Diagnóstico

Virológico
 Virus
• Partículas microscópicas (20-250nm)
• Genoma
• Cápside proteica
• Envoltura ( algunos)
• Para replicarse requieren células vivas
TOMA DE MUESTRA PARA EL
DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
• La probabilidad de obtener un buen rendimiento diagnóstico depende de la
calidad de la muestra recibida en el laboratorio. Para obtener muestras de
alta calidad debemos conocer, por ejemplo, el sitio o lesión donde se
sospecha esté el agente, de manera de pedir la secreción o el tejido donde el
virus (o parte de éste) esté presente.
• Es importante también estimar el período en que se encuentra la infección,
tanto para solicitar la muestra en el momento de mayor replicación viral,
como para estimar en los casos en los que necesitemos evaluar la respuesta
inmune del hospedero.
• Por otro lado, son determinantes la cantidad y calidad de la muestra, además
de las condiciones en la que es mantenida y el tiempo en la que es
transportada al laboratorio
Técnicas diagnósticas:
• Ante la necesidad de solicitar exámenes
de diagnóstico virológico debemos
recordar que los virus son organizaciones
macromoleculares que constan
esencialmente de genoma (ácidos
nucleicos de tipo ARN o ADN) y proteínas.
• Algunos de ellos presentarán además
lípidos en su manto e hidratos de carbono
unidos a las proteínas virales.
• Existen técnicas de laboratorio específicas
para la detección de la partícula viral
completa, los antígenos virales
(proteínas) y del genoma viral. Además,
podemos detectar y caracterizar la
respuesta inmune antiviral específica.
 detección de la partícula viral completa
• Las técnicas de aislamiento viral o microscopia electrónica sólo están
disponibles en laboratorios especializados en virología y se encuentran
generalmente reservadas para fines de investigación.
• Estas técnicas clásicas han sido reemplazadas en la práctica clínica por técnicas
moleculares o inmunoensayos que requieren menor infraestructura e implican
un menor tiempo en la entrega de resultados.
• La característica de los virus de ser parásitos intracelulares implica que para el
aislamiento viral se deban utilizar líneascultivos celulares, los cuales son
“infectados” por el virus viable presente en la muestra y tras lo cual se
observan los cambios morfológicos de las células hospederas o efectos
citopáticos, como consecuencia de una replicación viral efectiva .
• Todo aislamiento viral debe ser confirmado mediante técnicas de
inmunodiagnóstico (inmunofluorescencia) o moleculares específicas, debido a
que ningún efecto citopático es patognomónico de un virus en particular. Una
de las mayores ventajas del aislamiento viral es la posibilidad de obtener altas
concentraciones de virus completo, para posteriores estudios de
caracterización genómica y antigénica, de sensibilidad antiviral y para
conservación en biorepositorios.
detectar antígenos virales
• Se basan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo.
• En todas estas técnicas es necesario conocer el antígeno a detectar,
de manera de definir el anticuerpo específico para dicho fin.
• La detección puede realizarse mediante métodos directos o
indirectos.
• Método directo, el anticuerpo específico contra el antígeno a
detectar está acoplado a un marcador.
• Método indirecto, el anticuerpo anti-antígeno no posee marcador,
y la formación del complejo antígeno-anticuerpo se evidencia
mediante un segundo anticuerpo marcado, llamado anticuerpo
secundario conjugado.
• De esta forma, la denominación de las técnicas de inmunoanálisis
se basa en el tipo de marcador utilizado para evidenciar la unión
del anticuerpo con el antígeno.
 ELISA
• Ensayo inmuno enzimático:el anticuerpo está acoplado a una enzima que al
reaccionar con un sustrato produce un producto coloreado visible.
• Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto
detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir
los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que
reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que
lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes
permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la
muestra.
• La técnica ELISA fue propuesta como una alternativa al radioinmunoensayo, ya que
este último suponía un riesgo para la salud debido a los isotopos radiactivos utilizados.
• Esta técnica se diferencia de otras basadas en la reacción Ag-Ac en que la unión a una
superficie sólida permite la identificación de reacciones específicas y, por lo tanto, la
obtención de resultados cuantitativos.
video

• https://www.youtube.com/watch?v
=fxyHClJ3sgo&t=228s
• https://www.youtube.com/watch?v
=KrGC0ZgIDI8
• https://www.youtube.com/watch?v
=_8r5XVmKfOc

• https://youtu.be/wb5c4oqzFxw
 Elisa directa
• Ensayo ELISA simple de dos capas. Las placas
ELISA se preparan recubriendo los pocillos
con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno. Se incuban con
anticuerpos marcados. Indican la presencia
de antígeno en la solución analizada. Es
necesario incluir controles negativos que
serán muestras del mismo tipo que las
analizadas (sangre, orina...), pero en las que
se tenga la certeza de la ausencia del
antígeno buscado. Asimismo se incluyen
controles positivos (soluciones donde se
encuentra el antígeno buscado).
 Elisa indirecta
• Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos.
• El sistema de detección emplea dos anticuerpos:
• Uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el
primario.
• La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación
de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por
cada primario.
• Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta,
pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático
permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un
método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión
por tener un eslabón más con respecto al método directo.
• El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia
de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH),
• Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el
núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los
pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos
contra epítopos en estas proteínas víricas.
• En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos
contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.
ELISA inhibidor o competitivo:
• Este tipo de ELISA es el más complejo. Se utiliza para detectar o cuantificar antígenos
presentes en bajas cantidades. Se denomina así ya que se utiliza un antígeno de referencia
que competirá con el antígeno de la muestra por la unión al anticuerpo.
• El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1. El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2. Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra
que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-
anticuerpo
3. Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia
competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
4. Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
5. Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al
anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
6. Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible.
 ELISA «sándwich»
(Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos)

• Se trata de un ensayo muy empleado en el que se

recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno.
• Después de lavar el exceso de anticuerpo, se
aplica la muestra problema en la que se encuentra
el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo.
• Después de un segundo lavado que elimina el
material no retenido, se aplica una solución con
un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.
• Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida
a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca.
• Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que
permite el segundo anticuerpo.
 ELISPot.
• ELISpot es un método altamente sensible en la
inmunología para enumerar las células que producen
una citoquina dada.
• Las células se estimularon en una placa de
microtitulación per-recubierta con un anticuerpo
específico anti-analito.
• En respuesta a la estimulación, las células liberan
citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito.
• Después de una etapa de lavado, que elimina las células
de los pozos, la ubicación de citoquinas secretadas se
visualiza mediante un anticuerpo de detección marcado
con enzima y su sustrato cromogénico correspondiente.
• El resultado final es un conjunto de manchas de color,
cada uno de los cuales representa un área donde se
había localizado una célula que secreta la citoquina.
 Inmunoflorescencia:

• El anticuerpo está unido a una

molécula que emite fluorescencia
Tipos de Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia directa
Inmunofluorescencia Indirecta
 Radioinmunoanálisis:
• En esta técnica al anticuerpo
se une un isótopo radiactivo,
siendo posible la
cuantificación del complejo
Ag-Ac a través de la
radiactividad emitida
Parte experimental
ELISA «sándwich»
• El kit de lisa para HBs Ag de
Wantai es un ensayo
inmunosorbente ligado a
una enzima para la detección
cualitativa de antígeno de
superficie del virus hepatitis
B en suero o plasma
humano, está dirigido para
su uso en laboratorio médico
para el tamizaje de donantes
de sangre y para el
diagnóstico de pacientes
infectados por el virus de
hepatitis B
 Paso 3: Adicional 50 µl de control positivo, control negativo y el espécimen
Procedimiento dentro de los posos, luego adicionar 50 µl del conjugado a cada pocillo
excepto el blanco y mezclar agitando la placa muy suavemente.
Paso 1: Dejar que los reactivos alcancen una temperatura
ambiente entre 18 a 30 °C por lo menos esto puede demorar
entre 15 30 minutos. Verificar el concentrado de buffer de
lavado por la presencia de cristales de sal si se presentan los
cristales o se han formado calentando 37 °C hasta que se
disuelven los cristales diluir el buffer de lavado de 1:20 agua
destilada o agua de ionizada emplear sólo envases limpios
para dilución del buffer

Paso 2: Enumeración de los posos colocar las tiras requeridas en el receptáculo y numerar
suficientes número de poso incluyendo control negativos (B1) controles positivos (C1) y un
blanco (A1) (ni las muestras ni los conjugados deben ser adicionales en el pozo blanco) y
muestra (D1)
 Paso 6: dispensar 50 µl de la solución cromogénica A y 50 µl de la solución
cromogénica B en cada poso incluyendo el vacío y mezclar o golpeando la placa

Procedimiento suavemente incubar la placa a 37 °C durante 15 minutos (evitar la luz)

Paso 4: Cubrir la placa con la lámina adhesiva en incubar por 60 minutos a 37 °C .

Paso 5: Al final de la incubación retirar lamina adhesiva de la placa, lavar cada poso cinco
veces con buffer de lavado diluido cada vez hacer que las micro placas se remojen con 30 60
segundos al final del último ciclo de lavado voltear las tiras sobre papel secar con secante y
toalla limpia y agitar suavemente las placas Paso 7 : Adicionar 50 µl de la solución parada en cada poso y mezclar muy
suavemente se desarrolla un color amarillo intenso en el control positivo y en
los posos de la muestra positiva.

Pasos 8: El lector de placas de poso en blanco y leer la absorción a 450 nano metros si se emplea un instrumento filtro dual establecer la
referencia en longitud de onda 600 o 650 nano metros calcular el valor de corte evaluar los resultados lee las observaciones dentro de los
10 minutos luego de pasar la reacción.
Otras…..
• La aglutinación: simple que ocurre al unirse el antígeno con el
anticuerpo, formándose grandes complejos que sedimentan. Esta
sedimentación es fácilmente visible, por lo que la técnica es rápida y
sencilla.
Otras…..
• Técnica rápida de inmunocromatografía : Se basa en la detección del
complejo antígeno-anticuerpo sobre una membrana de
nitrocelulosa. La muestra se hace migrar por capilaridad sobre esta
membrana, la que tiene los anticuerpos antivirales específicos fijados
y que evidenciarán la unión del antígeno mediante una banda de
color oscuro. Ambas pruebas requieren infraestructura mínima y
pueden estar disponibles en cualquier centro de salud.
Otras….
• La detección de genoma viral: En la actualidad es la técnica de elección en la mayoría de las infecciones virales que requieren
de diagnóstico virológico certero y rápido. Se basa en la identificación de secuencias específicas de ADN o ARN viral y puede
ser virtualmente utilizado para cualquier virus. Más aún, la masificación y perfeccionamiento de estas técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos (TAAN) nos ha llevado al descubrimiento de nuevos virus desde la detección de su genoma.
• Los análisis pueden ser específicos para un virus o bien para un grupo de ellos.
• Ventajas : Poder detectar virus que no pueden ser aislados en cultivos celulares, o en aquellas infecciones en las que la carga
antigénica es muy baja como para ser detectada por inmunoanálisis.
• Desventaja:Es la posibilidad de contaminación y falsos positivos.
• La técnica prototipo de las TAAN es la PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, en la que se amplifican segmentos de ADN
utilizando partidores específicos y una ADN polimerasa termoestable ( Taq polimerasa). Cabe mencionar que en los casos en
que se debe detectar ARN viral, la amplificación debe estar precedida por un paso de transcripción reversa, donde el ARN es
copiado a un “ADN copia (ADNc)”. Este ADNc será el templado que se utilizará en el proceso posterior de amplificación por la
polimerasa.
• Los productos de amplificación podrán ser visualizados mediante distintos métodos: electroforesis en el caso de PCR
convencional; mediante sondas fluorescentes que permiten la detección en la medida que ocurre la amplificación (PCR en
tiempo real) , o mediante la hibridación en plataformas que permiten la detección de múltiples virus a la vez (Ej: Pneumovir,
Filmarray).
• También nos entrega información que permite clasificar a los virus (genotipificación), conocer su distribución y transmisión en
las poblaciones, y detectar mutaciones asociadas a resistencia a drogas antivirales oa manifestaciones clínicas inusuales. Las
técnicas de secuenciación han avanzado enormemente en los últimos años, siendo la“Secuenciación de nueva generación
(NGS)” una promesa para avanzar en el conocimiento de la patogenia viral y para descubrir y rastrear nuevos o desconocidos
virus
técnicas de laboratorio, Muestras a solicitar y algunas
características de los exámenes de diagnóstico viral
 Tarea
• Este trabajo es grupal deberán recopilar toda la información en un
documento y
• Realizar una infografía de diagnóstico virológico ( tipos de diagnostico
fundamentos, para que virus, características
Haga clic para agregar y demás datos de
importancia) texto

• Realizar flujo grama con imágenes de procedimiento de técnicas de

inmunofluorescencia y Elisa .
• Investigar y elaborar un resumen de cultivo celular para diagnostico
de virus.