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    Clase 4 ELISAs

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    El documento describe la prueba de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), un método cuantitativo y cualitativo para detectar antígenos o anticuerpos. Se explica que la prueba involucra el uso de enzimas como reporteros para detectar la unión de antígenos-anticuerpos. Existen varios tipos de ELISA como directo, indirecto, de sándwich y competitivo. La prueba es sensible, específica y se usa comúnmente para diagnósticos de infecciones y detección de metabolitos.

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    El documento describe la prueba de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), un método cuantitativo y cualitativo para detectar antígenos o anticuerpos. Se explica que la prueba involucra el uso de enzimas como reporteros para detectar la unión de antígenos-anticuerpos. Existen varios tipos de ELISA como directo, indirecto, de sándwich y competitivo. La prueba es sensible, específica y se usa comúnmente para diagnósticos de infecciones y detección de metabolitos.

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    clase 4 ELISAs

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    El documento describe la prueba de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), un método cuantitativo y cualitativo para detectar antígenos o anticuerpos. Se explica que la prueba involucra el uso de enzimas como reporteros para detectar la unión de antígenos-anticuerpos. Existen varios tipos de ELISA como directo, indirecto, de sándwich y competitivo. La prueba es sensible, específica y se usa comúnmente para diagnósticos de infecciones y detección de metabolitos.

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    Pruebas para detección de

    antígeno-anticuerpo

    ELISA

    MGTR. BRECHLA MORENO A.


    LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
    EVA ENGVALL Y PETER PERLMANN
    • 1971, UNIVERSIDAD STOKHOLM, SUECIA. ENGVALL AND PERLMANN PUBLISHED THEIR FIRST
    PAPER ON ELISA IN 1971 AND DEMONSTRATED ITS QUANTITATIVE VALUE USING ALKALINE
    PHOSPHATASE AS THE REPORTER.
    • UN AVANCE REVOLUCIONARIO QUE REEMPLAZA LAS PELIGROSAS PRUEBAS RADIOACTIVAS.
    ELISA
    ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
    ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS
    • ENZYME IMMUNOASSAY- EIA
    • PRUEBA DE LABORATORIO BASADA EN LA QUÍMICA MEDIANTE LA QUE SE DETECTA LA PRESENCIA DE
    UNA SUSTANCIA, O SE DETERMINA EN QUÉ CANTIDAD ESTÁ PRESENTE, EN UNA MUESTRA DE SANGRE O
    EN OTROS LÍQUIDOS CORPORALES UTILIZANDO PARA ELLO UNA REACCIÓN INMUNOLÓGICA.
    ELISA
    ENSAYO DE INMUNOABSORBENTE LIGADO A
    • ES UN
    ENZIMAS
    MÉTODO UTILIZADO PARA DETECTAR CUALITATIVA O CUANTITATIVAMENTE UN ANTÍGENO O
    ANTICUERPO DENTRO DE UNA MUESTRA UTILIZANDO LA PROPIEDAD DE UNA MOLÉCULA MARCADORA.
    • UN ANTÍGENO ES CUALQUIER SUSTANCIA QUE PROVOCA QUE EL SISTEMA INMUNITARIO PRODUZCA
    ANTICUERPOS CONTRA SÍ MISMO. UN ANTÍGENO PUEDE SER UNA SUSTANCIA EXTRAÑA PROVENIENTE DEL
    AMBIENTE, COMO QUÍMICOS, BACTERIAS, VIRUS O POLEN.
    • UN ANTICUERPO ES UNA PROTEÍNA PRODUCIDA POR EL SISTEMA INMUNITARIO DEL CUERPO CUANDO
    DETECTA SUSTANCIAS DAÑINAS, LLAMADAS ANTÍGENOS.
    ELISA
    ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY

    CARACTERÍSTICAS DE LA PRUEBA ELISA:


    1)EL ANTÍGENO Y ANTICUERPO PUEDEN ENLAZARSE A UNA SUPERFICIE PORTADORA INSOLUBLE Y
    RETENER SU REACTIVIDAD INMUNOLÓGICA;
    2)LAS ENZIMAS TIENEN ACTIVIDAD ESPECÍFICA ALTA Y CONVIERTEN UNA CANTIDAD RELATIVAMENTE
    GRANDE DE SUSTRATO EN PRODUCTO DETECTABLE, LO QUE PERMITE DETECTAR CONCENTRACIONES
    MUY BAJAS DEL LIGANDO;
    3) LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA O REACTIVIDAD INMUNOLÓGICA DE LOS CONJUGADOS SE PRESERVA Y
    PERMANECE ESTABLE DURANTE EL ANÁLISIS Y EL ALMACENAMIENTO;
    4) LAS ENZIMAS NO ESTÁN PRESENTES EN EL LÍQUIDO BIOLÓGICO QUE SE VA A ANALIZAR.
    ELISA
    ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT
    ASSAY

    Soporte de pocillos: POLIPROPILENO.

    Conjugados: Ac. Monoclonal +enzima


    Fosfatasa alcalina
    Peroxidasa de rábano

    Cromógenos:
    Rojo fijo PNPP (Para-nitrofenil-fosfato)
    DAB (Diaminobenzidina)
    OPD (Ortho-fenilendiamina)
    TMB (Tetrametilbencidina)
    ABTS
    PNPP (PARA NITROFENIL FOSFATO)
    PERÓXIDO DE HIDROGENO

    Solución de Stop
    ÁCIDO SULFÚRICO De Waglione - Trabajo propio, CC BY-SA 3.0,
    https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=4508
    875
    TIPOS DE ELISA

    Elisa Directo

    Elisa Indirecto

    Elisa de sandwich

    Elisa Competitivo
    ELISA DIRECTO
    • EN ESTA TÉCNICA TENDREMOS ANTÍGENOS INMOVILIZADOS ( EN LA PLACA ) Y AL
    ENTRAR EN CONTACTO CON LA MUESTRA PROBLEMA LOS AB ANTICUERPOS
    PRIMARIOS CONJUGADOS CON ENZIMAS SE UNIRÁN PRODUCIENDO UNA
    REACCIÓN.
    • ES ESPECÍFICA YA QUE SOLO DETECTARÁ EL ANTICUERPO PRIMARIO.
    ELISA INDIRECTO
    • EN UN ELISA INDIRECTO, EL ANTÍGENO SE UNE AL FONDO DEL POCILLO DE LA MICROPLACA, LUEGO
    SE AGREGA UN ANTICUERPO ESPECÍFICO PARA EL ANTÍGENO. UN ANTICUERPO SECUNDARIO,
    CONJUGADO CON UNA ENZIMA U OTRA MOLÉCULA DE DETECCIÓN, SE UNE AL PRIMER ANTICUERPO.
    ELISA DE SANDWICH
    • PARA EL ELISA SANDWICH, SE USAN DOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA DOS EPÍTOPOS DIFERENTES EN EL
    ANTÍGENO OBJETIVO.
    • EL ANTICUERPO DE CAPTURA ESTÁ UNIDO AL FONDO DEL POCILLO DE LA MICROPLACA Y SE UNE A UN
    EPÍTOPO DEL ANTÍGENO. EL ANTICUERPO DE DETECCIÓN SE UNE AL ANTÍGENO EN UN EPÍTOPO DIFERENTE Y
    SE CONJUGA CON UNA ENZIMA QUE PERMITE LA DETECCIÓN. (SI EL ANTICUERPO DE DETECCIÓN NO ESTÁ
    CONJUGADO, SE REQUIERE UN ANTICUERPO DE DETECCIÓN SECUNDARIO CONJUGADO A ENZIMA).
    https://www.moleculardevices.com/applications/enzyme-linked-immunosorbent-assay-
    elisa#gref
    ELISA COMPETITIVO

    • ES UNA VARIANTE DE LA TÉCNICA DE ELISA CONOCIDA TAMBIÉN COMO ELISA DE INHIBICIÓN DEBIDO
    AL USO DE UN ANTÍGENO DE REFERENCIA QUE COMPETIRÁ CON EL ANTÍGENO DE LA MUESTRA POR
    UNIRSE A UN ANTICUERPO PRIMARIO.
    • PORQUÉ SE UTILIZA ? PARA DETECTAR O CUANTIFICAR ANTÍGENOS PRESENTES EN MUY BAJAS
    CANTIDADES.
    https://www.thermofisher.com/pa/en/home/life-
    science/protein-biology/protein-biology-learning-
    center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-
    methods/overview-elisa.html
    IMPORTANTE SABER….

    • SENSIBILIDAD: ES LA CAPACIDAD DE LA TÉCNICA PARA DETECTAR LAS MENORES


    CONCENTRACIONES DEL ANALITO EN INVESTIGACIÓN.

    • ESPECIFICIDAD: CAPACIDAD DE LA TÉCNICA PARA DIFERENCIAR LOS ACS ESPECÍFICOS (O


    ANTÍGENOS) DE OTROS.

    • LOS RESULTADOS FINALES DE LA LECTURA COLORIMÉTRICA SE REFLEJAN NUMÉRICAMENTE


    MEDIANTE VALORES DE ABSORBANCIA O DENSIDAD ÓPTICA QUE SE OBTENDRÁN A LA LONGITUD
    DE ONDA MÁS ADECUADA PARA LA COLORACIÓN FINAL ALCANZADA.
    • PLACAS DE MICROPOCILLOS
    INSTRUMENTACIÓN
    • RECIPIENTES DESECHABLES PARA REACTIVOS

    • DISPOSITIVO DE LAVADO ( LAVADOR DE MICROPLACAS O BOTELLAS DE LAVADO MANUAL)

    • PIPETAS DE DIVERSOS VOLÚMENES

    • PIPETA MULTICANAL

    • PUNTAS DE PIPETA

    • LECTOR DE MICROPLACAS

    • BUFFER DE LAVADO

    • DILUYENTES

    • SISTEMAS DE DETECCIÓN ( ESTRAPTAVIDINA-HRP)

    • ANTICUERPOS VALIDADOS

    • SOLUCIÓN STOP
    RESUMEN
    APLICACIONES CLINICAS

    • DIAGNÓSTICOS DE INFECCIONES: AL DETECTAR EL ANTÍGENO DEL AGENTE


    INFECCIOSO.
    • CONFIRMACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS: PUEDES SER CONTRA
    CUALQUIER MICROORGANISMOS, VACUNAS , AUTOANTICUERPOS ETC.
    • CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS: HORMONAS, MEDICAMENTOS, DROGAS.
    CONSIDERACIONES GENERALES

    • LOS ENSAYOS DE ELISA PUEDEN SER CUALITATIVOS O CUANTITATIVOS ( SI ES CUANTITATIVOS USTED


    DEBE REVISAR LAS UNIDADES DE MEDIDAS QUE VIENEN ACOMPAÑADAS CON SUS UNIDADES DE
    REFERENCIA ).
    • CURVA ESTÁNDAR SE USA UNA CURVA ESTÁNDAR PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DE LA
    MUESTRA. PRIMERO, SE TRAZAN LOS VALORES DE ABSORBANCIA DE LAS CONCENTRACIONES
    ESTÁNDAR (PG / ML).
    • LAS CAUSAS DE ERROR EN ELISA QUE SE REPITEN CON FRECUENCIA SUELEN TENER UN ORIGEN EN LA
    INSTRUMENTACIÓN, PROCEDIMIENTO DE LAVADO , PREPARACIÓN DE REACTIVOS O EN EL INCORRECTO
    CUMPLIMIENTO DEL PROTOCOLO.
    GRACIAS !

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