Biología molecular:

como herramienta
para estudios
poblacionales
• Maria Fernanda Díaz Narváez- 20201188275
• Yenifer Vanessa Díaz Arias-20191178804
 CONTENIDOS
1. Importancia de la biología molecular como técnica para la investigación

2. Herramientas moleculares aplicadas:

• Extracción y purificación de ADN

• Electroforesis de ADN
• PCR: Reacción en cadena polimerasa
• Microsatelites 
• Secuenciación de fragmentos de ADN 

3. Ejemplos a estudios poblacionales

 IMPORTANCIA DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR

Marcadores Moleculares Técnicas

01 Proteínas ARN y ADN 02 Procesos ecológicos-evolutivos

Procesos moleculares Aporte investigativo

03 Permite comprender, desde un
punto de vista molecular, los
04 Permite encontrar soluciones en
diferentes ámbitos.
procesos en los organismos vivos.
 Herramientas
Moleculares
Las técnicas de biología molecular sirven para
analizar ácidos nucleicos y para detectar, e
identificar tanto microorganismos, como diferentes
genotipos dentro de una misma especie y genes de
resistencia al tratamiento farmacológico.

• La diversidad genética
• Paternidad
• Conducta animal
• Adaptación
• Especiación e interacciones
 01 Extracción y purificación de ADN
• La extracción consiste en el aislamiento y purificación
de moléculas de ADN y se basa en las características
fisicoquímicas de la molécula.
Los grupos fosfato están cargados
negativamente y son polares, lo que le Cinco etapas principales:
confiere al ADN una carga neta homogeneización del tejido, lisis
negativa y lo hace altamente polar, celular, separación de proteínas y
características que son aprovechadas lípidos, precipitación y redisolución
para su extracción. del ADN.
 METODOS DE ANALISIS

• Cuantificación del ADN: La ley de Beer-

Lambert indica que la concentración de una
molécula en solución depende de la cantidad
de luz absorbida de las moléculas disueltas.
Una característica del ADN es que absorbe la
luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite
estimar su concentración mediante
espectrofotometría.

Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN

puro, proporciones menores a este valor indican
la presencia de proteínas

La pureza de ácidos nucleicos es la proporción

260/230, los valores aceptados se encuentran
en el rango de 2.0 a 2.2
 Comprobación de la integridad por
electroforesis
Además de conocer la cantidad
y calidad del ADN por
espectrofotometría, es
importante conocer si el ADN
obtenido está integro. La
integridad del ADN se puede
observar mediante
electroforesis en gel de agarosa
(ver capítulo de electroforesis)
 Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y
analizado mediante electroforesis, una parte de la
muestra se puede almacenar a 4 °C para los análisis
inmediatos y el material restante a -20 °C o -80 °C, para
una preservación por varios meses.
—Almacenamiento del ADN
 ELECTROFORESIS

Fragmentos de Planteamiento
Vin Thorne
ADN y ARN principal
Tamaño, visualizarlos Bioquímico del Instituto de
Virología de Glasgow, Sometidos a un campo
mediante una sencilla tinción,
y de esta forma determinar el quien a mediados de los eléctrico, la carga neta
contenido de ácidos nucleicos años 60 del pasado siglo negativa del ADN y el ARN
de una muestra, teniendo una estaba interesado en hará que estos se muevan
estimación de su caracterizar las distintas en dirección al ánodo
concentración y grado de formas de ADN.
entereza
La electroforesis de ADN puede realizarse
en geles de agarosa o de poliacrilamida.
Ambos tienen características diferentes en
cuanto a sus propiedades y modo de
preparación, por lo que se utilizará uno u
otro en función de la aplicación y objetivos
que persigamos
Análisis de electroforesis
 PCR
la PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias
proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra
que funciona como molde.

1. La identificación del sitio de origen de la replicación

2. El desenrollamiento de la doble hélice
3. La estabilización de la estructura desenrollada
4. La generación de cadenas iniciadoras complementarias con un
extremo 3’ libre que sirve de iniciador para que la ADN
polimerasa comience su actividad catalizadora
5. El avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento
6. Los pasos finales del ensamblaje de dos cadenas
complementarias
7. La identificación de los sitios de terminación
8. El superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN
 ¿QUE ES UN OLIGONUCLEOTIDO?
Origen de la técnica de PCR
En 1971, Gobind Khorana describió esta técnica al explicar la
Un oligonucleótido
replicación de un fragmentoes una secuencia
de ADN, cortacuando
pero fue en 1983 de DNA Kary
Mullis y sus compañeros,
generalmente de la llevaron
entre a2cabo y por
75primera vez en un
nucleótidos
laboratorio en california
sintetizados mientras trabajaban
artificialmente para tenerenuna
la fabricación
secuencia.de
oligonucleótidos y en el uso de indicadores para la secuenciación del
Los oligonucleótidos son utilizados generalmente
ADN.
como cebadores en las reacciones dePCRy como
sondas en losmicroarrays.
REACTIVOS
 DESNATURALIZACIÒN
La PCR inicia con la apertura de la doble
Alineamiento
cadena del ADN Una vez separadas las cadenas de ADN, se
alinean los indicadores a sitios específicos
entre 94 y 96 °C para romper los puentes de la región que se va a amplificar.
de hidrógeno que las unían, de esta
manera cada cadena queda como molde Se baja la temperatura entre 40 y 60°C lo
para la síntesis de una nueva cadena que permite la unión de los indicadores
complementaria de ADN.

EXTENSIÓN

Finalmente se sintetiza una nueva

cadena a una temperatura de 72 °C ,
una temperatura perfecta a la cual el
ADN polimerasa se une a los
indicadores e inicia la replicación
MICROSATELI
TES
Los microsatélites son secuencias de ADN
constituidas por repeticiones de motivos
nucleótidos de 1 a 6 pares de bases (desde
mononucleótidos hasta hexanucleótidos).

Se distribuyen en regiones codificantes y

no codificantes y se caracterizan por ser
altamente polimórficos en cuanto a su
longitud
 Mecanismos que contribuyen al polimorfismo de
los microsatélites
El deslizamiento en el apareamiento de las
hebras de ADN:slippage misspairing

En el proceso de replicación del ADN pueden ocurrir

alineamientos erróneos por un deslizamiento entre las
dos hebras
 Cuando el deslizamiento en el apareamiento ocurre en
la hebra nueva hay un incremento en el número de
repeticiones del microsatélite 
Cuando el alineamiento erróneo ocurre en la hebra
parental hay un decremento
Entrecruzamiento desigual:
(unequal crossing over).

Esto ocurre durante la recombinación, lo cual

da como resultado la pérdida de repeticiones
en una cromátida y el incremento en otra.
 Análisis de microsatélites en secuenciador
automático
Reactivos Equipos
● Taq ADN polimerasa  • Termociclador
● Buffer de amplificación • Micropipetas
● Cloruro de Magnesio (MgCl2) • Cámara de electroforesis
● Microsatélites 81  horizontal
● Mezcla de dNTP´s  • Fuente de poder
● Agua destilada ultrapura (ddH2O) • Secuenciador automático de
● Iniciadores específicos. Uno de los capilares
iniciadores debe estar marcado con un
fluoroforo.
● Agarosa (CAS N° 9012-36-6) 
● Buffer TBE 10X
● Bromuro de Etidio (CAS N° 1239-45-8)
 APLICACIONES
• A partir de los datos generados con esta técnica es posible estimar parámetros poblacionales básicos
para estudios ecológico-evolutivos, como la heterocigosis, el tamaño efectivo, la distancia genética y el
nivel de diferenciación de las poblaciones
•
Mediante los microsatélites se pueden estimar tiempos de coalescencia y parámetros evolutivos de las
poblaciones como el tiempo a la expansión poblacional y theta(θ)  que es un estimador histórico de la
variación genética Es por esto que el análisis de microsatélites se ha generalizado para 94
Herramientas moleculares aplicadas en ecología estudios de genética de poblaciones, filogeografía y
genética 
•
Los altos valores de polimorfismo de los microsatélites permiten identificar genéticamente a los
individuos dentro de una población. Debido a que la información de un conjunto de alelos puede ser
única para cada individuo y similar entre los miembros de una familia, es posible utilizar a estos
marcadores para la caracterización genética de linajes y razas. Por ejemplo, Parker y colaboradores
(2004) a través del análisis de 95 loci de microsatélites de Canis familiaris lograron la de 85 razas de
perros.
ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD) y regiones intermedias entre
secuencias simples repetidas (ISSR)
 ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD) y regiones intermedias entre
secuencias simples repetidas (ISSR)
Estos marcadores usan iniciadores (también llamados oligonucleótidos o primers)
que amplifican al azar diferentes regiones en el genoma y generan un patrón de
productos de PCR o huella genética que se visualizan mediante una
electroforesis en geles de agarosa o acrilamida.

estos marcadores son marcadores dominantes, lo cual significa que bajo el

modelo de un locus con dos alelos, la presencia de una banda representa al
genotipo dominante (tanto homócigo como heterócigo), mientras que una
ausencia de la banda representa al genotipo homócigo recesivo.
LOS RAPDs

Es una técnica que consiste en la

amplificación de segmentos de
ADN con iniciadores pequeños
(generalmente de 10 nucleótidos de
longitud) de secuencias aleatorias
no-palindrómicas, con un contenido
de G + C entre 50 y 80%,
 LOS ISSRs

amplifican fragmentos que se ubican entre las

repeticiones de secuencias
simples (simple sequence repeats o SSRs),
también llamadas microsatélites.

Los iniciadores de ISSRs suelen ser de

16 a 25 pares de bases (pb) y están
conformados por una secuencia repetida de un
di- o trinucleótido complementario al
microsatélite.
 APLICACIONES
● Los datos obtenidos por medio de RAPDs e ISSRs han permitido conocer
los patrones de diversidad y estructuración genética presente en las especies
de plantas en función de su ciclo de vida, distribución geográfica y
estrategias reproductivas.
● Particularmente, los ISSRs han permitido conocer los patrones de diversidad
● genética en especies de plantas silvestres como por ejemplo, Calamagrostis
● En México, los RAPDs se han utilizado para evaluar poblaciones silvestres
y
● domesticadas de chile. Ambos marcadores se han empleado en estudios del
género Agave
 SECUENCIACION
Historia ¿Qué es?
En 1976, Walter Fiers y colaboradores,
secuenciaron el genoma completo del  El orden que tienen los
bacteriófago Ms2 de aproximadamente nucleótidos en el ADN es lo que
unas 3 500 pares de bases (pb). Pero es en se denomina secuencia (Figura 1)
1977 cuando surgen dos técnicas y las técnicas y métodos que se
modernas de secuenciación de ADN: la utilizan para conocer esa
secuenciación química de Maxam y Gilbert secuencia son llamados de
(1977) y el método que revolucionó a la secuenciación
biología molecular, la secuenciación
enzimática de Sanger
 TECNICA ENZIMATICA

Se basa en la interrupción controlada de la replicación del

ADN in vitro. Se realiza una PCR del fragmento que se va a
secuenciar pero, a diferencia de una PCR convencional (ver
capítulo de PCR), se utiliza un solo iniciador y se agregan
dideoxinucleótidos (ddNTPs) que carecen del grupo hidroxilo
en el extremo 3´ y están marcados con radiactividad o con
fluoróforos.
Cuando se incorpora un dideoxinucleótido a la cadena en
elongación, se termina su amplificación, de tal manera que al
final, se tienen fragmentos de diferente longitud, cada uno
terminando en un ddNTPs. Los fragmentos obtenidos, se
separan y analizan electroforéticamente de manera manual o
automática
 EJEMPLOS DE LAS
HERRAMIENTAS MOLECULARES
APLICADAS A ESTUDIOS
POBLACIONALES
ESTUDIO PILOTO PARA LA EVALUACIÓN DEL USO DE MUESTRAS FECALES EN LA
IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS DE POBLACIONES NATURALES DE OCELOTE (Leopardus
pardalis) EMPLEANDO HERRAMIENTAS MOLECULARES, EN COLOSÓ (SUCRE), COLOMBIA.
 CONTEXTO
● Contexto: El Ocelote (Leopardus pardalis) es
una de las especies de felinos menos estudiadas
en Colombia, ya que las metodologías invasivas
no son lo suficientemente eficientes para la
obtención de información sobre sus poblaciones,
impidiendo la realización de planes eficaces que
permitan la conservación de esta especie en
Colombia.

● Objetivo: Evaluar la viabilidad del uso

● Herramientas utilizadas: Dos marcadores de muestras fecales para la
moleculares diferentes, amplificación por identificación genética de individuos de
PCR y pureza-calidad del ADN de las heces. poblaciones naturales de Leopardus
pardalis empleando herramientas
moleculares de ADN.
 ANÁLISIS Y CONCLUSIONES DEL
ESTUDIO
En este estudio se utilizó el gen
mitocondrial 16s como para la
identificación de la especie L. Pardalis. Se
realizó un alineamiento con los resultados
obtenidos de la secuenciación de las
extracciones de este gen (16s) en heces
fecales de ocelote recolectadas en campo,
en sangre de ocelotes en cautiverio y en
secuenciaciones halladas en la base de
datos NCBI con la herramiente de BLAST.
 ANÁLISIS Y CONCLUSIONES DEL
ESTUDIO
Según los resultados de la electroforesis el gen
mitocondrial 16S puede ser usado para la identificación
de felinos usando ADN extraído de muestras fecales, sin
embargo al ser un gen que presenta pocas variaciones
nucleotídicas entre especies no es eficiente para la
identificación de L. pardalis.

Las muestras fecales permiten obtener registros de L.

pardalis en Colombia y se pueden convertir en fuente de
información para la realización de análisis genéticos con
este especie
Here’s an assortment of alternative resources whose style fits the one of this template NO BORRES LOS
DIBUJOS JAJAJA
por si de pronto necesitamos rellenar con ellos algo