UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y AGRICULTURA

Trabajo de integración curricular, previo a la obtención del título de Ingeniera en

Biotecnología

Aislamiento y caracterización de microorganismos probióticos a partir de una

bebida tradicional (Chaguarmishqui), considerando dos especies de penco
(Agave), “azul” y “blanco”, para su aplicación como agente antimicrobiano. 

Autores:  Mora Rosero, Nathaly Michelle & 

                 Rosero Ganchozo, Diana Leticia

Tutor:     Sánchez Llaguno, Sungey Naynee, PhD.

FECHA ÚLTIMA REVISIÓN: 13/12/11 CÓDIGO: GDI.3.1.004 VERSIÓN: 1.0
1 Introducción
 Introducción
Text Here Generalidades
Gram positivas,
Origen del penco
You can simply
catalasa negativa y
impress your audience
Planta inducida
anden Ecuador
add a uniquedesde
zing la época colonial. de textura cremosa.
Se expande por imbabura, Manabí, Loja, Cañar.

02 Clasificación
Text Here
Subproductos Text Here Homofermentativas,
Se obtiene la pulpa, sabia o mucílago = Chaguarmishqui heterofermentativas,
termófilas y mesófilas
aumenta su valor nutricional con el tiempo.
BAL
Propiedades antimicrobianas
03 04
Características fisicoquímicas y microbiológicas Las bacteriocinas son los
TextsuHere
Villacrés (2018) indica alto contenido de azúcares, metabolitos que más se
aminoácidos, vitaminas, minerales, levaduras y bacterias destacan.

Microorganismos presentes Aplicación

Agentes de control
Presencia de probióticos, beneficiosos para el ser
biológico
humano.
Defensa antimicrobiana
Antifúngicos
2 Objetivos e
Hipótesis
 Objetivos
General
Aislar y caracterizar microorganismos probióticos a partir de una bebida tradicional
(Chaguarmishqui), considerando dos especies de penco (Agave americana), “azul” y
“blanco”, para su aplicación como agente antimicrobiano

Específicos
● Caracterizar las propiedades fisicoquímica y microbiológica de la bebida
tradicional Chaguarmishqui

● Aislar y caracterizar los microorganismos probióticos presentes en la bebida

tradicional Chaguarmishqui, considerando dos especies de penco (Agave
americana), “azul” y “blanco”

● Evaluar de forma In Vitro la actividad antimicrobiana de los microorganismos

probióticos frente a microorganismos patógenos
 Factor A
H0: Las especies de penco no influyen en los cambios de las
características fisicoquímicas y microbiológicas del chaguarmishqui.

Hipótesis
Ha: Las especies de penco influyen en los cambios de las
características fisicoquímicas y microbiológicas del chaguarmishqui.

Diseño Factor B

AxB H0: El estado del chaguarmishqui no influye en los cambios de las

características fisicoquímicas y microbiológicas de su composición.
Ha: El estado del chaguarmishqui no influye en los cambios de las
características fisicoquímicas y microbiológicas de su composición.

Interacción AxB
H0: El efecto de las interacciones entre los factores especies de penco y
estado de fermentación no influye en los parámetros fisicoquímicos y
microbiológicos.
Ha: El efecto de las interacciones entre los factores especies de penco y
estado de fermentación influye en los parámetros fisicoquímicos y
microbiológicos.
 Factor A
H0: Los microorganismos probióticos presentes en las diferentes
especies de penco poseen la misma capacidad antimicrobiana.

Hipótesis
Ha: Los microorganismos probióticos presentes en las diferentes
especies de penco no poseen la misma capacidad antimicrobiana.

Diseño Factor B
AxBxC H0: La inhibición de los microorganismos patógenos no se ve
influenciada por la actividad antimicrobiana de las bacterias aisladas.
Ha: La inhibición de los microorganismos patógenos se ve influenciada
por la actividad antimicrobiana de las bacterias aisladas.

Factor C
H0: Los tipos de solución no influyen en la actividad antimicrobiana de
los microorganismos probióticos.
Ha: Los tipos de solución influyen en la actividad antimicrobiana de los
microorganismos probióticos.
3 Materiales y
Métodos
 Diseño Experimental
AxB
Factores y niveles del experimento

Factores Simbología Niveles

a0 Azul
Especie de
penco (A) a1 Blanco

b0 Fresco
Estado (B)
b1 Fermentado
 Diseño Experimental
Tipo de diseño
ANOVA DBCA con arreglo
factorial AxB (2x2).
Tratamiento a comparar

Factores Simbología Niveles Repeticiones

5 repeticiones por
T1 a0 b 0 Azul+ Fresco tratamiento con un total de
20 unidades experimentales.
T2 a0 b1 Azul+
Fermentado

T3 a1 b0 Amarillo + Análisis funcional

Fresco Prueba de significancia
Tukey.
T4 a1 b1 Amarillo +
Fermentado

Variables a medir
pH, Acidez, Sólidos
solubles, Recuento de
mohos y bacterias
 Factores Simbología Niveles

Especie de penco (A) Diseño Experimental

a0
Azul

AxBxC
a1 Blanco

Factores y niveles del experimento

Microorganismo patógeno (B) b0 Escherichia coli

b1 Citrobacter freundii

b2 Klebselia pneumoniae
 Diseño Experimental
AXBXC Tratamiento a comparar

Tipo de diseño Factores Simbología Niveles

ANOVA DBCA con arreglo
factorial AxBxC (2x3x2). T1 a0 b0 c 0 Azul+ E. coli + SolBac

T2 a0 b 0 c 1 Azul+ E. coli + Sol

T3 a0 b 1 c 0 Azul+ C. freundii + SolBac

Repeticiones
3 repeticiones por tratamiento T4 a0 b 1 c 1 Azul+ C. freundii + Sol
dando un total de 36 unidades
experimentales. T5 a0 b 2 c 0 Azul+ K. pneumoniae + SolBac

T6 a0 b 2 c 1 Azul+ K. pneumoniae + Sol

Análisis funcional T7 a1 b 0 c 0 Blanco+ E. coli + SolBac

Prueba de significancia
T8 a1 b 0 c 1 Blanco + E. coli + Sol
Tukey.
T9 a1 b 1 c 0 Blanco + C. freundii + SolBac

T10 a1 b 1 c 1 Blanco + C. freundii + Sol

Variable a medir
Halo de inhibición T11 a1 b 2 c 0 Blanco + K. pneumoniae + SolBac

T12 a1 b 2 c 1 Blanco + K. pneumoniae + Sol

 Extracción
Fase 1
del mucílago
Obtención Fermentación

Fermentació
n discontinua

Aislamiento de BAL
Aislado Caracterización
puro de BAL

38ºC
 Fase 1
Caracterización fisicoquímica y microbiológica
pH Acidez Sólidos solubles

INEN 389 INEN 381 Refractómetro de 45º

Recuento de Recuento de
aerobios mohos/levaduras

Siembra en petrifilm
(UFC/ml)
 Fase 2
Incubación a 37 °C
durante 48 horas
Preparación de soluciones
Solución +
Bacterias
Centrifugación 3500 rpm Filtración

Solución libre
de células

Microorganismos patógenos Turbidez 0,5 Mcfarland

Inoculación en
suero fisiológico
Solución de
microorganismos
patógenos
 Fase 2
Actividad antimicrobiana

Placas con medio Mueller Hinton Incubación a 37 °C durante 48 h

Pozos de 6 mm

Esparcimiento de solución de patógenos Adición de 75 µL de soluciones BAL Variable a medir: Halo de inhibición
4 Resultados y
Discusión
 Caracterización
Factor A
Sólidos solubles
pH Acidez
Acidez

4,67 0,39
4,59 11,58
0,30

13,57

Valores altos debido al estado de

Según Escalante et al. (2016) son maduración y al adecuado tiempo de
valores adecuados para iniciar la El chaguarmishqui por lo general no es recolección (Changoluisa, 2020).
fermentación y Changoluisa (2020), ácido, por lo que exhibe bajos valores Las ligeras variaciones que se notaron
menciona que son valores (Herrera, 2008). ocurren debido a diferencias en el
característicos del chaguarmishqui. tiempo de maduración, almacenamiento
y zona de siembra (Villacis et al (2021).
 Caracterización
Factor A
Recuento de mohos y
Recuento de aerobios
levaduras
1,5X10^6

1X10^7
9,6X10^5

6,6X10^5

La población de microorganismos de los Se notó una mayor población en el caso del

extractos de ambas especies de penco fue penco blanco, probablemente debido a la
elevada, debido a la recolección al aire mayor concentración de azúcares que
libre (Jurado & Sarzosa, 2009). proporciona (Changoluisa, 2020) .
 Caracterización
Factor B
pH Acidez Sólidos solubles

5.50
16,10
0,62
9,05

3,75 0,08

Porras (2011) el mucílago del

Herrera (2008)estableció un valor Robles et al. (2016) explican que la
penco se encontró en un nivel
parecido y determinó que para el reducción de sólidos solubles se
ligeramente ácido en su estado
pulque el valor mínimo debe ser de debe a la transformación de los
fresco. Para el valor del fermentado
0,40 y el máximo de 0,75. azúcares a etanol y CO2.
la INEN 2304 (2017) se considera
que es un valor aceptable.
 Caracterización
Factor B
Recuento de Recuento de mohos
aerobios y levaduras

4,5x10^5 1,6x10^6
2,1x10^7
6x10^5

(Ramirez et al., 2011) este valor El alto valor puede atribuirse a la presencia
incrementó debido a que las bacterias de levaduras. Lema (2015) afirma que son
llegan a una etapa de crecimiento las principales encargadas de la
exponencial fermentación de la bebida.
Análisis de conglomerados
 Análisis de componentes
principales
Gráfico de
componentes
Matriz de correlación
principales

pH Acidez Sólidos Aerobios Mohos y

solubles levaduras

Correlación pH 1,000 -,971 ,974 -,580 -,825

Acidez -,971 1,000 -,896 ,749 ,880

Sólidos ,974 -,896 1,000 -,423 -,774

solubles

Aerobios -,580 ,749 -,423 1,000 ,846

Mohos y -,825 ,880 -,774 ,846 1,000

levaduras
 Identificación de bacterias
ácido lácticas
Pruebas microbiológicas
y bioquímicas Gram positivo Gram positivo
Catalasa Catalasa
negativo negativo
Bacilo Coco

Pruebas molecular

Código Bacteria Homología

Penco Azul Lactobacillus plantarum 100%

Penco Blanco Weissella confusa 100%

 Actividad antimicrobiana

a0 b0 c0 a0 b0 c1 a0 b1 c0 a0 b1 c1 a0 b2 c0 a0 b2 c1

a1 b0 c0 a1 b0 c1 a1 b1 c0 a1 b1 c1 a1 b2 c0 a1 b2 c1
 Actividad antimicrobiana
Factor A Factor B

2,78 1,79
1,36 1,83
2,58

Jay (2002) menciona que en esta bebida Serna & Enríquez 2013 demostraron el
se pueden encontrar microorganismos efecto antimicrobiano contra E. coli y
del género Lactobacillus, Lactococcus y Bartkiene et al. (2020) evaluaron la
Streptococcus, y heterofermentativos del inhibición de K. pneumoniae y C. freundii
género Weissella y Lactobacillus. obteniendo resultados favorables.
 Actividad antimicrobiana
Factor C Interacción AxB

3,00
1,14

Los tratamientos utilizando la SolBac dieron

mejores resultado, la presencia de la La inhibición más efectiva fue por parte de
bacteria en el medio permitía una mayor W. confusa frente a C. freundii. Shah et al.,
capacidad para producir sus metabolitos (2016) muestra resultados similares.
(Serna & Enríquez, 2013)
5 Conclusión y
Recomendación
 Conclusiones
Respecto a la Respecto a la
Caracterización Identificación
Entre los tratamientos fermentados y sin
Se evidenció presencia de BAL para ambas
fermentan se muestra una disminución de pH y
especies de penco, dado que presentaron
1 sólidos solubles, y un aumento de los valores
características morfológicas similares a las
que corresponden a la acidez, recuento de
descritas para estas bacterias. Además,
aerobios y recuento de mohos y levaduras
mediante una caracterización morfológica se
después de los 3 días de fermentación
determinó que L. plantarum es la bacteria
predominante en la especie de penco azul y
El chaguarmishqui del penco blanco, ofrece
W. confusa en la especie de penco blanco.
una mayor eficiencia para la fermentación, ya
2 que, presentó un mayor contenido de azúcares
iniciales y una mayor población de
microorganismos incluso durante la fase
exponencial de fermentación.
 Conclusiones
Respecto a la Actividad antimicrobiana
Las BAL presentes en los extractos de las diferentes especies de penco tienen actividad
1 antimicrobiana frente a microorganismos patógenos. En nuestro caso, el microorganismo
aislado del penco blanco, Weisssela confusa, logró los mejores resultados en cuanto a
inhibición.

2 Con respecto a la evaluación de los microorganismos patógenos C. freundii fue el que

presentó mayor sensibilidad frente a los componentes antimicrobianos que exhiben las BAL.

La SolBac preparada a partir de las BAL permitió una mayor actividad antimicrobiana en
3
comparación con la solución libre de bacterias.

Finalmente, la interacción entre los tres factores evaluados (AxBxC) no produce diferencia
4
significativa al evaluar el halo de inhibición de los diferentes tratamientos que incluye.
 Recomendaciones
Debido a la falta de investigaciones en torno a la caracterización fisicoquímica y microbiológica del
Chaguarmishqui, se recomienda realizar más estudios comparativos, especialmente de la especie
1 de penco blanco. Además, en un estudio de comparación entre el extracto de ambas especies, se
recomienda conseguir la pulpa de plantas con el mismo tiempo de maduración y técnicas de
recolección.

Se recomienda realizar una caracterización más detallada de las bacterias ácido lácticas
2 presentes en el Chaguarmishqui, ya que, en nuestro estudio únicamente se analizaron las
predominantes.

Se recomienda utilizar la SolBac para estudios de capacidad antimicrobiana de las BAL, además
3 para mejores resultados en cuanto a la actividad antimicrobiana el uso de W. confusa para
contrarrestar el efecto de patógenos Gram negativos, especialmente contra C. freundii.

Debido a que no se logró una caracterización de los metabolitos obtenidos por las diferentes BAL, se
4 recomienda un estudio del contenido de péptidos mediante espectrofotometría de alta densidad
(HPLC), especialmente para W. confusa de la cual no se tiene mucha información.
 Gracias
por su atención
AGRADECIMIENTOS