PCR Reacción en Cadena de La Polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Una técnica utilizada para amplificar, o hacer muchas copias de, una región de ADN blanco en
específico.
Puntos más importantes:

• La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer
muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de
ensayo en lugar de un organismo).
• La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y

requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de
ADN de interés.
• En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de

temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región
blanco.
• La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza

de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis
forense de ADN.
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio
común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una
región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le
interese al experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere
entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses
para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.
Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco

para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN
amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en
gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.
La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación
en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.
La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima
ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las
cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en
la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló
(Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es

muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70 °\text C70°C70, °,
start text, C, end text (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E.
coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad
térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente
para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.
Cebadores para PCR

Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay
un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de
partida para la síntesis de ADN. En una reacción de PCR, la región de ADN que será
copiada, o amplificada, se determina por los cebadores que el o la investigadora
elija.
Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla,
generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se
utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco (la
región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán que se
unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la región a
copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases.
ADN molde:
5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3'

ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5'
Cebador 1: 5' CAGATCCATGG 3' Cebador 2:
Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la región que se
encuentra entre ellos se copia.
[Diagrama que muestra con más detalle el ADN y la direccionalidad del cebador]
Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores,
ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan
en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos
repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:
1. Desnaturalización (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): la reacción se

calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto
proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
2. Templado (555555 - 656565°\text C°C°, start text, C, end text): la reacción se
enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias
complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
3. Extensión (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): la temperatura de la

reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice
así nuevas cadenas de ADN.
Este ciclo se repite 252525 - 353535 veces en una reacción de PCR típica, que
generalmente tarda 222 - 444 horas, según la longitud de la región de ADN que se
copia. Si la reacción es eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones
de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco.
Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad,
el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente
ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas
de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de
ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón
de crecimiento exponencial.
Uso de la electroforesis en gel para visualizar los
resultados de una PCR
Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen
visibles) al usar electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica en la
que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de
gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un
estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de
los fragmentos en la muestra de PCR.
Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel que se
puede identificar a simple vista si el gel se tiñe con un pigmento que se una al ADN.
Por ejemplo, una reacción de PCR que produce un fragmento de 400400400 pares de
bases (pb) se vería así en un gel:
Carril izquierdo: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500 pb.
Carril derecho: resultado de la reacción de PCR, una banda de 400 pb.
Una banda de ADN contiene muchas, muchas copias de la región blanco de ADN, no
solo una o unas cuantas copias. Dado que el ADN es microscópico, deben existir
muchas copias de este para poder verlo a simple vista. Esto es una parte importante
de por qué la PCR es una herramienta importante: produce suficientes copias de una
secuencia de ADN para poder ver o manipular esa región de ADN.
Aplicaciones de la PCR
Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o
miles de millones de veces y producirá suficientes copias de ADN para que se
analicen mediante otras técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por
electroforesis en gel, enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restricción
y clonar en un plásmido.
La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene

aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por
ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a
partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La
PCR también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el
cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar regiones
de su ADN de una muestra de sangre o tejido.
Problema de ejemplo: la PCR en ciencias forenses

Imagina que trabajas en un laboratorio forense. Acabas de recibir una muestra de
ADN de un cabello encontrado en la escena de un crimen junto con muestras de ADN
de tres posibles sospechosos. Tu trabajo es examinar un marcador genético
determinado y ver si alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello
para este marcador.
El marcador se presenta en dos alelos o versiones. Uno contiene una secuencia

repetida una vez (región marrón en la siguiente imagen) y el otro contiene la
secuencia repetida dos veces. En una reacción de PCR con cebadores que flanquean
la región con las secuencias repetidas, el primer alelo produce un fragmento de ADN
de 200200200 \text{pb}pbstart text, p, b, end text y el segundo produce un fragmento
de 300300300 \text{pb}pbstart text, p, b, end text:
Alelo marcador 1: los cebadores que flanquean la región de secuencias repetidas

amplifican un fragmento de 200 pb de ADN.
Alelo marcador 2: los cebadores flanquean la región de repetidas amplifican un

fragmento de 300 pb de ADN
Realizas PCR para las cuatro muestras de ADN y visualizas los resultados por
electroforesis en gel, como se muestra a continuación:
El gel tiene cinco carriles:
Primer carril: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500 pb.
Segundo carril: ADN de la escena del crimen, banda de 200 pb.
Tercer carril: ADN del sospechoso #1, banda de 300 pb.
Cuarto carril: ADN del sospechoso #2, bandas de 200 y 300 pb.
Quinto carril: ADN del sospechoso #3, banda de 200 pb.
¿Cuál es el sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del crimen para
este marcador?
Escoge 1 respuesta:
Escoge 1 respuesta:
El sospechoso 111
•
El sospechoso 222
•
El sospechoso 333
•
Ninguno de los sospechosos
[Pista]
Comprobar
Más sobre PCR y análisis forense

En pruebas forenses reales de ADN para una escena del crimen, los técnicos harían
un análisis conceptualmente similar al del ejemplo anterior. Sin embargo, se
compararía un número de diversos marcadores (no solo un marcador como en el
ejemplo) entre el ADN de la escena del crimen y el ADN de los sospechosos.
Además, los marcadores utilizados en un análisis forense típico no tienen solo dos
formas diferentes. Por el contrario, son altamente polimórficos (poli =
muchos, morfo = forma). Es decir, se presentan en muchos alelos que varían en
pequeños incrementos de longitud.
El tipo de marcador más usado en el análisis forense, llamado repeticiones cortas

en tándem (STR, por sus siglas en inglés), consiste en muchas copias repetidas de la
misma secuencia corta de nucleótidos (de 222 a 555 nucleótidos de largo, por lo
general). Un alelo de un STR puede tener 202020 repeticiones, mientras que otro
podría tener 181818 y otro solo 101010^11start superscript, 1, end superscript.
Al examinar múltiples marcadores, cada uno de los cuales presenta muchas formas
alélicas, los científicos forenses pueden construir una "huella dactilar" genética
única a partir de una muestra de ADN. En un análisis típico de STR que
utiliza 131313 marcadores, la probabilidad de un falso positivo (que dos personas
tengan la misma "huella dactilar" de ADN) ¡es menor a 111 en 101010 \text{mil
millones}mil millonesstart text, m, i, l, space, m, i, l, l, o, n, e, s, end text^11start
superscript, 1, end superscript!
Aunque se pueda pensar que las pruebas de ADN se usan para condenar a los
criminales, también han jugado un papel crucial en exonerar personas falsamente
acusadas (incluso algunas que tenían muchos años encarceladas). El análisis forense
también se usa para determinar paternidad y para identificar restos humanos en
escenas de desastre.

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Puntos más importantes:

• La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y

• En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de

• La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es

Cebadores para PCR

5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3'

Cebador 1: 5' CAGATCCATGG 3' Cebador 2:

Los pasos de la PCR

Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): la reacción se

3. Extensión (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): la temperatura de la

Carril derecho: resultado de la reacción de PCR, una banda de 400 pb.

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene

Problema de ejemplo: la PCR en ciencias forenses

El marcador se presenta en dos alelos o versiones. Uno contiene una secuencia

Alelo marcador 1: los cebadores que flanquean la región de secuencias repetidas

Alelo marcador 2: los cebadores flanquean la región de repetidas amplifican un

Segundo carril: ADN de la escena del crimen, banda de 200 pb.

Tercer carril: ADN del sospechoso #1, banda de 300 pb.

Quinto carril: ADN del sospechoso #3, banda de 200 pb.

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