DETERMINACIN DE PROTENAS EN ALIMENTOS CON EL MTODO DE BIURET

CONCEPTOS PREVIOS:

Mtodos colorimtricos para la determinacin de protenas. 1.2. Mtodo de

Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja
con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la
cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante
especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del
mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). 1.3.
Mtodo de Bradford Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida,
existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la
forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente
de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15
g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin. Entre las sustancias que interfieren estnlos detergentes y
las soluciones bsicas. 1.4. Mtodo de BCA El cido bicinconnico, sal sdica,
es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con inones
Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico
capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las
protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad
del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de
protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran
tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. OHProtena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA complejo

prpura BCA- Cu1+ 1.5. Objetivos Con esta prctica se pretende introducir
al alumno en los diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas: su
fundamento, sus ventajas e inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos
(Biuret, Bradford y BCA), para cada uno de ellos se realizar una curva
estndar, se determinar el coeficiente de extincin, el rango de
sensibilidad, y se realizar la cuantificacin de dos muestras problemas.

Mtodos para la determinacin de nitrgeno

Caractersticas de las protenas

INTRODUCCION El termino protena fue utilizado por primera vez por el
qumico alemn Gerardus Mulder, en 1838, tomo este nombre del vocablo
griego PROTERIOS, que significa primordial nivel primario. Las protenas son
un grupo de biopolmeros constituidos de aminocidos que exhiben una
amplia gama de estructuras y funciones. Las protenas como un grupo de

biomolculas, desempean una gran variedad de funciones, algunas

participan en la contraccin muscular y sirven para dar soporte estructural,
otras trasportan y almacenan molculas pequeas. Los anticuerpos
(molculas que sirven para como proteccin inmunolgica) son protenas al
igual que las enzimas (catalizadores biolgicos) y algunas hormonas. Las
protenas pueden llevar a cavo funciones tan diversas por la enorme
posibilidad de combinaciones en la composicin y secuencia de
aminocidos. Las protenas tambin se clasifican segn su composicin, las
que se forman solo de residuos de aminocidos y no tienen otras
biomolculas son PROTENAS SIMPLES; no todas las protenas son solubles
en agua, de hecho las protenas insolubles son esenciales para dar soporte y
mantener la integridad estructural de las clulas y organismos.
DETERMINACION DE PROTEINAS I. OBJETIVOS: * Determinar el nivel de
protena que posee un alimento a travs del contenido de nitrgeno. * El
estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por los
mtodos: Kjeldahl y Sorensen. * El estudiante se familiarizar con los
equipos y el procedimiento del anlisis de protenas para los mtodos de
Kjeldahl y sorensen . * El estudianteaprender a realizar los clculos
pertinentes para la determinacin de nitrgeno en protenas. II.
FUNDAMENTO TEORICO: El problema que representa proporcionar protenas
adecuadas a la poblacin del mundo es un tanto secundario en el problema
general de alimentacin mundial. Adems de su significado nutritivo las
protenas juegan un papel importante en las propiedades organolpticas de
los alimentos. Las protenas ejercen una influencia controladora en la
textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. El anlisis para
la determinacin de protenas, a pesar de no estar incluido generalmente
como factor de clasificacin en los estndares de granos se acepta como un
factor comercial. Las protenas existen en los alimentos en combinacin
fsica o qumica con carbohidratos o lpidos. Las glucoprotenas y las
lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las soluciones
alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes
comestibles. El "envejecimiento" de la carne est relacionado con cambios
qumicos en las protenas. Las protenas naturales puras poseen poco sabor.
Durante el proceso de calentamiento (ebullicin, panificacin, asado) las
cadenas laterales de aminocidos se degradan o interactan con otros
componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azcares
reductores) para conferir sabores tpicos. El calentamiento excesivo puede,
por otro lado, reducir el valor nutritivo. El analista de alimentos
comnmente desea saber el contenido proteico total de los alimentos,
aunque dicho contenido est conformado por una mezcla compleja de
protenas. Actualmente todos los mtodos para determinar el contenido
proteico total de los alimentos son de
naturaleza emprica. El aislamiento y pesado directo de la protena
proporcionara un mtodo absoluto, sin embargo, dicho mtodo es llevado a
cabo slo a veces en investigaciones bioqumicas pero es completamente
imprctico para el anlisis de alimentos. Metodos MTODO MICRO KJELDAHL
La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado,
convirtindose en CO2 y H2O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual
pasa a ser fijado por el cido como sulfato de amonio, una sal de gran
estabilidad. La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a

que parte del H2SO4 es simultneamente reducido a SO2, que se comporta

como un fuerte reductor. La digestin de la muestra es la parte mas difcil
de la determinacin, esta se acelera mediante la adicin de catalizadores
como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato
cprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4) o una
mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla
con la finalidad de aumentar el punto de ebullicin y disminuir entonces el
tiempo de digestin. Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido
digerida, se libera el amonaco por descomposicin del sulfato de amonio
con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y recoleccin
en un volumen de cido brico, como borato de amonio. El amonio se
determina por titulacin con solucin valorada de HCl 0,1 N en presencia de
un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo, el cual en
medio cido se presenta de color morado y en medio alcalino de color
verde. Resumen de las reacciones qumicas en el mtodo Micro-Kjeldahl Se
acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier
impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula
aplicando la siguiente frmula: %N= G x N x 0.014 x 100M Donde: V = mL
de HCl gastados en la titulacin. N = normalidad de la solucin de HCl (0,1
N). M=Peso de la muestra en gramos Luego de calculado el porcentaje de
nitrgeno, es necesario calcular el porcentaje de protenas basndose en
este valor y utilizando entonces la siguiente ecuacin; %P=Nx F Donde:
N=porcentaje de nitrogeno F=FACTOR: ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL:
N*6.25 ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL: N*5.70 LECHE Y DERIVADOS:
N*6.38 III. MATERIALES Y METODOS: * MATERIALES: * Muestra. * Destilador.
* Incinerado

* Matraz Kjeldahl. * matraz Erlenmeyer (250 ml) * Bureta fina. * Matraces de

100 y 1000 ml. * Pipetas de 10 ml. * Probetas de 25 ml. * REACTIVOS: *
Acido sulfrico 98%. * Mezcla catalizadora: 3 gr de oxido de titanio (TiO2), 3
gr de sulfato cprico (CuSO4) y 100 gr de sulfato de potasio (K2SO4). *
Disolucin de hidrxido de sodio al 50%. * Disolucin de acido clorhdrico
(HCl) 0.1 mol/l. * Indicador rojo de metilo. * METODO DE KJELDAHL
MODIFICADO: * Este mtodo consta de 4 fases: 1. Digestin o ataque de la
materia orgnica. 2. Destilacin del amoniaco. 3. Titulacin del borato de
amonio. FASES DE DIGESTIN: * Pesar 0.3 gr de la muestra seca. * Agregar
3 gr dela mezcla catalizadora y 20 ml de cido sulfrico concentrado y unas
perlas de vidrio. * Colocar el baln en posicin inclinada sobre una de las
hornillas de digestin del multi Kjeldahl. * Se inicia con un calentamiento
suave y mantener en ebullicin, a calor, el tiempo necesario para que la
solucin sea amplia y tenga un color ligeramente azul. * FASE DE LA
DESTILACIN DEL AMONIACO: * Terminado la digestin enfriar el baln a
temperatura ambiente (tener cuidado). * Agregar con cuidado agua
destilada (aproximadamente 40 ml). * Pasar a un baln de destilacin y
completar hasta 150ml con agua destilada, lavar el baln Kjeldahl con agua
destilada. * Se aade 10ml de disolucin de hidrxido de sodio al 40%. *
Colocar el baln en una de las hornillas para destilacin y conectarlo al tubo
condensador correspondiente mediante un bulbo de seguridad de vidrio,
ajustar bien las uniones. * Colocar en un Erlenmeyer o Beacker de 400 ml,
50 ml de acido brico al 4% para retener los gases de amoniaco y dos gotas

del indicador rojo de metilo. * Luego el Erlenmeyer o Beacker se coloca en la

parte inferior del tubo condensador de tal manera que el extremo se
encuentre sumergido en el acido borico. * Hacer circular el agua de cao por
el condensador de Kjeldahl y comenzar la destilacin a temperatura
controlada. * Continuar la disolucin hasta que se haya eliminado el
amoniaco, comprobar con papel de tornasol o fenolftalena. * Retirar el
Erlenmeyer lavando con un poco de agua destilada el extremo del tubo. *
FASE DE TITULACION * Titular el contenido de Erlenmeyer con una solucin
de cido clorhdrico (HCl) al 0.1N (cada

ml de esta solucin equivale a 1.4008 mg de Nitrgeno) hasta que vire de

color (amarillo a rojo o verde a azul) esto depende del indicador que se
adiciona. Efectuar los clculos de acuerdo a la muestra utilizada y el factor
de conversin de acuerdo a la muestra. * FACTOR DE CONVERSIN DE
NITRGENO EN ALIMENTOS * Avena, cebada y centeno 5.83 * Arroz 5.95 *
Trigo, harina refinada 5.70 * Trigo, grano entero 5.83 * Almendras 5.18 *
Soya 5.71 * Leche y sus productos 6.40 * Otros(carne, Huevos, maz) 6.25 El
contenido porcentual de protena P de la muestra se calcula: P=ab1.4008FM * a: gasto en ml de la disolucin del acido clorhdrico (0.1mol/l),
en la muestra. * b: gasto en ml de la solucin de acido clorhdrico (0.1mol/l),
en el blanco. * F: factor de conversin para calcular el contenido proteico. *
M: peso en gramos de la muestra. 1.4008mg de Nitrgeno por cada ml de
gasto de disolucin valorada en cido clorhdrico. * MTODO VOLUMTRICO
DE SORENSEN POOL Fundamento: Se basa en que el formaldehido va a
actuar bloqueando los grupos aminos, dando como resultado la liberacin
de los grupos carboxilos con el consiguiente aumento de la acidez, la cual
se valora con NaOH al 0.1N. Procedimiento: * Medir 10 de leche neutralizar
con HCl al 0.1 N * Agregar 20 ml de formaldehido neutro (neutralizado con
NaOH 0.1N), se agrega el formaldehido a la leche y desaparece el color
rosado. * Titular nuevamente con NaOH al 0.1 N Clculos: %P=G x 0.1909 x
5 IV. CALCULOS Y RESULTADOS: * PORCENTAJE DE PROTENAS POR EL
MTODO KJELDAJL DE HARINA: %P= G x N x 0.014 x F x 100M %P=23 x 0.02
x 0.014 x 100x 5.700.3 %P=12.24% * PORCENTAJE DE PROTENAS POR EL
MTODO SORENSEN POOL. * Determinacin de acidez de leche
0.14-0.18%
Rango de acidez en la leche
%A=V x N x F x 100M %A=3.4 x 0.1 x 0.09 x 10020 %A=0.152% *
Determinacin de protena de la leche: 2.83.4%Rango de proteinas en la leche
V1=2.4 ml %P=G x 0.1909 x 5 %P=2.4 x 0.1909 x 5 %P=2.2908% V2=3.2
ml %P=G x 0.1909 x 5 %P=3.2 x 0.1909 x 5 %P=3.0544% V. DISCUSIONES:
* Para la determinacin de protenas en leche por el mtodo de Sorenser,
comparando nuestros resultados con los de , en primer lugar con el V1 nos
damos cuenta de que el % de protena obtenida no se asemeja al de la
bibliografa por lo que podemos darnos cuenta de que la leche fue
adulterada o alterada por algn agente, por lo que realizamos nuevamente
el proceso, obtuvimos un V2 con el que dio como resultado un % de 3.0544

que si est dentro del rango estipulado en . * Este problema de los

volmenes lo asumimos por el viraje en l titulacin, que depende de la vista
de la persona encargada del trabajo. VI. CONCLUSIONES: * El mtodo se
basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico
concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de
sodio libera amonaco, el que se destila recibindolo en: a) Acido sulfrico
donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con
hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido brico
formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico. * Es
importante el anlisis de protenas para: la determinacin de la actividad
biolgica en alimentos ejemplos: pectinasas durante la maduracin de
frutos; investigacin sobre propiedades funcionales. Ejemplos: gliadina y
gluteninas para la elaboracin del pan; para el etiquetamiento nutricional
del producto final, etc. * Existe una gran necesidad del anlisis de protenas
con el fin de obtener el contenido proteico total, composicin de
aminocidos contenido de alguna protena particular, contenido proteico
durante el aislamiento y purificacin de una protena, nitrgeno no proteico
y valor nutritivo relacionados con un alimento especfico a analizar. *
Constituyen fuentes de error en del mtodo de Kjeldahl son: la inclusin de
nitrgeno no proteico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno
durante la digestin, la digestin incompleta de la muestra
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al
cido (para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una
descomposicin por calor y la consecuente prdida de amonaco;
generalmente se recomiendan temperaturas de digestin de 370-410C. *
Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado titanio o
la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente; las
condiciones son an ms crticas que con el cobre o el mercurio cuando se
usan como catalizadores. * Ventajas del mtodo de Kjeldahl: * Apropiado
para varios tipos de productos. Alta fiabilidad. * Usado como mtodo de
referencia. * Desventajas del mtodo de Kjeldahl: * Interfieren compuestos
nitrogenados no proteicos. VII. CUESTIONARIO: * Qu es una protena
bruta? El nitrgeno total o protena bruta (N x 6,25) se determina por el
mtodo de Kjeldahl, que consiste en convertir todo el N orgnico (de las
protenas en su mayora) en N amoniacal (como NH4SO4), destilar el
amoniaco (en medio bsico) y valorarlo con una disolucin cida
contrastada. El % de protena se calcula multiplicado el % de N por el factor
de 6,25. * Seale los grupos de alimentos y los factores de conversin que
se usa para el clculo de protena total. * Trigo-harina entera 5,83 * Harinas
(excepto la entera) 5,70 * Salvado 6,31 * Arroz 5,95 * Cebada, avena,
centeno 5,83 * Maz 6,25 * Soya 5,71 * Nueces-cacahuates, nueces del
Brasil 5,41 * Almendras 5,18 * Otras nueces 5,30 * Leche y productos
lcteos 6,38 * Gelatina 5,55 * Todos los otros alimentos 6,25 * Cuando se
denomina nitrgeno proteico y nitrgeno no proteico. Se denomina
nitrgeno no proteico a los compuestos de nitrgeno que pueden se
convertidos en protenas por algunos organismos vivos. Muchos organismos
superiores no pueden obtener aminocidos de otras formas, ms que
absorbindolos de la dieta. A los sumo pueden convertir algunos
aminocidos en otros diferentes. Los compuestos que forman el NNP son los
que contienen amonaco, nitritos y nitratos y otros como la urea, el biuret o

el cido rico. Los organismos que puede utilizar el NNP son los hongos, las
plantas y algas, bacterias y organismo que viven en simbiosis con ellos
VIII. BIBLIOGRAFIA: * AOAC. 1995. Official Methods of Analysis. 16th edition.
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http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno_no_proteico