Universidad Nacional

Federico Villarreal
pmf•iatales

"Año de la Diversificación Productivay el Fortalecimientode la

Educación."
INGENIERíA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS
INGENIERíA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO 9 E BIOQUÍMICAll

ESCUELA: INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

CURSO: LABORATORIO DE BIOQUíMlCA ll
TEMA: CONCENTRACIÓN DE PROTEíNAS.
PROFESOR: ING. ESCOBAR RODRIGUEZ PABLO E.
INTEGRANTES:
SURCO GONZALES GABRIELA.
• ROSALES TORRES YENIFER.
SANTILLÁN VEGA INGRID.
TOLEDO MONTENEGROSHEYLA.
• ALVARADO SARAVIAVICTOR RAULV
CICLO: cuarto
SECCIÓN: A
AÑO: 2015

1
Determinar la concentración de proteínas en muestras problema mediante tres
métodos colorimétricos que frecuentemente se utilizan para medir concentraciones de
proteínas: Biuret, Lowry y Bradford
Determinar la concmtración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de
ruana básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,
cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para
el de enfermedades,así como para otros muchos propósitos. Existen
diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se
basan en-
a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV,
b) para la formación de derivados químicos, o
c) la que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
En esb práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de proteínas: Biuret,
Bradfordy BCA
Se realizará la de dos muestras problemas de baja y alta concentración,
respectivamente, y se discutirá las ventajas e inconvenientes de cada uno de los
métodos.
El uso de un determinado método colorimétrico depende de:
Pureza de la muestra: presencia de otras proteínas, detergentes, agentes reductores
Cantidad de proteína: límite de detección del método
Disponibilidad de equipo, costo.

2
Determinar la concentración de proteínas en muestras problema mediante tres
métodos coloriméfricos que frecuentemente se utilizan para medir concentraciones
de proteínas: Biuret, Lowry y Bradford
 LABORATORIO N 09 DE BIO UíMlCA I
l, VER ION Dl
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de
rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,
cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para
el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Para el estudiode la estructurade una proteína,de la actividadde una enzima o el
contenido proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamentela
concentración de las proteínas. Existen diferentes métodos para la cuantificación de
proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las
proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c)
la capacidad que tienen las proteínas de formar complejos.
Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de
sensibilidad

Rango de sensibilidad Coeficiente de exünción o Cálculo de la

concentración
Métoós
INOOO 1 murg cm
Bao 3100 31 mUmg cm
lomo (nWmL)
Proteína : (1.5% - 0.76AE)
2$700 Proteína (m@mL): (Aas - Aao)/2.51
Aas•Am 5180 Proteína(flVmL) : (Aza - A06)10.6
245 (WmL)=
Proteína -

Métoús Deriva"
Cúriméticos
Buret IOOMOOOO : 0.06
LMY 25100 a 500m Usar curva estáMar
2-30 a 660 m
1-2 a 750 n
Bradfrd 1-15 z 81

BCA 0.5 IO Usar uva estándar

Métoús Dyivaós
Huoriméticos
*laldehno 1-5 a 340 rrn Usar a.jrva estárúr
a 475 m
Principles métodospara la cuantificación de proteínas, principales ventaja e
inconvenientes

Método Inconvenientes
"toós No se Interfierenmuchos absorbe'
en el W

Mébós
Bastüte espci0co para Tiene poca serwNded
proteinas
Muestra

Es barato
Tiene bastarte No todas las proteinas reaccionan igual
sens&dad Mustra muchas interferencias como
dete entes no iónicos. sulfato américo etc.
Muestra interferencias con
Es el n*todo mas sens±
Es d We muestramutos

0-uddd•ido smsbie La irterÉrenda de arMas en

la mestra
No todas las muestras reaceonan

La sangre está formadapor una solución acuosa que contienemoléculasde tamaño

variable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre
se encuentran en suspensión en una solución acuosa denominada plasma. Aunque el
plasma es el medio natural de las células sanguíneas, la mayoría de las
determinacionesquímicas se hacen en suero. Las proteínas del plasma pueden
clasificarse en dos grupos: las que son sintetizadaspor el hígado (albúmina)y las
inmunoglobulinas(producidaspor las células plasmáticas de la médula ósea). El
plasma humano tiene una concentración en proteínas de 60-80 g/L (frecuentementese
expresa en g/dL; 6-8 g/dl). Casi la mitad de esta proteína plasmática es albúmina, cuyo
rango de concentraciónes 35-45 g/L Es una proteínade 62.000 D que actúa como
proteína de reserva, además de importantetransportador(ácidos grasos, bilirrubinay
fármacos) y regulador osmótico. Es producida por el hígado. Su concentración
aumentaen casos de deshidratacióny disminuyeen casos de ascitis/edema,y daño
hepáticosevero. La determinaciónde la concentraciónde proteínasen sangre puede
ser llevada a cabo por diferentesmétodos. En esta práctica vamos a utilizar dos de los
métodos que se utilizan con más frecuencia: Biuret y Bradford.Los dos métodos
tienen en común que la disoluciónde proteínase mezcla con algún reactivoque
determina que aparezca o se intensifiqueun color (azul) que se cuantifica midiendo la
absorbancia a una determinadalongitudde onda frente a un blanco de reactivo. El
color generado es poco estable y depende de las condiciones de reacción, por lo que
hay que realizar una curva patróncon soluciones de una proteínade concentración
conocida (albúmina bovina).
Bi r
Se basa en la formaciónde un complejocoloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de
los enlaces peptídicos en mediobásico. 1Cu2+ se acomplejacon 4 NH. La intensidad
de coloración es directamenteproporcionala la cantidad de proteínas (enlaces
5
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la
cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

Se basa en la unión de un colorante,Comassie Blue G-250 (tambiénServa Blue) a las

proteínas. El colorante,en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra
naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-
colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es
sensible (1-15 pg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfierenen su
determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las
soluciones básicas.
Método de Bradford: el mismo está basado en el cambio de color del colorante
Coomassie brilliantblue G-250 en respuesta a diferentesconcentraciones de
proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente
arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio
en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este
método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse
en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul
cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de
Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm)

sog-
CH3

CHA±O

sogNa

Estructura química del colorante Coomassie brilliantblue G-250.

Algunas ventajas ylo desventajas del Método
La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos.
• El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.
• La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo
permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo
de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el
ensayo
Se pueden utilizar un gran númerode muestras (muy reproducible)y es
adaptable a la automatización

6
 • Las interferenciaso no existen o son mínimas por cationes tanto sodio como
potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfierenen
el ensayo son los agentes fuertementealcalinos (fácilmentesolucionable con la
utilización de buffers). Los únicos componentes encontrados que dan una
excesiva interferenciaen el color del ensayo, son altas concentracionesde
detergentes el SDS, Triton X-IOO, etc.

BC
El ácido bicinconínico,sal sódica, es un compuestocapaz de formarun complejo
púrpura intenso con inones Cul+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un
método analítico capaz de monitorizarel ión cuproso producido en una reacción entre
las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidaddel
reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que
es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que
afeean a otros métodos.

Cu

púrpuraHCA- Cu

ét od Lw
Es un método colorimétricode valoración cuantitativa de las proteínas.
Bajo condiciones alcalinas el Cu++forma un complejo con los enlaces peptídicos de las
proteínas y se reduce a Cu'. El Cu* así como los grupos R de Tirosina, Triptofanoy
Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero
produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de
molibdeno/Wngsteno esta reacción ocurre en medio ácido.
Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: ácidos
fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductoresde Cu (por ej.:
mercaptoetanol,ditiotreitol,fenoles) serán interferentesde la reacción, Las proteínas
producirán distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido
de Tyr y Trp.
reatos
de

O OH de Folh
(coloranvUlo)
OH

cú2+

bAkbA
Cua•-protúa
Conwejo deFúl
medio reduddo
(color pudo)
(coi« a.aA)
7
 ngitede Sensibilidad y
s de cada rango efectivo Mecanismo de accióa Notas
de aplicación
detección

Se une a detergentesen la
IO a IO superficie de las proteínasy a ción protelnaa pmtclna
regioocs hidrofóbicas de las mlnim•. Ensayo rápido
protelnas; cl colormte no preciw con un Omco
reaccion•nte no presenta ensayo. Compatible con
fluorescenci• agentes reductores.
F.ARYO 'C Reacciona directamente con Gran vari•cióa proteina a
1WmIa I.S aminoácidos especificos y proteína. No compatible
(Ami ncfml estructums terciarias dc la con detergentes. Ensayo
Oe prolefnx el colorante cambia rápido. Utit cuando la
Cmo—ie) dc cafe a azul. precisión no es muy
importante
El Cu'* es reducido Cu en
Méso& pE.sencia de proteina.sa pH gentes. c•ótmfos
BCA OS a 1.2 elevado; cl ácido bicinco. wiventes orgánicos No
(Acido nfnico a iones de Cu • compatible con agentes
bici•c•"- tomando complejos color reductores. Las mueAras
eo) púrpura. deben set leidas dentro de
un intervalo de IO min.
Easayo El Cu') es reducidoa Cu• en
Lowry a 1.3 presencia de protcinas a pH Procedjmmco lento. No
(R extivos mg/ml elevado:cl rextivo Biuret compa:ible con dc«cr.
Baurety quela a iones de Cu' y el gentes o reducto.
Foltn. tractivo Folin•Ciocalteu po• res.
tencia el color azul.
Reaccionacon grups amino La dêpádc
Ensayo 4$V$S0 IO a 150 primarios en presencia dc del número de aminas
cuztit*ivo p;/ml cianuro o tioles; el colorante prtEntcs, Rc•cciona coa
CBQA no reaccionenccno yegnta otras unina.s primanas. No
compatible coa buffet*
que contengan aminas o
tioles.
Reacciona con grupos amino La sensibtlid•d dependê
39W47$ 0.3 %./ml 13 primarios; el colorante no te-
del numero dc amjnas
m iaa pg/ml xcionantc no presenta flu• presentes. No compatible
orescencia con buffers que contengM
Tris o elieina El reactivo
cs inestable
ReEciona con gruposamino La sensibilidad depende
OPA 34W4SS 0.2 a 2S primarios en presencia de p• del numero de aminas
Wml mercapcoetanol; el colorante pre%nces No compatible
naldái'o) no re•ccionanteno preseau con burreo que contentM
fluorescencia Tris o glicina. Su costo es

del muce La depende

Absorci& 2B0 Wml peptUico.Abwrcióa dc tirosi. dcl número de ami.
UV 50 pVmI a 2 au y tripeofano uomükos
Entes No es dcsuuctivo,
Su coscoes bap

8
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantoteico y
vitaminas A, D y k), minerales (calcio, potasio, sodio, fosforo y metales en pequeñas
cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos
(lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantesde los que carece la leche son el
hierro y la vitaminaC.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y
fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones intermolecularescomo son los puentes de
hidrogeno de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en
suspensiones coloidales
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lactato albuminas y laciato
globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteínaque se separa
de la leche por acidificacióny forma una masa blanca. Las fosfoproteínasson un
grupo de proteínas que están químicamenteunidas a una sustancia que contiene
ácido fosfórico,en la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los
grupos hidroxilode los aminoácidosserina y treonina.La caseína en la leche se
encuentraen forma de sal cálcica (casinita cálcico). La caseína representacerca del
77% al 82% de las proteínaspresentesen la leche y el 2.7 % en composiciónde la
leche líquida
O ISOLECT
Todas las macromoléculasde la naturalezaadquierenuna carga cuando se dispersan
en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeroses que la carga toral
que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendodel pH del medio en el que
se encuentreny de los aminoácidosque la componen,así como de las cargas de
cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente
(irreversible).
Debido a la composiciónen aminoácidosde la proteína,los radicales libres pueden
existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos,
Cualquier proteínatendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientementeácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y
glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina
estarían protonados(-NH3+)
De igual formasi la proteínase encuentraen un medio con un pH muy alto estaría
cargada negativamenteya que en este caso los grupos carboxilo estarían des
protonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).

La transmitancia de una sustancia en solucion es la relación entre la cantidad de luz

transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, lt,Y la cantidad
de luz que incidio sobre ella, lo, y se representa normalmente en tanto por ciento: %
T: IVIox 100
9
La trasmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y
trasmitidaal pasar por la muestra. La relaciónentre % T y la concentraciónno es
lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.

ABSORBANCIA
Absorbancia es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de I/T en
consecuencia:
A = log I/T = -log T = -log IV lo.
Cuando la intensidad incidente y trasmitida son iguales (lo= lt), la trasmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y
entonces A vale log 1= O
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de
la solución del cromóforoy de la concentración de este

Sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una
misma magnitud fotométrica relativa a 2 haces de radiación y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra
Pueden ser de absorción atómica o de masa y visuales
Tiene la capacidad de proyectar un haz de la luz monometricaa través de una muestra
y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra, eso permiterealizar 2
funciones
Dar informaciónsobre la naturaleza de la sustancia
Indicador directamente que la cantidad de la sustancia que interesa está presente en
la muestra.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinarmediante la reacción

del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuS04 en solución acuosa alcalina (gracias a
la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formaciónde un compuesto
de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones
Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos.
La reacción debe su nombreal biuret, una molécula formada a partirde dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a
todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus
moléculas

10
il Rı ı POS:

11
MATRAZ KITAZATQ
AANQ.MARlA

Ο ΑβΑΑΤΟ

ΗΟΒΝ9

12
PROCEDIMIENTO:
X) Separación de las de la leche
1. La leche de vaca contiene aproximadamente3.5% de proteínas, principalmente
caseína (2.9%), lactoalbumina(0.5%) y lactoglobulinas(0.1%).

Separación de Casein.•l.

1. Tomar una porción de leche (100ml) y agregar el

acido láctico (1:9) hasta que su PH sea exactamente
4,7 agitar y dejar reposar por 5 minutos.

2. Decantar sobre un papel filtro cuantitativo tarado, filtrar,

desecar el residuo del homo a 600 C y pesar y estimar su
contenido de leche.

paración de lactoalbu mina

1. Neutralizar con exactitud el suero filtradode la caseína con NaOH al 10%, y

agregar posteriormente3 ml de acido concentradopor cada 100 ml de
leche usada. Calentar sobre baño de María hasta que la albumina precipite
completamente.

2. Centrifugar y obtener el precipitado por decantación, lavar con agua fría,

centrifugar y secar el precipitado por inversión del tubo; pesar para estimar
el contenido albumina húmeda.

14
B) Separación de las proteínas (gluten) de la harina.

1. Pesar de 10g de harina de trigo, colocarla en un

mortero y adicionando agua formar una
pequeña bola de masa, ayudándose con una 1
espátula o cuchara.

2. Tomar la masa y colocarla bajo el chorro de

agua de la llave permitiendoque el agua
arrastre al almidón, hasta tener una pasta
chidosa de color marrón

3. Dejar secar el gluten a temperatura ambiente y

pesar.

15
CUFS AR
1.- Fxplicar cual es el electo de la adición de
sales en altas concentraciones a las protennas
Las sales pesadas actúan sobre las proteínas (enzimas) desnaturalizándolas.
La presencia de sales o agentes como el ion guanidino tambiénpueden
afectar a las interacciones electrostáticas ya que los iones disueltos compiten a
la hora de establecerinteraccioneselectrostáticasde este tipo. Uno de los
agentes desnaturalizantesque se utiliza con más frecuencia es la urea puesto
que compite en la formación de enlaces de puentes de hidrogeno.Las
interacciones hidrofobicas se verán alteradas por sustancias que puedan
establecer interaccionesde la misma naturaleza con los residuos, como lo son
los disolventesapolaresy los detergentes.En algunos casos, si se establecen
las condiciones fisiológicas la proteína recupera su conformaciónnativa y su
función en un proceso denominado re naturalización este hecho demuestra que
toda la conformaciónnecesaria para que se produzca el plegamientose
encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Que proteínas tiene la harina de trigo y

se clasifican
CC)n1Q
Proteínas de la Harina de Trigo
Clasificación:
Las proteínas de la harina de trigo pueden clasificarse con base en:
1. Solubilidad y 2. Funcionalidad
Con base en su solubilidad
Esta clasificaciónfue desarrolladapor Osbome (1924) y consiste en una serie de
extracciones consecutivas con: agua, solución de sal diluida, solución de alcohol y
solución de ácidos o álcalis diluidos. Usando esta secuencia de separación, las
proteínas se pueden clasificar en albúminas, globulinas, gliadinas y gluteninas
respectivamente.La tabla 2, muestra las proteínas presentes en las diferentes
fracciones, además su papel biológico y funcional (Goesaert et al 2005).

16
 ea k-v.•.s•.•..

2. nortt.AS EN

Una fracción importantede proteínas se excluye de las fracciones de Osbome por que
no son ext-ai- bles con ninguno de los disolventesutilizados. Las fracciones de
Osbome no proporcionan una clara separación entre las proteínas para poder
diferenciarlas bioquímicamente, genéticamente o en funcionalidad durante la
elaboración de pan. Actualmente los nombres gliadinas y gluteninas son generalmente
usados para indicar la relación bioquímica/funcionalidad de las proteínas en lugar de la
exclusiva solubilidad de la fracción de Osbome. El fraccionamientode Osbome se usa
todavía extensamente en estudios que relacionan la composición de proteínas con su
funcionalidad, en la elaboración de pan. Además, debido a que este método de
separación es relativamentesimple, a menudo es muy usado como una etapa de
separación inicial para obtener fracciones semipuras de proteína (Goesaert et al
2005).
Con base en su funcionalidad
Desde el punto de vista de la funcionalidad de las proteínas, se pueden distinguir dos
grupos de proteí- nas de trigo. Proteínas pertenecientes al gluten con un desempeño
muy importante en la elaboración del pan y proteínas no pertenecientes al gluten, con
un desempeño secundario en la elaboración del pan. Las proteínas no pertenecientes
al gluten representan entre un 15—20 % del total de las proteína del trigo,
principalmentese encuentranen las capas extemas del grano de trigo y en bajas
concentraciones en el endospermo. Estas proteínas son extraídas en soluciones de
sales diluidas y por Io tanto se encuentran en las fracciones de Osbome de albúminas
y globulinas. En su mayor parte son proteínas monoméricas, estructurales o
fisiológicamente activas (enzimas). No obstante a estas proteínas también pertenecen
un grupo secundario de proteínas poliméricas de almacenamiento, llamadas triticinas,
que pertenecen a la clase globulinas de las proteínas de almacenamientode la
semilla. Están relacionadas con la mayoría de las proteínas de almacenamientode
legumbres y en otros cereales, como la avena y el arroz. (Shewry y Halford, 2002;
Shewry, Napier, y Tatham, 1995).
Estas proteínas se han encontrado en el residuo que queda después del
fraccionamientode Osbome. Su papel en la formaciónde pan no está muy claro
(Veraverbeke y Delcour, 2002).
 Las proteínasdel gluten representanentre un 80-85 % del total de las proteínasdel
trigo, representan la mayor parte de las proteínas de almacenamiento. Pertenecen a la
dase de prolaminas. (Shewry y Halford, 2002; Shewry, Napier, y Tatham, 1995).
Las proteínasdel gluten se encuentranen el endospermodel grano de trigo maduro
donde forman cna matriz continua alrededor de los gránulos de almidón. Las proteínas
de gluten son en gran parte insolubles en agua o en soluciones de sales diluidas.
Pueden distinguirse dos grupos funcionalmente distintos de proteínas de gluten:
gliadinas que son monoméricasy gluteninas que son polimé- ricas y estas últimas se
subclasifican en extraíbles y TABLA 2. PROTEÍNAS PRESENTES EN LAS
FRACCIONES DE OSBORNE. Proteínasde la harina de trigo...Temas de Ciencia y
Tecnología mayo - agosto 2009 29 no extraíbles

% la hV'tru Proteínu

en
del trto. y 15-20%
coocetu•cboes en el

OE pea+us LA Da TEGOCON SU

La tabla 3, muestrala clasificaciónde las proteínascon base en su funcionalidad.Las

gliadinas y gluteninas se encuentran normalmenteen una relación 50/50 en el trigo.
Las gliadinas representan un grupo sumamente polimórfico de proteínas
monomericasdel gluten con peso molecularesque varían entre 30,000 y 80,000
Bioquímicamentese han identificadotres tipos (a, g y w ) (Shewry et al 1986;
Veraverbeke y Delcour 2002). Estas son fácilmente solubles en soluciones de alcohol
en agua y son por lo tanto los principales componentesen la fracción de gliadinas de
I Osbome (ver tabla 2).
Por otra parte, las gluteninasson una mezcla heterogéneade polímeros con pesos
moleculares que varían desde aproximadamente80 000 hasta varios millones de kDa.
Las gluteninasestán entre las proteínasmás grandes encontradasen la naturaleza
(WriIey,1996).El verdaderotamañode las proteínas poliméricasmás grandes no ha
sido determinado con precisión por su enorme tamaño. Mientras que aquellas
gluteninas de tamaño relativamentepequeño, son solubles en soluciones de alcohol al
igual que las gliadinas y ello ha permitidoconocer su peso molecular.
Una gran parte es soluble en ácidos diluidos (Ver tabla 1). Sin embargo una parte
importante no puede ser solubilizada sin cambiar su estructura. Esta importante
insolubilidadde las gluteninasexplica por que a pesar de los esfuerzos significativos,
de ya más de un siglo, se ha encontradopoca informaciónsobre la estructurade las
gluteninas.
Las gluteninas están constituidas por subunidades que están unidas a través de
enlaces disulfuro. Estas subunidades de gluteninas pueden liberarse reduciendo
18
enlaces disulfuro con agentes tales como el b-mercaptoetanolo ditiotreitol,Las
subunidades de glutenina están bioquimicamenterelacionadas con las gliadinas y son
solubles en soluciones de alcohol en agua
Cuatro diferentesgrupos de subunidades de gluteninas pueden ser distinguidos
subunidades de glutenina de alto peso molecularque van entre 65,000 y 90 000 kDa
Subundades de bajo peso moleculartipos B, C y D. Con pesos molecularesentre
30,000 y 60,000

La tabla 4, muestrala clasificaciónde las proteínasdel gluten:gliadinas y globulinas,

con base en sus pesos moleculares,
Ruuo Subudd•da npo•
enraíbles
000

Aho

F•so c

4. DE LAS PROTOu.S DEL GLUTEN, GOA.

ORAS Y GtoeUUNAS. e.AsEEN WS PESOSMOLECULARES.
Por otro lado, las
proteínas del gluten también se pueden clasificar en: ricas en azufre, pobres en azufre
(Shewry et al 1985). Las a y g gliadinas y las subunidadesde gluteninade bajo peso
molecular (tipos B y C) formanel primer grupo (ricas en azufre). Las gliadinas tipo w y
las subunidadesde gluteninade bajo peso moleculartipo D formanel segundo tipo
(pobres en azúfre). (Shewry et al 1985, Shewry et al 1997).

3.- Cuál es la función del gluten en la

para la eja boracion de prod tos horneados
El gluten es responsablede ta elasticidadde la masa de harina, lo que permiteque
junto con la fermentaciónel pan obtenga volumen, así como la consistencia elástica y
esponjosa de los panes masas horneadas.

El gluten se puede obtenera partirde la harina de trigo, centeno,avena y cebada,

lavando el almidón. Para ello se forma una masa de harina y agua, que luego se lava
con agua hasta que el agua sale limpia. El productoresultantetendrá una textura
pegajosa fibrosa, parecida a la del chicle.

En el homeado,el glutenes el responsablede que los gases de la fermentaciónse

19
queden retenidosen el interiorde la masa, haciendo que esta suba. Después de la
cocción, la coagulación del gluten es responsable de que el bollo no se desinfle una
vez cocido. En la cocina, se utiliza para darie consistencia a los alimentos.

4.- Cotno y porque puede llevarse a cabo la

separación de proteínas en base al pH del
ruedio
Electroforesis de zona: las proteínas son moléculasanfóteras:su carga neta depende
del pH del medio. Normalmente, la separación electroforéticade proteínas se hace a
pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global
negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que
las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de
variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel,
acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamiday electroforesis capilar, La muestra cuyas
proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soportey se aplica una
diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas.
Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que tambiéndetermina
hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor
carga y menor tamaño, más velocidad de migración.

5.- Escribir por medio de un ejemplo las

estructuras primarias, secundarias
cuaternarias de una proteína.
• La estructuraprimaria de una proteínase correspondecon la secuencia
lineal de aminoácidos codificada en su correspondiente unidad de
transcripción y suele representarse por medio de una cadena donde cada
letra identifica a un aminoácido o residuo. Por ejemplo, los primeros 30
aminoácidos de la proteína insulina de la mosca Drosophila
melanogaster son:
MFSQHNGAAV HGLRLQSLLI AAMLTAAMAM...

Donde por ejemploM es metionina, es glutaminao A es alanina (ver

tabla 1.1). El sentido de la cadena es desde el extremoaminoterminalhacia el
carboxiloterminal.

20
 Tabla 1.1: Nomenclaturade los 20 aminoácidos
esenciales

CYS Cisteína N ASN Asparagina

ASP Aspartato p PRO Prolina
GLU Glutamato Q GLN Glutamina
Fenilalanina R ARG Arginina
GLY Glicina s SER Serina
HIS Histidina Treonina
ILE Isoleucina v VAL Valina
LYS Lisina W TRP Triptófano
LEU Leucina Y TYR Tirosina
desconocido

De igual manera, la estructura primaria de los ácidos nucleicos es su secuencia

de nucieótidos,que tiene un sentido dado por la direcciónde los enlaces
fosfodiéster.
• La estuctura secundaria es el plegamientoque la cadena polipeptídica
adopta gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos
que forman el enlace peptídico. Los puentes de hidrógeno (en color verde
en la figura inferior) se establecen entre los grupos -CO- y -NH- del enlace
peptídico (el primero como aceptor de H, y el segundo como donador de
H). De esta forma, la cadena polipeptídicaes capaz de adoptar
conformaciones de menor energía libre, y por tanto, más estables.
La estructura secundaria de los ácidos nucleicos está también basada en la
formación de puentes de hidrógeno, dada la naturaleza polar de los
nucleótidos. Para el caso del ADN, como se muestra en la figural.10, el
repertoriode puentes de hidrógeno posibles es muy limitado: adenina (A) con
timina (T) y guanina (G) con citosina (C).

PM AdenlM.Tlmha Par Guanina-CitosiM

Figura 1.10: Posibles emparejamientos de bases en el ADN, figura tomada
21
de

Estos emparejamientos son la base de la estructurasecundariade los ácidos

nucleicos, que suelen ser patronesrepetidoshelicoidales.En el caso del ADN se
suelen formar entre dos polinucleótidos de secuencia complementaria, mientras que
en et ARN son estructuras que se forman dentrodel mismo polinuclétido.
BacNkJs mase P RNA

- mati-loop
I •int«ior hop Anc 1
E - bulge loop
H - haiFin loop

11

11 • A

UCUCAOUA
cca

1 c 'B OSauAu •a

aza
a a u AAuca
o ea VUACL

I aau%

Figura 1.11: Ejemplo de estructura secundaria de una molécula de ARN,

tomado dehttp://www.bioinfo.rpi.edu.
22
 • La estructura cuaternaria solo esté presente si hay mas de una cadena
polipeptídica. Con varias cadenas polipeptídicas, la estructura cuaternaria
representa su interconexióny organización.Esta es la imagen de la hemoglobina,
una proteínacon cuatro polipéptidos,dos alfa-globinasy dos beta globinas. En
rojo se representaal grupo hem (complejopegado a la proteínaque contiene
hiemo, y sirve para transportar oxígeno).
Por lo que actualmente se sabe, la estructura cuatemaria es más bien la regla que la
excepción, de manera que un gran número de proteínas, sobre todo intracelulares,
tienen estructura cuatemaria. Por otra parte, la estructura cuaternaria está a veces
íntimamente relacionada con procesos regulatorios; así, formas activas e inactivas de
determinadas enzimas se diferencian en su estructuracuatemaria.
Un ejemplo clásico de proteína con estructuracuatemaria es la Hemoglobina. Se trata
de una proteína tetraméricacuya función es el transportede oxígeno. Este transporte
está regulado a través de leves modificacionesen su estructuracuatemaria,como
veremos. Así, la hemoglobina puede existir en dos estados diferentes,T y R. El estado
T corresponde a ladesoxihemoglobina, y el estado R a la oxihemoglobina. Esta última
está cargada con oxígeno molecular (02) en la forma que veremos más adelante.
Veamos la Hemoglobina Al (forma T, desoxihemoglobina), que es la forma
predominante en el adulto de una familia de proteínas, las hemoglobinas, encargadas
del transportede oxígeno en el hematíe. Se trata de una proteína oligomérica,
constituída por cuatro subunidades iguales dos a dos. Dos de estas subunidades son
del tipo a, y las otras dos del tipob. Así, la estructuracuatemariade la hemoglobina
Al es a2 b2.

6.- Que diferencias pueden haber

hari nas q ue tienen diferente con) posicion en
su relacion protel nas al 111
idon
Las proteínas de las diferentesharinas de cereales
varían en su composición de aminoácidos. El contenido almidón azúcar
en lisina de todos los cereales es bajo y también el de V materia
metionina, especialmente el trigo, el centeno, la cebada,
la avena y el maíz, comparadoscon las proteínas del proteínas
músculo, de los huevos y de la leche. Mediantemejora
genética se han realizado intentos para aumentar el
contenido de aminoácidos esenciales, que han tenido
de momentoalgunos éxitos. vitaminas materia
En 1907, Osbome separó las proteínas del trigo en mineral
cuatro fracciones en función de sus solubilidades,
extrayendo sucesivamente de una muestra de harina las albúminas, con agua, las
globulinas, con una disolución salina y las prolaminas, con etanol acuoso al 70%. Las
glutelinas quedan en el residuo de la harina. Pueden obtenerse todavía dos

23
subfracciones disolviendo las proteínas del residuo por reducción de los puentes
disulfuro. Aumentando la concentración de propanol al 60% precipitan las subunidades
de elevado peso molecular, quedando en disolución las de bajo peso molecular.

Las albúminas y las globulinas derivan probablementede los residuos citoplasmáticos

y de otras fracciones subcelulares que toman parte en la génesis del grano. También
existen enzimas en las dos primeras fracciones de Osbome, prolaminas y glutelinas
son proteínas de reserva.

tao

tac 4

40 •

H.wa
Mezclas

24
 ( ual es el electo (le Ja
adicion de alcohol o acetona a las soluciones

Emulsiones

r»ezclase hace aparentemente "homogénea" y cremosa.

ue proteunas

Se añaden ácidos débiles, vinagre o limón,para desnaturalizaralgunas proteínas. Con

ello se consiguen dos efectos:

El alimento sea más tiemo

Se crean unas condiciones adversas para el crecimientode
microorganismos. Métodode conservación
Los procedimientosmás usados som

ESCABECHAR (carne o pescado) Y ENCURTIR (frutas y verduras)

ADOBAR, MACERAR Y MARINAR. se añaden sustancias sápidas en
disolución
COCCIÓN CON AZÚCAR, CONSERVACIÓN EN ALCOHOL
SALAZÓN Y AHUMADO Su finalidad es la creación de condiciones adversas al
desarrollo de microorganismos

25
 J ) 22

*OTENA PROTEiNA DESNATURALIZADA

ha Ndo *erada por algut agente desnaturalizarte

DISCUSIONES:
La calidad de una proteína alimenticia,solo puede establecerse medianteensayos de
alimentación(Madl, 1993; Suarez et al-.,2006),pero hoy se sabe lo suficientecon
respeeo a la digestiónde las proteínasy a los efectosde las técnicas de procesados
como para poder realizar experimentalmentebastante precisos. Para ello, es
necesario conocer tanto el contenido proteínicototal del alimentocomo la composición
aminoacidica de su proteína(Madi, 1993).

CONCLUCIONES:

C• El mejor métodopara la determinaciónde proteínas dependerá de varios

factores, 1-node ellos la muestra a analizar y otros la infraestructuracon la que
se cuente; en todos los casos se prefiere la más sencillos y rápidos.

La sensibilidad de los métodos es muy importantecuando la cantidad total de

la muestra es limitadao bien cuando la concentraciónde la proteínaes baja.
La especificidad del métodoes importantecuando se analizan muestras de
diferentenaturaleza, la respuesta del métodono presentará grandes
variaciones dependiendodel tipo de proteína.

Todos los métodosson reproduciblesy varían en la sencillez de la

determinaciónen la sensibilidad y en el costo.
Las proteínas se necesitan para la mayoria de las funciones normales del
cuerpo, como el mantenimiento,crecimiento, reproducción, lactación y
producciónde pelo. El déficitde proteína en la dieta reduce las reversasen
sangre, hígado y músculos y predisponena los animales a padecer una
variedad de enfermedades graves o incluso fatales.
26
 BIBLIOGRAFÍA:

Bradford, M.M., Análisis Biochem., 72, 248-254(1976).

•:• David, N y M, M (2009) lehninger. Principios de la bioquímica. Editorial omega.

http://www.alimentacionynutricion.org/es/index.php?mod=content_detail&id=83
http://recursos.crfptic.es:9080/jspui/bitstream/recursos/55/8/7%20f%c3%8dsico

27