Articulo 2

PRODUCCIÓN DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki
POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON
MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL
MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
SANTAFE DE BOGOTA, D.C
2003
PRODUCCIÓN DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki
POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON
MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL
MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA
Propuesta de Proyecto de Grado para optar el titulo en Ingeniero Químico.
Director
ANDRES FERNANDO GONZALEZ BARRIOS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
SANTAFE DE BOGOTA, D.C
2003
AGRADECIMIENTOS
A Andrés Fernando González, por su colaboración.
A todo el personal del CITEC, en especial a José Maria Robles.
A Fernando Andrade, Representante de Purificación y Análisis.
A Amparo Forero, Directora de proyecto biopesticidas, VECOL.
A Oscar Álvarez.
A Carolina Rojas.
A Cristina Gómez.
A mis Padres,
Por su apoyo incondicional

TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN
JUSTIFICACIÓN
OBJETIVOS
1. ANTECEDENTES 9
2. BACILLUS thuringiensis 15
2.1 Morfología 15
2.2 Bioquímica de B. thuringiensis 16
2.3 Ciclo Biológico 16
2.3.1 Germinación y fase vegetativa 16
2.3.2 Fase estacionaria: Esporulación 17
2.3.3 Cristal paraesporal 18
2.4 Patogenicidad 19
3. TIPOS DE FERMENTACIÓN 22
3.1 Fermentación tipo Batch 22
3.2 Fermentación Continua 22
3.3 Fermentación tipo Fed-Batch 23
4. MODELO CINÉTICO PARA EL CRECIMIENTO DE

MICROORGANISMOS 24
4.1 Modelo no estructurado 24
4.2 Curva de crecimiento 24
4.3 Ecuaciones de crecimiento celular 27
4.4 Estequiometría 30
5. FILTRACIÓN 32
5.1 Filtración con flujo tangencial (CFF) 32
5.1.1 Ventajas de filtración con flujo transversal 34
5.2 Ultrafiltración 35
6. PRODUCTOS BIOINSECTICIDAS A BASE DE Bacillus thuringiensis 38

6.1 Productos de primera generación 39
6.2 Productos de segunda generación 42
6.3 Productos de tercera generación 43
7. MATERIALES Y MÉTODOS 45
7.1 Primera parte 45
7.1.1 Activación 45
7.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre 46
7.1.3 Conservación de Microorganismos 47
7.2 Segunda parte: Fermentación Batch 47
7.2.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación
Batch 48
7.3.Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo 49
7.3.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación
Fed-Batch discontinuo, pulsos 1, 2 y 3 de sustrato 49
8. MÉTODOS DE ANÁLISIS 53
9. RESULTADOS 54
9.1 Primera parte 54
9.1.1 Activación 54
9.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre 54
9.1.3 Conservación de Microorganismos 55
9.2 Segunda parte: Fermentación Batch 55
9.2.1 Parámetros de evaluación 56
9.2.2 Variables del crecimiento celular 58
9.3.Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo 59
9.3.1 Fermentación Fed-Batch: Con 1 Pulso de sustrato 59
9.3.1.1 Parámetros de evaluación 60
9.3.1.2 Variables del crecimiento celular 61
9.3.2 Fermentación Fed-Batch: Con 2 Pulsos de sustrato 62
9.3.3 Fermentación Fed-Batch: Con 3 Pulsos de sustrato 66
9.4 Análisis cualitativo y cuantitativo de proteína tóxica 69
10. ANÁLISIS DE RESULTADOS 72

10.1 Fermentación Batch 72
10.2 Fermentacion Fed-Batch Discontinuo 74
10.3 Proteína Toxica 79
11. CONCLUSIONES 80
BIBLIOGRAFÍA 84
ANEXOS 86
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Diferentes estudios para la producción de B. thuringiensis 13

Tabla 2. Clasificación proteínas Cry 21
Tabla 3. Productos comerciales de cepas nativas 40
Tabla 4. Productos recombinantes comerciales 42
Tabla 5. Productos recombinantes en Pseudomonas 44
Tabla 6. Pulsos de sustrato para las fermentaciones Fed-Batch Discontinuo 49
Tabla 7. Parámetros y metodologías de evaluación. 53
Tabla 8. Condiciones proceso Batch 56
Tabla 9. Resultados Esporulación Proceso Batch 57
Tabla 10. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Batch 58
Tabla 11. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 1 59
Tabla 12. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 1 R 59
Tabla 13. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch pulso 1 61
Tabla 14. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch pulso 1 61
Tabla 16. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2 R 63
Tabla 17. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch pulso 2 65
Tabla 18. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 2 65
Tabla 20. Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch 3 68
Tabla 21. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 3 68
Tabla 22. Resultados proteína total. 71
Tabla 23. Resultados análisis electroforesis. 71
Tabla 24. Resultados finales fermentaciones Batch 73
Tabla 25 Datos Globales fermentación Fed-Batch 78
Tabla 26. Medio de cultivo 86
Tabla 27. Porcentaje del Medio de cultivo 86
Tabla 28. Medio de cultivo LB 87
Tabla 29. Datos de la curva de calibración DNS 93
Tabla 30. Patrones estándares de Proteína 97
Tabla 31. Datos primera fermentación Batch 98
Tabla 34. Datos Fed-Batch pulso 1 100
Tabla 35. Datos Fed-Batch pulso 1 R 100
Tabla 37. Datos Fed-Batch pulso 2 R 101
Tabla 39. Consumo de glucosa Batch 1 103
Tabla 42. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1 104
Tabla 43. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1R 105
Tabla 45. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 2R 106
Tabla 47. Cuantificación de Biomasa Batch 1 108
Tabla 50. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 111
Tabla 51. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 R 112
Tabla 53. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 2 R 114
Tabla 55. Datos Esporulación Batch 1 119
Tabla 56. Promedio Esporulación Batch 1 119
Tabla 61. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1 122
Tabla 62. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1 122
Tabla 63. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1 R 123
Tabla 64. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1 R 123
Tabla 67. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2 R 125
Tabla 68. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2 R 125
Tabla 69. Datos filtración Agua 127
Tabla 70. Datos filtración cultivo 128
Tabla 71. Especificaciones del Biorreactor 133
Tabla 72. Partes del Biorreactor 134
Tabla 73. Especificaciones Bomba peristáltica. 140
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Esquema General de filtración Tangencial 33

Figura 2. Inoculo 43
Figura 3. Esquema del sistema de filtración 50
Figura 4. Montaje para el sistema Fed-Batch 51
Figura 5. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Batch 56
Figura 6. Grafica consumo de Glucosa Fermentaciones Batch 57
Figura 7. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch 57
Figura 8. Grafica Oxigeno Disuelto Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1 60
Figura 9. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso1 60
Figura 10. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Fed-Batch
Pulso 1 61
Figura 12. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso2 64
Pulso 2 65
Figura 15. Grafica Consumo de Glucosa Fermentaciones Fed-Batch Pulso 3 67
Pulso 3 68
Figura 17. Resultados Electroforesis 1 69
Figura 18. Resultados Electroforesis 2 70
Figura 19. Muestras de peso seco 90
Figura 20. Muestras para pruebas de Azucares 92
Figura 21 Curva de calibración DNS 93
Figura 22. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch 117
Figura 23. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones
Fed-Batch pulso 1 117
Figura 26. Partes del Biorreactor 126
Figura 27. Partes Bomba peristáltica 140
Figura 28. Proceso de limpieza para la membrana 141
Figura 29. Horno 142
Figura 30. Cámara de flujo laminar 142
Figura 31. Centrifuga para epphendors 142
Figura 32. Balanza de Precisión 142
Figura 33. Desecador 143
Figura 34. Equipo de Electroforesis 143
Figura 35. Bomba peristaltica 143
Figura 36. Espectrofotómetro 143
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Composición medio de cultivo liquido 86

Anexo B. Metodologías para los parámetros de evaluación 88
Anexo C. Toma de Datos 98
Anexo D. Datos del Consumo de Glucosa 103
Anexo E. Datos de Biomasa 108
Anexo F. Grafica comparativa de Biomasa Total 117
Anexo G. Datos Esporulación 119
Anexo H. Desempeño de la membrana 127
Anexo I. Descripción del Biorreactor 129
Anexo J. Membrana de flujo tangencial 135
Anexo K. Descripción Bomba Peristáltica 139
Anexo L. Procedimiento de limpieza para la Membrana de filtración 141
AnexoM. Equipos 142
INTRODUCCIÓN
La preocupación mundial acerca del problema sobre el control de plagas con productos
químicos se ha ido incrementado día a día y la reducción en la aplicación de estos
productos en la agricultura es cada vez más notable. Los productos agroquímicos no
siempre dan buenos resultados, por lo que se presta mucha atención e importancia a una
agricultura más biológica y menos dañina para el medio ambiente.
En el control integrado de plagas se trabaja de forma directa y preventiva. Una de estas
opciones es el control biológico, donde el empleo de microorganismos o sus productos
sirven para combatir las plagas. Por lo tanto se evita o reduce el uso de plaguicidas
químicos, los cuales dejan residuos tóxicos en los frutos, plantas y medio ambiente en
general.
En Colombia, el sector agrícola ha sido muy importante en el desarrollo económico del
país. No obstante diversos factores como el ataque de insectos considerados como plagas,
afectan las diferentes clases de cultivos, lo implica una reducción en el nivel de la
productividad nacional.
Como una alternativa de solución a este problema, se ha venido desarrollando en los
últimos años la biotecnología agrícola, la cual busca reducir en buena proporción el uso de
productos químicos existentes en el mercado. Esta tecnología busca incrementar la
producción del agro, y con el uso adecuado de agentes microbianos de control biológico
lograr un gran espectro de eficacia.
Bacillus thuringiensis es uno de los microorganismos más utilizados en todo el mundo
como biopesticida. Entre las diferentes subesp, se encuentra Bacillus thuringiensis subesp
kurstaki, la cual es tóxica para insectos del orden lepidóptera. Esta subespecie ya es
ampliamente industrializada y comercializada en el control biológico agrícola; por su alta
especificidad, estabilidad, biodegrabilidad, de actividad rápida y no siendo tóxica para
animales mamíferos. Por lo tanto surge la necesidad a nivel industrial de buscar nuevos
métodos de producción para aumentar el rendimiento dentro del proceso y obtener mayor
cantidad de producto en menos tiempo.
El propósito de este proyecto es desarrollar y evaluar un nuevo proceso para la producción
de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki a nivel de planta piloto. Para dicho proceso se
llevo a cabo la implementación de un biorreactor con membrana de flujo tangencial.

JUSTIFICACION
Debido a que Bacillus thuringiensis subesp kurstaki es uno de los biopesticidas más
producidos a nivel industrial, surge la necesidad de implementar nuevos procesos para una
mejor producción en periodos de tiempos más pequeños, sin alterar la calidad del producto
activo, en este caso la toxina.
Se a encontrado en los diferentes estudios para subespecies diferentes a kurstaki, una
mayor productividad de toxina, utilizando retención parcial de células, y cultivos continuos
de dos fases usando un sistema interno de filtración, también se han hecho estudios en
Cultivos Fed-Batch (Discontinuos y Continuos), llegando a la conclusión que sistemas Fed-
Batch discontinuos y la retención total de células, pueden ser los posibles métodos en los
cuales se podría obtener una mayor producción de esporas y biomasa para Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki.
Con el uso de la tecnología de una membrana de flujo tangencial, se quiere desarrollar a
nivel de planta piloto, un proceso de ultrafiltración con retención total de células en la
fermentación. Dicho proceso favorecerá el crecimiento del microorganismo al retirar los
metabolitos secundarios, que según otros estudios realizados inhiben el crecimiento; y en

consecuencia se obtenga una alta producción de biomasa, una alta concentración de esporas
y cristales, que finalmente generen un valor de toxicidad del nivel requerido, y con una
disminución del tiempo total durante el proceso.
La relevancia del proyecto radica en su aplicabilidad a futuro del proceso, dejando las bases
para un posible estudio de escalado en la producción a nivel Industrial de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki. Evaluando el rendimiento obtenido en el proceso Fed-Batch
Discontinuo con membrana de flujo tangencial.
Lo que se pretende con este proyecto en acuerdo con la Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB) Medellín, Col, es el de implementar un proceso para la producción de
Bacillus thuringiensis subesp kurstaki, por medio de un sistema Fed-Batch discontinuo con
membrana de flujo tangencial

OJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
• Aumentar el rendimiento para la Producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki
por medio de un sistema de Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo tangencial.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Implementar un biorreactor con una membrana de flujo tangencial y evaluar su
desempeño para la producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.
• Conocer y analizar los diferentes parámetros de la cinética de crecimiento de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki en un sistema Batch y en un sistema Fed-Batch
Discontinuo.
• Evaluar el comportamiento de diferentes variables importantes en el proceso como
son: concentración de biomasa, concentración de esporas, cantidad y análisis
cualitativo de toxina producida.

IQ-2002-2-06
1. Antecedentes1
La producción de Bacillus thuringiensis se realiza tanto en fermentaciones discontinuas o
tipo Batch como fermentaciones continuas y semicontinuas, denominadas Fed-Batch. La
metodología Batch es la más usada para producción industrial, pero a nivel de planta piloto
se han desarrollado otras metodologías como: Fed-Batch, cultivos discontinuos de Fed-
Batch (IFBC), cultivos continuos de Fed-Batch (CFBC), y sistemas de dos fases. Con el
fin de tener un aumento en la biomasa, concentración de esporas y toxicidad, logrando
una disminución en el tiempo total en el proceso de producción.
El proceso para la producción Bacillus thuringiensis tipo Batch, el cual consiste en la
adición inicial de nutrientes para que el microorganismo se reproduzca en forma
exponencial hasta que se agote el sustrato limitante; en esta fase hay mayor demanda de
oxígeno disuelto en el fermentador y al mismo tiempo, debido a la inhibición en el ciclo
del ácido tricarboxílico se produce una acumulación de ácidos y consecuentemente se
obtiene una disminución en el pH.
Finalizando el sustrato limitante, la fermentación llega a la fase estacionaria donde
aumenta la concentración del oxigeno disuelto y pH, iniciándose tanto el proceso de
1
Producción de Bacillus thuringiensis, Pág. 113-122.
9
IQ-2002-2-06
esporulación como el proceso para la formación del cristal. El proceso de producción
finaliza con la separación del cristal y las esporas con ayuda de alguna de las operaciones
de separación sólido-liquido tales como centrifugación o filtración.
El proceso Fed-Batch consiste en la adición de nutrientes durante la fermentación pero sin
la eliminación de medio agotado y material celular. Este procedimiento se puede realizar
en forma continua o discontinua. El Fed-Batch continuo consiste en un flujo constante de
nutrientes al fermentador, tratando de mantener una concentración permanente de sustrato
limitante dentro del cultivo ó para mantener constante la velocidad de crecimiento.
El mantenimiento de la concentración baja de sustrato limitante disminuye la velocidad de
crecimiento y permite un metabolismo mas ordenado, generando un posible aumento en la
densidad celular, y en la toxicidad del producto; también puede disminuir la demanda de
oxigeno disuelto en el fermentador. Kuppuusamy y Balaraman (1991) realizaron estudios
en Fed-Batch continuo con Bacillus thuringiensis subesp israelensis manteniendo la
concentración de glucosa entre 0.3 y 0.5%, obteniendo una de las densidades celulares más
altas señaladas hasta el momento, manteniendo la concentración de esporas y obteniendo
una toxicidad 5 veces mayor que la obtenido en cultivo Batch (tabla 1).
Con el mismo propósito Kang et al. (1992) realizaron estudios en Fed-Batch discontinuo y
continuo con Bacillus thuringiensis subesp kurstaki con un flujo constante de sustrato; sin
embargo para inducir la esporulación en el cultivo fue necesario suspender el suministro de
nutrientes logrando una esporulación completa a las 23 horas de iniciada la fermentación.
10
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También notaron que el aumento de la concentración de sustrato limitante (glucosa)
aumentaba la concentración de bacteria, pero inhibía la esporulación. Avignon-Rossa y
Mignone (1993) desarrollaron un sistema Fed-Batch continuo con incremento lineal de
flujo de sustrato utilizando Bacillus thuringiensis subesp israelensis. Este incremento
lineal del flujo se adapta mejor al crecimiento del microorganismo, lo que permite tener
mayor concentración de sustrato en donde la concentración celular es baja y viceversa. La
toxicidad del producto fue menor a la obtenida en cultivos Batch, pero se logro mantener en
los ensayos realizados a diferentes concentraciones de sustrato en Fed-Batch.
El sistema Fed-Batch discontinuo consiste en el suministro de nutrientes en forma de
pulsos, durante momentos estratégicos de la fermentación cuando el sustrato limitante esta
próximo a acabarse. Kang et al. (1992) realizaron con éxito un cultivo Fed-Batch
discontinuo con Bacillus thuringiensis subesp kurstaki obteniendo concentraciones de hasta
72.6 g/L de biomasa y 1.25x1010 esporas/mL, estos resultados son superiores a los logrados
en Fed-Batch continuo; en este proceso se pude realizar una disminución controlada de
sustrato limitante y, por lo tanto, una disminución en la velocidad de crecimiento. Se puede
concluir que es necesario una velocidad alta de crecimiento para lograr una buena
esporulación.
Vallejo et al. (1999), estudiaron la producción de Bacillus thuringiensis subesp Medellín
en un sistema Fed-Batch discontinuo, logrando mantener la toxicidad del producto a nivel
11
IQ-2002-2-06
normal en los cultivos con 1, 2 y 3 pulsos de sustrato. Obteniendo valores de 25 g/L de
biomasa y 9x108 esporas/mL. La adición de un cuarto pulso causa una esporulación y una
toxicidad menor.
La producción de Bacillus thuringiensis en sistemas fermentativos alternativos ha sido
estudiadas por Kang et al. (1993) quienes desarrollaron una metodología semejante a un
cultivo continuo pero con retención celular completa, permitiendo de esta manera retirar
medio agotado que posiblemente puede inhibir la esporulación y agregar medio fresco.
Utilizando Bacillus thuringiensis subesp kurstaki se obtuvo una biomasa de 82.2 g/L y
una concentración de 1.6x1010 esporas/mL.
Selinger et al. (1988) investigaron el crecimiento y producción de cristales de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki en un reactor tipo ciclón por medio de un cultivo Batch y
continuo. Pasados los 25 ciclos del cultivo continuo, se encontró que se empezaron a
generar microorganismos asporiferos, disminuyendo los rendimientos en las producción
de la toxina de interés. Los cultivos continuos de Bacillus thuringiensis solo se han
realizado para el estudio de la cinética de crecimiento de la bacteria (Mignone y Avignone-
Rossa, 1996; Sachidananham et al., 1997), ya que en la prolongación del tiempo del
cultivo se registra la aparición de mutantes asporiferos y en consecuencia una disminución
de de la toxicidad. Esto posiblemente sea debido a que los cultivos continuos han utilizado
como fuente de carbono par la esporulación glucosa y se ha descrito que la glucosa inhibe
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IQ-2002-2-06
la producción de algunos metabolitos generados en el ciclo del ácido tricarboxílico
(Sachidananham et al. 1997).
En la siguiente tabla se muestran los resultados de diferentes estrategias alternativas para
la producción de Bacillus thuringiensis realizados a nivel de planta piloto.
Subesp de Bacillus Biomasa Esporas

Estrategia Referencias
thuringiensis [g/L] [esp/mL]
Fed-Batch Continuo con

Kuppusamy y
el flujo dependiente de la Israelensis 80 ND
Balaraman (1991)
concentración de glucosa

kurstaki 36 4.8x109 Kang et al. (1992)
flujo constante de sustrato
Fed-Batch Discontinuo kurstaki 72.6 1.2x1010 Kang et al. (1992)
Fed-Batch Continuo con Avignone Rossa y

Israelensis 5.5 5.3x108
aumento lineal de flujo Mignone (1993)
Cultivo Continuo con

kurstaki 82.2 1.6x1010 Kang et al. (1993)
retención celular total
Cultivo continuo de dos

etapas con retención kurstaki ND 1.8x109 Kang et al. (1993)
celular parcial
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Continuación
Subesp de Bacillus Biomasa Esporas

Estrategia Referencias
thuringiensis [g/L] [esp/mL]

thuringiensis 5.0 8x109 Jong et al (1994)
flujo dependiente del pH
Fed-Batch Continuo en
el reactor air-lift darmstadiensis 6.5 1x1010 Jong et al (1995)
modificado
Cultivo Batch en reactor Tzeng y Yong

darmstadiensis 2.2 ND
airfit (1996)
Sachidanandham
Cultivo Continuo gallerie 8 ND
et al (1997)
Fed-Batch Discontinuo medellin 25 9x108 Vallejo et al (1999)
Tabla 1. Diferentes estudios para la producción a nivel planta piloto de B. thuringiensis
14
IQ-2002-2-06
2. Bacillus thuringiensis2
2.1 Morfología
Bacillus thuringiensis es una bacteria entre 1.0 y 1.2 µm de ancho por 3-5 µm de largo.
Pertenece a la familia Bacillaceae, situado taxonómicamente dentro del grupo de los
bacillos Gran positivos formadores de endoesporas. Durante el proceso de esporulación
hay la formación de uno o mas cuerpos cristalinos de naturaleza proteica adyacente a la
espora.
Estos cristales contienen proteínas (δ-endotoxinas) que son tóxicas para ciertas especies de
insectos, el cristal presenta una diversidad de formas dependiendo de las proteínas que lo
integran, con tamaños desde los 350 nm de diámetro en algunos cristales irregulares hasta
de 2 µm de longitud en muchos cristales bipiramidales.
La morfología de las colonias de Bacillus thuringiensis varían de forma diferente según el
medio en que sean cultivado, en agar nutritivo, forma colonias circulares con borde
irregular, perfil plano y color marfil claro, su textura es seca y cerosa. En medio LB, las
colonias son de borde circular y textura mucosa
2.2 Bioquímica de B. thuringiensis
Bacillus thuringiensis es un organismo anaerobio facultativo, quimioorganotrofo, con
actividad catalaza positiva, poseen una serie de características bioquímicas comunes, con
2
Iriarte, Pág. 16-24
15
IQ-2002-2-06
son capaces de hidrolizar almidón, gelatina, glucógeno, esculina y N-acetil-glucosamina, no
fermentan galactosa, lactosa ni manitol.
2.3 Ciclo Biológico
2.3.1 Germinación y fase vegetativa
El comienzo del ciclo de Bacillus thuringiensis se puede establecer en la germinación de la
espora de resistencia, proceso que en condiciones adecuadas durara unos minutos. El factor
fundamental que provoca la germinación de la espora dentro de los intestino es el pH
alcalino donde se lisa. Entonces aparece la fase vegetativa, que se multiplica activamente
en condiciones aeróbicas. Crece adecuadamente en la hemolinfa de los insectos y en gran
variedad de medios no selectivos.
La temperatura optima de crecimiento se sitúa entre 26 y 30ºC, con un pH optimo entre
valores de 6.5 y 7.5.
2.3.2 Fase estacionaria: Esporulación
La esporulación normalmente esta inducida por el empobrecimiento del cultivo y coincide
con el cambio de fase de crecimiento exponencial a fase estacionaria. En la fase
estacionaria tiene lugar simultáneamente la formación de la endoespora de resistencia y el
16
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cristal paraesporal. En condiciones de baja tensión de oxigeno o altos niveles de nitrógeno
orgánico en el medio de cultivo, la esporulación puede llegarse a inhibirse completamente.
El proceso de formación de la espora puede dividirse en siete etapas. Inicialmente, el ADN,
duplicado inmediatamente antes, se dispone formando un eje longitudinal de la bacteria . A
continuación se forma un septo transversal que divide a la célula en dos partes asimétricas,
encerrando una copia de ADN en cada una de ellas. La membrana de la célula mayor crece
rodeando a la mas pequeña. De manera que esta queda englobada finalmente por el
citoplasma de la anterior, lo que constituye la preespora, que se define como una porción
de citoplasma rodeada por dos membranas celulares. El cortex, espacio comprendido entre
estas dos membranas, se rellena de un único péptido glucano y es la primera estructura que
se forma. Después vendrá la acumulación de proteínas altamente resistentes a disolventes
alrededor de la membrana mas externa, lo que constituye la denomina cubierta de la espora.
La cubierta representa el 30 al 60% del peso seco total de la espora y contiene cerca del
80% de la proteína contenida en ella. La espora se rodea después de una capa mas fina y
laxa, el exosporio y, por ultimo, madura acumulando iones Ca2+ y ácido dipicolínico, que le
confiere resistencia al calor.
La espora de Bacillus thuringiensis es de contorno elipsoidal y ocupa una posición
subterminal dentro de la célula vegetativa, es resiste a temperatura extremas entre (70 y
80ºC), puede resistir a la desecación y a muchos desinfectantes (etanol 95%) por largos
periodos de tiempo. Son sensibles a la radiación ultravioleta.
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2.3.3 Cristal paraesporal
Simultáneamente a la formación de la espora, tiene lugar la síntesis de uno o varios
cristales paraesporales, que pueden presentar entre un 20 y un 30% del peso seco del
esporangio.
El cristal paraendosporal se ubica en el interior del esporangio y, generalmente fuera del
exosporio. Sin embargo, se han descrito cristales paraendosporarales dentro del exosporio
en algunos aislamientos, con lo que el cristal y la espora continúan juntos tras la lisis
celular. Al igual que la espora existen pruebas de que los cristales son inactivados por la
acción de la luz ultravioleta, siendo además fácilmente degradados por la acción de
microorganismos del suelo.
Cada cristal esta constituido por proteínas de una o varias clases, también denominadas δ-
endotoxinas, que se agrupan entre si mediante puentes de disulfuro. La estabilidad de estas
uniones condiciona el pH de solubilización del cristal, al estabilizarse los puentes de
disulfuro previene la disolución de la proteína, impidiendo su activación por parte de las
proteasas.
18
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Una ves completada la esporulación, se produce la lisis de la pared del esporangio,
liberándose el cristal y la espora en el medio, comenzándose el ciclo si las condiciones son
favorables.
2.4 Patogenicidad
El mecanismo de actuación de las proteínas Cry, las cuales producen el efecto toxico hacia
los insectos, se establece en los siguientes pasos: los cristales paraesporales de Bacillus
thuringiensis son ingeridos y a continuación se solubilizan en el intestino medio del insecto
liberando las proteínas cristalinas en su forma de protoxína. Una vez las protoxinas han
sido activadas en el intestino del insecto, las toxinas se unen específicamente a receptores
de membrana de naturaleza glicoproteica con pesos entre 120 y 180 kDa, situados en la
células columnares del intestino medio de los insectos, cuya permeabilidad al ión K+
aumenta inmediatamente. La teoría mas aceptada es que la inserción de las varias hélices α
de la toxina en torno a un punto concreto da lugar a la atrición de una estructura que actúa
como un poro de un radio de unos 0.6 nm en la membrana celular. La apertura del poro
hace que las células culumnares se hinchen rápidamente perdiendo funcionalidad con lo
que se inicia un cambio de fluidos entre la luz intestinal y la cavidad hemocelica, con el
consiguiente choque osmótico. Los receptores son claves en la acción toxica de las
proteínas Cry, cuya actividad esta en relación con la afinidad hacia los mismos y su
densidad en el epitelio. Después las células se lisan, desorganizándose el tejido epitelial del
mesenteron.
19
IQ-2002-2-06
Tras la lisis de las células epiteliales, cuyos efectos pueden bastar para matar al insecto, las
esporas contenidas en el intestino pueden acceder a la cavidad hemocélica del insecto
aprovechando las lesiones como puerta de entrada, provocando en ocasiones septicemia al
germinar y multiplicarse activamente en la hemolinfa, lo que supone un efecto sinérgico
con el de la toxina.
En larvas de lepidópteros, los síntomas iniciales del proceso toxico vienen marcados por la
parálisis muscular de todo el intestino, por lo que el insecto deja de alimentarse. El tiempo
entre la ingestión y el cese de la alimentación es de 80 minutos para B. mori. A
continuación el pH y el contenido de K+ de la hemolinfa aumentan rápidamente, y la larva
disminuye sus movimientos. Comienza entonces un proceso de vómitos, diarrea y,
seguidamente, la parálisis se vuelve general. Desaparecen los reflejos de los movimientos y
la larva muere tras cesar los latidos cardiacos, Si la cantidad de protoxina ingerida no es
letal, la larva supera el síndrome de parálisis intestinal inicial y se recupera, pero si la
exposición subletal es continua dará lugar a adultos con menor fertilidad y fecundidad.
20
IQ-2002-2-06
Las proteínas Cry se clasificaron según la homología de la secuencias de aminoácido.
PESO
CLASE PATOTIPO MOLECULAR TIPO DE CRISTAL
[kDa]
CryI Lepidoptera 130-140 Bipiramidal
CryII Lepidoptera/Diptera 65 Cúbico
CryIII Coleoptera 73 Plano
CryIV Diptera 135,128,65 Semiesférica / esférica
CryV Lepidoptera/Coleoptera 81 Críptico
Cyt Inespecífico 27 Redondo-Poliedrico
Tabla 2. Clasificación Proteínas Cry
3 Tipos de Fermentación
3.1 Fermentación tipo Batch3
La fermentación tipo batch o discontinua se puede considerar como un sistema cerrado,
donde se agrega una cantidad inicial de medio de cultivo y de microorganismos en
condiciones optimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no hay adición o
remoción de nutrientes, excepto oxigeno (aire), antiespumante y ácidos o bases para el
control de pH.
3
Shuler, Pág. 149
21
IQ-2002-2-06
Una típica curva de crecimiento para una fermentación posee cinco fases de crecimiento4:
(1) la fase lag o de latencia, (2) la fase de crecimiento logarítmica o exponencial, (3) la fase
de desaceleración, (4) la fase estacionaria, (5) la fase de muerte.
3.2 Fermentación Continua
En la fermentación continua se estable un sistema abierto. Existen dos formas básicas de
cultivo de flujo tapón y el quimiostato. En el Cultivo flujo tapón, el cultivo viaja sin
mezclarse a través de un reactor tubular. Un quimiostato consiste en un tanque agitado con
una suspensión de biomasa perfectamente mezclada y homogénea, a la que se alimenta con
medio fresco a una tasa constante, el caldo de fermentación es extraído a la misma
velocidad de alimentación de modo que el volumen permanece constante5. La composición
de nutrientes, la biomasa, la transferencia de masa y la productividad varían en distintas
posiciones dentro del sistema 6.
3.3 Fermentación tipo Fed-Batch7
La fermentación tipo Fed-Batch los nutrientes son alimentados continuamente o
discontinuamente, mientras que el efluente es removido discontinuamente. Un sistema Fed-
Batch es usualmente utilizado para superar la inhibición por sustrato o la represión
4
Shuler, Pág. 155
5
Quintero, Pág. 57
6
Crueger, Pág. 77
7
Shuler, Pág. 243
22
IQ-2002-2-06
catabólica en la alimentación intermitente de sustrato. Si el sustrato es inhibitorio, la
adición intermitente de este aumenta la productividad de la fermentación, manteniendo la
concentración baja de sustrato.
4. Modelo cinético para el crecimiento de microorganismos
4.1 Modelo no estructurado8
Donde la biomasa es descrita por una sola variable (concentración de biomasa total) y no
se considera segregación en la población celular (todas las células son iguales).
4.2 Curva de crecimiento9
1. Fase lag o de latencia
Ocurre inmediatamente después de la inoculación, es un periodo de adaptación para las
células debido a un nuevo ambiente. Los microorganismos reconocen sus constituyentes
moleculares cuando se transfieren a un nuevo medio. Fase de crecimiento logarítmica o
exponencial. Durante esta fase la masa celular puede aumentar un poco, sin aumentar la
densidad celular. Es conveniente reducir la fase de latencia como sea posible, no solo para
8
Brown, Pág. 131
9
Shuler, Pág. 154-159
23
IQ-2002-2-06
evitar la perdida de tiempo, sino también por que se consumen nutrientes para mantener el
cultivo viable en dicho periodo previo al crecimiento.
El tiempo de la fase de latencia puede reducirse usando un inoculo relativamente grande
(3-10%) de un cultivo en fase exponencial que haya sido preparado del mismo medio
utilizado para la fermentación10.
2. Fase de crecimiento exponencial
También conocida como fase logarítmica, en esta fase las células ya se han ajustado a su
nuevo ambiente. Después del periodo de adaptación , las células se pueden multiplicar
rápidamente. Este es un periodo de crecimiento balanceado en donde todos los
componentes de crecimiento de la célula están a la misma taza. La velocidad especifica de
crecimiento esta determinada por el numero de células o por la masa de células, ya que son
la misma. Debido a una concentración grande de nutrientes en el medio, la velocidad de
crecimiento es independiente de la concentración de nutrientes.
3. Fase de desaceleración
Continua después de la fase de crecimiento exponencial, en esta fase el crecimiento se
desacelera debido a la disminución de los nutrientes esenciales, o debido a la acumulación
10
Boffey, Pág. 77
24
IQ-2002-2-06
de subproductos tóxicos del crecimiento. En cultivo de bacterias este cambio ocurre en un
periodo de tiempo muy pequeño.
4. Fase estacionaria
Empieza al final de la fase de desaceleración, cuando la taza de crecimiento es igual a cero
o cuando la taza de crecimiento es igual a la taza de muerte. A pesar que la taza neta de
crecimiento es cero, las células siguen metabolicamente activas y hay producción de
metabolitos secundarios.
- Metabolitos primarios: Productos relacionadas al crecimiento.
- Metabolitos secundarios: Productos no relacionadas al crecimiento.
Durante la fase de desaceleración los siguientes fenómenos ocurren:
- La concentración de masa total se mantiene constante; pero el numero de células
viables puede disminuir.
- Puede ocurrir lisis celular y la masa de las células viables puede disminuir; puede
ocurrir una segunda fase de crecimiento.
- Al estar activo el metabolismo de las células, la regulación celular puede cambiar
cuando hay una concentración baja de ciertos metabolitos. Metabolitos secundarios
son producidos como resultado de la no regulación de metabolitos.
25
IQ-2002-2-06
5. Fase de muerte.
Debido al agotamiento total de nutrientes o acumulación de subproductos tóxicos comienza
la fase de muerte, durante esta fase la célula se puede o no lisar.
4.3 Ecuaciones de crecimiento celular
En una fermentación los microorganismos extraen nutrientes del medio para convertirlos en
componentes biológicos. Parte de esos nutrientes son usados para producción de energía y
otra parte son usados para biosíntesis y formación de productos. Como resultado de esa
utilización de nutrientes, la biomasa aumenta en el tiempo:
Substrato + Células Productos + Mas células

extracelulares
∑ S + X → ∑ P + nX
La taza de crecimiento de microorganismos se caracteriza por la taza de Crecimiento
Especifico:
1 dX
µ=
X dt
Donde: µ = Crecimiento especifico (h-1)
X = Es la concentración de biomasa (g/l)
t = Tiempo (h)
26
IQ-2002-2-06
El aumento de la biomasa o numero de células en el tiempo esta determinado por la taza de
crecimiento exponencial (reorganizando):
dX
= µ.X X = Xo a t = to
dt
Para el relacionar el número inicial de células con el número final de células tenemos de la
ecuación anterior:
Separando variables
X t
dX
∫Xo X = to∫ µdt
X t
1
∫Xo X dX = µ to∫ dt
Integrando:
ln X − ln Xo = µt
ln X (t ) = ln Xo + µt
Aplicando exp:
X (t ) = Xo * e µt
27
IQ-2002-2-06
Para poder calcular µ, se realiza una regresión lineal de logaritmo natural de la biomasa Vs
tiempo en la curva de crecimiento, donde µ es la pendiente de la recta, según las ecuaciones
tenemos:
ln X − ln Xo = µt
X
µt = ln
Xo
El tiempo de duplicación, es el tiempo donde la masa microbiana se duplica:
dX
= µ. X
dt
X
ln ln = µt
Xo
Si 2 X = Xo :
2 Xo
ln = µt
Xo
ln 2
τd =
µ
28
IQ-2002-2-06
Cuando el crecimiento celular esta limitado por un solo un nutriente del medio (sustrato
limitante). La ecuación de Monod describe la relación entre la velocidad especifica de
crecimiento, µ, y la concentración del sustrato limitante, S, en un cultivo microbiano 11:
De la fase exponencial tenemos: µ = µ max
µ max S
µ=
Ks + S
Donde: µmax= Velocidad de Crecimiento especifico maxima(h-1)
Ks= Constante de saturación.
4.4 Estequiometría
La estequiometría para el crecimiento celular varia con el microorganismo, con el sustrato y
con las condiciones ambientales como el pH, temperatura, y potencial de reducción.
Coeficiente de Rendimiento
Biomasa _ Formada
YX =
S Sustrato _ Consumido
11
Quintero, Pág. 31
29
IQ-2002-2-06
X − Xo
YX =
S So − S
1
YX =
S YS
X
Coeficiente de Rendimiento relacionado al producto
Pr oducto _ Formado
YP =
S Sustrato _ Consumido
P − Po
YP =
S So − S
El coeficiente de mantenimiento, se describe como la taza de consumo para el
mantenimiento celular:
Sustrato _ Consumido _ para _ mantenimiento

m=
Biomasa * tiempo`´
m=
[dS dt ]. m
30
IQ-2002-2-06
5. Filtración12
La filtración es muy utilizada en los procesos de separación sólidos-liquido, por lo general
la diferencia de presión se mantiene del impulsor constante, la velocidad de filtración
disminuye con el tiempo. Esta reducción de velocidad se puede atribuir directamente al
incremento de la resistencia al flujo a través de la creciente torta del filtro (acumulación).
5.1 Filtración con flujo tangencial (CFF)
La limitación del crecimiento de la torta en el filtro puede reducir la disminución de la
velocidad de filtración, para evitar lo anterior se diseño una modalidad de operación
llamada Filtración con flujo tangencial (CFF). En este tipo de filtración se utiliza una alta
velocidad de circulación del fluido, tangencial con el medio filtrante, con el objeto de
minimizar la acumulación de partículas sobre la superficie del filtro.
Pi Po
Entrada del Salida del

Fluido Fluido
Concentrado
Pf
Filtrado
31
IQ-2002-2-06
Figura 1. Esquema General de filtración Tangencial13
Según el anterior esquema, la caída de presión dada por el flujo del fluido es:
∆P = Pi − Po
Donde la caída de la presión transmembranal es:
Pi + Po
∆PM = − Pf
2
Pf es la presión del filtrado, usualmente la presión atmosférica. Si se asume que Pf es igual
a la presión atmosférica o que Pf es igual a cero, si es presión manométrica, se puede
relacionar ∆P con ∆PM de la siguiente manera:
∆PM = Pi − 1 2 ∆P
por lo tanto para obtener alto ∆PM es necesario tener una alta presión de entrada con una
velocidad de fluido pequeña. El flux de filtración. Como una función de la caída de presión
transmembranal esta dada por la siguiente ecuación:
∆PM
J=
RG + R M
Donde RG y RM son las resistencias de la torta y de la membrana respectivamente, RM es
constante y RG varia según la concentración del soluto y la velocidad tangencial a través de
la membrana, la cual se puede eliminar la formación de la torta.
12
Perry, sec. 17, Pág. 56
13
Shuler, Pág. 343
32
IQ-2002-2-06
5.1.1 Ventajas de filtración con flujo transversal
- la velocidad de filtración no se ve afectada en forma significativa por la diferencia de
densidad en el medio de suspensión de las partículas.
- La acumulación de las partículas en la superficie del filtro se minimizan; debido a las
altas velocidades de filtración que evitan la acumulación.
- No se requiere la alimentación de aditivos, como agentes floculantes.
- No se requiere adición de ayuda de filtro. Esto es especialmente importante cuando se
desea minimizar la contaminación del producto sólido.
5.2 Ultrafiltración14
La ultrafiltración es un proceso de membrana, impulsado por la presión, para la separación
de dos componentes de una solución, con base en el tamaño y forma de la molécula.
Bajo una diferencia de presiones aplicadas a una membrana de ultrafiltración, el disolvente
y las especies pequeñas de soluto pasan a través de una membrana y se recogen en el
filtrado, en tanto que las especies mas grandes de soluto se recirculan por la membrana y se
recuperan como un concentrado ó retenido.
14
Perry, Cáp. 17 Pág. 57
33
IQ-2002-2-06
La acumulación de las partículas sobre la superficie del medio filtrante produce una
resistencia importante a la filtración. El desplazamiento tangencial del fluido minimiza la
acumulación de partículas, pero no la elimina completamente.
La polarización del filtro ocurre por que las partículas son transportadas a la superficie por
el liquido y se retiene ahí, mientras que el liquido pasa a través del medio. En dirección
perpendicular al medio filtrante se establece un gradiente de concentración de sólidos
retenidos, que regresan a la corriente masiva por un mecanismo de difusión (movimiento
browniano). Esta polarización de las partículas se puede controlar al variar la velocidad de
flujo tangencial en el medio filtrante, por que este flujo promueve la difusión de regreso a
la corriente masiva.
Por lo tanto, en estado estacionario la taza convectiva de transferencia del soluto a través de
la membrana es igual a la taza de difusión del soluto en dirección opuesta debido a la
concentración de la polarización:
dC
JC = DC
dX
Donde DC es la difusividad del soluto en el liquido [cm2/s], J es el Flux volumétrico de
filtración del liquido [cm3/cm2s] y C es la concentración del soluto [mol/cm3liquido].
Integrando la ecuación en las siguientes condiciones limite:
C = CB a X =0 y CW = C a X = δ
34
IQ-2002-2-06
Tenemos:
D e CW CW
J= ln ó J = k ln
δ CB CB
DC
Donde k = , el cual es el coeficiente de transferencia de película y δ es el ancho de la
δ
capa de la torta.
El coeficiente de transferencia de masa es función del fluido, de las propiedades del soluto,
de las condiciones de flujo y se puede correlacionar con el número de Reynolds (Re) y el
número de Schmidt (Sc):
dk
Sh = = a Re b Sc b
Ce
Donde Re = dυρ / µ , Sc = µ / ρDe , siendo Sh, el numero de Sherwood, el valor de a es
1/3, b es aproximadamente 0.5 para flujo laminar y 1.0 para flujo turbulento.
6.
7. Productos bioinsecticidas a base de Bacillus thuringiensis15
El primer producto comercial de Bt usado como insecticida microbiano, llamado
Sporeine® estuvo disponible en Francia en 1938 para el control del gusano barrenador de la
15
Cerón, Pág. 154-155
35
IQ-2002-2-06
harina. A partir de este momento se produjo un desarrollo de productos comerciales mas
extenso durante la década de los años 50s en varios países como URSS, Checoslovaquia,
Francia y Alemania. En Estados Unidos también se inicio el interés del uso de Bt, lo cual
llevo al desarrollo y comercialización de Thuricide® por parte de Bioferm Co.
Entre los años 1960 y 1970 se determino el alto grado de especificidad entre las cepas;
cepas diferentes exhibían diferentes espectros de actividad insecticidas. Las cepas Bt
difieren en su patogenecidad contra especies de insectos particulares. En los últimos 20
años el mercado de lo los bioinsecticidas ha sido dominado por productos que contienen
como ingrediente activo una mezcla de cristal y esporas de la cepa HD1 subesp kurstaki
para el control de plagas agrícolas y forestales, dando lugar a la sustitución de algunos
insecticidas convencionales.
La mayoría de los bioinsecticidas a base de Bt son producidos por cepas de Bt nativas y
utilizan una pequeña fracción de las proteínas Cry conocidas. En los Estados Unidos y
Canadá se han utilizados productos con la cepa Bt HD1 subesp kurstaki para el control de
lepidópteros de interés agrícola y forestal.
6.1 Productos de primera generación
Son aquellos cuya formulación incluyen como ingrediente activo una mezcla de cristales
(δ-endotoxinas) y esporas de una cepa nativa de Bt. Constituyen la mayor proporción de los
36
IQ-2002-2-06
productos comerciales y corresponden al 84% de un total de 75 productos registrados. Estos
productos están disponibles en diferentes formulaciones tanto sólidas como liquidas y son
empleadas en una amplia gama de sectores que van desde la agricultura hasta la salud
publica y las zonas urbanas.
En el sector agrícola han sido utilizados productos a basa de Bt en cultivos de trigos, maíz,
algodón, frutales, sorgo y soja, entre otros, casi exclusivamente para el control de plagas de
lepidópteros filófago.
En la siguiente tabla se enumeran algunos productos comerciales de cepas nativas de Bt.
Compañía Nombre Comercial Variedad Blanco
Dipel, Biobit XL,

kurstaki Lepidópteros
Foray
Gnatrol, Bactimos,
israelensis Dípteros
VectoBac
Abotts Labs
Florbac aizawi Lepidópteros
Xentari aizawi Lepidópteros
Futura kurstaki Lepidópteros
Bactec Bernan Bt kurstaki Lepidópteros
Biochem Bactmos israelensis Dípteros
37
IQ-2002-2-06
Products
Farbwerbe-
Biospor kurstaki Lepidópteros
Hoechst
Fermenta
Cutlass kurstaki Lepidópteros
ASC Co.
Chamapol-
Bathurin thuringiensis Lepidópteros
Bioka
Compagnia di Bactis kurstaki Lepidópteros

Recerca chim.
CRC Bactucide israelensis Dípteros
Farmos Muscabac thuringiensis Lepidópteros
Glavmikro- Dendrobacilin dendrolimus Lepidópteros
bioprom Endobacterin Galleriae Lepidópteros
Huazhong Lepidópteros
Aggricultural Shuangdu preparat Chinesensis Ct-43 Dípteros
University Coleópteros
Libec Sporine kurstaki Lepidópteros
38
IQ-2002-2-06
Continuación
Knol Bioproducts Larvo-Bt kurstaki Lepidópteros
M-One tenebrrionis Coleópteros

Mycogen
M-Peril kurstaki Lepidópteros
Biobit kurstaki Lepidópteros
Novo Nordisk Foray kurstaki Lepidópteros
Skeetal israelensis Dípteros
Suturad kurstaki Lepidópteros

Randoja
Nubilacid kurstaki Lepidópteros
Steward kurstaki Lepidópteros

Termo Triogy
Trident tenebrrionis Coleópteros
Corporation
Vault kurstaki Lepidópteros
Shionogi Bacillex thuringiensis Lepidópteros
Thomson
Bactur kurstaki Lepidópteros
Hayward Co.
Towagosei Chem Toaro, Toaro-Ct kurstaki Lepidópteros
Tuticorin Alcali
Chemicals and Spicturin gallerie Lepidópteros
Fertilisers Limited
Tabla 3. Productos comerciales de cepas nativas
39
IQ-2002-2-06
6.2 Productos de segunda generación
Son aquellos constituidos por una mezcla de esporas y cristales (δ-endotoxinas)
provenientes de una cepa de Bt a la cual se le introdujo, por conjugación o transformación,
los genes que codifican para las δ-endotoxinas de genes presentes en varias cepas nativas,
ampliando su espectro de actividad hacia otro s insectos plagas.
La manipulación de genes Cry en Bt ofrece un gran potencial en la mejora de la efectividad
y la relación costo-beneficio de los productos a base de Bt,. Se ha descrito que ciertas
combinaciones de proteínas exhiben una actividad sinérgica hacia plagas de insectos
lepidópteros y dípteros.
El desarrollo de vectores de clonación para Bt ha hecho posible la construcción de cepas
mejoradas de Bt. El uso de cepas de Bt como huésped ofrece varias ventajas. Las cepas
nativas pueden mantener, de forma estable y expresar eficientemente, varios genes
homólogos de toxinas de Bt.
40
IQ-2002-2-06
En la siguiente tabla se enumeran algunos productos comerciales recombinantes de Bt
Tenebrrionis
Abbott Labs Novodor Coleópteros
NB176
Ecogen Lepinox ® Kurstaki ED7826 Lepidópteros
Crymax Kurstaki ED7841 Lepidópteros
Raven Kurstaki EG7673 Coleópteros
Condor kurstaki Lepidópteros

Ecogen
Cultas (T) Kurstaki Lepidópteros
Foil OF Lepidópteros
kurstaki EG2424
Foil BFC Coleópteros
Termo Trilogy Agree aizawi-CG91 Lepidópteros
Corporation Desing aizawi Lepidópteros
Tabla 4. Productos recombinantes comerciales
7.3 Productos de tercera generación
Han sido desarrolladas con el objeto de resolver las limitaciones de una inadecuada
aplicación y de su corta toxicidad residual.
Son aquellos cuya formulación bacterias recombinantes muertas, consistentes en
Pseudomonas flourescens que han sido transformadas con genes que codifican δ-
41
IQ-2002-2-06
endotoxinas de Bt. Este tipo de producto se conocen con el nombre de CellCap (tabla 5).
Solamente se conocen 3 productos de este tipo, los cuales representan el 4% del total de
productos de Bt y son elaborados por a empresa Mycogen.
Estos productos se obtienen insertando los genes que codifican para las toxinas de Bt en
otros microorganismos, los cuales son capaces de colonizar el habitad del insecto objeto en
tratamiento, con la idea de que los organismos transformados puedan sintetizar en forma
continua cantidades suficiente de toxinas para prevenir el daño causado por el insecto.
El inconveniente de esta técnica se encuentra en que involucra la liberación de
microorganismos recombinantes, lo cual representa numerosas restricciones de regulación
en su empleo.
En la siguiente tabla se enumeran los productos comerciales recombinantes en
Pseudomonas
Match (R) Pseudomonas(EC) Lepidópteros
Mycogen MTrak (R) Pseudomonas(EC) Coleópteros
MVP (R) Pseudomonas(EC) Lepidópteros
Tabla 5.Productos recombinantes en Pseudomonas
42
IQ-2002-2-06
7. Materiales y Métodos
7.1 Primera parte
7.1.1 Activación
Para la realización de este estudio se utilizó la cepa Bacillus thuringiensis subesp kurstaki
proporcionada por la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB), Medellín,
Colombia.
Para desarrollar las diferentes fermentaciones, fue necesario activar esta cepa, la cual se
encontraba liofilizada. Este procedimiento se utiliza para el mantenimiento de células,
donde el agua es removida por sublimación16 (secado al vació partiendo del estado de
congelación).
Se realizó el siguiente procedimiento para activación de la bacteria: primero se preparó
medio de cultivo líquido estéril con un volumen total de 50 ml, en un erlenmeyer de 500 ml
(Anexo A), se tomó una pequeña muestra de las esporas liofilizadas con una asa redonda, y
se realizó la siembra directamente en el medio, colocándose el erlenmeyer en el shaker por
un período de 36 horas a una temperatura de 30ºC; después fue necesario tomar una
muestra para observar el crecimiento del microorganismo en el microscopio, realizándose
proceso de coloración.
43
IQ-2002-2-06
7.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre
Para evitar tener diferentes características genéticas entre la cepa a utilizar, se decidió aislar
y cultivar una sola colonia para partir del principio de igualdad con el siguiente
procedimiento: se preparó 10 cajas de petri con medio sólido de LB estéril (Anexo A).
Partiendo del cultivo anterior, se realizó siembras por asilamiento en cada caja de petri.
Colocándose luego en la incubadora por un período de 24 horas a una temperatura de 30ºC.
Después de haberse observado crecimiento se escogió la caja de petri en la cual se pudiera
visualizar colonias individuales separadas de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.
Para el cultivo de la colonia madre se preparó medio de cultivo líquido estéril con un
volumen total de 100 ml, en un erlenmeyer de 1000 ml (Anexo A). Posteriormente de la
caja de petri escogida se seleccionó una sola colonia, la cual se sembró en este medio
líquido; se colocó el erlenmeyer en el shaker por un período de 72 horas, a una temperatura
de 30ºC. Luego de transcurrido el tiempo, se tomó una muestra para observar el
crecimiento y esporulación del microorganismo en el microscopio, realizándose el proceso
de coloración correspondiente.
7.1.3 Conservación de Microorganismos
16
Shuler, Pág. 356
44
IQ-2002-2-06
Para poder mantener varias réplicas de la colonia viables para utilizarlas en los procesos de
fermentación, fué necesario realizar el siguiente procedimiento para la conservación de la
solución de esporas de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki: se llevó a centrifugación el
cultivo anterior durante 10 minutos a 4000 rpm. Se obtuvo el botton (biomasa),
descartándose el sobrenadante. Después, se preparó un solución estéril glicerol-agua 20/100
v/v, resuspendiéndose el botton con esta solución. Posteriormente se prepararon 30
eppendors estériles con 1 ml de la solución anterior y se llevaron al congelador a una
temperatura de –20ºC
7.2 Segunda parte: Fermentación Batch
Para poder conocer el comportamiento y la cinética de crecimiento de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki, se realizaron 3 fermentaciones Batch. Utilizando el
fermentador Bioflo 3000 (New Brunswick), el cual tiene una capacidad total de 5 L, y
utilizando un volumen de control de 3.3 L.
45
IQ-2002-2-06
7.2.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación Batch
Para poder realizar el procedimiento de inoculación al fermentador, se preparó medio de
cultivo con un volumen total de 300 ml y con 1 mL de la solución de esporas; este ultimo
equivale al 9% del volumen de control, en un erlenmeyer de 500 ml, a una temperatura de
30ºC por un período de 14 horas en el shaker (figura2), esto con el fin de disminuir la fase
estacionaria de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.
Figura 2. Inoculo
Pasadas las 14 horas del cultivo del inóculo, se pasó el inóculo al fermentador de manera
aséptica con un volumen de medio de cultivo de 3L, en las siguientes condiciones de
fermentación: una temperatura de 30ºC, la cual se controló automáticamente mediante un
controlador PID, el pH se mantuvo entre 6.5 y 8, monitoreado por un electrodo pH (Mettler
Toledo). La velocidad de agitación fué de 300 rpm mediante un controlador PID,
modificándose el flujo de aire según la demanda de oxígeno disuelto en el fermentador no
46
IQ-2002-2-06
menor a un valor del 20% de DO y monitoreado por un electrodo polarográfico de oxígeno
(Mettler Toledo).
7.3 Tercera parte: Fermentación Fed-Batch Discontinuo
Para realizar el proceso de fermentación Fed-Batch discontínuo, se tuvo en cuenta los
estudios realizados anteriormente en este campo y se determinaron los momentos
estratégicos para adicionar los pulsos tanto de glucosa como de extracto de levadura al
medio de cultivo según el análisis de la cinética de crecimiento desarrollada en el
laboratorio por Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.
Al realizar los diferentes pulsos de sustrato, se tuvo en cuenta la taza de consumo de
glucosa, desarrollándose estos en un aumento lineal y por repetición de la siguiente manera:
Glucosa Extr. Levadura

Fermentaciones
[gr/L] [gr/L]
Batch 8 8
Fed-Batch Pulso 1 16 16
Tabla 6. Pulsos de sustrato para las fermentaciones Fed-Batch Discontinuo
47
IQ-2002-2-06
Se implemento un sistema de filtración mediante una membrana de filtración tangencial
con el fin de realizar una recirculación de células al fermentador mientras se llevaba a cabo
una remoción por filtración de metabolitos secundarios generados en la fase de crecimiento
del microorganismo, evitando la inhibición del crecimiento celular y así poder realizar los
pulsos de sustrato en iguales proporciones al volumen retirado en la filtración (figura 3).
Glucosa
Ext. de Levadura
Membrana FT Medio
Agotado
Figura 3. Esquema del sistema de filtración
Se utilizo como membrana de filtración tangencial el Filtro Ultraflux AV400 (Fresenius,
Hamburgo, Alemania). La membrana esta hecha de polisolfona, la longitud de los capilares
es de 27 cm con un área efectiva de filtración de 0.75 m2, La carcaza esta hecha de
policarbonato y el material de relleno es de poliuretano. Esta membrana deja pasar
sustancias con un peso molecular de 30.000 Daltons. La adaptación de la membrana al
fermentador se hizo mediante conexiones hechas con manguera siliconada de diámetros de
1/8 in y 1/2 in. El volumen de remoción del fermentador de 3.3 L fue de 1 L con excepción
48
IQ-2002-2-06
del primer pulso donde el volumen retirado fue de 0.5L, para la succión del medio agotado
se utilizo una bomba peristáltica (Manostat, IL USA) y para llevar a cabo el filtrado se
utilizo una bomba de vació con una presión manométrica de 9 in de Hg.
La descripción del montaje completo para el sistema Fed-Batch discontinuo se puede ver en
la figura 4. Desarrollado en el laboratorio de Ing. Química de la universidad de los Andes
(CITEC).
Figura 4. Montaje para el sistema Fed-Batch
49
IQ-2002-2-06
7.3.1 Procedimiento de inoculación y condiciones de la fermentación Fed-Batch
discontinuo para los pulsos 1, 2 y 3
Para el procedimiento de inoculación y las condiciones para el proceso de fermentación
Fed-Batch discontínuo para los pulsos 1, 2 y 3, fueron las mismas que para el proceso
Batch explicadas anteriormente.
50
IQ-2002-2-06
8 Métodos de análisis
Los parámetros a analizar tanto en el proceso Batch como en el proceso Fed-Batch fueron
los siguientes:
PARÁMETROS METODOLOGÍAS
Determinación de Biomasa Peso Seco
Concentración de Esporas Unidades Formadoras de Colonia
Concentración de Glucosa DNS
Cantidad de d-endotoxína SDS PAGE
Tabla 7. Parámetros y metodologías de Evaluación.
Para conocer la confiabilidad de los datos, la determinación de biomasa se realizó por
duplicado, mientras que la concentración de esporas se realizó por triplicado. Para
procedimientos ver anexo B
51
IQ-2002-2-06
9. Resultados
9.1 Primera parte
9.1.1 Activación
La activación de la cepa de a Bacillus thuringiensis subesp kurstaki se dio de manera
positiva con el cambio de color del medio, signo de crecimiento de la bacteria. Para poder
corroborar esto se realizó el procedimiento de coloración y llevándose la muestra al
microscopio, pidiéndose apreciar el color rozado característico de Bacillus thuringiensis.
9.1.2 Aislamiento y Cultivo de la Colonia Madre
Al finalizar el período de tiempo del procedimiento de aislamiento se observó el
crecimiento de colonias separadas en las diferentes cajas de petri. Con las siguientes
características:
- Morfología Macroscópica bacteriana:
• Forma de crecimiento: Circular
• Elevación de colonia: Plana
• Característica de los bordes: Ondulado.
• Consistencia de la colonia: Cremosa
52
IQ-2002-2-06
- Pigmentación: Color abano claro.
Para corroborar la esporulación de la colonia madre se realizó la coloración habitual y se
llevó la muestra al microscopio, donde se podía apreciar Bacillus thuringiensis de color
rozado, y esporas de color verde lo cual indicaba la esporulación positiva del cultivo.
9.1.3 Conservación de Microorganismos
Para mantener viable la solución de esporas, se la colocó en glicerol-agua al 20% y se
llevaron a congelación los 30 eppendors a -20°C.
9.2 Segunda parte: Fermentación Batch
Las 3 fermentaciones Batch, se llevaron a cabo sin contaminación y en iguales condiciones
de operación.
Tiempo total Fermentación = 33 h
53
IQ-2002-2-06
CONDICIONES
OPERACIÓN Tiempo O2 Vol de Aire Temperatura Agitación
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] rpm
Inoculación Batch 1 0 6,38 84 0 30 300
Inoculación Batch 2 0 6,33 83,5 0 30 300
Inoculación Batch 3 0 6,21 78,3 1,1 30 300
Tabla 8. Condiciones proceso Batch
9.2.1 Parámetros de Evaluación
120
100
80 Batch 1
OD [%]
60 Batch 2
Batch 3
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo [h]
Figura 5. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Batch
54
IQ-2002-2-06
Glucosa [gr/L]
6
4 Batch 1
Batch 2
Batch 3
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo [h]
Figura 6. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Batch
1,8
1,5
Biomasa [gr/L]
1,2 B atch 1
0,9 B atch 2
0,6 Batch 3
0,3
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo [h]
Figura 7. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Batch
Esporas
Fermentaciones
[UCF/mL]
Batch 1 6x107
Batch 2 8,2x108
Batch 3 7x107
Tabla 9. Resultados esporulación proceso Batch
55
IQ-2002-2-06
9.2.2 Variables de crecimiento Celular:
Según los datos analizados en la fase de crecimiento exponencial de Bacillus thuringiensis
subesp kurstaki se obtuvieron los siguientes resultados:
Biomasa final µ Y X/S τd

Fermentaciones -1
[gr/L] [h ] [%] [h]
Batch 1 4,15 0,20 51,87 3,47
Batch 2 3,45 0,12 43,12 5,78
Batch 3 3 0,20 37,50 3,47
Tabla 10. Variables de crecimiento celular fermentaciones Batch
µ: Velocidad especifica de Crecimiento
Y X/S: Rendimiento Global del proceso
τd: Tiempo de duplicación.
9.3 Tercera parte: Fermentaciones Fed-Batch Discontinuo
Se realizaron 5 fermentaciones Fed-Batch, con suministro de sustrato tanto de glucosa
como de extracto de levadura en iguales cantidades, realizando 1, 2 y 3 pulsos.
56
IQ-2002-2-06
9.3.1 Fermentación Fed-Batch: Con 1 Pulso de sustrato
Fermentación Fed-Batch pulso 1
Tiempo Inóculo = 13 h
Volumen Total removido Filtración 1 = 500 mL
Condiciones
Operación Tiempo O2 Vol de Aire Temperatura Agitación
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] [rpm]
Inoculación Batch 0 6,5 30 6,7-7,2 30 300
Filtración 1 12 6,5 45,2 6,9-6,5 30 300
Inoculación Pulso 1 13,2 6,5 43 6,8-7,5 29,7 300
Tabla 11. Condiciones de proceso Fed-Batch pulso 1
Fermentación Fed-Batch pulso 1 Repetición
Condiciones
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] [rpm]
Inoculación Batch 0 6,32 85 8,2-7,5 30 300
Filtración 1 R 12 6,5 29,9 7,2-7,6 30 300
Inoculación Pulso 1R 14 6,5 26,2 7,7-8,3 30 300
Tabla 12. Condiciones de proceso Fed-Batch pulso 1 R
57
IQ-2002-2-06
9.3.1.1 Parámetros de Evaluación
120
100
80
OD [%]
1 Pulso
60
1Pulso R
40
20
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Tiempo [h]
Figura 8. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Fed-Batch Pulso 1
14
12
10
Glucosa g/L
6
Pulso 1
Pulso 1 R
4
0
0 2 4 6 8 10
Tiempo [h]
Figura 9. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Fed-Batch Pulso1
58
IQ-2002-2-06
Biomasa [gr/L]
4
Pulso 1
Pulso 1 R
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo [h]
Figura 10. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso1
Esporas
Fermentaciones
[UCF/mL]
Pulso 1 3x108
Pulso 1 R 1x109
Tabla 13 . Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch Pulso 1
9.3.1.2 Variables de crecimiento Celular:
Biomasa final µ Y X/S Pulso Y X/S Global τd

Fermentaciones -1
[gr/L] [h ] [%] [%] [h]
Pulso 1 6.2 0.37 38.75 25.83 1.83
Pulso 1 R 8.35 0.15 52.18 34.79 4.44
Tabla 14. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1
59
IQ-2002-2-06
Y X/S Pulso: Rendimiento por pulso del proceso
Y X/S Gobal: Rendimiento Global del proceso
9.3.2 Fermentación Fed-Batch: con 2 Pulsos de Sustrato
Tiempo Inóculo = 13 h (congelación)
Condiciones
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] [rpm]
Inoculación Batch 0 6,79 100 5,6-5,9 30,2 300
Filtración 1 10 6,5 15 7,3-7,5 30 300
Inoculación Pulso 1 10.5 6,2 19 7,9-6,5 30 300
Filtración 2 24 4,93 0,1 5,1-5,6 30,2 300
Inoculación Pulso 2 24.5 6,5 14,5 5,6-5,4 30 300
Tabla 15. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2
60
IQ-2002-2-06
Fermentación Fed-Batch pulso 2 Repetición
Entrada de oxígeno al fermentador para mantener 1% de OD = 30 h
Condiciones
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] [rpm]
Inoculación Batch 0 7,23 90,1 7,6-8,4 29,7 300
Filtración 1 11,5 6,9 69 6,4-6,2 30 300
Inoculación Pulso 1 12 7,33 53,7 6,1-6,0 29,7 300
Filtración 2 26 6,76 9,4 6,1 30 300
Inoculación Pulso 2 R 26,5 6,83 55,4 5,5 30 300
Tabla 16. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 2 R
61
IQ-2002-2-06
9.3.2.1 Parámetros de Evaluación
60
50
40
OD [%]
30 Pulso 2
20
Pulso 2 R
10
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo [h]
Figura 11. Grafica oxigeno disuelto fermentaciones Fed-Batch Pulso 2
30,00
25,00
Glucosa [gr/L]
20,00
Pulso 2
15,00
Pulso 2 R
10,00
5,00
0,00
0 2 4 6 8 10
Tiempo [h]
Figura 12. Grafica consumo de glucosa fermentaciones Fed-Batch Pulso 2
62
IQ-2002-2-06
8,00
7,00
6,00
Biomasa [gr/L]
5,00
4,00 Pulso 2
Pulso 2 R
3,00
2,00
1,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo [h]
Figura 13. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso 2
Esporas
Fermentaciones
[UCF/mL]
Pulso 2 No Esporulo
Pulso 2 R 2.5x109
Tabla 17 . Resultados esporulación proceso Fed-Batch Pulso 2
9.3.1.2 Variables de crecimiento Celular:

Fermentaciones -1
[gr/L] [h ] [%] [%] [h]
Pulso 2 4.76 0.13 19.83 9.91 5.23
Pulso 2 R 15.71 0.14 65.45 32.72 4.80
Tabla 18. Variables de crecimiento celular Fermentaciones Fed-Batch Pulso 2
63
IQ-2002-2-06
9.3.3 Fermentación Fed-Batch: con 3 Pulsos de Sustrato
Entrada de oxígeno al fermentador para mantener 1% de OD = 43 h
Pequeña contaminación.
Condiciones
pH
[h] [%] [L/min] [ºC] [rpm]
Inoculación Batch 0 7,8 67-7 8,9-8,2 30 300
Filtración 1 13,5 6,5 40 7,8-8,3 30 300
Inoculación Pulso 1 14 5,61 22,6 7,9-7,4 30,4 300
Filtración 2 23 6,59 75,5 6,9-6,6 30,1 300
Inoculación Pulso 2 23,5 7,05 32,5 7,5-7,1 31,7 300
Filtración 3 37,5 6,5 21,3 6,6-6,7 30 300
Inoculación Pulso 3 39 5,62 19 6,4-6,7 29,2 300
Tabla 19. Condiciones de Proceso Fed-Batch pulso 3
64
IQ-2002-2-06
9.3.1 Parámetros de Evaluación
80
70
60
OD [%]
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50
Timepo [h]
Figura 14. Grafica oxigeno disuelto fermentación Fed-Batch Pulso 3
30,00
25,00
Glucosa [gr/L]
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 2 4 6 8
Tiempo [h]
Figura 15. Grafica consumo de glucosa fermentación Fed-Batch Pulso 3
65
IQ-2002-2-06
16,00
14,00
Biomasa [gr/L]
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo [h]
Figura 16. Grafica cuantificación de biomasa fermentaciones Fed-Batch Pulso 3
Esporas
Fermentaciones
[UCF/mL]
Pulso 3 1x108
Tabla 20 . Resultados Esporulación Proceso Fed-Batch Pulso 3
9.3.2 Variables de crecimiento Celular:

Fermentaciones -1
[gr/L] [h ] [%] [%] [h]
Pulso 3 17.23 1.04 54.06 21.62 0.66
Tabla 21. Variables de crecimiento celular fermentación Fed-Batch Pulso 3
66
IQ-2002-2-06
9.4 Análisis cualitativo y cuantitativo de Proteína Tóxica
Para el análisis cualitativo de la toxina se llevo a cabo dos electroforesis en gel de
poliacrilamida con las muestras obtenidas tanto el proceso Batch como en el proceso Fed-
Batch para la producción de Bacillus thuringiensis y se obtuvieron los siguientes
resultados:
Primer Gel
P B2 B1 B2 B3 FB1 FB1R FB1 FB1R P

kDa
207
121
81
51
33.6
28.6
21.1
Figura 17. Resultados Electroforesis 1
67
IQ-2002-2-06
Segundo Gel
kDa P FB1 FB1R FB2R FB2R FB3 FB3 FB1 P FB2R

207
121
81
51
33.6
28.6
21.1
Figura 18. Resultados Electroforesis 2
Para la cuantificación de proteína se realizaron dos métodos: Proteína total (Bradford) y
concentración de proteína de 60 y 130 kDa según las bandas obtenidas en el proceso de
electroforesis (desitometro).
68
IQ-2002-2-06
Bradford
Fermentaciones
[µg/mL]
Batch 1 110
Batch 2 65
Batch 3 60
Fed-Batch Pulso 1 1912
Fed-Batch Pulso 1 R 2001
Fed-Batch Pulso 2 R 2231
Tabla 22. Resultados análisis de proteína total
Electroforesis
Fermentaciones [µg/mL]
60 kDa 130 kDa
Batch 1 37 0
Batch 2 140 648
Batch 3* - -
Fed-Batch Pulso 1 R 236 703
Fed-Batch Pulso 2 R 930 178
Tabla 20. Resultados análisis de Electroforesis
*A la fermentación Batch 3 no se realizo análisis de electroforesis.
69
IQ-2002-2-06
10. Análisis de Resultados
10.1 Fermentación Batch
Se llevaron a cabo 3 fermentaciones de tipo Batch, para conocer la cinética de crecimiento
y el comportamiento del microorganismo durante todo el proceso de fermentación. Se
demostró una buena reproducibilidad en los datos obtenidos en oxigeno disuelto, biomasa,
consumo de glucosa, velocidad de crecimiento y cantidad de esporas. En la variación de la
biomasa en el tiempo se puede apreciar que la fase de latencia es de 2 horas, seguido por
una fase de crecimiento lineal, característico de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki
según las publicaciones (Liu and Bajpai., 1995), (Kang et al., 1993), (Vallejo et al., 1999)
desarrollándose una cinética de crecimiento de orden cero y una velocidad específica de
crecimiento promedio de 0.17 h-1 (δ=4.61x10-2) (Ver figura 7).
Según la curva de oxígeno disuelto (figura 5) en el fermentador se pudo apreciar que este
empezó a disminuir desde la primera hora de inicio de la fermentación, signo de que se
están llevando a cabo las reacciones metabólicas típicas de microorganismo. En
consecuencia se puede ver igualmente una disminución considerable en el pH. Cuando el
valor de oxígeno disuelto aumentó, simultáneamente aumentó el valor del pH,
70
IQ-2002-2-06
demostrándose que el microorganismo entró en fase de desaceleración y posteriormente a
fase estacionaria, que es donde se lleva a cabo la formación el complejo espora-cristal.
El parámetro de diseño para los pulsos de sustrato en las fermentaciones Fed-Batch, se baso
en el análisis de la curva de glucosa. La taza promedio de consumo de glucosa según el
cálculo de la pendiente fue de 0.43 gr/Lh en la fase de crecimiento. Analizando los datos
obtenidos, el consumo de glucosa total se dió entre las 12 y 14 horas después de haber
iniciado el proceso. Lo anterior indica que el consumo es lento debido a que la densidad
celular es pequeña.
Al analizar los parámetros de evaluación del proceso (tabla 24), se obtuvo una biomasa
final promedio de 3.45 g/L (δ=0.57), un rendimiento global promedio de 44.16% (δ=7.24)
y una concentración de esporas promedio de 3.16x108 UFC/mL (δ=4.35x108), esta ultima,
es una concentración baja comparada con resultados reportados por: (6.5x109 UFC/mL)
Pearson y Ward, 1988, (4.0x109 UFC/mL) Golberg et al., 1980, y (2.1x109 UFC/mL) Arcas
et al., 1984, para el proceso de fermentación Batch. Esto posiblemente debido a que se
estaba utilizando en diferentes cantidades en algunos componentes del medio de cultivo que
se utilizo, como son glucosa 10 g/L y extracto de levadura 28 g/L.
71
IQ-2002-2-06
Biomasa Final µ YX/S

Fermentaciones
[gr/L] [h-1] [%]
Batch 1 4,15 0,2 51,87
Batch 2 3,45 0,12 43,12
Batch 3 3 0,2 37,5
Promedio 3,53 0,17 44,16
Desv Estandar 0,57 4,61x10-2 7,24
Tabla 24. Resultados finales fermentaciones Batch
10.2 Fermentación Fed-Batch Discontinuo
Según los datos analizados en el proceso de fermentación Batch y teniendo en cuenta las
condiciones en el laboratorio, se realizaron fermentaciones Fed-Batch discontinuo con uno,
dos y tres pulso de sustrato por repetición. Mejorando las condiciones de cada uno, con
miras obtener mejores resultados.
Los componentes para el diseño de los pulsos de sustrato fueron glucosa y extracto de
levadura en un radio de 1:1, debido a que la cinética de crecimiento del microorganismo fue
de orden cero, se decidió llevar a cabo un aumento lineal según la concentración inicial de
estos componentes en el proceso de fermentación Batch. En consecuencia la concentración
fue de 16 gr/L para el primer pulso, 24 gr/L para el segundo y finalmente 32 gr/L para el
tercer pulso para la glucosa y para el extracto de levadura..
72
IQ-2002-2-06
A medida que se realizaron los diferentes pulsos de sustrato, el oxígeno disuelto disminuyo
desde la primera hora de haber iniciado el proceso de fermentación; signo de que se
activaron nuevamente y empezaron a llevarse a cabo las reacciones metabólicas (figuras
8,11,14) del microorganismo. Se observó que el consumo de oxígeno era mayor con
respecto a la transferencia de este en el fermentador, obteniéndose un valor de 0% en el
sensor oxígeno disuelto desde la hora 4 de haber iniciado el pulso 1 de sustrato.
Simultáneamente se pudo apreciar una disminución considerable en el pH durante la fase
de crecimiento debido a la inhibición que se presenta en el proceso del ciclo del ácido
tricarboxílico. Llegando hasta el punto que en el proceso Fed-Batch pulso 2, el pH llego a
tener un valor de 4, lo que constituye un choque osmótico grande para Bacillus
thuringiensis; por lo tanto esta deficiencia de oxígeno disuelto sumado a la baja tan drástica
en el pH, influyeron de manera importante para que no se llevara a cabo el proceso de
esporulación por parte de la bacteria, y por ende la producción de las δ-endotoxínas. Para
aumentar la transferencia de oxígeno en el fermentador, para los procesos Fed-Batch pulso
2 (repetición) y Fed-Batch pulso 3, se suministro oxigeno puro y se mantuvo el porcentaje
de oxígeno disuelto por encima del 1%; para que este no fuera un factor limitante en la
esporulación.
Durante el desarrollo de todo el proceso de fermentación, el valor del oxígeno disuelto no
aumentó y se mantuvo en valores muy bajos. Por el contrario se pudo observar un aumento
en el valor del pH, signo de que el microorganismo entró en fase de desaceleración para
73
IQ-2002-2-06
pasar a fase estacionaria, siendo en esta última donde se lleva a cabo simultáneamente el
proceso de esporulación y formación del cristal.
En los procesos de fermentación Fed-Batch, según el análisis para el consumo de glucosa,
en la primera parte se llevo a cabo un proceso Batch con un periodo de 12 horas, y se pudo
determinar que a medida que se llevaron a cabo los pulsos 1 y 2 de sustrato, el consumo
total de glucosa se daba entre las 6 y 4 horas respectivamente (Figuras 9,12) de haberse
realizado los pulsos para los procesos Fed-Batch. Según el cálculo de la pendiente la taza
promedio de consumo de glucosa aumentó en 4 y 8 veces respectivamente, en comparación
a las fermentaciones Batch anteriores. Esto se debe a que hay mayor densidad celular, el
consumo de glucosa se realizó en menor tiempo y a mayor velocidad.
Durante el proceso de filtración, se decidió remover 1000 mL, con excepción en el pulso 1
de 500 mL, para disminuir la concentración de metabolitos secundarios en la fermentación
y realizar el pulso con en el mismo volumen removido para mantener el volumen promedio
de la fermentación en 3.3 L. A medida que se llevaron a cabo todos los procesos de
filtración se puede apreciar un decaimiento drástico en el flux entre los volúmenes filtrados
(ver anexo H), esto debido al taponamiento que se va generando en la superficie de la
membrana a través del tiempo mientras se lleva a cabo la filtración tangencial; por ende al
aumentar la concentración celular, la membrana es ineficiente hasta el punto de triplicar el
tiempo de filtración para el tercer pulso.
74
IQ-2002-2-06
A los filtrados se realizó tanto análisis de glucosa como cuantificación de biomasa; como
resultados no se obtuvo ninguna concentración de glucosa ni de biomasa, de acuerdo a lo
esperado para los proceso de primer pulso, lo cual indicó que si se llevo a cabo una
retención celular total por parte de la membrana en la fermentación.
Debido a que se presentaron unos problemas de contaminación, se tuvo que recurrir a un
proceso de limpieza para la membrana (Ver anexo L) para poder llevar a cabo las
fermentaciones Fed-Batch con dos y tres pulsos de sustrato; el cual al parecer dilato en un
porcentaje pequeño el diámetro de los poros de filtración de la membrana, disminuyendo
así la retención celular por parte de esta en el proceso de filtrado. Por lo tanto a medida que
se realizaron las diferentes filtraciones, la cantidad de biomasa en el filtrado aumentó (Ver
anexo E), obteniéndose un máximo valor de 2.55 g/L en la filtración del tercer pulso,
donde se puede ver que la influencia en la dilatación de los poros ya es un factor critico en
el desarrollo del proceso de filtración; determinante para la escogencia de la membrana y
posible escalamiento del proceso.
Al analizar los parámetros de evaluación para el proceso Fed-Batch discontinuo, se puede
ver que al aumentar linealmente la concentración de sustrato por medio de los pulsos se
puede llegar a aumentar la densidad celular y en consecuencia obtener una esporulación
alta. Según los resultados obtenidos en los procesos que se llevaron a cabo en mejores
condiciones la evaluación del rendimiento por pulso se aumento en comparación al proceso
Batch, con el primer pulso 1.2 veces y con el segundo pulso 1.5 veces, (tabla 25). Estos
75
IQ-2002-2-06
resultados obtenidos tienen igual tendencia según datos publicados por Vallejo et al. (1999)
(duplicando valores obtenidos en la fermentación Batch).
Biomasa Final µ Y X/S Pulso Y X/S Global

Fermentaciones
[gr/L] [h-1] [%] [%]
Pulso 1 6.2 0.37 38.75 25.83
Pulso 1 R 8.35 0.15 52.18 34.79
Pulso 2 4.76 0.13 19.83 9.91
Pulso 2 R 15.71 0.14 65.45 32.72
Pulso 3 17.23 1.04 54.06 21.62
Tabla 25 Datos Globales fermentación Fed-Batch
Los mejores resultados obtenidos se dieron en los procesos Fed-Batch 1 (repetición) y Fed-
Batch pulso 2 (repetición) (tabla 25), con una concentración celular final de 8.35 y 15.71
gr/L respectivamente y una concentración de esporas de 1x109 UFC/m y 2.5x109 UFC/mL
respectivamente. Lográndose un aumento en este ultimo parámetro de ocho veces los
resultados obtenidos analizados en la fermentaciones Batch. Según datos publicados por
Vallejo et al., (1999), donde se utilizo un proceso Fed-Batch discontinuo con Bacillus
thuringiensis subesp medellín; a pesar que se llego a un valor mas alto en la biomasa (25
gr/L), se obtuvo una concentración menor de esporas (9x108 UFC/mL), generándose una
diferencia al implementar el proceso de fermentación con la membrana de flujo tangencial
y así disminuir la concentración de metabolitos secundarios en el proceso, los cuales
podrían influir tanto en el aumento de biomasa como en la concentración de esporas.
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Por lo tanto al realizar una comparación con el proceso Batch, se puede ver que se mejoró
en todos los parámetros de evaluación propuestos para el proceso Fed-Batch discontinuo
con 1, 2 y 3 pulsos de sustrato, y que variables de operación como por ejemplo el volumen
de filtración, el control de pH y el oxigeno disuelto, son fundamentales para que el proceso
sea efectivo.
Cabe anotar que el redimiendo global para los diferentes pulsos (YX/S) fue menor debido a
que en este se tuvo en cuenta la entrada total de glucosa al sistema, en acuerdo con
resultados obtenidos por Vallejo et al., (1999). pero si se logró mejorar el rendimiento a
nivel de pulso, el cual es muy importante para ver la eficiencia del proceso.
10.3 Proteína Tóxica
Para el análisis cualitativo de la expresión de la proteína toxica en los procesos de
fermentación tanto Batch como Fed-Batch, se realizo dos electroforesis en gel denaturante
de poliacrilamida (SDS PAGE) (figuras 17, 18), donde claramente se pueden diferenciar las
bandas para las toxinas de interés, las cuales tienen pesos moleculares de 60 y 130 kDa
respectivamente, y se puede determinar que el aumento en la concentración de sustrato
llevadas a cabo en los pulsos 1, 2 y 3, y el desarrollo del proceso de filtración no tienen una
influencia en la expresión de las proteínas toxicas por parte del microorganismo.
77
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Según el análisis cuantitativo para la proteína toxica (tabla 22), se pudo ver que en los
procesos de fermentación Batch la cantidad de proteína total, se encuentra por valores muy
bajos con un promedio de 78.33 µg/mL (δ=27.53) comparados a los resultados obtenidos
en las fermentaciones Fed-Batch discontinuo, donde se obtuvo valores de 1912 µg/mL para
el primer pulso, 2001 µg/mL para la repetición del primer pulso y para el segundo pulso
repetición con el valor más alto de proteína total de 2231 µg/mL; por lo tanto a medida que
se va aumentando la concentración de sustrato en los diferentes pulsos, hay un aumento en
la cantidad de toxina total.
Para la cuantificación de toxina expresada según las bandas obtenidas para las proteínas de
60 y 130 kDa, siendo esta última la de mayor efecto tóxico, se puede apreciar que a medida
que se fue incrementando la concentración sustrato mediante los pulsos, la concentración
de la proteína de 60 kDa, va en aumento; mientras que para la proteína de 130 kDa, no se
puede establecer un parámetro de comportamiento, es necesario que se realicen más
investigaciones y que además se completen con Bioensayos, para poder determinar la
toxicidad de la proteína, y si este aumento en la concentración de sustrato tiene algún efecto
en la síntesis del cristal.
78
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11. Conclusiones
Debido a la creciente demanda en los sistemas de control biológico para plagas en los
diferentes cultivos, la mayoría de los procesos para la producción a nivel industrial de
Bacillus thuringiensis se realizan por medio de una fermentación tipo Batch, las otras
metodologías existentes solo se han llevado acabo a nivel de planta piloto. Es por eso que
surgió la necesidad de desarrollar una metodología diferente en relación a los parámetros de
evaluación como son: la concentración de biomasa, concentración de esporas, análisis
cualitativo y cualitativo de toxina obtenidos, para ver la factibilidad de realizar a futuro el
escalamiento del proceso. En este estudio se implemento un sistema Fed-Batch discontinuo
en un biorreactor con membrana de flujo tangencial y se evaluaron los resultados obtenidos
comparando con los de un proceso Batch en iguales condiciones de operación.
De los resultados obtenidos, uno de los parámetros más importantes para la evaluación del
proceso para la producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki fue la biomasa. Se
puede concluir que a medida que se llevo a cabo el aumento en la concentración sustrato
por medio de los pulsos, se logro aumentar la densidad celular del cultivo; al realizar una
comparación de los procesos de fermentación Batch donde se obtuvo un valor promedio de
biomasa final de 3.53 gr/L, con la realización del proceso Fed-Batch discontinuo con 1
pulso de sustrato donde se obtuvo un valor de biomasa final de 8.35 gr/L; se puede ver la
densidad celular aumento en 2.36 veces que el proceso Batch. Con el proceso Fed-Batch
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discontinuo con 2 pulsos de sustrato, donde se obtuvo un valor de biomasa de 15.71 gr/L,
el aumento ya es de 4.45 veces comparado con el proceso Batch y finalmente si hacemos
una comparación con el proceso Fed-Batch con 3 pulsos de sustrato con un valor en la
densidad celular es de 17.23 gr/L, el aumento de esta última alcanza un valor de 4.88 veces;
cabe anotar que en esta fermentación se presento un pequeña contaminación afectando
todos los parámetros de evaluación.
Otro parámetro para la evaluación del proceso para la producción de de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki, es la concentración de esporas; en cuanto al proceso Batch se
obtuvo una concentración promedio baja con un valor de 3.16x108 UFC/mL (δ=4.61x10-2),
pero al llevar a cabo el proceso Fed-Batch discontinuo, a medida que se realizaban los
pulsos de sustrato la concentración de esporas también aumento, con 1 pulso de sustrato
(repetición) se obtuvo una concentración de esporas de 1 x109 UFC/mL; llegándose a
obtener el valor mas alto en concentración de esporas de 2.5x109 UFC/mL con 2 pulsos de
sustrato (repetición). En este parámetro de evaluación, hay una influencia directa de la
transferencia de oxígeno disuelto en el fermentador, la cual se debe tener en cuenta para el
desarrollo del proceso.
La implementación de la membrana de filtración tangencial al fermentador fue satisfactoria
desde todo punto de vista en cuanto al proceso de producción de Bacillus thuringiensis
subesp kurstaki, ya que se logró aumentar tanto la biomasa como la esporulación,
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obteniéndose buenos resultados en la cuantificación de la toxina expresada por el
microorganismo; ya que al retirar medio agotado; se disminuyo la probabilidad de una
inhibición por una concentración alta de metabolitos secundarios en el fermentador
generados en la fase de crecimiento.
Al llevar a cabo el análisis para la concentración de azúcares durante el proceso de
fermentación, se pudo observar un aumento en el consumo de este parámetro en el tiempo,
ya que al llevar a cabo una remoción de los metabolitos secundarios en la fermentación, se
mejoro las condiciones para el desarrollo del metabolismo del microorganismo,
aumentándose la taza para el consumo de glucosa, y consecuentemente obteniéndose una
densidad celular mayor. Sin embargo es indispensable que se sigan efectuando
investigaciones en este campo para determinar si el microorganismo continua su
crecimiento y posteriormente desarrolla el complejo espora-cristal o si la concentración de
sustrato es excesiva hasta punto de llegar a inhibir la esporulación; según datos reportados
por Kang et al., (1992) a una concentración de glucosa de 200 gr/L, se obtuvo un aumento
en la biomasa de 49 gr/L, pero no se desarrollo proceso de esporulación.
Durante el proceso de fermentación Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo
tangencial, se encontraron dos problemas de operación para la producción de Bacillus
thuringiensis subesp kurstaki; el primero esta relacionado con la baja transferencia de
oxígeno en el fermentador, esta limitación genero un aumento en el tiempo para el
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crecimiento del microorganismo, el cual se encuentra entre 12-14 horas, posiblemente
debido a que el experimento se llevo a cabo en Bogotá, donde la altura es de 2.600 msnm,
siendo este un facto critico ya que la cantidad de oxigeno disuelto es menor; en
comparación a procesos llevados a cabo en Medellín donde la altura es de 1474 msnm,
donde la cantidad de oxígeno disuelto es mayor y en consecuencia la duración de la fase de
crecimiento es de 4 h (Vallejo et al., 1999).
El segundo problema operacional es el desempeño de la membrana de filtración, ya que
según los resultados obtenidos, el flux decae a medida que se llevan a cabo las diferentes
filtraciones, debido a un taponamiento progresivo. Además es de suma importancia que el
proceso de fermentación se lleve a cabo en condiciones asépticas, siendo fundamental que
el proceso de limpieza de la membrana sea efectivo, para que no se generen problemas de
contaminación.
Por lo tanto la deficiencia en la transferencia de oxigeno y el taponamiento de la membrana
son factores limitantes para el posible escalamiento del proceso para la producción de
Bacillus thuringiensis subesp kurstaki.
82
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BIBLIOGRAFÍA
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13. Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias.” Departamento de Ciencias
Biológicas” Manual de Laboratorio Microbiología para Biólogos”, Santa fe de Bogota,
1997.
14.
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Anexo A
Composición medio de cultivo liquido:
Cantidad
Componentes
[g/l]
Glucosa Anihidra 8
Extracto de Levadura 8
Fosfato monobásico de Potasio 3
Fosfato bibásico de Potasio 3
Sulfato de Amonio 1
Cloruro de Calcio 0.41
Sulfato de Magnesio 4
Tabla 26. Medio de cultivo
Para poder llevar a cabo el proceso de esterilización por autoclave fue necesario separar los
componentes del medio en glucosa, sulfato, y el resto en las siguientes proporciones:
Volumen Total
Componente del Medio Liquido
[%]
Glucosa Anihidra 10
Sulfato de Magnesio 10
Resto 80
Tabla 25. Porcentaje del Medio de cultivo
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1. Composición del medio cultivo sólido LB:
Cantidad
Componentes
[g/l]
B Bacto-Tryptone 10
Extracto de Levadura 5
Cloruro de Sodio 15
Agar 15
Tabla 28. Medio de cultivo LB
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Anexo B1
Metodologías para los parámetros de evaluación
1. Coloración de Esporas
Se realizó el siguiente procedimiento para la coloración de esporas en la cámara de flujo
Laminar (Figura 30):
1. Se toma la muestra en la lámina.
2. Se realiza una fijación de la muestra con evaporación.
3. Se agrega verde malaquita
4. Se realiza una fijación de colorante verde malaquita con evaporación hasta formar un
anillo alrededor de la lamina.
5. Se lava con cuidado la muestra con agua.
6. Se agrega fushina
7. Se espera por un periodo de tiempo de 3 minutos.
8. Se lava con cuidado la muestra con agua.
9. Se seca fija la coloración con evaporación.
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2. Determinación de biomasa
La biomasa es una medida o una estimación económica de conocer la concentración de
microorganismos que hay en una muestra. Una de las metodologías para determinarla es
por peso seco.
Procedimiento
1. Los recipientes que se utilizan son eppendors de 1.5 ml, los cuales se llevaran al horno
(figura 29) a 121ºC durante 4 horas, posteriormente se llevan al desecador durante 2
horas para que éstos alcancen la temperatura ambiente. Finalmente se pesan en la
balanza (con guantes de látex) (figura 32) y se anota el peso de cada uno de ellos.
2. Se toma 1 ml de cada una de las muestras y se centrífuga (figura 31) por un periodo
de tiempo de 10 minutos a 10000 rpm.
3. Se Revisa que este separado el sobrenadante de la biomasa, en caso contrario repetir el
procedimiento del ítem 2 a las muestras que no están completamente separadas.
4. Se descarta el sobrenadante del botton.
5. Se resuspende el botón con 1 ml de agua destilada y se centrifugar en las mismas
condiciones.
6. Repetir el ítem 5
7. Se descarta el sobrenadante.
8. Se llevan al horno a 121 0C durante 2 horas
1
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9. Se pesa nuevamente (Con guantes de látex) y se resta el peso tomado inicialmente.
Figura 19. Muestras de peso seco
3. Determinación de la concentración de esporas
Debido a que B. thuringiensis es una bacteria esporulada, y que la esporulación está
acoplada a la formación del cristal, una de las variables más importantes a cuantificar es la
concentración de esporas. El método que será utilizado para cuantificar la concentración de
esporas es el conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) en caja de petri.
Procedimiento
1. Se prepararan 24 tubos de ensayo cada uno con 4.5 ml de agua estéril.
2. Se toman 0.5 ml de la última muestra del primer día y las muestras de las 3 últimas
muestras y se llevan a tubos de ensayo previamente estériles con 4.5 ml de una
solución de agua previamente esterilizada.
3. Se preparan 36 cajas de petri con medio sólido LB.
4. Se realizan diluciones sucesivas dependiendo de la muestra de la siguiente manera:
- Ultima muestra primer día, dilución 1/10
90
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- 3 últimas muestras: 10-5, 10-6 , 10-7
5. Se Lleva a choque térmico los anteriores tubos. El choque térmico consiste en colocar
en baño Maria a 80oC durante 10 minutos.
6. Una vez los tubos de ensayo alcancen la temperatura ambiente, se siembra por
Triplicado en cajas de petri.
7. Se Llevan a incubación durante 20 horas a 30oC
8. Se escoge la dilución que presente l cifra más cercana a 100 y se realiza el conteo de
colonias.
5. Determinación de Azucares
La determinación de azucares reductores, como es el caso de glucosa se utilizara el método
DNS, el cual se basa en la colorimetría dado por el ácido Di-nitro-salicílico, el cual la
glucosa reduce transformándolo en 3-amino5-nitro-salicílico de color naranja-rojo. La
densidad óptica del color producido por es directamente proporcional a la cantidad del
cuerpo reducido y a la cantidad de glucosa en la solución.
Preparación de la solución estándar de DNS
1. Se mezclan y disuelven los siguientes componentes:
• Agua destilada:1416 mL
• Ac. Di-nitro-salicílico: 3,510.6 gr
• NaOH :19.8 gr
91
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2. Se agrega:
• Tartato de sodio y potasio (sal de Rochelle): 306 gr
• Fenol: 7.6 mL
• Metabisulfito de sodio:8.3 gr
Se almacena la anterior solución a temperatura ambiente por una semana antes de su uso.
Para usar la solución DNS, adicionar 210 µL de una solución de glucosa0.1 M, para 100
mL de DNS el día que se va a usar.
Procedimiento
1. Se toma 0.25 ml de cada una de las muestras en un tubo de ensayo y se lleva a 10 ml
con agua desionizada.
2. De la anterior solución se toman 2 ml y se agregan 5 ml de la solución de DNS.
3. Se debe realizar la muestra Blanco con 2 ml de agua y 5 ml de DNS.
4. Se lleva a ebullición por un periodo de 15 minutos y se deja enfriar.
5. Se lee en espectrofotómetro a 600nm (figura 35).
92
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Figura 20.. Muestras para pruebas de Azucares
Curva de Calibración
Muestra Absorvancia Glucosa Agua DNS

[mmol/tubo] [nm] [gr/L] [µL] [mL]
0 0 0 2000 5
0,5 0,0875 0,315 1910 5
1 0,1753 0,63108 1820 5
1,5 0,2608 0,93888 1730 5
2 0,3358 1,20888 16,4 5
2,5 0,4256 1,53216 1550 5
3 0,5204 1,87344 1460 5
5 0,8588 3,09168 1100 5
7 1,2607 4,53852 740 5
10 1,7243 6,20748 200 5
Tabla 29 Datos de la curva de calibración DNS
Curva de Calibracón DAS

2
1,8
Absorvancia [nm]
1,6
1,4
1,2
1
0,8 y = 0.17470 x − 0.00317
0,6
0,4 R 2 = 0.99901
0,2
0
0 2 4 6 8 10
Muestra [ mol/tubo]
Figura 21 Curva de calibración DNS
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6. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Una de las principales características de las proteínas expresadas por B. thuringiensis que
permite diferenciar cualitativamente es el peso molecular. Uno de los procedimientos más
adecuados para esto es realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS PAGE).
Procedimiento:
1. Preparación del gel 10% para mls del gel:
• Agua bidestilada: 2 mL
• Tris-HCl 1.5 M pH 8.8: 1.25 mL
• SDS 10% (w/v): 50 µL
2. Solución Acrilamida/Bisacrilamida al 30%:
• Persulfato de Amonio al 10%: 1.6666 mLs
• Temed: 10 µL
Se coloca en las laminas de vidrio
3. Stakin Gel al 4% para un volumen de 2.5 mL:
• Agua bidestilada: 1.6 mLs
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• Tris –HCl 0.5 M, pH 6.8: 625 µL
• SDS 10% (w/v) : 25 µL
• Acrilamida (30 gr) + Bisacrilamida (1.6 gr) :375 µL
• Persulfato de amonio 10% : 21µL
• Temed : 28 µL
Se coloca encima del anterior gel, colocándose la peineta y esperar 30 minutos hasta que
endurezca.
4. Buffer de la muestra:
• Agua deshionizada: 3.8 mL
• Tris de HCl 0.5 M, pH 6.5: 10 mL
• Glycérol :0.8 mL
• SDS 10% (w/v) : 1.6 mL
• 2 mercaptoetanol : 0.4 mL
• Azul de bromo fenol 1% (w/v):0.4 mLs
Diluir la muestra 1:4 con el buffer de la muestra y calentar a 95ºC por 4 minutos
6. Buffer de corrida
• Glicina: 14.4 gr
• Trizma base: 3.03 gr
• SDS al 20%: 5mls
• Se completa con agua deshionizada: hasta 1000 mL
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Una vez estén las muestra y el patrón aplicadas en el gel tapar la cámara (figura 34).,
verificar el color de los electrodos y colocar en 18 mA constantes hasta que llegue al final
del gel las muestras
7. Fijación de las proteínas
Una vez terminada la electroforesis, se sumerge los vidrios con el gel durante 5 minutos
en la solución de fijado.
• Metano: 25 mL
• Agua: 75 mL
• Ácido acético: 7 mL
Luego con la ayuda de una micro espátula se despega el gel. Y se deja el gel por mas de
una hora.
8. Tinción de las proteínas con Azul de comassie al 0.2%
Después de la fijación, se sumerge el gel en la solución de azul de comassie de 0.2%
durante ½.
• Azul de comassie: 0.2 gr.
• Metanol: 50 mL
• Ácido acético glacial 5 mL
• Se completa con agua hasta 1000 mL.
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9. Decoloración del Gel.
Se sumerge el gel en solución de ácido acético al 10% y 30% de metanol. Cambiar la
solución 3 o 4 veces hasta obtener una buena coloración.
10. Patrones estándares utilizados en la electroforesis:
Bio-rad. Broad Range, Catalog 161-0.318, control 81623
Peso Molecular
Proteína
[Da]
Myosin 207.000
B-galactosidase 121.000
Bovine Serum Albumin 81.000
Ovalbumin 51.000
Carbonic Anhydrase 33.600
Soybean Trypsin inhibitor 28.600
Lysozyme 21.100
Aprotinin 7.500
Tabla 30. Patrones estándares de Proteína
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Anexo C
Toma de Datos
1. Primera Fermentación Batch
Muestra Tiempo Temperatura Vol de Aire O2 Agitación

pH
# [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
0 0 6,38 30 0 84 300
1 1 6,46 30 1,4 100 300
2 2 6,5 30 1,2 100 300
3 3 6,49 30 1,3 55,6 300
4 4 6,1 30 3,2 35,9 300
5 5 6,17 30 7,1 44 300
6 6 6,5 30 7,7 22,6 300
7 7 6,5 30 7 28,9 300
8 24 7,5 30 9,1 100 300
9 33 6,5 30 9,2 100 300
Tabla 31. Datos primera fermentación Batch
2. Segunda Fermentación Batch

pH
# [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
0 0 6,33 30 0 83,5 300
1 1 6,5 30 0,9 97,8 300
2 2 6,5 30 0,9 89,9 300
3 3 6,5 30 0,9 68,2 300
4 4 6,5 30 1 40,8 300
5 5 6,5 30 7,2 67,6 300
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6 6 6,5 30 7,9 41,8 300

7 7 6,5 30 8.2 32 300
8 24 6,5 30 8,75 99 300
9 33 6,5 30 8,2 100 300
Tabla 32. Datos segunda fermentación Batch
3. Tercera Fermentación Batch

pH
# [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
0 0 6,21 30 1,1 78,3 300
1 1 6,5 30 1,3 90,3 300
2 2 6,5 30 1,2 88,5 300
3 3 6,5 30 1,2 79,9 300
4 4 6,5 30 0,1 53,8 300
5 5 6,5 30 7 68 300
6 6 6,5 30 6,7 55 300
7 7 6,5 30 7,4 42,6 300
8 24 6,5 30 6,05 99,2 300
9 33 6,5 30 6,1 2,6 300
Tabla 33. Datos primera fermentación Batch
4. Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato
Tiempo total Muestra Hora Temperatura Vol de Aire O2 Agitación

pH
Fermentación [#] [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
13 0 0 6,5 29,7 6,8-7,5 43 300
14 1 1 6,5 30 7,9-8,2 92,1 300
15 2 2 6,5 30 8,6 100 300
16 3 3 6,38 30 9,6-8,8 79,3 300
17 4 4 6,5 30 9,5 0,6 300
18 5 5 6,5 30 9,3 0,4 300
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19 6 6 6,5 30 8,1 7,3 300

20 7 7 6,5 30 9,6 28,1 300
21 8 8 6,5 30 9,1 3,2 300
22 9 9 6,5 30 8,1 7,2 300
38 10 24 6,5 30 7,7-8,4 9,5 300
42 11 28 6,5 30 7,7-7,2 0,2 300
46 12 33 6,5 30 7,0-6,5 0,1 300
62 13 49 6,5 30 7,0-6,5 0 300
Tabla 34.Datos Fed-Batch pulso 1
5. Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)

pH
Fermentación [] [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
14 0 0 6,5 30 7,7-8,3 26,2 300
15 1 1 6,5 30 8,1-8,7 10,5 300
16 2 2 6,5 30 8,5-7,5 1 300
17 3 3 6,38 30 8,8-8,1 3,3 300
18 4 4 6,5 30 7,9-8,4 27,9 300
19 5 5 6,5 30 8,8-8,2 24,1 300
20 6 6 6,5 30 7,8-8,5 29,6 300
21 7 7 6,5 30 7,8-8,6 9,4 300
22 8 8 6,5 30 7,6-8,2 10,3 300
38 9 24 7,74 30 6,2-6,3 0 300
42 10 28 6,5 30 6,3-7,0 0 300
46 11 33 6,5 30 3,6-2,9 0 300
61 12 48 6,5 30 7,5-8,1 0,1 300
Tabla. 35 Datos Fed-Batch pulso 1 R
100
IQ-2002-2-06
6. Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato

pH
Fermentación [h] [h] [ºC] [L/min] [%] [rpm]
26 0 0 6,5 30 5,6-5,4 14,5 300
27 1 1 6,14 30 5,3-5,4 11,6 300
28 2 2 6,5 30 4,9-5,0 5,1 300
29 3 3 6,5 30 5,6-5,3 2,8 300
30 4 4 6,4 30 5,3-5,5 0,5 300
31 5 5 6,5 30 6,3-6,0 0,2 300
32 6 6 6,5 30 6,4-6,9 0 300
33 7 7 6,5 30 6,4-6,8 0 300
50 8 24 6,51 30 6,1-6,7 0 300
54 9 28 6,73 30 6,0-6,5 0 300
58 10 32 6,91 30 2,3-2,5 0 300
74 11 48 6,78 30 0,9-0,3 5,2 300
Tabla 36 Datos Fed-Batch pulso 2
7. Fed-Batch 2 Pulsos de sustrato (repetición)

pH
26 0 0 6,2 30,1 6,8-6,6 55,4 300
27 1 1 6,12 30 6,2-6,3 37,3 300
28 2 2 6,18 30,1 7,8 1,3 300
29 3 3 6,22 30,3 0 0 300
30 4 4 6,7 29,9 9,5-9,2 1 300
31 5 5 6,12 30 5,3-5,7 0,6 300
32 6 6 6,78 30 9,1-8,4 7,5 300
33 7 7 6,76 30 7,9-7,6 6,4 300
34 8 8 6,74 30 7,5-8,0 1,3 300
101
IQ-2002-2-06
50 9 24 7,16 30 9,1-9,0 0 300

55 10 29 7,53 30 9,5-9,0 3,6 300
59 11 33 7,77 30 9,0-9,3 2,5 300
74 12 48 8,35 30 10,1-9,5 4 300
Tabla 37 Datos Fed-Batch pulso 2R
8. Fed-Batch con 3 Pulsos de sustrato

pH
37 0 0 6,47 31,4 6,7-7,1 25,2 300
38 1 1 6,57 30,7 6,7-6,5 23,4 300
39 2 2 5,93 28,9 7 16 300
40 4 4 6,27 30 9,2-9,7 24 300
41 5 5 6,38 30,1 9,1-9,5 62,8 300
42 6 6 6,23 30,1 9,9-10,5 70 300
43 7 7 6,13 30,1 9,8-10,7 62,9 300
44 8 8 6,39 29,8 11,6-10,6 74,3 300
60 9 24 6,88 29,6 2,9-2,6 5,3 300
64 10 28 6,84 30 1,9-2,2 4,2 300
68 11 32 6,82 30 1,2-1,5 3,4 300
84 12 48 6,96 30 0,7-0,8 0,8 300
Tabla 38. Datos Fed-Batch pulso 3
102
IQ-2002-2-06
Anexo D
Datos del Consumo de Glucosa
Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

[h] [µmol/tubo] [nm] gr/L
1 1,5 0,2594 5,4
2 2 0,3467 7,2
3 1,5 0,2594 5,4
4 1,3 0,22448 4,68
5 1,2 0,20702 4,32
6 1 0,1721 3,6
7 0,8 0,13718 2,88
24 0,6 0,10226 1,08
33 0,6 0,10226 1,08
Tabla 39. Consumo de glucosa Batch 1

[h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]
0 1,7 0,29432 6,12
1 1,8 0,31178 6,48
2 1,8 0,31178 6,48
3 1,7 0,29432 6,12
4 1,7 0,29432 6,12
5 1,5 0,2594 5,4
6 1,3 0,22448 4,68
103
IQ-2002-2-06
7 0,9 0,15464 3,24

24 0,5 0,0848 0,9
33 0,5 0,0848 0,9

[h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]
0 1,5 0,2594 5,4
1 1,8 0,31178 6,48
2 1,7 0,29432 6,12
3 1,7 0,29432 6,12
4 1,6 0,27686 5,76
5 1,5 0,2594 5,4
6 1,4 0,24194 5,04
7 1,4 0,24194 5,04
24 0,8 0,13718 1,44
33 0,4 0,06734 0,72
4. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato
Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]
13 0 3 0,5182 10,8
14 1 2,5 0,4389 9
15 2 2,6 0,4093 9,36
16 3 2,4 0,4074 8,64
17 4 1,2 0,2089 4,32
18 5 0,9 0,1626 3,24
19 6 0,1 0,0199 0,36
104
IQ-2002-2-06
20 7 0,1 0,0152 0,36

21 8 0 0,0325 0
22 9 0 0,030 0
38 24 0 0,0236 0
42 28 0 0,0286 0
46 33 0 0,0388 0
62 49 0 0,0390 0
F 12 0 0,0011 0
Tabla 42. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1
5. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)
Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L]
13 0 3,7 0,6366 13,32
14 1 3,5 0,6019 12,6
15 2 3,2 0,56487 11,52
16 3 2,5 0,4325 9
17 4 1,2 0,2082 4,32
18 5 0,3 0,0483 1,08
19 6 0 0,0008 0
20 7 0 0,0023 0
21 8 0 0,005 0
38 24 0 0,0013 0
42 28 0 0,0005 0
46 33 0 0,0011 0
62 48 0 0,039 0
F 13 0 0,0005 0
Tabla 43. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 1R
105
IQ-2002-2-06
6. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato
Tiempo total Muestra Lectura Absorbancia Glucosa Corrección Vol = 4.3 L

Fermentación [h] [µmol/tubo] [nm] [gr/L] [gr/L]
26 0 5,2 0,9032 18,72 24,39
27 1 5,1 0,8873 18,36 23,92
28 2 3,7 0,6372 13,32 17,36
29 3 2,1 0,3630 7,56 9,85
30 4 0,2 0,0266 0,72 0,94
31 5 0,1 0,0173 0,36 0,47
32 6 0,1 0,0079 0,36 0,47
33 7 0,1 0,0093 0,36 0,47
50 24 0,1 0,0210 0,36 0,47
54 28 0,0 0,0022 0 0,00
58 32 0,0 0,0110 0 0,00
74 48 0,0 0,0098 0 0,00
10 F1 0,3 0,0491 1,08 0,00

24 F2 0,1 0,0095 0,36 0,00
7. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato (repetición)

26 0 4,4 0,7629 15,84 23,04
27 1 3,5 0,6117 12,6 18,33
28 2 2,5 0,4263 9,0 13,09
29 3 0,8 0,1452 2,88 4,19
30 4 0,1 0,1451 0,36 0,52
31 5 0,1 0,0062 0,36 0,52
106
IQ-2002-2-06
32 6 0,1 0,0078 0,36 0,52

33 7 0 0,0055 0 0,00
34 8 0 0,0054 0 0,00
50 24 0 0,0024 0 0,00
55 29 0 0,0048 0 0,00
59 33 0 0,0001 0 0,00
74 48 0 0,0001 0 0,00
11 F1 0 0,0005 0 0,00
26 F2 0 0,001 0 0,00
Tabla 45. Consumo de glucosa Fed-Batch Pulso 2R

37 0 4,6 0,7985 16,56 24,09
38 1 4 0,7008 14,4 20,95
39 2 3,7 0,6513 13,32 19,37
40 4 2,8 0,4835 10,08 14,66
41 5 2,1 0,3609 7,56 11,00
42 6 0,9 0,1475 3,24 4,71
43 7 0,1 0,01 0,36 0,52
44 8 0,1 0,0111 0,36 0,52
60 24 0 0,003 0 0,00
64 28 0 0,001 0 0,00
68 32 0 0,02 0 0,00
84 48 0 0,0019 0 0,00
10 F1 0 0,0014 0 0,00
24 F2 0 0,0013 0 0,00
39 F3 0 0,005 0 0,00
107
IQ-2002-2-06
Anexo E
Datos de Biomasa
Peso
Muestra
Codificación Peso inicial Peso final Biomasa Promedio Promedio
[h] [gr] [gr] [gr] 1mL L
1 1 0,8959 0,8965 0,0006 0,00055 0,55
2 1 0,9402 0,9407 0,0005
3 2 0,9003 0,9007 0,0004 0,0004 0,4
4 2 0,9033 0,9037 0,0004
5 3 0,8998 0,9002 0,0004 0,0006 0,6
11 3 0,9274 0,9282 0,0008
12 4 0,9302 0,9310 0,0008 0,0009 0,9
13 4 0,9036 0,9046 0,0010
14 5 0,8941 0,8955 0,0014 0,00125 1,25
15 5 0,9035 0,9046 0,0011
21 6 0,9057 0,9073 0,0016 0,0014 1,4
22 6 0,9013 0,9025 0,0012
23 7 0,9316 0,9336 0,0020 0,0016 1,6
24 7 0,8975 0,8987 0,0012
25 24 0,9285 0,9325 0,0040 0,0042 4,2
31 24 0,9302 0,9346 0,0044
32 33 0,9026 0,9069 0,0043 0,00415 4,15
33 33 0,9246 0,9286 0,0040
Tabla 47. Cuantificación de Biomasa Batch 1
108
IQ-2002-2-06
Peso
Muestra
[h] [gr] [gr] [gr] 1 mL L
0 0 0,9033 0,904 0,0007 0,00055 0,55
0 0 0,9006 0,901 0,0004
1 1 0,9022 0,9028 0,0006 0,00055 0,55
2 1 0,8978 0,8983 0,0005
3 2 0,8971 0,8978 0,0007 0,0006 0,6
4 2 0,9318 0,9323 0,0005
5 3 0,926 0,9268 0,0008 0,00075 0,75
11 3 0,9405 0,9412 0,0007
12 4 0,9032 0,9038 0,0006 0,00085 0,85
13 4 0,9023 0,9034 0,0011
14 5 0,899 0,9001 0,0011 0,00095 0,95
15 5 0,9044 0,9052 0,0008
21 6 0,9005 0,9016 0,0011 0,00115 1,15
22 6 0,9036 0,9048 0,0012
23 7 0,9278 0,9291 0,0013 0,00125 1,25
24 7 0,8997 0,9009 0,0012
25 24 0,9288 0,9322 0,0034 0,0036 3,6
31 24 0,9326 0,9364 0,0038
32 33 0,9344 0,9378 0,0034 0,00345 3,45
33 33 0,8983 0,9018 0,0035
109
IQ-2002-2-06
Peso
Muestra
[h] [gr] [gr] [gr] 1 mL L
0 0 0,9282 0,9284 0,0002 0,00035 0,35
0 0 0,8956 0,8961 0,0005
1 1 0,9247 0,9262 0,0015 0,0006 0,6
2 1 0,9287 0,9293 0,0006
3 2 0,8959 0,8962 0,0003 0,00055 0,55
4 2 0,9042 0,905 0,0008
5 3 0,8955 0,8963 0,0008 0,00095 0,95
11 3 0,928 0,9291 0,0011
12 4 0,8961 0,8973 0,0012 0,00115 1,15
13 4 0,8963 0,8974 0,0011
14 5 0,8955 0,8963 0,0008 0,0008 0,8
15 5 0,9307 0,9315 0,0008
21 6 0,9338 0,9345 0,0007 0,0014 1,4
22 6 0,9274 0,9288 0,0014
23 7 0,9412 0,9427 0,0015 0,0015 1,5
24 7 0,8975 0,8983 0,0008
25 24 0,9005 0,9024 0,0019 0,00205 2,05
31 24 0,9315 0,9337 0,0022
32 33 0,8973 0,9003 0,003 0,003 3
33 33 0,906 0,909 0,003
110
IQ-2002-2-06
4. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato
Peso
Muestra
1 0 0,8956 0,8966 0,0010 0,00105 1,05
2 0 0,9035 0,9046 0,0011
3 1 0,8987 0,8994 0,0007 0,00085 0,85
4 1 0,8957 0,8967 0,0010
11 2 0,9037 0,9048 0,0011 0,0011 1,1
12 2 0,9002 0,9013 0,0011
13 3 0,8949 0,8961 0,0012 0,00115 1,15
14 3 0,8958 0,8969 0,0011
21 4 0,9 0,9018 0,0018 0,0018 1,8
22 4 0,9066 0,9084 0,0018
23 5 0,8946 0,896 0,0014 0,0014 1,4
24 5 0,8955 0,8969 0,0014
31 6 0,9007 0,9028 0,0021 0,0021 2,1
32 6 0,9302 0,9323 0,0021
33 7 0,9014 0,9041 0,0027 0,00275 2,75
34 7 0,9307 0,9335 0,0028
41 8 0,9325 0,9376 0,0051 0,0047 4,7
42 8 0,9301 0,9344 0,0043
43 9 0,9268 0,9311 0,0043 0,00435 4,35
44 9 0,9029 0,9073 0,0044
51 24 0,9334 0,9366 0,0032 0,00305 3,05
52 24 0,8929 0,8958 0,0029
53 28 0,9 0,9033 0,0033 0,00325 3,25
54 28 0,9017 0,9049 0,0032
61 33 0,9024 0,9074 0,0050 0,0056 5,6
62 33 0,9043 0,9095 0,0052
63 49 0,8982 0,9042 0,0060 0,0062 6,2
64 49 0,9261 0,9325 0,0064
111
IQ-2002-2-06
71 F 0,9007 0,9007 0,0000 0 0

72 F 0,8967 0,8967 0,0000
Tabla 50. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1
5. Fermentación Fed-Batch con 1 Pulso de sustrato (repetición)
Peso
Codificación Muestra Peso inicial Peso final Biomasa Promedio Promedio
1 0 0,9299 0,9335 0,0036 0,0035 3,5
2 0 0,9025 0,9059 0,0034
3 1 0,8974 0,9011 0,0037 0,0037 3,7
4 1 0,9310 0,9347 0,0037
11 2 0,8931 0,897 0,0039 0,0039 3,9
12 2 0,9064 0,9103 0,0039
13 3 0,9020 0,9051 0,0031 0,0031 3,1
14 3 0,9001 0,9032 0,0031
21 4 0,9015 0,9047 0,0032 0,00305 3,05
22 4 0,8934 0,8963 0,0029
23 5 0,9001 0,9034 0,0033 0,0033 3,3
24 5 0,8959 0,8992 0,0033
31 6 0,9060 0,9099 0,0039 0,0038 3,8
32 6 0,8949 0,8986 0,0037
33 7 0,9065 0,9105 0,0040 0,00405 4,05
34 7 0,9286 0,9327 0,0041
41 8 0,8961 0,9006 0,0045 0,00455 4,55
42 8 0,8998 0,9044 0,0046
51 24 0,9278 0,9334 0,0056 0,00535 5,35
52 24 0,9270 0,9321 0,0051
53 28 0,9299 0,9363 0,0064 0,0068 6,8
54 28 0,8990 0,9062 0,0072
61 33 0,9282 0,9354 0,0072 0,008 8
112
IQ-2002-2-06
62 33 0,9036 0,9112 0,0076

63 48 0,9013 0,9097 0,0084 0,00835 8,35
64 48 0,8928 0,9011 0,0083
F 71 0,906 0,906 0,0000 0 0

F 72 0,9073 0,9073 0,0000 0 0
Tabla 51. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 1 R
Peso Peso Peso

Codificación Muestra inicial final Biomasa Promedio Promedio Corrección Vol = 4.3 L
[h] [gr] [gr] [gr] 1mL gr/L gr/L
1 0 0,9016 0,9040 0,0024 0,00235 2,35 3,06
2 0 0,9061 0,9084 0,0023
3 1 0,9328 0,935 0,0022 0,00235 2,35 3,06
4 1 0,9032 0,9057 0,0025
11 2 0,8959 0,8982 0,0023 0,00245 2,45 3,19
12 2 0,9033 0,9059 0,0026
13 3 0,9268 0,9295 0,0027 0,00275 2,75 3,58
14 3 0,8961 0,8989 0,0028
21 4 0,9061 0,9094 0,0033 0,00335 3,35 4,37
22 4 0,8957 0,8991 0,0034
23 5 0,9023 0,9058 0,0035 0,00365 3,65 4,76
24 5 0,9341 0,9379 0,0038
31 6 0,8999 0,9026 0,0027 0,00275 2,75 3,58
32 6 0,9070 0,9098 0,0028
33 7 0,9349 0,9374 0,0025 0,00225 2,25 2,93
34 7 0,9014 0,9034 0,0020
41 24 0,9328 0,9360 0,0032 0,0033 3,3 4,30
42 24 0,9028 0,9062 0,0034
43 28 0,8950 0,8980 0,0030 0,0029 2,9 3,78
113
IQ-2002-2-06
44 28 0,8973 0,9001 0,0028

51 32 0,9034 0,9051 0,0017 0,00165 1,65 2,15
52 32 0,9015 0,9031 0,0016
53 48 0,9008 0,9036 0,0028 0,0026 2,6 3,39
54 48 0,8979 0,9003 0,0024
71 F1 0,9399 0,9401 0,0002 0,0002 0,2 0,26

72 F2 0,8951 0,8954 0,0003 0,0003 0,3 0,39
7. Fermentación Fed-Batch con 2 Pulsos de sustrato (repetición)
Peso Peso Peso

Codificación Muestra Inicial Final Biomasa Promedio Promedio Corrección Vol = 4.8 L
[h] [gr] [gr] [gr] 1mL L [gr/L]
1 0 0,9063 0,9105 0,0042 0,00415 4,15 6,04
2 0 0,8974 0,9015 0,0041
3 1 0,9011 0,9052 0,0041 0,00425 4,25 6,18
4 1 0,8956 0,9000 0,0044
11 2 0,8997 0,9041 0,0044 0,00445 4,45 6,47
12 2 0,9065 0,911 0,0045
13 3 0,9027 0,9069 0,0042 0,0044 4,4 6,40
14 3 0,9305 0,9351 0,0046
21 4 0,9032 0,9073 0,0041 0,00455 4,55 6,62
22 4 0,8990 0,9040 0,0050
23 5 0,898 0,9028 0,0048 0,00475 4,75 6,91
24 5 0,8953 0,9000 0,0047
31 6 0,8955 0,9000 0,0045 0,00505 5,05 7,35
32 6 0,9020 0,9076 0,0056
33 7 0,9281 0,9328 0,0047 0,00515 5,15 7,49
34 7 0,9415 0,9471 0,0056
41 8 0,9029 0,9081 0,0052 0,00525 5,25 7,64
114
IQ-2002-2-06
42 8 0,9031 0,9084 0,0053

51 24 0,9008 0,9069 0,0061 0,00565 5,65 8,22
52 24 0,8988 0,9040 0,0052
53 29 0,903 0,9098 0,0068 0,00625 6,25 9,09
54 29 0,9408 0,9465 0,0057
61 33 0,9272 0,9331 0,0059 0,00715 7,15 10,40
62 33 0,9021 0,9105 0,0084
63 48 0,9345 0,9444 0,0099 0,0108 10,8 15,71
64 48 0,8951 0,9068 0,0117
F1 71 0,8976 0,8978 0,0002 0,0002 0,2 0,29

F2 72 0,9346 0,9349 0,0003 0,0003 0,3 0,44
Tabla 53. Cuantificación de Biomasa Fed-Batch Pulso 2R
Peso Peso Peso

Codificación Muestra inicial final Biomasa Promedio Promedio Correccion Vol = 4.8 L
[h] [gr] [gr] [gr] 1mL gr/L gr/L
1 0 0,8985 0,9025 0,004 0,00425 4,25 6,18
2 0 0,8989 0,9034 0,0045
3 1 0,9258 0,9305 0,0047 0,0048 4,8 6,98
4 1 0,9325 0,9374 0,0049
11 2 0,9013 0,9066 0,0053 0,00555 5,55 8,07
12 2 0,8956 0,9014 0,0058
13 4 0,9002 0,9062 0,006 0,006 6 8,73
14 4 0,9015 0,9075 0,006
21 5 0,9292 0,9359 0,0067 0,0075 7,5 10,91
22 5 0,8984 0,9067 0,0083
23 6 0,8998 0,9093 0,0095 0,00885 8,85 12,87
24 6 0,8992 0,9074 0,0082
115
IQ-2002-2-06
31 7 0,9000 0,9092 0,0092 0,0093 9,3 13,53

32 7 0,9034 0,9128 0,0094
33 8 0,8976 0,9074 0,0098 0,00965 9,65 14,04
34 8 0,8954 0,9049 0,0095
41 24 0,9024 0,9112 0,0088 0,00875 8,75 12,73
42 24 0,9287 0,9374 0,0087
43 28 0,9305 0,9397 0,0092 0,0102 10,2 14,84
44 28 0,8976 0,9088 0,0112
51 32 0,9000 0,9101 0,0101 0,0105 10,5 15,27
52 32 0,9327 0,9436 0,0109
53 48 0,9412 0,9536 0,0124 0,01185 11,85 17,24
54 48 0,9070 0,9183 0,0113
71 F1 0,9012 0,9018 0,0006 0,0006 0,6 0,87

72 F1 0,9328 0,9334 0,0006
73 F2 0,8979 0,8987 0,0008 0,00075 0,75 1,09
71 F2 0,9034 0,9041 0,0007
72 F3 0,9289 0,9307 0,0018 0,00175 1,75 2,55
73 F3 0,8979 0,8996 0,0017
116
IQ-2002-2-06
Anexo F
Grafica comparativa de Biomasa Total
1. Fermentaciones Batch
5,00
4,00
Biomasa [gr/L]
Batch 1
3,00
Batch 2
2,00
Batch 3
1,00
0,00
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo [h]
Figura 22. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Batch
2. Fermentaciones Fed-Batch con 1 pulso de sustrato
10,00
8,00
Biomasa [gr/L]
6,00
Pulso 1
4,00
Pulso 1 R
2,00
0,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Tiempo [h]
Figura 23. Grafica Cuantificación de Biomasa Fermentaciones Fed-Batch Pulso 1
117
IQ-2002-2-06
3. Fermentaciones Fed-Batch con 2 pulsos de sustrato
18,00
16,00
14,00
Biomasa [gr/L]
12,00 Pulso 2
10,00
Pulso 2 R
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Tiempo [h]
4. Fermentaciones Fed-Batch con 3 pulsos de sustrato
21,00
18,00
Biomasa [gr/L]
15,00
12,00
9,00 Pulso 3
6,00
3,00
0,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiem po [h]
118
IQ-2002-2-06
Anexo G
Datos Esporulación
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 5 0 0 0 0 0 0 0 0
24 3 6 7 0 4 2 0 0 0
33 I 0 0 I 0 0 60 0 0
Tabla 55. Datos Esporulación Batch 1
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 5 0 0
24 5.33 3 0
33 I I 60
Tabla 56. Promedio Esporulación Batch 1
119
IQ-2002-2-06
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 5 1 3 2 0 0 0 0 0
24 14 5 9 10 5 5 0 1 0
33 I I I 35 I I 7 82 64
Tabla 57. Datos Esporulación Batch 2
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 9 2 0
24 9.33 6.66 1
33 I I 82
Tabla 58 Promedio Esporulación Batch 2
120
IQ-2002-2-06
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0
24 30 8 0 10 12 0 0 1 2
33 I I I I I I 7 2 3
Tabla 59 Datos Esporulación Batch 3
Dilución
1x10-4 1x10-5 1x10-6
Muestra
7 0 0 0
24 30 11 1.5
33 I I 7
Tabla 60. Promedio Esporulación Batch 3
121
IQ-2002-2-06
4. Fermentación Fed-Batch Pulso 1
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 I 5 3 0 4 0 0 0 0
33 15 2 I 0 6 0 0 0 0
49 I I 30 2 I 15 3 0 0
Tabla 61 Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 4 4 0
33 15 6 0
49 I 15 3
Tabla 62 Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1
122
IQ-2002-2-06
5. Fermentación Fed-Batch Pulso 1 Repetición
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 1 0 0 0 0 0 0 0 0
33 18 I 0 0 2 2 7 0 1
42 I I 10 0 8 5 9 13 8
Tabla 63. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 1R
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 1 0 0
33 I 2 7
42 I 6.5 10
Tabla 64. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 1R
123
IQ-2002-2-06
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 0 0 0 0 0 0 0 0 0
32 0 0 0 0 0 0 0 0 0
42 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla 65. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 0 0 0
32 0 0 0
42 0 0 0
Tabla 66. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2
124
IQ-2002-2-06
7. Fermentación Fed-Batch Pulso 2 Repetición
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
29 0 0 7 0 0 1 2 0 1
33 I I 0 0 5 12 11 2 7
48 I I I 10 30 12 29 25 20
Tabla 67. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 2 R
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
29 7 1 1.5
33 I 8.5 9
48 I 17.33 25
Tabla 68. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 2 R
125
IQ-2002-2-06
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
28 0 0 0 1 0 0 0 0 0
38 4 0 10 2 1 0 0 0 0
42 I 0 15 0 3 8 1 0 0
Tabla 69. Datos Esporulación Fed- Batch pulso 3
Dilución
1x10-5 1x10-6 1x10-7
Muestra
42 15 5.5 1
38 30 11 1.5
42 I I 7
Tabla 70. Promedio Esporulación Fed- Batch pulso 3
126
IQ-2002-2-06
127
IQ-2002-2-06
Anexo H
Desempeño de la membrana
Procesos de filtración Volumen Tiempo Flujo Flux Presión

2
Agua [mL] [min] [mL/min] [mL/min*m ] [psi]
Bomba Muestra 1 3,30 1,00 3,30 4,40 3,37
Peristáltica Muestra 2 3,50 1,00 3,50 4,67 3,37
Pequeña Muestra 3 3,40 1,00 3,40 4,53 3,37
Promedio 3,40 1,00 3,4 4,53 3,37
Desviación Estándar 0,1 0 0,1 0,13 0,00
Bomba Muestra 1 500,00 2,10 238,10 317,46 3,37

Peristáltica Muestra 2 500,00 2,29 218,34 291,12 3,37
Grande Muestra 3 500,00 2,21 226,24 301,66 3,37
Promedio 500,00 2,20 227,56 303,41 3,37
Desviación Estándar 0,00 0,10 9,94 13,26 0,00
Tabla 69. Datos filtración agua
128
IQ-2002-2-06
Procesos de filtración Volumen Tiempo Flujo Flux Presión

Cultivo [mL] [min] [mL/min] [mL/min*m2] [psi]
Filtración 1 1A 250 51,93 4,81 6,42 3,37
1B 250 60,28 4,15 5,53 3,37
Filtracion 2 1A 500 48,58 10,30 13,73 3,37
1B 500 56,57 8,84 11,79 3,37
2A 500 50,61 9,88 13,17 3,37
2B 500 52,06 9,60 12,80 3,37
Filtración 3 1A 500 37,61 13,29 17,73 3,37
1B 500 64,59 7,74 10,32 3,37
2A 500 54,69 9,15 12,20 3,37
2B 500 71,56 6,99 9,32 3,37
Filtración 4 1A 500 44,58 11,22 14,96 3,37
1B 500 51,26 9,76 13,01 3,37
2A 500 41,07 12,17 16,23 3,37
2B 500 58,47 8,56 11,41 3,37
Filtración 5 1A 500 48,36 10,34 13,79 3,37
1B 500 53,49 9,35 12,46 3,37
2A 500 59,08 8,46 11,28 3,37
2B 500 65,47 7,64 10,18 3,37
Filtración 6 1A 500 5,12 97,66 130,21 3,37
1B 500 5,41 92,42 123,23 3,37
2A 500 6,19 80,78 107,70 3,37
2B 500 6,51 76,80 102,41 3,37
Filtración 7 1A 500 5 100,00 133,33 3,37
1B 500 4,32 115,74 154,32 3,37
2A 500 5,08 98,43 131,23 4,42
2B 500 7,15 69,93 93,24 4,42
Filtración 8 1A 500 4,05 123,46 164,61 3,37
1B 500 7 71,43 95,24 3,37
2A 500 6,54 76,45 101,94 4,42
2B 500 9,5 52,63 70,18 4,42
Filtración 9 1A 500 4,1 121,95 162,60 3,37
1B 500 5,7 87,72 116,96 3,37
2A 500 9,15 54,64 72,86 4,42
2B 500 15,57 32,11 42,82 4,42
3A 500 24,52 20,39 26,81 5,91
3B 500 60 8,33 11,11 5,91
Tabla 70. Datos filtración cultivo
129
IQ-2002-2-06
Anexo I
Descripción del Biorreactor
1. Descripción del equipo
Bioflo 3000 es un reactor versátil que provee un equipo completo para procesos de
fermentación y sistema de cultivo en un solo paquete. Se puede utilizar para cultivos Batch
o cultivos continuos con un microprocesador de control para pH, DO2, agitación,
temperatura, bombas de alimentación, antiespumante y nivel del tanque.
2. Descripción de vaso
El vaso esta diseñado para trabajar volúmenes de 1.25 a 5.0 Litros, consiste en una tapa de
acero inoxidable, el recipiente esta hecho en vidrio. La tapa superior esta enchaquetada para
la recirculación a temperatura controlada. El recipiente esta provisto de 4 puertos hechos en
polipropileno en la pared del recipiente en vidrio para la adición de antiespumante y
nutrientes; y para estudios en continuo, en la tapa hay puertos de entrada para: la
inoculación, adición de ácido y base, detección de temperatura, probeta para antiespumante,
para el difusor, saca muestras, condensador, oxigeno disuelto y electrodo de pH.
130
IQ-2002-2-06
3. Sistema de agitación
Posee un motor removible de corriente directa localizado en la parte de arriba del reactor,
este esta conectado al sistema de agitación con un acople (multi-jaw). Puede ser
desconectado mientras se esta auto clavando y remplazado después de la esterilización. El
motor provee un rango de agitación de 50 hasta 1200 rpm.
4. Control de temperatura:
La temperatura del cultivo se puede seleccionar entre un rango de –5ºC hasta 80ºC (±0.1ºC)
y es controlado mediante un microprocesador basado en un controlador. El sensor de
temperatura es RTD (Resístanse Temperature Detector) sumergido en la termocupla.
5. Aeración
El aire y el oxigeno se pueden introducir al medio mediante el difusor de anillo con
agujeros y la taza de flujo es controlado mediante una válvula de aguja localizada en la
parte derecha de la cabina del controlador.
El porcentaje de oxigeno es introducido en el medio y se puede determinar manualmente
por el usuario, para cultivos de alta densidad, se puede aplicar hasta el 100 % de oxigeno.
6. Control de pH
131
IQ-2002-2-06
El pH es controlado en un rango de 2.00-12.00 (±0.001). El sensor de pH tiene un electrodo
de vidrio. El controlador se lleva a cabo mediante un controlador (PID), el cual opera con
dos bombas peristálticas conectados a los dos puertos para el ácido y la base.
7. Controlador de Oxigeno Disuelto
Para el control del oxigeno disuelto existen dos métodos, uno es mediante el flujo
automático de aire y el otro es mediante un flujo manual de aire. Este se puede controlar en
un rango de 5-95% (±1%). Si el oxigeno disuelto es sensado por el electrodo de oxigeno
disuelto y el control se mantiene mediante un regulador PID, el cual puede cambiar con la
velocidad de agitación y el porcentaje de oxigeno en el flujo de aire.
8. Control de antiespumante
La espuma es controlada durante las fermentaciones Batch mediante una probeta de
antiespumante, la cual esta localizada en el plato superior. El controlador opera en la
adición del antiespumante mediante una bomba la cual adiciona antiespumante químico
dentro del vaso.
9. Sistema de salida de gases
132
IQ-2002-2-06
Los gases de salida pasan por un condensador externo el cual remueve l humedad y luego
son recirculados al tanque. El aire sobrante pasa por un filtro de 2 µm.
10. Sistema de muestreo
Sistema I
Este sistema tiene un dispositivo el cual esta adherido a tubo de muestra hasta la parte mas
baja del vaso. Este dispositivo esta provisto de una bomba (pera de caucho) de succión el
cual facilita la recolección de muestra sin contaminar.
Sistema II
Este sistema consiste en una línea e muestreo conectada a una bomba peristáltica, el cual
puede ser operarse desde la bomba modelo de operación.
133
IQ-2002-2-06
Especificaciones
Volumen Total 6.6 Litros
Vaso
Volumen de Trabajo 5 Litros
Indicación Tablero Digital en unidades de 0.1ºC
Rango 4ºC hasta 80ºC (±0.1ºC)
Temperatura Control PID con calentador PWM y agua de
enfriamiento
Sensor RTD de platino
Tipo Motor DC permanente
Rango 50-1200 rpm
Sensor disco óptico fotoplástico 1000 lineas/rev
Agitación
Control Microprocesador PID
Impelers 6 impulsores de aspas de turbinas
Indicación Tablero Digital en unidades de 1 rpm
Filtro 2 µm cartucho intercambiable
Condensador
Condensador Acero inoxidable localizado en plato superior
Sistema 2-Gas Aire-O2 distribuido en el difusor
Flujometro 0-10 SLPM Flujometro de masa
Aireación
Difusor Difusor de anillo
Filtro Interno 2 µm cartucho intercambiable
Indicación Tablero Digital en unidades de 0.01 pH
Rango 2-12 pH
pH
Control PID
Probeta pH Ingold
Indicación Tablero Digital en unidades de 0.1%
Oxigeno Rango 0-200 %
disuelto Probeta Ingold Polarogrico
Control PID
Voltaje Universal 240-1000V
134
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Tabla 71. Especificaciones del Biorreactor
Figura 26. Partes del Biorreactor
135
IQ-2002-2-06
Partes del Reactor

Numeración Descripción
1 4 Puertos de proceso en Polipropileno
2 Vaso en Vidrio
3 Tubo ajustable de alimentación
4 Entra y salida de agua
5 Conectores
6 Chaqueta hemisférica de agua en Acero Inox.
7 Difusor en forma de disco
8 4 Bafles
9 Impellers
10 Puertos para el control de pH
11 Motor
Tabla 72 Partes del Biorreactor
Anexo J
136
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Membrana de flujo tangencial
137
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138
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139
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Anexo K
Descripción Bomba Peristáltica
1. Descripción del equipo
La bomba de velocidad variable MANOSTAT permiten el bombeo continuo de fluidos
mientras la corriente esta conectada. Las bombas de 115 V están homologadas por UL y
cUL. La gama de velocidad de las bombas para el modelo es de 24-720 rpm.
Modelo No: 72-310-000
Descripción: SIMON potenciómetro de velocidad analógico, 115V.
2. Controles
a. Interruptor de Alimentación: (encendido o apagado), Enciende o apaga la unidad,
tiene un brillo verde cuando la corriente esta encendida.
b. Perilla de control de velocidad de flujo: Fija la velocidad de la bomba. Cuando
mayor sea el numero seleccionado, mayor será la velocidad de la bomba.
c. Interruptor de sentido de flujo: Fija el sentido de giro de la bomba hacia la
derecha/apagada/hacia la izquierda.
140
IQ-2002-2-06
Figura 27. Partes bomba peristáltica
Especificaciones
Velocidad 24-720 rpm

Salida
Par 8.6 Kg*cm
Entrada Voltaje 100-130 VCA, 60 Hz, 1.3 A
Temp. De operación 0 a 40ºC
Temp. De Almacenamiento -45 a 65ºC
Ambiente Humedad 10% a 90% sin condensación
Altitud Menos de 2000 m
Nivel de contaminación Nivel 2 según IEC 664
Dimensiones (LxAxH) 30.5 cm x 22.9 cm x 15.2 cm
Peso 6.8 Kg
Construcción
Color Negro
Material Caja de acero pintada
Tabla 73. Especificaciones Bomba peristáltica
141
IQ-2002-2-06
Anexo L
Procedimiento de limpieza para la Membrana de filtración
Agua destilada y autoclavada
Para
destapar
Hipoclorito 2 ppm
Agua destilada y autoclavada
NaOH 0.1 N en 1 L de Agua Recircular por

30 min
Hasta un
Agua destilada y autoclavada pH neutro
Formaldehído 1 % N Mínimo 1
noche
Para
Agua destilada y autoclavada desinfectar
Figura 28. Procedimiento de limpieza para la membrana
142
IQ-2002-2-06
Anexo M
Equipos
Figura 29. Horno Figura 30. Cámara de flujo laminar
Figura 31. Centrifuga para epphendors

Figura 32. Balanza de Precisión
143
IQ-2002-2-06
Figura 33. Desecador Figura 34. Equipo Electroforesis.
Figura 35.Bomba peristáltica Figura 35. Espectrofotómeto
144
IQ-2002-2-06
128

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PRODUCCIÓN DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON

MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL

MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

SANTAFE DE BOGOTA, D.C

POR LA METODOLOGÍA EN FED-BATCH DISCONTINUO CON

MEMBRANA DE FLUJO TANGENCIAL

MARIA ALEJANDRA DELGADO ORTEGA

Propuesta de Proyecto de Grado para optar el titulo en Ingeniero Químico.

ANDRES FERNANDO GONZALEZ BARRIOS

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

SANTAFE DE BOGOTA, D.C

A Andrés Fernando González, por su colaboración.

A todo el personal del CITEC, en especial a José Maria Robles.

A Fernando Andrade, Representante de Purificación y Análisis.

A Amparo Forero, Directora de proyecto biopesticidas, VECOL.

Por su apoyo incondicional

4. MODELO CINÉTICO PARA EL CRECIMIENTO DE

6. PRODUCTOS BIOINSECTICIDAS A BASE DE Bacillus thuringiensis 38

10. ANÁLISIS DE RESULTADOS 72

Tabla 1. Diferentes estudios para la producción de B. thuringiensis 13

Figura 1. Esquema General de filtración Tangencial 33

Anexo A. Composición medio de cultivo liquido 86

químicos se ha ido incrementado día a día y la reducción en la aplicación de estos

productos en la agricultura es cada vez más notable. Los productos agroquímicos no

agricultura más biológica y menos dañina para el medio ambiente.

En el control integrado de plagas se trabaja de forma directa y preventiva. Una de estas

opciones es el control biológico, donde el empleo de microorganismos o sus productos

En Colombia, el sector agrícola ha sido muy importante en el desarrollo económico del

afectan las diferentes clases de cultivos, lo implica una reducción en el nivel de la

productos químicos existentes en el mercado. Esta tecnología busca incrementar la

lograr un gran espectro de eficacia.

Bacillus thuringiensis es uno de los microorganismos más utilizados en todo el mundo

ampliamente industrializada y comercializada en el control biológico agrícola; por su alta

especificidad, estabilidad, biodegrabilidad, de actividad rápida y no siendo tóxica para

cantidad de producto en menos tiempo.

El propósito de este proyecto es desarrollar y evaluar un nuevo proceso para la producción

llevo a cabo la implementación de un biorreactor con membrana de flujo tangencial.

activo, en este caso la toxina.

Se a encontrado en los diferentes estudios para subespecies diferentes a kurstaki, una

mayor productividad de toxina, utilizando retención parcial de células, y cultivos continuos

Cultivos Fed-Batch (Discontinuos y Continuos), llegando a la conclusión que sistemas Fed-

thuringiensis subesp kurstaki.

Con el uso de la tecnología de una membrana de flujo tangencial, se quiere desarrollar a

nivel de planta piloto, un proceso de ultrafiltración con retención total de células en la

fermentación. Dicho proceso favorecerá el crecimiento del microorganismo al retirar los

metabolitos secundarios, que según otros estudios realizados inhiben el crecimiento; y en

disminución del tiempo total durante el proceso.

para un posible estudio de escalado en la producción a nivel Industrial de Bacillus

thuringiensis subesp kurstaki. Evaluando el rendimiento obtenido en el proceso Fed-Batch

Discontinuo con membrana de flujo tangencial.

Biológicas (CIB) Medellín, Col, es el de implementar un proceso para la producción de

membrana de flujo tangencial

• Aumentar el rendimiento para la Producción de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki

por medio de un sistema de Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo tangencial.

• Implementar un biorreactor con una membrana de flujo tangencial y evaluar su