EXTRACCIÓN DE ADN EN

SALIVA

Andrea Rodríguez González

Yordy Ferney Rodríguez González
Ingrith Johanna Ruiz Gómez
Grupo A
Saliva
* Segregada por las glándulas salivales
* Alcalino, transparente y algo viscoso.
* Una persona sana puede generar de 1 a 2 L/día.

Contiene: albúmina, mucina, NaCl, K, tialina

y células epiteliales.

Humedecer
Disolver los alimentos
Facilitar su degustación
Distinción por el sabor
Elaboración del bolo, preparándolo para su deglución.

http://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/feria21/feria315_01_saliva_humana_para_diagnostico_e_investigacion_de_.pdf
 A partir de las muestras de saliva

puede extraerse el ADN

Investigación de enfermedades hereditarias

Diagnóstico del cáncer de vejiga, adenomas de próstata, entre otros

http://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/feria21/feria315_01_saliva_humana_para_diagnostico_e_investigacion_de_.pdf
1. Agregue 40 μl de solución de proteinasa K, mezcle inmediatamente
mediante el vortex
2. Incubar a 60° C durante 1 hora para lisar la muestra.
3. Precaliente el tampón EB a 70°C
4. Agregue 4ml de etanol a la muestra y utilice vortex para mezclar
5. Coloque una columna GeneFixTM Midi DNA en un tubo de recolección de
15 ml. Pipetee 2 ml de la muestra en la columna
sin tocar el borde. Centrifugar a alta velocidad (mínimo 3500 x g) durante 1 a
2 minutos.
Deseche el flujo continuo.
6. Repita el paso 5 hasta que toda la muestra se haya cargado en la columna.
7. Lave la columna agregando 2,5 ml de solución WB.
Centrifugar a alta velocidad (mínimo 3500 x g) durante 1 a 2 minutos.
Deseche el flujo continuo.
8. Repita el paso de lavado añadiendo 2,5 ml más de solución WB.
Centrifugar a alta velocidad (mínimo 3500 x g) durante 1 a 2 minutos.
Deseche el flujo continuo.
9. Centrifugue a alta velocidad (mínimo 3500 x g) durante 5 minutos para
eliminar todos los restos de etanol.
10. Coloque la columna en un tubo de recolección limpio de 15 ml.
Añadir 400μl de tampón EB precalentado a 70ºC en el centro de la membrana.
11. De pie la columna durante 3 minutos y luego centrifugar a alta velocidad (mínimo 3500 x g)
durante 3 minutos para eluir el
ADN.
12. Verifique la concentración y pureza del ADN mediante nanodrop o ensayo Qubit (Picogreen).
Paso de precipitación de etanol opcional para aumentar la concentración de ADN
13. Si la concentración está por debajo del nivel requerido, realice una etapa de precipitación de
etanol en la muestra eluida.
14. Coloque la muestra eluida de 400 μl en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Agregue 40μl de
acetato de sodio 3M pH 5.2. Mezcle por medio del Vortex brevemente
luego agregue 1320μl (3 vols.) 98-100% de etanol, invierta para mezclar. El ADN debe ser visible
como hilos blancos.
15. Centrifugar a velocidad máxima (13.4 K rpm, 12,000 g) durante 3 minutos. Cuidadosamente
vierta el sobrenadante sin
perturbar el pellet. Lavar con 1 ml de etanol al 70%. Invierta varias veces para mezclar y
centrifugar a velocidad máxima
(13.4 K rpm, 12,000 g) durante 1 minuto. Retire con cuidado todo el líquido y seque brevemente.
16. Rehidratar el sedimento de ADN en 200 μl de tampón TE o tampón EB. Repita el análisis
nanodrop o el ensayo Qubit para verificar concentración y pureza del ADN
EXTRACCIÓN DE SALIVA USANDO ACETATO
DE AMONIO
1. La saliva entera se centrifugó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a
10.000 g durante 5 minutos.
2. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 1 ml de
tampón de extracción [Tris-HCl 10 mM; pH 7,8; EDTA 5 mM;
Dodecilsulfato de sodio al 0,55% (SDS)
3. Proteinasa K, Los tubos se agitaron vorticialmente y se incubaron en un
baño de agua a 56 ° C.
4. Centrifugar y añadir 500 μL de solución de acetato de amonio 10 M
centrifugaron a 21,000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
5. Luego, 500 μL de este sobrenadante se transfirieron a un nuevo tubo y se
añadieron 540 μL de alcohol isopropílico frío, seguido de 15 segundos de
agitación en vórtex. Las muestras se colocaron en un refrigerador durante
2 horas y luego se centrifugaron a 10.000 gdurante 20 minutos a
temperatura ambiente.
6. El sobrenadante se descartó con cuidado para no volver a suspender el
sedimento de ADN; Se añadió 1 ml de etanol al 70% frío a los tubos, que
luego se centrifugaron a 10.000 g durante 5 minutos.
7. El sobrenadante se descartó y luego el ADN se hidrató en 50 μl de agua
desionizada esterilizada en autoclave (50 μl del volumen de elución final).
Fundamento
Para poder acceder al ADN primero tenemos que acceder al núcleo de la célula y para eso es
necesario:
1. Romper la membrana plasmática.
2. Romper la membrana nuclear, para dejar libre el ADN.
3. Proteger el ADN de enzimas que puedan destruirlo y para aislarlo hay que hacer que se
precipite en alcohol.
La sal (NaCl), con esa concentración, es un medio hipertónico que provoca el estallido de las
células y los núcleos, quedando libre las fibras de cromatina.
El detergente cumple la misión de formar un complejo con las proteínas histonas y separarlas
del ADN.

https://www.madrimasd.org/cienciaysociedad/taller/biologia/extraccion-adn/default.asp
Función del detergente
Todas las células tienen una membrana hecha de fosfolípidos que separan el contenido
celular del ambiente extracelular; cumple la misión de formar un complejo con las
proteínas histonas y separarlas del ADN .
La técnica escogida para la ruptura celular tiene que considerar el origen del tejido
para evaluar su facilidad o dificultad de destrucción.

Función de la Sal en este proceso:

El agua con la presencia de sal es un medio hipertónico para la célula
lo que provoca el estallido de las células y los núcleos, quedando libre
las fibras de cromatina.

Función del alcohol:

Para aislar las cadenas de ADN, ya que el ADN no es soluble en alcohol,
debido a que tiene pentosa formada por carbono.
El alcohol es polar, pero está unido a grupos alquílicos, que tienen carbono
en su estructura, como consecuencia no hay solubilidad.
 FUNCIONALIDAD Y
VENTAJAS

Simple recogida de la muestra y fácil manejo

Elimina los costos de las flebotomías

No invasivo, indoloro para el paciente No genera ansiedad en los

pacientes, facilitando el
reclutamiento

Aumenta la eficiencia, minimiza

la manipulación y los errores de
manipulación de las muestras
El ADN de la saliva es equivalente al ADN
sanguíneo en aplicaciones posteriores

Ideal para usar con niños o pacientes a

los que no se les pueda extraer sangre
Las muestras se pueden enviar
por correo postal convencional

La muestra se mantiene estable durante

años a temperatura ambiente, lo que reduce
los costos de transporte y almacenamiento
http://www.abyntek.com/extraccion-de-adn-a-partir-de-
saliva/
 CALIDAD
Estudios demuestran que el DNA
extraído a partir de saliva arroja
resultados equivalentes al obtenido en
muestras de sangre en técnicas como
PCR, SNP, genotipado, microarrays y
NGS.

http://www.abyntek.com/extraccion-de-adn-a-partir-de-saliva/
 ADN puro?

El producto finalmente obtenido de la extracción

no es ADN puro, puesto que, entremezclado con
él, hay fragmentos de ARN.
Además las bacterias y enzimas presentes en la
saliva pueden alterar y degradar el ADN.

http://www.abyntek.com/extraccion-de-adn-a-partir-de-saliva/
 Purificación.

El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar

etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una
Precipitación del ADN. centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las
sales añadidas previamente.

Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse

El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris

tras ser secado completamente. La confirmación de la
presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en
Recuperación. un gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y
observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro
mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm.

http://identidad.queretaro.itesm.mx/2012/03/purificacion-de-adn/
 El ADN purificado se puede cuantificar
con un espectrofluorímetro mediante el
uso de fluoróforos específicos

El paso 3 puede realizarse con la ayuda de

minicolumnas equipadas con una membrana de sílica
que retiene específicamente el ADN permitiendo el
paso de las moléculas y sales que acompañan la
reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se
eluye el contenido

Al tener la confirmación ya puede ser utilizado en el PCR.

(identificar virus o bacterias, identificar cadáveres en la
medicina forense o simplemente estudiar un fragmento de
ADN amplificado)

http://identidad.queretaro.itesm.mx/2012/03/purificacion-de-adn/
 Un método basado en nanopartículas magnéticas para la extracción
de ADN de la saliva de pacientes con accidente cerebrovascular

Factible y preciso: el método es sensible y

ADN extraído de la saliva: 15.67 ± 7.67
reproducible. Debe ser lo suficientemente puro
μg / mL. genotipos MTHFR C677T,
para permitir la amplificación por PCR y la
por lo tanto es viable su uso.
selección de genes.

Cómodo y rápido: Toma menos de 15 segundos. Extracción de ADN con el

método de nanopartículas magnéticas (cinco pasos), no más de 40 minutos.

No se necesita equipo de laboratorio especial. Este método requiere solo un

imán y un bloque calefactor.

No invasivo e indoloro: en este método basado en nanopartículas

magnéticas no es invasivo y es fácilmente aceptable para los
pacientes. El uso de saliva como fuente de extracción de ADN ha
reducido el riesgo de infecciones transmitidas.
● Se obtiene aprox. 0,5 ml de saliva con un hisopo bucal antes de una comida en lo posible o 10
minutos después de la comida con los restos de comida extraídos de la boca con agua.
● El hisopo utilizado se cortó con tijeras, se colocó en un tubo Eppendorf estéril y luego se
almacenó a temperatura ambiente.
● Se colocan las muestras de saliva en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se agitaron verticalmente
(durante 10 segundos)Se debe mezclar la muestra con 200 μl de tampón de lisis celular durante
30 minutos a 80 ºC.

● Los tubos nuevamente se someten a agitación vertical durante (15 segundos) y se centrifugan
(20 segundos) en una microcentrífuga Eppendorf (ángulo fijo, 24 000 xg ), y las mezclas
tampón de lisis de saliva se aspira al vacío. Las células bucales se lisaron y se liberó ADN.
● las mezclas tampones de lisis de saliva se transfieren a tubos Eppendorf de 1,5 ml nuevos y
se añadieron 20 μl de nanopartículas magnéticas de ADN, estas se deben centrifugar a
temperatura ambiente durante 20 segundos a 600 RPM.
Li Yi J. A magnetic nanoparticles-based method for DNA extraction from the saliva of stroke patients [Internet]. PubMed Central (PMC).
2013 [cited 09 February 2018]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4146207/

● Se colocan las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos para garantizar que el ADN
estuviera completamente unido a la superficie de las nanopartículas magnéticas.
● Pasados los 10 minutos se debe colocar el tubo junto a un imán durante 20 segundos para
atraer las nanopartículas, el sobrante se descarta y se retiene el sedimento de ADN.
● El sedimento de ADN que se retuvo se resuspende en 100 μL de etanol al 70 % para purificarlo, y
luego se debe centrifugar a una temperatura ambiente durante 20 segundos a 600 RPM. Hecho
esto es necesario devolver al material magnético para atraer las perlas durante 20 segundos.
● El sobrante de nuevo lo descartamos y retenemos el sedimento. Repetimos una vez más el
proceso anterior de purificación con el objetivo de eliminar cualquier contaminante residual.

Dato Adicional : Los tubos se secaron a 50 ° C con tapas abiertas en un bloque

calefactor Eppendorf durante 10 minutos. Los tubos se sometieron a vórtex brevemente
de nuevo y se centrifugaron durante 2 minutos a 600 rpm.
 ● El ADN purificado se debe eluir mediante la adición de 50 μl de tampón de elución, este
se debe incubar a 70 ºC durante 10 minutos con el fin de disociar el ADN unido de las
nanopartículas magnéticas
● Es necesario agitar en vórtex hasta que el sedimento quede resuspendido
completamente.
● Después de la centrifugación (15 segundos a aproximadamente 12 000 xg ), el
sobrenadante con ADN puro se eliminó por aspiración a vacío a otro tubo nuevo.

Li Yi J. A magnetic nanoparticles-based method for DNA extraction from the saliva of stroke patients [Internet]. PubMed Central (PMC). 2013 [cited 09 February
2018]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4146207/
 CONCLUSIONES

A. actualmente no existen estudios que describan métodos que usan

nanopartículas magnéticas para la detección de genes en pacientes con distintas
patologías como en el caso concreto del estudio, pacientes con accidente
cerebrovascular.

B. tiene una gran importancia clínica pues puede ser utilizado para detectar
alteraciones genéticas

C. método económico y muy rápido y no se necesitó ningún equipo de laboratorio

especial.

Li Yi J. A magnetic nanoparticles-based method for DNA extraction from the saliva of stroke patients [Internet]. PubMed Central (PMC). 2013
[cited 09 February 2018]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4146207/
 Bibliografia

• http://www.feriadelasciencias.unam.mx/anteriores/feria21/feria315_01_saliva_hum
ana_para_diagnostico_e_investigacion_de_.pdf
• http://www.abyntek.com/extraccion-de-adn-a-partir-de-saliva/
• https://www.google.com.co/search?q=espectrofluor%C3%ADmetro&source=lnms&t
bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiV8aqH9Y3ZAhUxxVkKHYTEAP0Q_AUICigB&bi
w=1164&bih=608#imgrc=OQAnboqZ8V9kqM
• http://identidad.queretaro.itesm.mx/2012/03/purificacion-de-adn/
• http://studylib.es/doc/580576/extracci%C3%B3n-de-adn-de-c%C3%A9lulas-de-la-
mucosa-bucal
• https://www.madrimasd.org/cienciaysociedad/taller/biologia/extraccion-
adn/default.asp
• http://www.ehu.eus/biofisica/pdf/practica_1.pdf
• Li Yi J. A magnetic nanoparticles-based method for DNA extraction from the saliva of stroke patients [Internet].
PubMed Central (PMC). 2013 [cited 09 February 2018]. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4146207/