Curso: Biotecnología Vegetal: Tecnología Del DNA Recombinante

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE AGRONOMÍA
Curso: Biotecnología Vegetal
Tecnología del DNA Recombinante

Objetivos:
• Conocer los vectores plasmídicos comerciales y el proceso de

transformación de bacterias.
Introducción
Tecnología del DNA Recombinante, también denominado

clonación de genes o clonación molecular, es un término
general que compone procesos moleculares que conlleva a la
transferencia de información genética de un organismo a otro.
No hay un sólo conjunto de métodos que pueden ser usados

para lograr este objetivo; sin embargo, un experimento de DNA
recombinante a menudo presenta el siguiente formato:
Esquema de clonación de DNA
Transformación y selección de bacterias
recombinantes
Vectores Plasmídicos de Clonación
Micrografía electrónica del plásmido pBR322. Magnificación, ×100,000.

Fuente: K. G. Murti. © Visuals Unlimited.
Características de los vectores plasmídicos para
la clonación de fragmentos de DNA
Estructura de un vector Plasmídico
Mapas genéticos de vectores plasmídicos
comerciales
Plásmido pBR322
Plásmido pJET1.2
Plásmidos pUC18/19
Plásmidos PBS
Transformación bacteriana por choque térmico
 Cuando se clona el DNA, los plásmidos recombinantes se pueden introducir en las células
bacterianas por medio de una transformación, con el objetivo que la bacteria pueda
multiplicar los plásmidos recombinantes.
 Las células que han sido tratadas para su transformación se llaman células competentes.
 Una técnica usada para preparar células competentes consiste en tratar las células con
una solución de cloruro cálcico helada.
 Los átomos cargados positivamente (cationes), en el cloruro cálcico, atacan la membrana
bacteriana para crear poros a través de los cuales el plásmido pueda penetrar.
 Se cree que los cationes del cloruro cálcico desempeñan un papel importante a la hora de
neutralizar las cargas negativas de los fosfatos en la membrana bacteriana y el
plásmido.
Choque térmico
Transformación bacteriana por Electroporación
 La electroporación es otra técnica habitual utilizada para transformar las células bacterianas.
 En esta aproximación, se usa un instrumento llamado electroporador que produce un breve
choque eléctrico que introduce el plásmido en las células bacterianas sin matar a la mayoría de
células.
 La electroporación ofrece ciertas ventajas en comparación con el tratamiento con cloruro cálcico
en la transformación.
 La electroporación es rápida, requiere menos células y también puede utilizarse para introducir
DNA en muchos otros tipos de células, incluyendo las células de levadura, hongos, animales y
plantas. Además, la electroporación es un proceso mucho más eficaz que la transformación con
cloruro cálcico.
 Muchas más células recibirán el DNA extraño gracias a la electroporación contrariamente a lo que
ocurrirá con el tratamiento con cloruro cálcico. Debido a esto, se usa mucho menos DNA para
transformar las células (basta con un picogramo de DNA).
Electroporación
1. Se coloca una mezcla de bacterias y DNA

plasmídico en una cubeta.
2. Aplicación de un breve choque eléctrico a la
cubeta.
3. Las células que contienen DNA recombinante,
pueden ser seleccionadas en medio de cultivo.
Selección de bacterias recombinantes por antibióticos
 La selección antibiótica, es una técnica en la que las células bacterianas

transformadas se siembran en placas de agar con diversos antibióticos,
como medio para identificar bacterias recombinantes y células no
transformadas.
 Los antibióticos pueden actuar directamente o impedir la replicación
celular de las bacterias, gracias a que evitan que los procesos
importantes que tienen lugar en la célula bacteriana se produzcan
(como es el caso de la replicación del DNA, la síntesis de proteínas y la
síntesis de la pared celular bacteriana) y bloquean las enzimas
necesarias para el metabolismo celular.
Modos de acción de los antibióticos
Selección con antibiótico, de bacterias recombinantes
Selección de Bacterias recombinantes por X-gal
Recientemente, las técnicas de clonación a menudo incorporan otras estrategias

de selección más populares como la selección «azul-blanca».
 En la selección azul-blanca, se clona el DNA en un sitio de restricción en el gen

lacZ.
 El gen lacZ codifica β-galactosidasa (β-gal), una enzima que degrada el
disacárido lactosa en los monosacáridos glucosa y galactosa.
 Cuando se interrumpe por un gen insertado, el gen lacZ es incapaz de producir
β-gal funcional.
Selección azul-blanca de colonias de bacterias recombinantes
(a) Vector pUC18 diseñado

para selección azul-blanco;
(b) Selección de colonias
transformadas (blancas) a
partir de un medio que
contiene X-gal (sustrato para
la enzima B-galactosidasa).
vectores para clonación de fragmentos de
DNA de mayor tamaño
1. Vectores bacteriófagos.
2. BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano).
3. YAC (Cromosoma Artificial de Levadura).
Clonación en bacteriófago lambda
Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC)
Los BAC pueden aceptar insertos de DNA de entre los 100 a los 300 kb
Deriva del factor bacteriano F. Su

esqueleto contiene regiones
esenciales que le otorgan estabilidad y
bajo número de copias en cada
bacteria, parA, parB y parC.
oriS: origen de replicación
unidireccional.
CMr: gen marcador seleccionable en
medio con cloranfenicol.
repE: gen de proteína autoregulatoria
esencial para la replicación desde oriS.
El vector BAC más utilizado, tiene tres

sitios únicos de clonado, HindIII,
BamHI y SphI dentro del gen
marcador lacZ.
Cromosomas artificial de Levadura (YAC)
Los YACs son particularmente útiles para clonar grandes fragmentos de DNA de 200
kb hasta aproximadamente 2 megabases (mb = 1 millón de bases) de tamaño.
Cromosoma artificial de Levadura

(YAC).
ARS: origen de replicación, CEN:
centrómero,
TEL: telómeros,
URA: gen marcador seleccionable
para el desarrollo en medio con
uracilo.
Amp: gen marcador seleccionable
en medio con ampicilina.
El ADN es clonado en el sitio
BamHI.

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Tecnología del DNA Recombinante

• Conocer los vectores plasmídicos comerciales y el proceso de

Tecnología del DNA Recombinante, también denominado

No hay un sólo conjunto de métodos que pueden ser usados

Micrografía electrónica del plásmido pBR322. Magnificación, ×100,000.

1. Se coloca una mezcla de bacterias y DNA

 La selección antibiótica, es una técnica en la que las células bacterianas

Recientemente, las técnicas de clonación a menudo incorporan otras estrategias

 En la selección azul-blanca, se clona el DNA en un sitio de restricción en el gen

(a) Vector pUC18 diseñado

Deriva del factor bacteriano F. Su

El vector BAC más utilizado, tiene tres

Cromosoma artificial de Levadura

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