Anticuerpos monoclonales y su uso como tratamiento de Lupus

Eritematoso Sistémico (LES)

INTRODUCCIÓN - Desarrollo de la inmunología: El descubrimiento y caracterización de los anticuerpos tiene
una larga historia que es propia de la inmunología.

SIGLO XIX

• Von Behring y Kitasato: sentaron las bases de la inmunidad humoral al descubrir que el suero producía
sustancias que antagonizaban toxinas como la diftérica y tetánica.
• Ehrlich: idea de que las toxinas generaban antitoxinas séricas que se comportaban según las leyes de
la química; las células de la sangre producían unas cadenas laterales que reaccionaban de manera
específica frente a toxinas como una llave con su cerradura

SIGLO XX

• Landsteiner: descubridor del sistema ABO, identifica los anticuerpos y sus funciones, y va sustituyendo
el nombre de toxina por antígeno
• Landsteiner y Pauling: desarrollan la teoría instruccionalista de formación de los anticuerpos, según la
cual los Ag determinarían la conformación de los Ac acomodándola a su estructura

FINALES 40’s

• Se descubre el origen de los Ac de las células B y plasmáticas

• Se describen las cadenas ligeras y se identifican las Igs A, D y E

FINALES 50´s

• Burnett y Talmage: adelantan la teoría de la selección clonal y presupone que cada célula B produce
solo un tipo de Ac especifico la cual se genera por mutaciones somáticas al azar durante el proceso de
maduración celular; más adelante la exposición a Ag hace que las células B proliferen.

1975

• Milstein y Köhler: Descubren los Ac monoclonales (AcM)

1976

• Tonegawa: describe la recombinación somática de los genes de inmunoglobulinas. Desde entonces se

completa el conocimiento de la genética molecular de los Ac y los mecanismos de generación de la
diversidad

ESTRUCTURA GENERAL DE LOS AC

Cada Ac está formado por 4 cadenas: 2 ligeras y 2 pesadas

• Cada una de ellas idénticas

• Unidas por puentes disulfuro formando una estructura espacial similar a una “Y”

Funciones fundamentales:

• Reconocimiento del Ag
• Unión al Ag

Se llevan a cabo mediante los extremos terminales amino de las cadenas y una función efectora por el
extremo carboxiterminal
Cadenas ligeras:

• Región variable: de la cual depende su especificidad

• Región constante: difiere según se trate de κ o λ

Cadenas pesadas:

• Región variable:
• Región constante: determinará las clases o isotipos principales de las Igs (α – IgA; δ – IgD; γ – IgG; ε –
IgE; μ - IgM.)

Una vez secretadas son monoméricas, excepto:

• IgA- forma dímeros • IgG – forma pentámeros

Regiones variables de cadenas ligeras y pesadas:

• Están yuxtapuestas y forman el sitio de unión al Ag (cada molécula de Ac tiene 2 sitios de unión)

Dominios (estructuras repetidas de 110 aa):

Cadenas ligeras:

• 1 dominio en la región variable (VL) • 1 dominio en la región constante (CL)

Cadenas pesadas:

• 1 dominio en la región variable (VH) • 3 o 4 dominios en la región constante (CH)

Regiones hipervariables: 10 aa en el sitio de unión que forman bucles

• CDR 1 • CDR 2 • CDR 3: el mas variable

Proteólisis de la Ig da lugar a distintos fragmentos:

• Pepsina: corta a la altura de la bisagra dejando la parte superior de la “Y” con 2 fragmentos F(Ab)
unidos
• Papaína: digiere la molécula más arriba y deja 3 fragmentos: 2 F(Ab) y un fragmento constante Fc

SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS

¿Cómo se sintetizan millones de Ac distintos con un número limitado de material genético en cada
individuo? El organismo utiliza genes con una multitud de segmentos génicos internos. Estos segmentos se
recombinan para dar lugar a la formación de millones de LB diferentes y que así se pueden sintetizar Ig
diferentes.

Existe una gran variedad de Ac, tantos como Ag. Esta gran variedad se obtiene como consecuencia de la
reordenación y la mutación de los genes que codifican la región V. Existen 2 etapas básicas en este proceso:

• Reordenamiento Somático: los genes de las inmunoglobulinas (anticuerpos) se reorganizan para

crear una amplia diversidad de anticuerpos.
• Hipermutación Somática: es un proceso que ocurre en las células B activadas en los centros
germinales de los folículos linfoides durante una respuesta inmunológica. Introduce mutaciones
específicas en las regiones variables de los genes de las inmunoglobulinas, lo que aumenta la
diversidad y la afinidad de los anticuerpos.

Segmentos Génicos:
Existen múltiples segmentos génicos que codifican diferentes partes de las cadenas de inmunoglobulina:

Cadena Pesada tiene:

• Segmento V (variable): responsable de la región variable

• Segmento D (diversidad):
• Segmento J (unión): responsables de la región de unión de la
cadena pesada del Ac
• Segmento C (constante)

Cadena Ligera tiene:

• Segmento V (variable)
• Segmento J (unión)
• Segmento C (constante)

Locus de Igs: segmentos génicos que se reordenan para la formación de la diversidad de inmunoglobulinas se
encuentran en los siguientes cromosomas según la cadena:

• Reordenamientos puede generar alrededor de 1010 variaciones

• El número segmentos génicos para recombinar en cada cadena difieren entre los individuos

Reordenamiento Somático

Cadenas pesadas:

1. Reconocimiento de segmentos V(D)J: En el locus de Igs en el cromosoma 14, los segmentos V

(variables), D (diversidad) y J (unión) correspondientes a las cadenas pesadas son reconocidos por las
enzimas recombinasas RAG1 y RAG2.
2. Recombinación V(D)J: Las enzimas RAG1 y RAG2 cortan y unen los segmentos V, D y J de manera
aleatoria, generando así una combinación única de estos segmentos en una cadena de ADN (VDJ
unido).
3. Empalme alternativo: proceso que elimina las secuencias no deseadas y une los segmentos V, D y J
seleccionados de manera precisa para crear una secuencia de ADN contigua llamada "región variable
completa" de la cadena pesada.
4. Unión de cadenas pesadas: regiones variables completas de las cadenas pesadas se ensamblan con
las regiones constantes de las cadenas pesadas para formar la cadena pesada completa de la
inmunoglobulina.

Cadenas ligeras:

1. Reconocimiento de segmentos V(J): En el locus de inmunoglobulina en el cromosoma 2, los segmentos

V (variables) y J (unión) correspondientes a las cadenas ligeras son reconocidos por las enzimas
recombinasas RAG1 y RAG2.
 2. Recombinación V(J): enzimas RAG1 y RAG2 cortan y unen los segmentos V y J de manera aleatoria,
generando así una combinación única de estos segmentos en una cadena de ADN (VJ unido).
3. Empalme alternativo: proceso que elimina las secuencias no deseadas y une los segmentos V y J
seleccionados de manera precisa para crear una secuencia de ADN contigua llamada "región variable
completa" de la cadena ligera.
4. Unión de cadenas ligeras: Las regiones variables completas de las cadenas ligeras se ensamblan con
las regiones constantes de las cadenas ligeras para formar la cadena ligera completa de la
inmunoglobulina.

Hipermutación Somática: Es un proceso que induce mutaciones específicas en las regiones variables de las
cadenas pesadas y ligeras de las Ig.

1. Activación de los LB: este proceso ocurre en células B activadas durante una respuesta inmunológica.
Estas células B han pasado por el proceso de reordenamiento somático para generar Ac con regiones
variables específicas.
2. Ingreso a los centros germinales: células B activadas que han pasado por el reordenamiento somático
ingresan a los centros germinales de los folículos linfoides, que son estructuras especializadas en los
tejidos linfoides.
3. Inducción de mutaciones aleatorias: dentro de los centros germinales, las células B experimentan la
hipermutación somatica, proceso catalizado por una enzima llamada "AID" (Actividad de Desaminasa
de la Citidina). AID induce mutaciones específicas en las secuencias de ADN de las regiones variables
de los genes de inmunoglobulinas. Estas mutaciones son aleatorias y pueden afectar a las secuencias
de bases en las regiones variables de los genes de inmunoglobulinas. Pueden incluir sustituciones,
inserciones o eliminaciones de bases.
4. Selección de afinidad: células B que han experimentado mutaciones continúan expresando anticuerpos
con las nuevas secuencias mutadas en sus regiones variables. Luego, interactúan con el antígeno
específico.
5. Clonación y expansión: aquellas células B cuyos Ac mutados tienen una mayor afinidad por el Ag
tienen más probabilidades de sobrevivir y proliferar en los centros germinales.
6. Iteración del proceso: proceso de hipermutación somática y selección de afinidad continúa
iterativamente en los centros germinales. Las células B siguen acumulando mutaciones y
seleccionando las que confieren una mayor especificidad y afinidad para el antígeno.
7. Diversificación del proceso: las células B con anticuerpos cada vez más afinados se seleccionan y se
convierten en células productoras de anticuerpos de alta afinidad. Esto contribuye a una respuesta
inmunológica más eficaz y específica contra el antígeno invasor.

Reordenamiento no productivo

• Todas estas variaciones pueden generar una inmunoglobulina no funcional

• Las secuencias no productivas pueden tener varios destinos: apoptosis, reparación del ADN, no
participan en la respuesta inmune.

PRODUCCIÓN Y DESARROLLO DE AcM

Los anticuerpos monoclonales (AcM) son proteínas diseñadas para reconocer y unirse específicamente a un
objetivo particular, como un Ag específico. La producción de AcM implica varios pasos clave:

1. Selección del Ag objetivo: identificar y seleccionar el Ag específico al cual se dirigirá el AcM. Este Ag
puede ser una proteína, una célula, un virus u otro componente que se desea detectar o neutralizar.
2. Seleccionar la fuente de células productoras de Ac: esto se puede lograr de dos maneras principales:
 -Inmunización: inyectar Ag en un organismo modelo (ratón o rata, etc). Las células B del animal
generan una respuesta inmunológica y producen una variedad de anticuerpos contra el antígeno.
-Clonación de células B humanas: esto se hace tomando muestras de sangre o médula ósea de un
individuo, seleccionando células B específicas o células B que han sido activadas contra el antígeno de
interés.
3. Fusión de células: células B que producen Ac específicos se fusionan con células de mieloma (células de
cáncer de médula ósea). Esto crea células híbridas llamadas hibridomas, que pueden crecer y proliferar
de manera indefinida en cultivo y continúan produciendo el Ac.
4. Selección de clones: hibridomas se seleccionan y se analizan para identificar aquellos que producen Ac
específicos de interes
5. Cultivo de hibridomas y recuperación de Ac: hibridomas se cultivan en grandes cantidades en
condiciones controladas >> los Ac producidos por los hibridomas se secretan al medio de cultivo >>
Luego, los anticuerpos se pueden recuperar y purificar a través de técnicas de cromatografía y
precipitación.
6. Especificidad y reactividad: se analiza la capacidad de un anticuerpo para unirse a un único Ag diana.
7. Afinidad e internalización: se analiza la fuerza de la interacción de unión entre la molécula y su ligando
o pareja de unión. La internalización es el proceso de monitorización de la capacidad de una partícula
determinada para entrar en la célula.

Humanización de Ac

Los anticuerpos monoclonales originales pueden provenir de ratones, ratas u otras especies, y a menudo
generan una respuesta inmunológica en los pacientes humanos, lo que puede limitar su eficacia y seguridad.

La "humanización" de Ac es un proceso de ingeniería biológica que implica modificar AcM de origen no

humano para que sean más similares a los anticuerpos producidos naturalmente por los seres humanos.

Consiste en:

• Transferencia de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región hipervariable

de las Ig del organismo modelo, a estructuras de las regiones variables o constantes de cadenas
pesadas o ligeras de una Ig humana.

Proceso general:

1. Identificación de CDR de la especie: se identifican las regiones en el anticuerpo que contribuyen de

manera significativa a su especificidad y capacidad de unión al antígeno (CDR).
2. Clonación de genes de la región variable de los Ac no humanos: Se clonan los genes que codifican las
regiones variables de los anticuerpos originales (VH y VL) de la especie no humana.
3. Fusión con genes de la región constante del Ac humano: Los genes de las regiones variables (VH y VL)
de la especie no humana se fusionan con genes humanos que codifican la región constante (CH y CL)
de un anticuerpo humano. Crea una estructura de Ac híbrida con regiones variables no humanas y
regiones constantes humanas.

APLICACIONES GENERALES DE LOS AcM

1. Detectar y cuantificar niveles de expresión génica

2. Identificar interacciones moleculares con productos de genes
3. Marcador fenotípico de un tipo celular: base de la moderna clasificación de linfocitos y fagocitos
monucleares
4. Inmunodiagnóstico: dx de muchas enfermedades infecciosas y sistémicas al permitir la detección
de Ag y Ac específicos en la circulación o tejidos usando AcM
 5. Diagnóstico y tratamiento de tumores específicos
6. Tratamiento de enfermedades autoinmunes
7. Tratamiento de septicemia
8. Tratamiento de intoxicaciones por fármacos

GENERALIDADES DEL LES

• El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune crónica que implica la producción
de ciertos anticuerpos en todo el cuerpo y la consecuente inflamación de tejidos conjuntivos
• Es bastante progresiva y mortal cuando no se lleva a cabo el tratamiento adecuado
• Se ha postulado su procedencia genética, ambiental, inmunológica, o incluso por factores hormonales;
pero en realidad su etiología es desconocida

Prevalencia

• Estados Unidos: 150 por cada 100 000 habitantes por año
• Paises de Europa: 28 y 71 por cada 100 000 habitantes por año

Incidencia

• Estados Unidos: 5.1 por cada 100 000 habitantes por año
• Paises de Europa: 2.2 a 4.7 por cada 100 000 habitantes por año

Es más común en mujeres que en hombres, casi de 10 a 1

• Mujeres jovenes: 15-44 años

SINTOMATOLOGÍA

El LES se presenta clínicamente de forma muy variable en los pacientes. Entre los principales sintomas se
encuentran:

• Fatiga
• Fiebre sin causa aparente
• Pérdida de peso
• Inflamaciones periódicas
• Afectaciones cutáneas (exantema en “alas de mariposa”)
• Afectaciones articulares (artritis, artrosis)
• Afectaciones hematológicas (anemia)
• Afectaciones cardiovasculares (miocarditis, endocarditis, hipertensión arterial pulmonar)
• Infecciones (neumonía, herpes e infecciones de vías urinarias)
• Nefropatías (nefritis, fallo renal)
• Serositis (derrame pleural, ascitis)

FISIOPATOLOGÍA

En cuanto a la fisiopatología del LES, se conoce que el sistema inmune, y específicamente los linfocitos B, no
son capaces de diferenciar entre lo propio y lo no propio, por lo que generan reacciones inflamatorias severas
en órganos importantes. Estos linfocitos son precursores de autoanticuerpos y de citoquinas proinflamatorias,
que regulan la actividad de los linfocitos T. Las citoquinas inducidas por tales anticuerpos corresponden a:

• Interleucina 2 (IL-2): promueve la proliferación de LT y es producida principalmente por los LT activados.

Forma parte de la respuesta de tipo Th1.
 • Factor de necrosis tumoral (TNF): producida por monocitos, macrófagos y linfocitos. Ejerce efecto
antitumoral a través de un doble mecanismo que incluye la inhibición de la angiogénesis (produce
necrosis hemorrágica del tumor) y el aumento de la respuesta inmune antitumoral.
• Interferón alfa (INF-α): producida por un grupo de células inmunes, incluyendo los macrófagos y los LB.
Potente efecto regulador de las células del sistema inmune, así como también acción antiviral y
antineoplásica.

A pesar de que se conoce esta actividad de las citoquinas, aún no se sabe completamente cómo es la
participación de las células B en la fisiopatología de esta enfermedad.

TRATAMIENTOS CONVENCIONALES

• Metotrexato: efectos antiproliferativo, antiinflamatorio e inmunorregulador,

• Ciclofosfamida y azatioprina: antineoplásico e inmunosupresor
• Hidroxicloroquina: Medicamentos antimaláricos. Reducen la inflamación
• Medicamentos inmunosupresores
• Glucocorticoides: amplios efectos antiinflamatorios en la inmunidad celular, pero pocos sobre la
humoral. Se unen a receptores intracelulares y regulan la transcripción de muchos otros genes.
Suprimen la formación de citoquinas proinflamatorias.
• Beta bloqueadores: se prescriben a personas con LES, para taquicardia sinusal y para hipertensión
arterial
• Anticuerpos monoclonales: reaccionan específicamente contra el antígeno que estimuló su
producción

AcM APROBADOS PARA LES

Belimumab (Benlysta®)

- Aprobado en marzo de 2011 por la FDA para el tratamiento del LES en adultos
- Es una IgG1 monoclonal humana que se une al estimulador de linfocitos B (BLyS). Citoquina de la
familia de TNF
- También conocido como factor activador de células B (BAFF)
- Esta unión evita que el BAFF actúe sobre las células B
- En esta patología, este factor (TNF) está sobreexpresado, por lo que promueve la supervivencia de
dichos linfocitos, incluidos los autorreactivos >> Alta concentración de BLyS en la circulación se
correlaciona con una mayor actividad de la enfermedad
- Los ensayos clínicos BLISS-52 y BLISS-76 demostraron la eficacia de este medicamento para reducir la
actividad de la enfermedad y para prevenir brotes.
- En un tercer estudio se encontró que pacientes con LES presentaban una gran fracción de LB de
memoria y una diferenciación celular muy marcada. Una vez aplicado el tratamiento con el AcM hubo
una disminución rápida de células B de las etapas iniciales de desarrollo, mientras que las de etapas
posteriores fueron más resistentes a alteraciones.

PERSPECTIVAS A FUTURO

Anticuerpos monoclonales en estudio y pruebas para el tratamiento del LES:

• Ofatumumab: AcM contra CD20. Marcador expresado en los LB, permitiendo que los antiCD20 puedan
realizar una acción dirigida hacia dichas células y provocar opsonización, lisis y muerte
• Sifalizumab y Anifrolumab son agentes bloqueadores del INF-α.
• Ustekinumab: bloquea la IL-12 y la IL-23. Ambas tienen un papel importante en la respuesta
inflamatoria; igualmente, desempeñan un rol en las respuestas autoinmunes
CONCLUSIONES

LES es una enfermedad autoinmune crónica que produce anticuerpos en todo el cuerpo y causa una
inflamación en tejidos conjuntivos.

Los Ac monoclonales son una herramienta que tiene alta especificidad que permite el abordaje de dianas muy
precisas que pueden determinar cambios celulares muy variados.

El uso del Belimumab como terapia complementaria al tratamiento convencional, ha disminuido el daño a
largo plazo en los pacientes, mejorando su calidad de vida, por tanto, se han demostrado que son una terapia
biológica efectiva contra el LES.

VIDEOS

https://www.youtube.com/watch?v=ZddX_GnuyqU&list=WL&index=52&t=345s

https://www.youtube.com/watch?v=N3mTKEscl5g&list=WL&index=51

https://paradigmia.com/curso/inmunologia/modulos/mecanismos-de-generacion-de-la-diversidad-de-
linfocitos-t-y-b/temas/reordenamiento-de-los-genes/