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Unidad N°5
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Procedimientos de recogida
Las muestras para cultivos microbiológicos deben recogerse en
recipientes estériles. Para muestras como orina, heces y líquidos
biológicos no se recomiendan los hisopos para la recogida ya que no
proporcionan una cantidad suficiente, se contaminan fácilmente y
pueden reservarse, con la consiguiente pérdida de microorganismos.
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Unidad N°5 - Análisis Clínicos III
Tecnicatura en Análisis Clínicos
Facultad de Ciencias Médicas
Los hisopos son apropiados para muestras del tracto respiratorio superior, oído
externo, ojo y tracto genital. Las puntas de los hisopos pueden ser de algodón, dacrón,
poliéster o alginato de calcio. Los hisopos con punta de algodón tienden a tener un
exceso de ácidos grasos que pueden ser tóxicos para ciertas bacterias.
Los hisopos de dacrón y de poliéster tienen una amplia gama de usos. Existen
sistemas de recogida de torundas que proporcionan medios de transporte y protegen
la muestra de la desecación.
Las lesiones, heridas y abscesos plantean muchos problemas en el laboratorio de
microbiología para la recolección de muestras. Una herida no es una fuente de
muestra apropiada para la recogida.
Antes de recoger la muestra, debe limpiarse la zona para eliminar la mayor cantidad
de flora microbiana comensal. Siempre que sea posible, la muestra debe recogerse
mediante aspiración con aguja, en lugar de hacerlo mediante frotis del margen de la
herida. El material aspirado debe ser colocado en un tubo estéril o un vial de
transporte, sin usar hisopos en la recolección.
Requisitos de etiquetado
Es importante que el recipiente de muestra esté correctamente
etiquetado y en la solicitud figure la identificación correcta de la muestra.
La etiqueta de la muestra debe contener información suficiente para que
la muestra y la solicitud coincidan cuando se reciban en el laboratorio. La
correcta identificación de cada muestra incluye una etiqueta firmemente adherida al
contenedor con la siguiente información:
● Nombre y apellido del paciente.
● Número de DNI.
● Número de protocolo.
● Médico solicitante.
● Lugar de cultivo.
● Fecha y hora de recogida.
Para realizar el análisis de laboratorio, el servicio necesita información específica sobre
el paciente y la muestra. Todo lo que el laboratorio sabe sobre el paciente se aprende
del formulario de solicitud.
El formulario de solicitud de análisis debe consignar la siguiente información: nombre
y apellido del paciente, edad y sexo del paciente, ubicación del paciente, médico
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Seguridad
Las muestras recogidas para microbiología no deben suponer un riesgo
para la seguridad del personal que las manipula. Los recipientes con
fugas y las muestras con agujas son los más peligrosos. Todas las
muestras deben transportarse en recipientes secundarios a prueba de
fugas. El personal de laboratorio debe cumplir unas estrictas directrices de seguridad
cuando empiece a trabajar con las muestras del paciente.
Todo el personal que manipula muestras de pacientes debe llevar ropa protectora, y
las muestras sólo deben abrirse en una cabina de seguridad biológica.
Almacenamiento de especímenes
Las muestras que no se van a transportar o procesar inmediatamente se
deben conservar almacenándolas en determinadas condiciones. Algunas
muestras como orina, heces, esputo, secreciones bronquiales, hisopos,
catéteres y muestras víricas, pueden mantenerse a una temperatura
refrigerada de 4 °C durante 24 horas. Las muestras con patógenos sensibles al frío
deben ser mantenidas a temperatura ambiente. Si el líquido cefalorraquídeo no se
procesa de inmediato, puede conservarse refrigerada a 35 °C durante un máximo de 6
horas.
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Conservantes
Dos tipos de muestras en las que se pueden utilizar conservantes son la
orina y las heces. Los conservantes están diseñados para mantener la
población bacteriana de la orina a temperatura ambiente durante 24 hs.
Las muestras de heces para cultivo bacteriano que no se transportan inmediatamente
al laboratorio pueden refrigerarse pero, si el retraso es superior a las 2 horas, la
muestra puede añadirse al medio de transporte Cary-Blair.
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Observación macroscópica
El procesamiento de las muestras comienza con una observación
macroscópica. El aspecto de la muestra puede proporcionar información
útil. Las características físicas de la muestra deben documentarse.
Las anotaciones de la observación macroscópica deben incluir lo
siguiente, entre otros:
● Hisopo o aspirado.
● Consistencia de las heces.
● Presencia de sangre o moco.
● Volumen de la muestra.
● Turbidez de la muestra.
El examen macroscópico también permite al procesador determinar la idoneidad de
la muestra y la necesidad de un procesamiento especial. Se seleccionan áreas de
sangre y moco para cultivo y examen microscópico directo. Los cultivos anaerobios
pueden estar indicados si hay presencia de gas, mal olor o gránulos de azufre.
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Inoculación primaria
Tipos de medios de cultivo
Los medios de cultivo pueden dividirse en grupos definidos por la
capacidad de favorecer el crecimiento bacteriano. Los medios no
selectivos favorecen el crecimiento de la mayoría de los microorganismos no
exigentes. Un ejemplo es el agar sangre.
Los medios selectivos favorecen el crecimiento de un tipo o grupo de microbios pero
no de otro. Estos medios pueden contener sustancias inhibitorias como
antimicrobianos, colorantes o alcohol. Un ejemplo es el agar MacConkey.
Los medios diferenciales permiten agrupar los microbios en función de las diferentes
características demostradas en el medio.
Los medios enriquecidos contienen potenciadores para el crecimiento que se añaden
a agar para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes. Un ejemplo es el
agar chocolate. Los caldos de enriquecimiento son medios líquidos diseñados para
favorecer el crecimiento de un número reducido de un organismo concreto,
suprimiendo al mismo tiempo el resto de la flora presente. Los caldos de
enriquecimiento se incuban durante un periodo determinado y luego se deben
subcultivar para aislar el organismo concreto. tal es el caso del caldo tioglicolato.
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Algunas muestras requieren una sóla placa, mientras que otras requieren una batería
de placas. Los medios de cultivo primarios de rutina incluyen: agar no selectivo,
medios enriquecidos, medios selectivos y diferenciales, y caldos de enriquecimiento.
Técnicas de aislamiento
Las muestras pueden inocularse en placas de agar utilizando una raya de
aislamiento de uso general para obtener una estimación semicuantitativa
del crecimiento. La muestra se aplica haciendo rodar el hisopo o
colocando una gota de muestra líquida en una pequeña zona del borde
de la placa y realizando la inoculación con el asa en anillo.
Los caldos deben inocularse colocando unas gotas de la muestra líquida en el tubo de
caldo o colocando el hisopo en el caldo.
El asa de inoculación se esteriliza a la llama directa y se deja enfriar completamente
antes de pasarla por el agar.
Existen varios tipos de formas de inoculación; su procedimiento depende del tipo de
muestra que se siembra y dependiendo del tipo de medio de cultivo.
Cuando se utiliza más de una placa de agar, el asa se flamea entre placas para evitar el
arrastre de un posible contaminante de una placa a otra.
Algunas muestras requieren una técnica cuantitativa para determinar el número de
bacterias presentes. Las muestras de orina se inoculan utilizando asas calibradas.
Siembra en placa
La siembra en placa se plantea con dos finalidades: el recuento o el
aislamiento de colonias.
● Para la siembra por recuento se deposita la muestra en el centro
de la placa, se traza una cruz y se extiende desde el centro al borde de la placa
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desde la cruz inicial mediante sucesivas estrías y se gira la placa 90° para
realizar un recorrido completo de la misma.
● La siembra por aislamiento se hace con una estría radial en la placa y la
extensión mediante sucesivas estrías perpendiculares en la mitad superior; se
continúa la siembra con el giro de la placa 90° y se cultiva el tercer cuadrante a
partir de las estrías del segmento anterior, hasta agotar la placa. El aislamiento
por agotamiento se emplea para separar cultivos muy poblados.
● La siembra por inundación se hace depositando la muestra sobre la placa
procurando que se difunda por toda la superficie con movimientos suaves de
balanceo. Es utilizada en la realización de antibiogramas.
● La siembra por goteo se hace con muestras líquidas en las que se espera poco
contenido bacteriano.
● Los catéteres se siembran por rodamiento, para lo que se utilizan segmentos de
no más de 4 cm y se arrastran por la placa tres o cuatro veces.
Una vez inoculadas, las placas se apilan y se incuban en posición invertida, para evitar
que la condensación que se produce contamine el cultivo.
Incubación
Una vez inoculado el medio, deben tenerse en cuenta las condiciones de
incubación. Las condiciones de incubación incluyen tanto la temperatura
como la atmósfera ambiental y están determinadas por el tipo de
muestra y los patógenos que puedan detectarse.
La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban entre 35 °C y 37 °C. Los aerobios
crecen en el aire ambiente, mientras que los anaerobios no pueden crecer en
presencia de oxígeno y requieren una atmósfera anaerobia. Las bacterias
microaerófilas crecen con oxígeno reducido y en una atmósfera con CO2 aumentado.
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Visualización microscópica
Generalmente la visualización es el primer paso del procesamiento
microbiológico de la mayoría de las muestras que llegan al laboratorio. El
examen microscópico se realiza como orientación diagnóstica,
directamente sobre la muestra clínica o bien sobre el cultivo que se
obtiene tras la siembra. Este examen permite valorar el componente celular y con ello
la calidad de la muestra, por su contenido en leucocitos como indicador de
inflamación; permite asimismo visualizar bacterias, su cantidad y sus características.
La observación permite predecir los resultados que se esperan en el cultivo, adelantar
la posible etiología del proceso infeccioso y orientar a la elección de un tratamiento
microbiano empírico.
Examen en fresco
El examen se hace directamente en el microscopio, sin la tinción de la
preparación. Se sigue el siguiente método:
● Se extiende entre el portaobjetos y el cubreobjetos los
microorganismos que se investigan emulsionados en una gota de agua o suero
fisiológico. La solución no se fija.
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Tinciones simples
Se puede mejorar la observación mediante el uso de distintos colorantes
que tiñen uniformemente todas las estructuras y con ello aumentar el
contraste de células y microorganismos.
Las tinciones simples se pueden aplicar en fresco (tinción vital), así como en material
fijado. Son métodos sencillos, simples y baratos.
● Hidróxido potásico (KOH) al 10% → es útil para identificar elementos fúngicos
resistentes a soluciones alcalinas fuertes, una vez se ha digerido el material
orgánico de la muestra con KOH.
● Tinta china → se emplea como colorante una solución coloidal de carbón. Se
utiliza para detectar especies de hongos. Es útil para el examen de líquidos
biológicos, como el líquido cefalorraquídeo, ya que se puede realizar el
diagnóstico rápido de la meningitis criptocócica.
● Azul de lactofenol → se usa para el examen de hongos.
● Yodo (lugol) → se usa para la observación de parásitos en heces. El colorante
incrementa el contraste y permite distinguir los leucocitos de las estructuras
parasitarias.
● Azul de metileno → tiñe de azul leucocitos y bacterias.
Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales resaltan la estructura del microorganismo.
Estas tinciones constan de 4 pasos: un colorante primario que tiñe
uniformemente todo el material, seguido de un mordiente que forma un
complejo con este colorante; a continuación se procede a decolorar, con ello se
elimina el colorante primitivo, excepto en las estructuras que han retenido el complejo
y, por último, se aplica un segundo colorante (secundario o de contraste) que tiñe los
gérmenes que no retuvieron el primario, así como el resto de la preparación y de este
modo se aprecia la diferenciación.
TINCIÓN DE GRAM
El método consiste en los siguientes pasos:
1. Colocación de la muestra en un portaobjetos con una gota de agua o suero.
2. Fijación por calor (con mechero o con tratamiento por alcohol).
3. Adición del colorante cristal violeta o violeta de genciana. Se espera 30
segundos y se lava con agua.
4. Tratamiento con lugol, que actúa como mordiente para formar un complejo
estable con el cristal violeta. Se espera 30 segundos y se lava con agua.
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TINCIÓN DE GIEMSA
Se utiliza una mezcla de azul de metileno y eosina. Se basa en el distinto carácter
ácido-base de los componentes celulares. La eosina tiene iones con carga negativa y
tiñe de color naranja y rosa los componentes básicos de las células; el azul de metileno
tiñe de azul y violeta los elementos ácidos celulares.
El método sigue los siguientes pasos:
1. Se fija la preparación con metanol durante 5 minutos y se deja secar.
2. Se cubre la muestra con el colorante Giemsa preparado en agua destilada al 3%.
Se deja actuar el colorante por 40 minutos y se lava con agua destilada.
El citoplasma de los protozoos se tiñe de azul verdoso, se tiñen de azul los cuerpos de
inclusión de virus y se observan en color violeta algunas bacterias de interés clínico.
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Es la tinción de referencia de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR):
micobacterias, etc. El método consiste en las siguientes operaciones:
1. Se cubre la preparación, fijada previamente, con carbolfucsina. Se calienta
pasando un hisopo empapado con alcohol ardiendo sin permitir que hierva, se
espera 5 minutos a que se enfríe y se repite la operación hasta 3 veces. A
continuación se lava con agua.
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Tinciones fluorescentes
Para la visualización de tinciones fluorescentes se requiere un
microscopio de fluorescencia, que se sirve de la propiedad de los
fluorocromos de emitir energía al ser sometidos a una luz ultravioleta.
● Tinción de auramina-rodamina → ambos fluorocromos actúan del
mismo modo que la carbolfucsina en la tinción de Ziehl-Neelsen; el decolorante
es alcohol clorhídrico y el colorante de contraste que se emplea es
permanganato de potasio. La técnica permite el cribado rápido de las
micobacterias en la rutina del laboratorio.
● Tinción de blanco de calcoflúor → es útil para teñir la pared celular de hongos y
parásitos de forma rápida. Puede combinarse con KOH para aclarar la muestra.
● Tinción de inmunofluorescencia directa → utiliza pigmentos fluorescentes
adheridos a anticuerpos específicos para el microorganismo que se desea teñir.
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Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas ponen de manifiesto las características
metabólicas de las bacterias. Pueden ser de varios tipos: las que
demuestran la presencia de una enzima preformada o las que evalúan la
capacidad de crecer en presencia de ciertos factores o de metabolizar
algunos sustratos que hay en el medio de cultivo.
Se pueden clasificar en 4 grupos: pruebas inmediatas, pruebas rápidas (lectura en
menos de 6 horas), pruebas diferidas (lectura en 18-48 horas) y pruebas de
sensibilidad/resistencia.
Pruebas inmediatas
● Catalasa → es una enzima que se encuentra en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. La catalasa convierte el peróxido de
hidrógeno en agua y el oxígeno se puede observar en forma de burbujas.
● Oxidasa → esta prueba detecta la presencia de oxidasa, enzima que activa la
oxidación del citocromo, el cual reduce el oxígeno molecular para producir
agua o peróxido de hidrógeno, según la especie.
Pruebas rápidas
● Ureasa → esta enzima desdobla la urea formando dos moléculas de amoniaco.
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Pruebas diferidas
● Medio TSI (triple sugar iron) → es un medio sólido dispuesto en pico de flauta.
Lleva rojo fenol como indicador, glucosa, lactosa, sacarosa, citrato férrico
amónico y tiosulfato sódico para revelar la formación de sulfuro ferroso, que
ennegrece el tubo. La fermentación de la glucosa colorea en amarillo el fondo
del tubo y el resto del tubo queda de color rosa. La fermentación de lactosa deja
todo el tubo amarillo. Si se produce gas, el medio se rompe o se separa del tubo.
● Medio bilis-esculina → si es germen es capaz de hidrolizar esculina, se produce
esculetina, que reacciona con el citrato férrico y produce un complejo de color
negro-pardo.
● Reacción de Voges-Proskauer → mide la producción de acetoína con la adición
de un oxidante fuerte que oxida la acetoína a diacilo de color rojos.
● Fermentación ácida mixta → se demuestra con la capacidad de un
microorganismo de producir etanol y ácidos, como los ácidos láctico, butírico y
acético, que disminuyen el pH del medio y hacen virar el indicador rojo de
metilo a rojo cuando son positivos.
● Reducción de nitratos → sirve para detectar la capacidad de un organismo de
reducir nitrato a nitrito.
● Coagulasa → permite detectar la capacidad de coagular el plasma por acción de
la enzima coagulasa.
● Fenilalanina → la fenilalanina desaminasa es una enzima que capacita a un
microorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina formando ácido
fenilpirúvico, lo que provoca una acidez que se pone de manifiesto al añadir
unas gotas de cloruro férrico.
● Desoxirribonucleasa → ciertas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar
enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla de polinucleótidos.
● Descarboxilasas → la descarboxilación ataca el extremo carboxilo de los
aminoácidos para reducirlos a una amina y dióxido de carbono. Los tres
aminoácidos que se investigan son arginina, lisina y ornitina.
● Lipasa → esta enzima descompone las grasas en ácidos grasos y glicerol.
● Lecitinasa → en presencia de esta enzima se forma un halo opaco alrededor de
la colonia.
● Citrato de Simmons → con esta prueba se determina si un microorganismo es
capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, con lo que se produce
una alcalinización del medio.
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Pruebas de sensibilidad/resistencia
Algunas de las pruebas utilizadas en microbiología son: novobiocina, bacitracina,
optoquina, solubilidad en bilis, entre otras.
Antibiograma
El tratamiento de una infección requiere conocer no sólo el
microorganismo que la produce, sino también su sensibilidad a los
antibióticos. De forma general, los antibióticos pueden clasificarse, según
su forma de actuación, en bactericidas y bacteriostáticos. Los antibióticos bactericidas
son los que destruyen bacterias y los antibióticos bacteriostáticos son los que impiden
la división celular, evitando que proliferen los microorganismos.
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Bibliografía
📚 El laboratorio en el diagnóstico clínico. Henry, JB. 4° Edición. Marbán (2008)
📚 Fundamentos de interpretación clínica de los exámenes de laboratorio. Ruiz Reyes,
G., Ruiz Argüelles, A. 3° Edición. Editorial Panamericana (2017)
📚 Técnicas y métodos de laboratorio clínico. González de Buitrago, JM. 3° Edición.
Elsevier (2010)
📚 Textbook of Diagnostic Microbiology. Mahon, C. 6° Edición. Elsevier (2019)
📚 Diagnostic Microbiology, Bailey & Scott´s. Tille, P. 14° Edition. Elsevier (2017)
📚 Medical Microbiology. Kayser, F., Bienz, K., Eckert, J., Zinkernagel, R. 10° Edición.
Thieme Stuttgart (2005)
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