Cromatografia Planar

Material de apoyo para ElectroQumica Analtica y Cromatografa
16
II. CROMATOGRAFIA PLANA

CROMATOGRAFA EN PAPEL (PC)
(E) Afinidad
La cromatografa en papel (1944, Consden, Gordon y Martin) es una tcnica analtica importante y
de gran aplicacin para la separacin e identificacin de microcantidades de substancias. Las especies
separadas aparecen como manchas despus de rociar el papel con algn reactivo formador de color
apropiado para el caso.
Existen varias formas de realizar cromatografa en papel. El mtodo clsico es como sigue (figura 16):
a) Se satura un trozo de papel filtro con agua.
b) Se coloca una gota de la mezcla a analizar sobre el papel.
c) El papel se sumerge en una cuba que contiene un solvente orgnico.
d) A medida que el solvente se mueve, va arrastrando y separando los componentes de la mezcla. A esta
operacin se le conoce como desarrollo.
e) Si es necesario, el papel se roca con un reactivo formador de color que haga aparecer a los distintos
componentes de la mezcla. A esto se le llama revelado.
Figura 16. Cromatografa en papel.

El solvente orgnico en la cuba es la fase mvil, mientras que el agua con la que se satur el papel
es la fase estacionaria. El solvente orgnico asciende por el papel. Cada componente de la mezcla XYZ
tiene un coeficiente de reparto diferente entre la fase orgnica y la fase acuosa, por lo que X, Y y Z se
separan a medida que el solvente se desplaza por el papel.
TAREA 1.
Investigar las variaciones en el desarrollo de las tcnicas en papel (ascendente,
descendente, sndwich, etc.)
17
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF)

Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de almina y
luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de Cromatografa de Capa Fina. Egon
Stanl (1956) di el nombre de Cromatografa de Capa Fina (TLC, CCF).
Este tipo de cromatografa planar, es una tcnica relacionada con la HPLC, pero con su propia
especificidad. Aunque estas dos tcnicas son experimentalmente diferentes, el principio de separacin y la
naturaleza de las fases es la misma. Debido a la reproducibilidad de las pelculas y las medidas de
concentracin, la CCF es ahora un mtodo cuantitativo de anlisis que puede efectuarse en instrumentos
modernos. El desarrollo de aplicadores automticos y densitmetros ha llevado a la nano CCF a ser una
tcnica simple con alta capacidad
Las placas, se recubren con una delgada capa (100-200 m)
Comnmente los ensayos en
de fase estacionaria, la cohesin de la fase y su enlazamiento al
TLC se usan como prueba
soporte se asegura introduciendo un ligando orgnico o un mineral preliminar antes de emplear
cuando se deposita la pelcula. El volumen de la muestra debe ser
otros tipos de cromatografa
pequeo (unos pocos nL o L) y se colocan en pequeos puntos de 1- ms complicados, tales como
3 mm de dimetro. La muestra puede aplicarse manualmente o HPLC (Cromatografa lquida
usando un capilar de extremo plano (fig. 17). La aplicacin puede de alta resolucin).
hacerse tambin a manera de una banda horizontal de unos cuantos milmetros depositada por rociado
automtico de la muestra.
La placa se coloca en una cmara cubierta, que contiene una pequea cantidad de fase mvil, la cual esta
en contacto con la placa con la parte donde se coloc la muestra sumergida a una profundidad de unas
cuantos milmetros. La fase mvil migra por capilaridad a travs de la fase estacionaria, induciendo a los
componentes de la muestra a migrar de manera diferencial. Una vez que el solvente ha recorrido la
distancia adecuada (unos cuantos centmetros) la placa se retira de la cmara y la fase mvil se evapora.
Figura 17 Aplicacin automtica empleada en CCF analtica. Aplicador

programable ATS-3
18
Fundamentos.
La separacin de mezclas de molculas mediante CCF se basa en el
principio del reparto entre dos fases. En general, se realiza permitiendo En cromatografa de capa
fina la fase estacionaria
que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione
con un medio de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo est hidratada, por lo que
medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace se le considera como la
fase polar.
fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra.
Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil
"lavar" a los componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la
fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.
Proceso de Adsorcin
La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material
por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, Para nano - CCF las
puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es partculas son del orden
expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de de 4 m y los poros son
de 6 nm.
enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el
solvente. Las caractersticas del adsorbente que definen las propiedades de la fase estacionaria son:
tamao de partcula, volumen de poro, dimetro de poro, rea superficial, homogeneidad y pureza.
La distancia entre los grupos silanol y siloxano determinan el carcter
RP
=
reversed
hidrofilico de la fase. Como en HPLC, pueden enlazarse varias cadenas a los
=
Fase
grupos silanol superficiales de las fases de silica. Algunas fases incorporan phase
cadenas de alquilos simples (RP-2, RP-8, RP-18) mientras otras incluyen
reversa
grupos funcionales orgnicos (nitrilos, aminas, o alcoholes) permitiendo que estas fases puedan usarse
con cualquier tipo de fase mvil.
Los adsorbentes ms utilizados en la CCF son:
Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)
Tierra Silcea Kieselguhr
Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
Poliamidas
PROCEDIMIENTO COMUN PARA CCF
1. Preparacin de la Placa Cromatogrfica

Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Aluminio). Los tamaos
de la placa para TLC convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2. Hay placas que contienen un indicador de
Fluorescencia : F254 F366. El nmero que aparece como subndice nos indica la longitud de onda de
excitacin del indicador utilizado.
19
2. Aplicacin de la muestra
La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en: banda o puntos. La tcnica
de aplicacin en banda, tiene la ventaja de presentar una alta reproducibilidad para la cuantificacin de la
muestra depositada, esencial en el anlisis cuantitativo.
3. Desarrollo de la Placa
Es un proceso mediante el cual son transportados a travs de la fase estacionaria por la fase mvil. Este
proceso se efecta en el interior de una cmara de desarrollo. Existen varios tipos de cmaras, Normal,
Doble Compartimiento, Sndwich, Horizontal, entre otras.
4. Deteccin Visualizacin
Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los)
componente(s) presentes. Estos mtodos pueden ser qumicos o fsicos En los Qumicos ya sea por
inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes. Los mtodos Fsicos
(pticos).generalmente utilizan radiacin UV.
Como ejemplos de estos mtodos, los fabricantes, ofrecen placas con una sal fluorescente de cinc,
adicionada a la fase estacionaria. Cuando la placa se irradia con una lmpara de mercurio, aparecen
puntos negros sobre un fondo fluorescente, indicando la posicin de los compuestos. Otro mtodo
universal de revelado, consiste en calentar la placa despus de rociarla con cido sulfrico, carbonizando
los compuestos y hacindolos visibles. Tambin pueden usarse reactivos como el cido fosfomolbdico
(general) o la ninhidrina en alcohol, (especfico para aminocidos).
Figura 18. Cmara vertical y placa de CCF. Apariencia tpica de una placa
de CCF despus del desarrollo.
CROMATOGRAFA EN DOS DIMENSIONES.
El uso de placas de CCF o de papel de geometra cuadrada permite

desarrollar cromatografa bidimensional, usando dos fases mviles distintas.
La segunda migracin se realiza despus de rotar la placa (o el papel) un
cuarto de vuelta (fig. 19) Una aplicacin tpica de esta tcnica, es en la
separacin de aminocidos, aunque no se acostumbra usarlo para el anlisis
cuantitativo.
20
El uso de diferentes
fases
mviles
se
recomienda para una
mejor separacin.
Conclusin: x es
probablemente
a,
pero
la
impureza no es
b, o c.
Figura 19. Principio de CCF bidimensional. A) aplicacin de 3

estndares (a, b y c) y una muestra (x). B) migracin con el primer solvente. C)
secado y rotacin del la placa. D) Migracin con el segundo solvente.
21
PARMETROS DE RETENCIN Y SEPARACIN

En CCF y en cromatografa en papel, cada componente es definido por su valor de R f (factor de retardo) el
cual corresponde a la migracin relativa en comparacin al solvente:
Rf = distancia recorrida por el soluto =
distancia recorrida por el solvente
x
x0
Figura 20. Definicin del factor de retardo.

Anlisis Cualitativo
Existen diferentes criterios para identificar compuestos separados por las tcnicas de cromatografa planar,
siendo algunos de ellos:
Medida de Rf
Comparacin Visual de Color/Intensidad
Propiedades UV/IR/MS/NMR
Anlisis Cuantitativo
Semi-cuantitativo: Consiste en la comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la

mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin conocida
Cuantitativo: puede hacerse de manera indirecta directa (densitometra, espectrofotometra)

Densitometra
El densitmetro es un instrumento que determina de manera indirecta la luz absorbida por una superficie.
La luz absorbida es la diferencia entre la luz reflejada y la luz incidente.
El densitmetro no mide densidades de manera directa; mide la luz reflejada y la compara con la luz
incidente.
Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la sustancia.
Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la sustancia.
22
El densitmetro produce un pseudo-cromatograma, que contiene picos con reas que pueden ser
medidas.
Espectrofotometra
Fluorescencia
Desactivacin de la Fluorescencia
Aplicaciones generales:
Determinar el grado de pureza de un compuesto
Comparar muestras
Realizar el seguimiento de una reaccin
Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna.
TAREA 2.
Buscar ejemplos de aplicaciones particulares de cromatografa en papel y en capa fina.

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Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

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Comparacin Visual de Color/Intensidad

Semi-cuantitativo: Consiste en la comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la

Cuantitativo: puede hacerse de manera indirecta directa (densitometra, espectrofotometra)

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Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la sustancia.

Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la sustancia.

Determinar el grado de pureza de un compuesto

Realizar el seguimiento de una reaccin

Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna.

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