitrgenoliquido,aunapresinde3
ATMconelusodeunacuchilladeafeitar.
3. Fijacin de platino - carbono
Seprocedeaevaporarunafinacapadecarbono-platinosobrelamuestra.As,las
caractersticastopogrficasdelasuperficiecongeladaseconviertenenvariaciones
enelespesordelacapadeplatinodepositadasobrelamuestra.
4. Limpieza de la rplica
Posteriormentealafijacin,lamuestrasellevaapresinatmosfricayseledeja
calentaratemperaturaambiente.Elmaterialbiolgicorestanteenlareplicaes
eliminadomedianteelempleodeunasolucindecidocrmico,hipocloritodesodio
uotrosagenteslimpiadores.
Enlaimagensehaampliadolazonadecontactoentredosclulas(1y2).
Cadaclulapresentaunalimitantequeeslamembranaplasmtica(Flechas
rojas)yentrelasdosclulashayunespaciointercelular(Ei)
Inmunohistoqumica
Lainmunohistoqumicaes un procedimiento histopatolgico que se basa en la utilizacin de un
anticuerpoespecfico,previamentemarcadomediante un enlace qumicoconunaenzimaque puede
transformarunsustratoenvisible,sinafectarlacapacidaddelanticuerpoparaformaruncomplejocon
elantgeno,aplicadoaunamuestradetejidoorgnico,correctamentefijadaeincluidaenparafina.
Conlautilizacindealgunadelastcnicasespecficas(peroxidasa,antiperoxidasa,flurosceina,etc.),
el complejo antgeno- anticuerpo as formado puede localizarse e identificarse en las muestras
tisulares o citolgicas a estudiar, con lo que se identifican losmarcadores antignicoscaractersticos
dedistintaslneasdediferenciacinyfuncionalismocelularysedeterminaeltipodeclulainvolucrado
enlamuestra.Estopuedeutilizarseparacolocalizarunaprotenadeinters.
FRACCIONAMIENTO
CELULAR
Elfraccionamiento
celularofraccionamient
o
subcelulares
una
tcnica de laboratorio, tras
la disgregacin, en la que
se intenta reagrupar las
partculas, generalmente
clulasu
orgnulos celulares,
en
funcin de sus propiedades
biofsicas.
Mediante
el
fraccionamiento celular se
consigue separar conjuntos
homogneos,
por
lo
general de orgnulos, a
partir de una poblacin
heterognea de clulas.
Esquema
de
la
centrifugacin diferencial,
para
separar
los
diferentesorgnulos
obtenidos mediante fraccionamiento
celular
ETAPAS
Existen tres etapas principales en el fraccionamiento celular:
1. Disgregacin o rotura (homogeneizacin) de las clulas y liberacin
de los orgnulos. 2.Macrofiltracin. 3. Purificacin de componentes
celulares ofraccionamiento celular propiamente dicho: Se
aplican tcnicas decentrifugacin diferencialy en gradiente
Homogeneizacin
El tejido se homogeneiza, normalmente
en unasolucin tampnisotnicausando
una variedad de mecanismos (moler,
picar, triturar, cambios de presin,
choque
osmtico,
congelacin
y
descongelacin, homogeneizacin con
ultrasonidos. La solucin se homogeneiza
en una solucin isotnica para detener el
daoosmtico, con una solucin tampn
para regular elpH, y a una temperatura
muy baja para evitar daos enzimticos.
Los orgnulos se mantienen en fro, en un
medio
isotnico
y
tamponado.
El
resultado ahora es una pasta fina de
lquido, el homogenato de clulas, que
consta de clulas intactas y componentes
celulares. Con un cuidadoso trabajo se
Filtracin
Este paso puede no ser
necesario dependiendo de la
fuente de las clulas. Si se
trabaja con tejidos animales,
es probable que se liberen
restos detejido conectivoque
debe
ser
eliminado.
Habitualmente, la filtracin se
realiza ya sea mediante el
vertido a travs de un tejido
poroso
o
con
un
filtrado por succin
empleando
el
correspondiente
filtro
de
cermica con un tamao de
poro adecuado.
Purificacin
Se realiza porcentrifugacinen
gradiente de densidad o por
centrifugacindiferencial,
aumentando secuencialmente la
velocidad de giro y la
fuerza gravitacional, dando como
resultado una separacin secuencial
Centrifugacin
enacuerdo
gradiente
de
de los orgnulos de
con su
densidad
densidad.
En
la
centrifugacin en gradiente de densi
dad
se sita el homogeneizado en un
medio con un gradiente de densidad
y
se
centrifuga.
Ahora
los
componentes de la clula se separan,
migrando cada uno a la zona de
densidad similar. Este mtodo es til
si se desea aislar componentes
celulares de tamao semejante con
una diferencia de densidad baja.
Izquierda: Centrifugacin en
gradiente
depercollde
glbulos rojos
infectados,
separados por su diferente
estado de desarrollo.
Centrifugacindiferencial
La centrifugacin diferencial es
un proceso de separacin que
puede
separar
los
componentes celulares por
centrifugacin
repetida,
a
velocidades cada vez mayores.
En estas condiciones, los
componentes de la clula se
separan en funcin de su
tamao
y
densidad:
los
componentes de gran tamao
y ms densos migran ms
rpidamente hasta el fondo a
velocidades
relativamente
bajas y forman un sedimento.
En el esquema de la derecha,
se observa un homogeneizado
celular
en
(1)
que
se
centrifugaa baja velocidad. El
precipitado resultante (verde)
se compone de componentes
grandes y pesados. Se elimina
el
sobrenadante
y
se
Centrifugadorade
laboratorio,
para
separar fracciones de
diferente
tamao
o
densidad

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