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    SEROLOGIA

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    Daniel Hurtado de Mendoza Caceres
    Este documento describe diferentes técnicas serológicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras. Describe pruebas directas e indirectas, así como técnicas primarias como inmunoprecipitación, aglutinación, fijación de complemento y neutralización, y secundarias como inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis. Explica conceptos como efecto prozona e inmunodifusión

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    SEROLOGIA

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    Daniel Hurtado de Mendoza Caceres
    43 vistas35 páginas
    Este documento describe diferentes técnicas serológicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras. Describe pruebas directas e indirectas, así como técnicas primarias como inmunoprecipitación, aglutinación, fijación de complemento y neutralización, y secundarias como inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis. Explica conceptos como efecto prozona e inmunodifusión

    Descripción original:

    SEROLOGIA DEL BANCO DE SANGRE

    Derechos de autor

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    Este documento describe diferentes técnicas serológicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras. Describe pruebas directas e indirectas, así como técnicas primarias como inmunoprecipitación, aglutinación, fijación de complemento y neutralización, y secundarias como inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis. Explica conceptos como efecto prozona e inmunodifusión

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    SEROLOGIA

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    Daniel Hurtado de Mendoza Caceres
    Este documento describe diferentes técnicas serológicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras. Describe pruebas directas e indirectas, así como técnicas primarias como inmunoprecipitación, aglutinación, fijación de complemento y neutralización, y secundarias como inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis. Explica conceptos como efecto prozona e inmunodifusión

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    de 35

    Microbiologí

    a
    SEROLOGÍA
    Serologí
    a
    Basadas en la reacción antígeno anticuerpo
    Dos grandes categorías:
    Pruebas directas: determinan la presencia del antígeno.
    Pruebas indirectas: determinan la presencia de anticuerpos específicos.
    Técnica
    s
    Primarias: Miden directamente la unión Ag‐Ac
    ‐Inmunoprecipitación
    ‐Aglutinación
    ‐Fijación de complemento
    ‐Neutralización

    Secundarias: La unión Ag‐Ac se detecta midiendo la formación de inmunocomplejos.


    ‐Fluorescencia: inmunofluorescencia
    ‐Radiactividad: radioinmunoanálisis
    ‐Enzimas: enzimoinmunoanálisis
    ‐Metales pesados: Inmunocromatografía
    Técnicas de
    precipitación
    Se usa cuando el Ag es es soluble (solución salina)
    POCO USO
    Tipos:
    Inmunoprecipitación en medio líquido
    Detecta: Ag o Ac en una muestra, cuando se mezclan en fase líquida
    Nota: para que exista reacción Ag‐Ac, los dos componentes deben estar en
    proporciones óptimas
    Lectura: La reacción Ag-Ac puede evidenciarse gráficamente en la "curva de
    precipitación"
    Efecto prozona: Ausencia de reacción inmunitaria cuando hay altas concentraciones de
    Ac.
    Zona de equivalencia: Todo el Ag y Ac se encuentra formando complejos
    macromoleculares insolubles (teoría del retículo).
    Técnicas de
    precipitación
    Inmunoprecipitación en medio sólido:
    Utiliza un soporte sólido gelificado
    Dos categorías:
    Inmunodifusión
    Puede ser: Simple en tubo, Doble en placa, Simple en placa
    Lectura: La reacción Ag‐Ac puede evidenciarse:
    Formación de anillo o lineal: precipitación visible en la agar
    Inmunoelectroforesis
    Se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se
    desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un pocillo
    lateral.
    Inmunoprecipitación: Inmunodifusión simple

    Inmunoprecipitación: Inmunodifusión doble


    Técnicas de
    aglutinación
    Se usa cuando el Ag es particulado
    Más sensibles que las técnicas de precipitación
    Fundamento: Ag se encuentran ligados a eritrocitos o partículas látex
    En microbiología puede ser: (-) (+)
    ‐ Cualitativo
    ‐ Cuantitativo “titulación del suero”

    + =

    Aglutinación: Reacción
    Eritrocitos o Suero de pacientes Ag-Ac
    partículas látex (Anticuerpos)
    ligados a Ag
    Cualitativos:
    ‐ Rosa Bengala: Brucelosis
    ‐ Monotest: Mononucleosis infecciosas (VEB)
    ‐ Ag capsular cryptococcus neofromans: Meningitis criptocócica
    ‐ Meningitis test: Meningitis bacterianas (H. Influenzae tipo b, S. pnuemoniae, N.
    Meningitidis A, B, C, Y o W135 y E. coli K1)
    ‐ Staphslide: Identificación de S. aureus
    - Aglutinación Streptococcus: Identificación de especies de Streptococcus

    Cuantitativo:
    ‐ RPR (Sífilis)
    Técnicas de fijación de
    complemento
    Fundamento: inmunocomplejo Ag-Ac activa el complemento y produce lisis celular
    (eritrocitos y otras células).
    Proceso en dos fases:
    ‐Se incuba el suero problema con el Ag y el complemento
    ‐Se añade un sistema indicador, como eritrocitos de oveja recubiertos de Ac específicos
    (hemolisinas).
    -Si se lisan los eritrocitos indica que hay complemento libre que no se fijó en la 1a
    reacción y, por tanto, no hay Ac en el suero.

    - En microbiología: brucelosis, micoplasma, coccidioidomicosis, histoplasmosis…


    Inmunofluorescencia
    Utiliza Ac marcados (“Conjugados”) con colorantes fluorescentes o fluorocromos
    (fluoresceína o rodamina) como sistema indicador.
    Cuando se aplica luz UV en el microscopio de fluorescencia, el fluorocromo emite luz
    visible: verde, naranja/rojo o azul.
    Tipos:
    Inmunofluorescencia directa (ID)
    Inmunofluorescencia indirecta (IFI): más sensible que la ID y permite hacer titulaciones
    del suero mediante diluciones
    La IF en microbiología:
    Virus: respiratorios, herpes, sarampión, parotiditis…
    Bacterias: bordetella, rickettsia, chlamydia
    Parásitos: toxoplasma, echinococcus, tripanosoma
    Radioinmunoanálisis
    Marcadores: radioisótopos (se cuantifica en contador de centelleo).
    (RAI)
    Actualmente poco uso (desplazado por técnicas de enzimoinmunoensayos)
    Tipos:
    RAI competitivo/directo: Se usa Ag marcado que es desplazado por el Ag no marcado de
    la muestra
    RAI no competitivo/indirecto: Se usa Ac secundario marcado con radiactividad.
    Enzimoinmunoanálisis
    (EIA)
    Fundamento: participación de una enzima y su sustrato para desarrollar color visible, luz
    o fluorescencia.
    Enzimas más utilizadas: peroxidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, glucosa‐6‐P
    deshidrogenasa, etc.
    Técnicas:
    ‐Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA)
    ‐Inmunoblotting (WB)
    ‐Inmunomigración (Lateral flow)
    ‐Inmunoanálisis por quimioluminiscencia (CLIA)
    ELIS
    A Ac.
    Utiliza placas de poliestireno con múltiples pocillos que se “tapizan” con el Ag o con el

    La reacción se revela añadiendo el sustrato que al actuar sobre la enzima del conjugado
    da lugar a un color visible que es cuantificable mediante un colorímetro especial (“Lector
    de ELISA”).
    Tipos ELISA

    Al igual que la IF, el color emitido es proporcional a la cantidad de Ac


    específico que se fija al Ag

    En microbiología: Múltiples usos, principalmente VIH


    Inmunoblotting: Western-Blot
    Detectar la presencia de Ac frente a mezclas complejas de Ag.
    En microbiología: VIH
    Pasos:
    ‐Separar la mezcla de Ag mediante electroforesis en geles de
    poliacrilamida
    ‐Se transfiere a papel de nitrocelulosa
    ‐Inmunodetección: adición de suero, adición de Ac secundario
    conjugado y adición de sustrato de revelado.
    ‐Se observan una o varias líneas de precipitación según existan Ac
    frente a una o varias proteínas
    Inmunomigració
    n
    Sinónimos: inmunocromatografía, lateral flow, dipstick, “jabonera”
    Kits rápidos de diagnóstico microbiológico: VIH, Mononucleosis, Chlamydia, antigenurias
    legionella/pneumococo, S. pyogenes, C. difficile, malaria, adenovirus, rotavirus,
    influenza….
    Utiliza Ac marcados con metales pesados: selenio (color azul) y oro (color rosa).
    La muestra fluye a través de una tira reaccionando con el Ac marcado, con el cual forma
    inmunocomplejos, y después con un Ac frente al antígeno inmovilizado, que captura los
    inmunocomplejos y reacciona con el sustrato dando color.
    Detección de
    Ac:
    Almohadilla Almohadilla Línea test Línea control
    de muestra de conjugado

    Ac del
    paciente
    Ag marcado Inmunocomplejo entre Inmunocomplejo entre
    con oro Ac del paciente y Ag Ac de la tira y Ag
    coloidal marcado de la tira marcado de la tira
    Detección de
    Ag:
    Almohadilla Almohadilla Línea test Línea control
    de muestra de conjugado

    Ag del
    paciente
    Ac marcado Inmunocomplejo entre Inmunocomplejo entre
    con oro Ag del paciente y Ac Ag de la tira y Ac
    coloidal marcado de la tira marcado de la tira
    Inmunoanálisis por quimioluminiscencia
    (CLIA)
    Emisión de radiación (luz) producida por una reacción química
    En este caso la reacción química se trata de una oxidación: sobre una sustancia
    (luminol o el éster de acridina)
    CLIA cuantifica la reacción Ag-Ac
    Serología Virus hepatitis
    B (VHB)
    Virus hepatitis B:
    Antes de explicar la serología, debo saber:
    VHB es un virus DNA, envuelto y que pertenece a la familia
    Hepadnaviridae (esto ya lo sabemos por la clase de virus)
    Por si lo preguntan: tiene 8 genotipos (denominados desde la
    letra A a la H)
    Como los demás virus tendrá: un genoma (ADN), una cápside
    (icosaedrica) y esa unión de genoma y cápside se llama: “core”
    (recordad la explicación de virus).
    Si me aprendo la estructura, entenderé la serología; ya que:
    En nucleocápside o core se encuentran 2 Antíegenos:
    El an
    En la nucleocápside o core se
    encuentran 2 Antígenos:
    1. El antígeno del core:
    HBcAg
    2. El antígeno e: HBeAg
    Además en la envoltura se
    encontrará otro antígeno:
    Antígeno de superficie
    (HBsAg)
    Recuerden que cuando les expliqué serología dije: todo antígeno me
    generará un anticuerpo, por lo tanto además de los antígenos que hemos
    mencionado tendremos sus anticuerpos correspondientes:
    anti‐HBs: El anticuerpo contra el HBsAg
    anti‐HBc: El anticuerpo contra el HBcAg, que puede ser de dos tipos: IgM e
    IgG
    anti‐Hbe: El anticuerpo contra el HBeAg

    Resumen: en la serología de la hepatitis B encontraremos: 3 antígenos y 4


    anticuerpos:
    ANTIGENOS ANTICUERPOS

    HBsAg anti‐HBs

    anti‐HBc (IgM)
    HBcAg
    anti‐HBc (IgG)

    HBeAg anti‐Hbe
    Ahora sí entremos en la interpretación de la
    serología:

    Para entenderla, hay que saber qué significa cada


    antígeno y me haría unas preguntas:
    ‐ HBsAg = Contacto: Tengo o no tengo el virus?
    ‐HBcAg = Tipo de contacto: Tengo el virus hace
    poco o hace mucho tiempo?
    ‐Si es hace poco será de tipo IgM
    ‐Si es hace mucho será de tipo IgG
    ‐ HBeAg = Replicación: El virus se está
    multiplicando?
    1. Infección AGUDA:
    ‐ La primera pregunta que me hago es: Tengo el virus? Como digo
    que es una infección aguda entonces obviamente tendré el virus:
    HBsAg
    positivo (como el antígeno es positivo, su anticuerpo será negativo. Ag y
    Ac irán al contrario)
    ‐ La segunda pregunta que me hago es: Tengo el virus hace
    mucho o hace poco? Como se trata de una infección aguda, o sea
    actual/ahora
    mismo: tendré un Anticuerpo de tipo: anti-HBc (IgM) positivo y anti-HBc
    (IgG) negativo
    ‐ La tercera pregunta que me hago es: El virus se está replicando?
    Como se trata de una infección aguda es obvio que el VHB está
    actualmente multiplicandose (replicando): HBeAg positivo (como el
    antígeno es positivo, el anticuerpo será negativo. Ag y Ac siempre al
    contrario)

    ‐ Conclusión: una infección AGUDA por VHB, será: HBsAg positivo,


    anti- HBc (IgM) positivo, anti-HBc (IgG) negativo y HBeAg
    positivo.
    2. Infección CRÓNICA:
    - La primera pregunta que me hago es: Tengo el virus? Como digo que es
    una infección crónica, quiere decir que AÚN estoy infectado; entonces
    obviamente tendré el virus: HBsAg positivo (como el antígeno es positivo, el
    anticuerpo será
    negativo. Ag y Ac irán al contrario)
    - La segunda pregunta que me hago es: Tengo el virus hace mucho o hace poco?
    Como se trata de una infección crónica, o sea llevo mucho tiempo infectado:
    tendré un Anticuerpo de tipo: anti-HBc (IgM) negativo y anti-HBc (IgG) positivo
    -
    La tercera pregunta que me hago es: El virus se está replicando? Si en la
    pregunta me especifican que es una infección crónica replicativa será: : HBeAg
    positivo y su anticuerpo anti-Hbe negativo. Si en el examen me especifican que
    es una infección crónica NO replicativa será: HBeAg negativo por lo tanto su
    anticuerpo anti-Hbe positivo.

    - Conclusión:
    - Una infección CRÓNICA REPLICATIVA por VHB, será: HBsAg positivo, anti-HBc
    (IgM) negativo, anti-HBc (IgG) positivo y HBeAg positivo.
    - Una infección CRÓNICA NO REPLICATIVA por VHB, será: HBsAg positivo, anti-
    HBc (IgM) negativo, anti-HBc (IgG) positivo y HBeAg negativo.
    3. Infección RESUELTA, PASADA O “CURADA”:
    ‐ La primera pregunta que me hago es: Tengo el virus? Como
    digo que es una infección curada o pasada entonces obviamente
    ya NO
    tengo el virus: HBsAg negativo por lo tanto su Anticuerpo es
    positivo: anti-HBs positivo
    ‐ La segunda pregunta que me hago es: Tengo el virus hace mucho
    o hace poco? Como se trata de una infección pasada: tendré un
    Anticuerpo de tipo: anti-HBc (IgM) negativo y anti-HBc (IgG)
    positivo
    ‐ La tercera pregunta que me hago es: El virus se está replicando?
    Como se trata de una infección pasada, ya no tengo virus que se
    replique: HBeAg negativo por lo tanto su anticuerpo anti-Hbe
    positivo

    ‐ Conclusión: una infección RESUELTA por VHB, será: HBsAg


    negativo, anti-HBs positivo, anti-HBc (IgM) negativo, anti-HBc
    (IgG) positivo, HBeAg negativo, anti-Hbe positivo.
    4. Y una persona vacunada?
    ‐ Tendrá SÓLO anti-HBs positivo
    GRACIAS

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