TRABAJO PRÁCTICO: MITOSIS y CITOGENÉTICA HUMANA

A) MITOSIS

Objetivo
1. Realizar una actividad de repaso y reconocimiento sobre las distintas fases de la división mitótica y sus
características más importantes.
2. Relacionar los patrones de reconocimiento de cada fase mitótica con los procesos subyacentes y los
resultados funcionales de dicho proceso.

Material a utilizar
 Preparados permanentes de meristemas de raíces de Allium cepa
 Microscopioóptico

Desarrollo del trabajo práctico

Los alumnos observarán los preparados en el microscopio a 400X y reconocerán las distintas fases de la
mitosis.Seguidamente cuantificaran en un total de 500 células contadas en por lo menos 3 campos distintos,
las distintas fases y registraran los valores obtenidos. Calcularán los siguientes parámetros
Índice mitótico (IM): Numero de células en mitosis / 500 células totales observadas
Índice de fases (If): Número de células en fase / total de células en mitosis

Responder:
a. ¿Cuál podría ser la utilidad de obtener el IM de un tejido proliferante?
b. ¿Cómo relacionaría los valores de Ife IM con la duración de la mitosis?
c. ¿Cómo relacionaría los diferentes valores de los If con los eventos que transcurren en cada una de
estas?
d. La condensación de los cromosomas es un factor presente en la división mitótica¿Con que otro
evento se podría correlacionar?
e. ¿Cuál de las fases es más adecuada para la observación de la morfología cromosómica? ¿Por qué es
necesario inhibir la formación de los microtúbulos e inducir la hipotonía?

B) CITOGENÉTICAH U M A N A

Introducción

La Citogenética es el campo deestudiosobre la estructura y organizacióndel genoma eucariota así como su

composición molecular y genómicabasada en análisis cromosómicos. Los cromosomas son unidades de
cromatina que portan una determinada secuencia de ADN en asociación con ARN y proteínashistónicas y no
histónicas. Elnúmero y la estructura cromosómica en eucariotas caracterizan grupos taxonómicos y en última
instancia las especies.

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La estructura y morfología de los cromosomas eucarióticos se visualiza y define cuando la cromatina
presenta máximo grado de compactación y el ADN se encuentra duplicado formando 2 cromátides. La
observación de células en división meióticatambién aplica las mismas técnicas aunque los objetivos de los
estudios están orientados ala búsqueda depatrones característicos en la meiosis como es el entrecruzamiento,
los quiasmas, las regiones homólogas que se manifiestan en el apareamiento de los cromosomas, etc, para
estudios evolutivos, clínicos poblacionales etc.
La técnica de observación de cromosomas fue llevada a cabo por Tjio y Levan en la década del 50 y fue a
partir de ese momento que la citogenética amplió su campo de estudio integrando los conocimientos
provenientes de la genética mendeliana, la mutagénesis yla genética molecular. Los campos de aplicación
más relevantes son el diagnóstico clínico, la evolución cromosómica, el mejoramiento genético, la
evaluación genotoxicológica.

Las técnicas citogenéticas incluyen el bandeo cromosómico, siendo el bandeo G el más utilizado para
identificary diferenciar a los cromosomas, aunque existen otras técnicas de bandeo citogenético. La
citogenética molecular aplica hibridación de sondas de ADN reveladas por fluorescencia in situ (FISH) e
hibridación genómica comparativa (CGH).

Metodología parael estudio de morfología cromosómica en células humanas

Los cromosomas metafásicospermiten el estudio de la morfología de los cromosomas y la determinación del

número modal o número cromosómico más frecuente. Dado que esta fase es bastante corta, la proporción de
metafases en una población de células proliferantes es en general, escasa. Para facilitar el análisis se puede
enriquecer el tejido en células metafásicas al incorporar al medio un inhibidor del huso mitótico como la
colchicina u 8-Q (este último es de preferencia en meristemas). Se pueden identificar 2 métodos generales
para la obtención de células mitóticas
Métodos directos: Las células mitóticas se obtienen a partir de tejidos proliferantes que se extraen y se
extienden o aplastan en un portaobjeto y se observan con una tinción adecuada.En estos tejidos las células
están en división mitótica espontánea (por ej.: meristemas, médula ósea, mucosas)
Métodos de cultivo: pueden ser cultivos primarios (ej: fibroblastos) o líneas celulares (HepG2, Hep-2, HeLa,
etc.) que proliferan espontáneamente en un medio de crecimiento,
Metodos de cultivo con estimulación:las células deben ser estimuladas con un agente mitógeno, para inducir
la desdiferenciación y el reinicio de la división mitótica (por ej.: linfocitos de sangre periférica, siendo éstos
los más utilizados en citogenética humana). Para los análisis cromosómicos clínicos, las células tienen que
crecer y dividirse rápidamente en cultivo. Las células más accesibles que cumplen estos requisitos son los
leucocitos de la sangre, en especial los linfocitos T.

Cultivo de linfocitos de sangre periférica

La muestra sangre periférica se obtiene por venopunción, mezclándola conheparina para impedir su
coagulación. La sangre puede usarse entera o aislando los leucocitos por centrifugación. Las célulasse
colocan en un medio de cultivo y se estimulan para que se dividan con un agente mitógeno. Al cabo de unos
cuantos días de incubación, las células en división se detienen en metafase mediante la inhibición del huso
mitótico con agentes químicos o frío. Posteriormentelos cultivos se retiran de incubación y se tratan con una
solución hipotónica para que la membrana nuclear se rompa al realizar el extendido y los cromosomas se
separen. Se coloca fijador para detener el proceso yfinalmente se extiende la fijación sobre un portaobjeto y
se tiñen con una de las técnicas disponibles. Los cromosomas ya están listos para su análisisbásico. El
análisis del cariotipo a nivel citológico puede ser complementado por cariotipado molecular, es decir, la
aplicación de las técnicas citomoleculares para la evaluación de la integridad y las características del
cariotipo a nivel del genoma completo. Los niveles de resolución, sensibilidad y facilidad del análisis de los
cromosomas y del genoma son cada vez mayores.

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Figura 1: siembra y cosecha.

Cultivo de líneas celulares

Las células en cultivo se dividen hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una
monocapa). Como consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación
hasta que se pasan a un recipiente de subcultivocon medio fresco.Alícuotas del cultivo pueden conservarse
por congelación y descongelarse para subcultivarsenuevamente al momento de hacer los estudios. Algunas
líneas celulares humanas son de utilidad para estudios cromosómicos aunque estos suelen presentar
alteraciones en el número y estructura conforme aumentan los pasajes.

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Análisis citogenético

En metafase cada cromosoma está formado por dos cromátidas hermanas unidas por el centrómero, que
controla la segregación cromosómica durante la división celular. El centrómero divide al cromosoma en
brazos: el brazo corto se llama p y el brazo largo se llama q, y tiene una posición fija y única para cada
cromosoma. Ésta puede ser medial (cromosoma metacéntrico), submedial (cromosoma submetacéntrico),
subterminal (cromosoma acrocéntrico) o terminal (cromosoma telocéntrico) (Fig. 2).

igura 2: Morfología cromosómica

F

El idiograma de un cromosoma es un mapa que muestra la relación entre los brazos, el centrómero y la
presencia de tallos y satélites. En el idiograma se ilustra, también, el patrón de bandas específico de ese
cromosoma. Por otro lado, el cariograma es el ordenamiento sistematizado de los cromosomas de una única
célula. Tras el análisis al microscopio óptico se toman imágenes de aquellas células en metafase que sean de
la mejor calidad. Laobservación de 15 a 20 células con un análisis completo de al menos 5 de ellas permite
disponer de los cromosomas de a pares según su tamaño y bandeo, definiendo así el cariotipo del individuo
en cuestión.
El número, la morfología (dada por el tamaño y posición del centrómero) y la estructura de los cromosomas
definen las constantes cromosómicas. Las metodologías de bandeo (ver más adelante) han hecho posible el
análisis detallado de la estructura cromosómica.

El cariotipo humano
Las células somáticas de Homo sapiens sapiens contienen 23 pares de cromosomas homólogos (22 pares de
autosomas y un par sexual: XX en la mujer, XY en el varón). En humanos se utiliza una nomenclatura
específica: primero se escribe el número cromosómico (2n), seguido por la descripción del par sexual, y a
continuación se indica la alteración cromosómica, si la hubiere. Por ejemplo: la nomenclatura
correspondiente a los complementos cromosómicos normales es 46,XX (mujer) y 46,XY (varón).
Los 23 pares cromosómicos presentan diferente tamaño y morfología. Según las variables cromosómicas, se
distinguen 7 grupos de cromosomas humanos; los autosomas se enumeran del 1 al 22 en orden decreciente
de tamaño (Tabla 1, Fig. 3).

Tabla 1

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Figura 3: Los cromosomas humanos ordenados según los diferentes grupos.

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Bandeo cromosómico
Las técnicas de bandeo permiten detectar, a lo largo de cada cromosoma, bandas alternantes de mayor y
menor tinción (o fluorescencia), que forman un patrón estable y característico de cada cromosoma. Este
patrón de bandas es de gran utilidad práctica porque facilita la identificación precisa de cada cromosoma y,
además, hace posible la caracterización de regiones particulares dentro de cada brazo cromosómico. El
primer bandeo utilizado fue el llamado “Q” (por la sustancia fluorescente empleada, quinacrina) que exhibe
uno de los patrones de bandas más informativos, aunque requiere de microscopía de fluorescencia.
Posteriormente, se comprobó que el mismo patrón de bandeo podía ser obtenido mediante la extracción
selectiva de componentes cromosómicos, utilizando la enzima tripsina o soluciones salinas y una tinción con
el colorante de Giemsa (usado habitualmente en hematología). Este patrón de bandas llamado G (de
“Giemsa”) es el utilizado como estándar (Fig. 4 y 5).

Figura 4: Metafase humana con Bandeo G. Figura 5: Cariotipo humano con Bandeo

El patrón de bandeo varía según el estado de elongación de los cromosomas; en los cromosomas más
acortados, propios de la metafase (y también acortados por mayor tiempo pasado en presencia de colchicina),
el número total de bandas detectables en el cariotipo humano es de aproximadamente 400 (Fig. 6).
Cuando se observan células en prometafase, con cromosomas más elongados, el número de bandas visibles
puede llegar a sobrepasar las mil. Este patrón de bandas es llamado “de alta resolución” (Fig. 7). Las
diferencias entre el primer patrón y el segundo consisten en el desdoblamiento de bandas metafásicas en sub-
bandas en la prometafase. El bandeo Q y el bandeo G producen bandas que están relacionadas con la
composición de bases del ADN en las regiones bandeadas. Las bandas oscuras del bandeo G y las brillantes
(fluorescentes) del bandeo Q representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T, de manera que su
coloración es proporcional a la concentración de A+T. Esto es apoyado por los resultados obtenidos con
sustancias de afinidad específicas por el par de bases A-T, tales como la daunomicina y el “Hoechst 33258”;
mientras que las sustancias que se unen preferencialmente al par G-C, como la cromomicina A3, dan un
patrón de bandeo fluorescente inverso al bandeo Q y al G.
Además de poseer riqueza en el par A-T, las bandas oscuras del bandeo G se caracterizan por poseer
relativamente pocos genes y por contener proteínas diferentes a las halladas en las bandas claras (no
coloreadas).

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 Figura 7: Representación esquemática del
cromosoma 14 con bandeo G en estadio de
320 bandas (izquierda), 500 (centro) y 900
(derecha); ilustrando el uso del Sistema
Internacional de Nomenclatura para
Figura 6: Representación esquemática del cariotipohumano designar a las regiones, bandas y sub-
en el estadio de 400 bandas con bandeoG. bandas cromosómicas.

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 Objetivo del TP
1. Experimentar el conteo y reconocimiento de cromosomas en preparados provenientes de linfocitos de
sangre periférica(LSP) y línea celular humana HEp-2 (human epidermoidlaryngeal carcinoma)
2. Familiarizarse con el reconocimiento de los grupos cromosómicos en los preparados celulares de
LSP.
3. Observar patrones de Bandas G en los preparados y comparar con figuras preestablecidas con el
objetivo de reconocer alguno de los cromosomas del esquema en el preparado.

Material a utilizar
 Preparados de cultivos de linfocitos de sangre periférica humana (LSPH) con y sin bandeo
 Preparados de cultivos celulares HEp-2 con y sin bandeo
 Microscopio

Desarrollo del Trabajo Práctico

Observación de preparados LSPH al microscopio óptico:

Los alumnos recorrerán los preparados a 100X y 400X tratando de localizar células en metafase. El objetivo
de esta parte es observar metafases y tratar de determinar el número cromosómicomediante el conteo de los
cromosomas presentes en cada metafase. Algunos vidrios corresponden a metafases con tinción estándar (o
tinción uniforme) y otros, bandeo G. Pueden verse con aceite de inmersión sin necesidad de ponerles
cubreobjetos. ¡¡¡NO olvidar limpiar la lente del microscopio al terminar de usarlo!!!
Observación de preparados provenientes de líneas celulares HEp-2:
Seguir las indicaciones que en el ítem anterior, y contar el número de cromosomas de las células. Es
probable encontrar células tengan un número muy diferente a 46 con frecuencia. Investigar las características
de la línea en relación con el número cromosómico o ploidía que la caracteriza.
Obtener un número modal a partir del conteo de 30 metafases.
Identificar por lo menos 3 grupos cromosómicos de acuerdo al tamaño.
Observar algún preparado con bandeo G y reconocer algún cromosoma por comparación con el esquema de
la guía.

Responder

¿Cuál es el númeromás frecuente encontrado en los LSP humana? Y en la línea HEp-2?

¿Cuántos grupos pudo reconocer de acuerdo al tamaño de los cromosomas humanos?
¿Y a su morfología?
¿Qué cromosomas pudo identificar en preparados con bandeo cromosómico?

Confección del cariotipo (actividad interactiva): Los alumnos realizarán un ejercicio de simulación con
imágenes digitales obtenidas de la siguiente dirección de internet:
http://www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping2.html. El ejercicio involucra la
comparación de los cromosomas por su tamaño, la ubicación del centrómero y la secuencia de bandas G. Los
cromosomas se ordenarán en un cariotipo completo y se interpretarán los resultados como si se estuviera
trabajando en un servicio de genética médica de un hospital. El cariotipo se completará electrónicamente
para tres casos, buscando alteraciones citogenéticas que puedan explicar el fenotipo de los pacientes.

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Verma R., A. Babu. 1994. Human chromosomes. Principles and techniques. Ed. McGraw-Hill.

Nota:La elaboración de este TP fue posible gracias al trabajo y la colaboración delasDras. Gabriela Chaufan,
Laboratorio de Enzimología, Estrés y Metabolismo (LEEM) del Departamento de Química Biológica y de la
Dra. Mariela Nieves del Grupo de Investigación en Biología Evolutiva (GIBE), Departamento de Ecología,
Genética y Evolución. FCEN-UBA