CONTROL DE CALIDAD

de INSTRUMENTAL de
LABORATORIO CLÍNICO
ULA
Escuela de Bioanálisis
Mérida
Noviembre 2005
Dr. Claudio Duymovich
 Control Instrumental
OBJETIVOS:

• Verificar el buen funcionamiento del

instrumental del laboratorio para
minimizar los errores analíticos.
• Complemento del Programa de
Control Interno para la toma de
decisiones
 Control Instrumental
• Establecer protocolos de verificación
• Procedimientos y frecuencias
• Registros
• Estándares a cumplir
• Resultados
• Acciones correctivas

• Servicios técnicos
2. Plan de Control Recomendado

Estudio Inicial Diario Semanal Quincenal Mensual Trimestral Semestral

Absorbancia
de solución O O
control
Temperatura
O O
Precisión
O O
Exactitud
O O
Deriva y Ruido
O O
Linealidad
O O
Longitud de
Onda O O
Cubetas
O O
 Norma ISO 15189:2004
• Registros: identificación del equipo, nombre del
fabricante, fecha de puesta en servicio, manual
del fabricante,plan de mantenimiento, daños,
reparaciones del equipamiento, informes de
calibraciones y/o verificaciones, criterios de
aceptación, personal autorizado,etc
 TIPOS DE CONTROL
• Instrumental: espectrofotómetros
fotocolorímetros
balanzas
centrífugas
lectores de placas
• Volumétrico: material de vidrio
pipetas y micropipetas
dispensadores y dilutores
• Termométrico: termómetros
baños de agua
cubetas termostatizadas
estufas
heladeras y congeladores
 Medición espectrofotométrica

• Fuente de radiación
• Selector de longitudes de onda
• Compartimiento de muestra
• Fotodetector
• Dispositivo de lectura
 Tipos de Instrumentos
 Manuales-Automáticos
Visible-UV
Filtro interferencial o Colorímetros
Red de difracción o Espectrofotómetros
Doble Haz
Bicromático
 Ley de Lambert-Beer

• Absorbancia = Σ b C
• Σ: coeficiente de extinción Molar
• B: Longitud de la cubeta (cm)
• C: concentración de la sustancia
 Propiedades Fotométricas
• Exactitud de la Longitud de Onda
• Exactitud Fotométrica
• Linealidad Fotométrica
• Precisión Fotométrica
• Presencia de Luz Parásita
• Estabilidad Fotométrica: Deriva y ruido
 Intensidad
A

B C

D E Longitud de onda

A: longitud de onda seleccionada

DE: ancho de rendija
BC: ancho de banda
Exactitud de la Longitud de Onda:

Métodos Primarios:
• Líneas de emisión de lámparas de
mercurio(313,365,405,436 y 546 nm),
hidrógeno (486 y 656 nm), etc.
• Espectro de soluciones de sales de
holmio(241,279,287,333,361,418,453,
536 y 636 nm)
• Filtros de holmio, didimio, etc.
Espectro del Holmio
Exactitud de la Longitud de Onda:

• Método del Punto Isosbéstico:

– Rojo Congo: PI = 541 nm

– Rojo Fenol: PI 1= 366 nm; PI 2= 499 nm

• Límites de aceptabilidad:
Corrimiento óptimo: +/- 2 nm
Corrimiento aceptable: +/- 3 nm
 Resultados de la encuesta de
Exactitud de la Long. de Onda
(Datos PEEC 13; feb/99)

Corrimiento Nº laboratorios
entre +/- 2 nm 694 51.1 %
entre +/- 3 nm 831 61.2 %
entre +/- 5 nm 1069 78.7 %
mayor de 5 nm 289 21.3%
total laboratorios = 1358
 Exactitud Fotométrica
•Filtros comerciales: con valores de
absorbancias conocidos y certificados a l
dadas.

•Soluciones de referencia:
 amplio pico máximo de absorbancia
Alto coeficiente de extinción molar
Buena solubilidad
Estabilidad en función del tiempo
 Exactitud Fotométrica:
SOLUCIONES ESTÁNDARES:
• UV: Dicromato de Potasio en medio de
Ac. Sulfúrico
• 510 nm: Sulfato de Cobalto en medio
de Ac. Sulfúrico
• 540 nm: Cianmetahemoglobina
Espectro del Dicromato de Potasio
 Cómo corregir errores de
Exactitud Fotométrica
• Rango de aceptabilidad:
-exactitud óptima: error entre +/- 2%
-exactitud aceptable: error entre +/- 3%
• Errores entre +/- 10%:
-Utilización de factor de corrección
F = Abs. de referencia / Abs. Obtenida
• Errores superiores a 10%:
-Recurrir al servicio técnico
 Resultados de las encuestas de
Exactitud Fotométrica

Error de exactitud 340 nm 510 nm 540 nm

Óptimo (entre +/- 2 %) 30,7% 36.0 % 35,2%
Aceptable (entre +/- 3 %) 40,5% 47,2% 51,1%
No aceptable (mayor a +/- 3 %) 59,5% 52,8% 48,9%
Comparación de las encuestas de
Exactitud Fotométrica a 340 nm

Error de exactitud 1998 2000

entre: PEEC11 PEEC16
+/- 2 % (límite óptimo) 24.8 % 30.7 %

+/- 3 % (límite aceptable) 36.8 % 40.5 %

mayor de +/- 3 % 63.2 % 59.5 %

 Linealidad Fotométrica
Soluciones de distinta concentración cuyas
absorbancias abarquen el rango de trabajo a
cada longitud de onda:
• UV: Dicromato de Potasio en medio
ácido
• 405 nm: p- nitrofenol en medio
alcalino
• 510 nm: Nitrato de Cobalto en medio
ácido
 Linealidad Fotométrica
• Graficar absorbancia hallada en función de la
absorbancia de referencia
• Determinar el valor de la pendiente de la recta

• Límites de aceptabilidad:
- linealidad óptima : pendiente entre 0.98 – 1.02
- linealidad aceptable: pendiente entre 0.97 – 1.03
Comparación de los datos de Linealidad
Fotométrica a diferentes long. de onda
Error pendiente 340 nm 405 nm 510 nm
entre +/- 2 % 27.3 % 26.7 % 36.5 %
entre +/- 3 % 36.9 % 35.9 % 46.2 %
entre +/- 5 % 51.9 % 47.4 % 60.9 %
entre +/- 10 % 70.3 % 62.3 % 77.2 %
mayor de 10% 29.7 % 37.7 % 22.8 %
Nº laboratorios 1929 2425 2513
Fecha Jul-98 Dic-99 Jul-00
 Presencia de Luz Parásita

• 340 nm: Solución de Nitrito de Sodio

– Lectura de absorbancia o % Transmitancia de

la solución

• Límites de aceptabilidad: % Transmitancia < 1%

 Causas de presencia de luz
parásita
• Presencia de “goteras”
• Envejecimiento de la fuente de energía
• Falta de alineación del sistema portacubeta
• Sistema óptico sucio
• Dispersión y reflexión de la luz incidente en las
diferentes piezas del circulo óptico
 Variación de la absorbancia con la luz parásita

1,6

1,4
Absorbancia obtenida

1,2
0%
1
0,50%

0,8 1%
2%
0,6
5%

0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Absorbancia real
 Resultados de Luz Parásita
Datos PEEC 11; julio/98

Luz parásita Nº laboratorios

menor a 0.5 % 1134 58.8%
entre 0.5 - 1.0 % 364 18.9%
entre 1.0 - 5.0 % 197 10.2%
entre 5.0 - 10.0% 78 4.0%
mayor al 10.0% 155 8.0%
Total de laboratorios participantes: 1929
 Precisión Fotométrica
• Estudio a 650 nm con Sulfato de
Cobre en medio ácido
– 10 medidas de la absorbancia de
alícuotas de la misma solución
– Cálculo de la precisión de las lecturas de
absorbancia

Realizar 10 lecturas y calcular el CV%

Límite óptimo < 0.5 %
Límite Aceptable < 1%
 Estabilidad Fotométrica
• 340 nm: solución de dicromato de potasio
en medio ácido

- Estudio de la deriva y ruido fotométricos

- Cálculo de la pendiente y de la dispersión
de la recta absorbancia vs. tiempo

• Límite de aceptabilidad: (deriva + ruido) < 1 %

 Estabilidad Fotométrica

Abs Ideal Abs Deriva

Tiempo Tiempo

Ruido Abs Deriva + Ruido

Abs

Tiempo Tiempo
 Resultados de la encuesta sobre
Estabilidad Fotométrica
Datos PEEC 16; feb/2000

Resultado Ruido Deriva Deriva + ruido

< 0.5 % 80.3% 41.2 % 29.5 %
< 1% 91.1 % 58.0 % 50.9 %
>1% 8.9 % 42.0 % 49.1 %
Nº total de laboratorios participantes: 2049
 Tipos de cubetas de medida

• Cuarzo: desde los 180 nm al visible

• Cristal: desde los 330 nm al visible

•Poliacrílico: desde los 330 nm al visible

 Control de Cubetas

•Homogeneidad de Cubetas
•Estado de las cubetas (limpieza)
•Sistema Portacubetas
 Control de cubetas
Llenar las cubetas con agua destilada y leer su
absorbancia contra aire:
 Cubetas de cuarzo: medir a 240 nm.
Absorbancia < 0.0093 UA

 Cubetas de vidrio: medir a 650 nm.

Absorbancia < 0.035 UA
 Limpieza de cubetas

• Agua destilada y metanol

• Detergente no ionico 5%
• 1 volumen de HCl concentrado + 3 volúmenes de
agua destilada + 4 volúmenes de metanol
• Mezcla sulfocrómica
 Comparación: automáticos vs.
manuales
Linealidad aceptable
60

50
manuales
automáticos
% instrumentos

40

30

20

10

0
Julio/ 98 Nov/01
 Linealidad no aceptable:
manuales vs automáticos

manuales automáticos
nº respuestas % nº respuestas %
error > 10 % 440 39,9 117 23,1
error > 20 % 245 22,2 60 11,9
 Automatización en Química
Clínica
Preparación e identificación de muestras
Preparación de reactivos
Dispensado de muestras y reactivos
Mezclado
Incubación
Detección
 Propiedades Fotométricas a
verificar:
• Exactitud Fotométrica
• Linealidad Fotométrica
• Precisión Fotométrica
• Presencia de Luz Parásita
• Estabilidad Fotométrica: Deriva y
ruido
• Grado de arrastre de muestras (carry
over)
 Correcciones por camino óptico

A = e . B. C

e = coeficiente de absortividad molar

B = camino óptico
C = concentración

Abs. Corregida (1 cm) = Abs. Medida

camino óptico (cm)
Equipo automático
Iluminación
 Error Proporcional

Recta ideal: pte 1

Abs. Medida

1.6

0.8

1.0 2.0
Abs. Referencia
 Error Mixto

Recta ideal: pte 1

Abs. Medida

1.7

1.0

1.0 2.0
Abs. Referencia
Presencia de luz parásita

luz parasita manuales automáticos

< 0,5% 40,3% 50,7%
entre 0,5 y 1% 19,7% 25,8%
entre 1 y 5% 11,3% 15,4%
mayor de 5% 28,7% 8,1%
 Grado de Arrastre

• Porcentaje de arrastre = 100 ( B2 – B1 )

A
B: Baja concentración
A: Alta concentración
 Lector de Placas
A= e . Masa/S
e = coeficiente de absortividad molar
M = masa de la sustancia
S = Diámetro del Pocillo

Ventajas:
Inexactitud del pipeteo de líquidos no
Abs.
Evaporación de líquidos no Abs.
Un cierto grado de inhomogeneidad o
turbiedad no afecta la medida.
Coagulómetro
 Principales causas de errores
fotométricos en autoanalizadores

• Fuente lumínica con baja intensidad

• Inestabilidad de emisión de la lámpara
• Ennegrecimiento de la lámpara
• Ancho de banda excesivo
• Filtros interferenciales degradados
• Cubetas sucias, rayadas o no paralelas
• Falta de sensibilidad o agotamiento del fototubo
• Existencia de luz parásita
• Excesivo ruido electrónico
• Arrastre entre muestras
Características instrumentales para el
análisis fotométrico de enzimas
Parámetro Intervalo o error
(95% confiabilidad +/- 2 SD)
Arrastre muestra a muestra < 0.3 %
Exactitud de la temperatura entre + 0.1 ºC
Manejo de la muestra
Exactitud 1%
Precisión 0.50%
Tamaño 50 ul o menos
Manejo de los reactivos
Tiempo de mezclado < 10 seg
Rendimiento fotométrico
Absorbancia inicial 0 - 1 UA <3%
Absorbancia inicial 1 - 2 UA <5%
Exactitud de la long. de onda entre + 2 nm
Ancho de banda < 8 nm
Intervalo de long. de onda variable
Intervalo de absorbancias 0 - 2 UA
Linealidad <2%
Camino de la celda < 0.6 %
Desplazamiento de la absorbancia
( de 10 a 60 min) <2%
Exactitud de la absorbancia <2%
Reproducibilidad de la absorbancia
entre 0 - 1 UA entre + 2 %
entre 1 - 2 UA entre + 4 %
 Control Volumétrico
Material Volumétrico:

• Matraces
• Buretas
• Dispensadores
• Pipetas aforadas
• Micropipetas
 PIPETAS:
Clasificación
 Clase A: graduaciones en forma de anillo contínuo.
Máxima exactitud. Certificación.
 Clase AS: iguales a clase A pero con diferentes tiempos
de vaciado y espera.

 Clase B: tolerancias dobles a clase A.

 Material graduación seriada: no utilizado en trabajos
de exactitud.
 Tolerancias

• Material volumétrico clase A:

10 ml ....................... 0.2%
2000 ml .................... 0.025%

• Pipetas
1 ml ............................. 0.6%
10 ml ........................... 0.2%

Material volumétrico clase B: doble de clase A

 Control Volumétrico

Métodos de Control Volumétrico:

• Gravimétrico: método primario.

• Fotométrico: método secundario.
 NECESIDAD DE CONTROL:
Pipetas de doble aforo

Volumen Tolerancia Nº % fuera de

nominal (clase B) rango
5 ml +/- 20 ul 820 2.7 %
(4.98 -5.02 ul)

3 ml +/- 20 ul 400 1.8 %

(2.98 – 3.02 ul)

1 ml +/- 20 ul 100 32.0 %

(0.98 – 1.02 ul)
 Micropipetas

• Desplazamiento positivo: tipo D

• Desplazamiento negativo: tipo A

MICROPIPETAS
Micropipetas de desplazamiento
negativo

Tip

Interfase
de aire

Liquido
Micropipetas de desplazamiento
positivo

émbolo

Punta
teflon

capilar

líquido
 MICROPIPETAS: Fuentes de error para
desplazamiento negativo (ISO 8655-2)

Causa Error Detección

Diferente densidad del > 0.2% Comparar densidad del
líquido respecto al agua liquido a pipetear

Diferente flujo o Depende Visualización de

viscosidad del líquido del líquido: burbujas, goteo.
0.5 a 50 %
Variaciones de la > 3% Medición de tº amb.
tºambiente y tip
Tips no adecuados 0.5 a 50 % Goteo o errores
excedidos
 METODOS DE CALIBRACIÓN

Método Gravimétrico
(Método de Referencia: resolución balanza
acorde al volumen; pesas certificadas E2)

Método Fotométrico
( Método Secundario: espectrofotómetro
calibrado con estándares de absorbancia)
 MÉTODO FOTOMÉTRICO
Comparar la absorbancia de una solución preparada
con la pipeta problema contra una solución de
referencia:

EJEMPLO:
Solución Referencia:
-2 ml colorante + 500 ml diluyente: “1/251”

Solución problema:
-20 ul colorante + 5 ml de diluyente: 1/251 ?

A = e. b. C. Dilución
 Control de temperaturas

• Termómetros
• Estufas
• Baños líquidos
• Heladeras
• Cubetas de reacción
 Puntos Fijos de
Temperatura:
temperaturas de referencia

• Puntos de fusión y ebullición del agua

• Fusión del galio: 29.7646 ºC
• Punto triple del ácido benzoico: 122.37 ºC

• Tolerancia: +/- 0.1 ºC

 TERMÓMETROS CERTIFICADOS:
Hg en Vidrio

 No constituyen Estándares Primarios de

temperatura, sino un medio de transferencia de
temperaturas estándar a sondas electrónicas,
baños y termómetros clínicos. (aseguran
exactitud y trazabilidad)

 Calibrados a puntos fijos y con instrumentos

primarios (Termómetro de Resistencia de Pt
Estándar)
TERMÓMETROS CERTIFICADOS:
Hg en Vidrio
Termómetros Electrónicos
 Cuidados
• Usar los termómetros en posición vertical
• Sostener el termómetro por el anillo del tope
• Recalibrar al menos 2 veces al año
• Cuando se calibra mas de un punto, hacerlo
primero a la temperatura más baja
• No usar termómetros con columnas de líquido
rotas o con burbujas de aire
• Calibrar con menisco creciente
 Control de baños de Agua
• La temperatura del baño debe especificarse y
narcarse con los límites de tolerancia
• Dejar un termómetro en el baño unido
apropiadamente
• Registrar diariamente la temperatura
• Marcar el nivel de agua apropiado
• Limpiar el recipiente de agua mensualmente
agregando inhibidores de crecimiento.
Control de Heladeras y frezer
• Controlar la temperatura en distintas
zonas de la heladera
• Registrar diariamente
• Utilización de soluciones testigos