Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud Universidad de Sonora

“El saber de mis hijos hará

http://biotecnia.unison.mx mi grandeza”

Inhibición de lipasa pancreática por flavonoides: importancia del doble

enlace C2=C3 y la estructura plana del anillo C
Inhibition of pancreatic lipase by flavonoids: relevance of the C2=C3 double bond and C-ring planarity

Alejandra Isabel Martinez-Gonzaleza, Ángel Gabriel Díaz-Sáncheza, Laura Alejandra de la Rosaa, Ismael Bustos-
Jaimesb, Alma A. Vazquez-Floresa, Emilio Alvarez-Parrillaa,*
a
Departamento de Ciencias Químico Biológicas, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez,
Ciudad Juárez 32310, México.
b
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, CDMX 04510, México.

RESUMEN with the extrinsic fluorescence analysis. Molecular docking

Lipasa pancreática es una enzima clave en el metabo- studies indicated that the interaction between pancreatic
lismo de lípidos. Los flavonoides son compuestos bioactivos lipase and flavonoids was mainly through hydrophobic
de gran relevancia debido a sus interacciones con enzimas interactions (pi-stacking). The interactions of all flavonoids,
digestivas. Se evaluó la actividad de lipasa pancreática en except rutin, occurred at the same enzyme site (subsite
presencia de flavonoides. Mediante espectroscopía UV- 1). Instauration between C2 and C3 was decisive for the
Visible se determinó que el mejor inhibidor fue quercetina, arrangement of flavonoids with the enzyme, mainly due to
seguido de rutina > luteolina > catequina > hesperetina, pi-stacking interactions.
con valores de IC50 de 10.30, 13.50, 14.70, 28.50 y 30.50 µM, Keywords: Pancreatic lipase, flavonoid, planarity, binding
respectivamente. Todos los flavonoides mostraron una inhi- site.
bición mixta, excepto catequina que mostró una inhibición
acompetitiva. La capacidad inhibitoria de los flavonoides se INTRODUCCIÓN
relacionó con propiedades estructurales compartidas entre Los flavonoides, el grupo más amplio de polifenoles,
los distintos flavonoides, como la hidroxilación en las posicio- han sido ampliamente estudiados por su actividad antioxi-
nes C5, C7 (anillo A), C2’ y C3’ (anillo B), y el doble enlace entre dante, antimicrobiana, antiinflamatoria, entre otras activi-
C2 y C3 (anillo C). Los resultados de inhibición coincidieron dades biológicas (Li et al., 2014; Calabrone et al., 2015). En
con el análisis de la fluorescencia extrínseca. Los estudios de años recientes se ha estudiado su interacción con proteínas,
docking molecular indicaron que la interacción entre lipasa como las enzimas digestivas para evaluar su posible uso en
pancreática y los flavonoides fue principalmente mediante el control de la obesidad y diabetes (Li et al., 2011; Zeng et
interacciones hidrofóbicas (pi-stacking). Las interacciones de al., 2015; Martinez-Gonzalez et al., 2017, 2019). La inhibición
todos los flavonoides, excepto rutina, se dieron en el mismo de enzimas digestivas está relacionada con la elevada afi-
sitio (subsitio 1) de la enzima. La insaturación entre C2 y C3 nidad de los flavonoides de interaccionar con las cadenas
fue determinante para el acomodo de los flavonoides con la polipeptídicas, generando interacciones no covalentes con
enzima, principalmente por interacciones de pi-stacking. la enzima. En donde, la estructura de los flavonoides ha sido
Palabras clave: Lipasa pancreática, flavonoide, estructura señalada como una de las responsables de esta interacción
plana, sitio de unión. enzima-ligando (Gonzales et al., 2015).
Los flavonoides derivados del 2-fenil-benzo-γ-pirano
ABSTRACT tienen una estructura común de dos anillos aromáticos (de-
Pancreatic lipase is a key enzyme in lipid metabolism. nominados “A” y “B”), unidos por un anillo heterocíclico central
Flavonoids are bioactive compounds obtained from vegeta- (anillo “C”) (Figura 1) (Harborne, 1964; Ribeiro et al., 2015). Exis-
bles with big relevance, due to their intrinsic interaction with ten aproximadamente 4,000 diferentes compuestos miembros
digestive enzymes. Pancreatic lipase activity was evaluated de esta familia (Huang et al., 2009) y sus variaciones dependen
in the presence of flavonoids, through UV-Vis spectroscopy. principalmente del grado de oxidación del anillo C (Rawel et
All tested flavonoids showed a mixed-type inhibition, except al., 2002). Se pueden encontrar distintas clasificaciones de los
catechin, which showed a uncompetitive inhibition. The flavonoides. De manera sencilla, se pueden clasificar en dos
best inhibitor was quercetin followed by rutin > luteolin > grandes categorías, dependiendo de la presencia o ausencia
catechin > hesperetin, with IC50 values of 10.30, 13.50, 14.70, del grupo hidroxilo en la posición C3, y se nombran como
28.50 and 30.50 µM, respectively. The flavonoids inhibitory 3-hidroxiflavonoides y 3-desoxiflavonoides, respectivamente.
capacity was related to structural properties shared between Estos dos grupos se pueden dividir dependiendo de las sus-
the different flavonoids, such as the hydroxylation at C5, C7 tituciones en otras posiciones de los anillos. Las principales
(ring A), C2’ and C3’ (ring B), and the double bond between subfamilias de flavonoides son las flavanonas, las flavonas, los
C2 and C3 (ring C). The inhibition results are in agreement flavonoles, y los flavan-3-oles o flavanoles (Erlund, 2004; Gon-

Volumen XXII, Número 2 *Autor para correspondencia: Dr. Emilio Álvarez-Parrilla

50 Correo electrónico: ealvarez@uacj.mx
Recibido: 01 de agosto de 2019
Aceptado: 19 de diciembre de 2019
 Martinez-Gonzalez et al: Inhibición de lipasa pancreática por flavonoides / XXII (2): 50-60 (2020)

zales et al., 2015) (Figura 1). De esta forma, las subfamilias de El análisis de la unión de estos flavonoides con enzi-
flavonoides presentan diferencias estructurales, en el número mas digestivas podría ayudar a elucidar un mecanismo de
y tipo de sustituyentes, en la presencia de dobles enlaces, inhibición. La inhibición reversible de enzimas como lipasa
entre otras (Martinez-Gonzalez et al., 2017b). Los flavonoides pancreática, podría ser parte de un tratamiento alternativo
pueden tener glicosilaciones (u otras sustituciones como para enfermedades no transmisibles como la obesidad
metilaciones) como sustituyentes de los anillos. No obstante, (Buchholz y Melzig, 2015). La lipasa pancreática es la enzima
la flexibilidad conformacional del flavonoide depende de la encargada de hidrolizar alrededor del 70 % de los triglicé-
estructura de los anillos B y C (Amat et al., 2008), la estructura ridos ingeridos por el ser humano (Birari y Bhutani, 2007).
plana del anillo C y las sustituciones en los diferentes anillos, La disminución de su actividad enzimática por inhibidores
son al parecer las principales características señaladas para la reversibles, como los polifenoles, es objeto de estudio ya que
interacción con enzimas como las digestivas (Gonzales et al., podrían eliminar los efectos secundarios de un inhibidor no
2015). reversible (Sakulnarmrat y Konczak, 2012). Se ha reportado
En la Figura 1 se presentan las estructuras de algunos una actividad inhibitoria en valores de IC50 (concentración
subgrupos de flavonoides. Se muestran las sustituciones o del ligando a la cual se inhibe la mitad de la actividad enzi-
modificaciones estructurales correspondientes, tales como mática), más eficiente para flavonoides como la quercetina,
la carencia del grupo hidroxilo en el carbono 3 (C3) para la en comparación con ácidos fenólicos como el ácido caféico
flavona luteolina (LUT, Figura 1a), a diferencia del flavonol (Martinez-Gonzalez et al., 2017a). Extractos vegetales ricos
quercetina (QUE) que cuenta con este grupo hidroxilo; o en flavonoides como QUE han sido evaluados por su elevada
la presencia de una glicosilación en esta posición para el actividad inhibitoria frente a lipasa (Sakulnarmrat y Konc-
flavonol glicosilado, rutina (RUT). Mientras que en la Figura zak, 2012), pero no se les había asociado con su estructura.
1b se muestra la estructura del flavanol catequina (CAT) que Comparar a la quercetina con flavonoides de estructura
carece del doble enlace entre el C2 y C3 en el anillo C. La similar, podría permitir elucidar el mecanismo de inhibición
flavanona hesperetina (HES) carece también de este doble de estos flavonoides que cuentan con insaturación C2=C3.
enlace (Figura 1c), pero a diferencia de los otros flavonoides, Analizar el efecto de la inhibición de la lipasa por parte de los
presenta en su estructura un grupo metoxi en el C4’ (anillo flavonoides por sus interacciones con los sitios hidrofóbicos
B). Así, estas estructuras presentan diferencias importantes de unión de la enzima, considerando que el sitio de unión
como la presencia del doble enlace entre el C2 y el C3 del del sustrato es hidrofóbico, permitiría elucidar la relevancia
anillo C, la sustitución en el C3 por un grupo hidroxilo o una de los aspectos estructurales de los flavonoides importantes
glicosilación, y la presencia de un grupo metoxi en el C4’, para la unión con la enzima y su consecuente inhibición.
que son características estructurales que han sido señaladas En este sentido, en el presente estudio se pretende evaluar
relevantes para su interacción con otras proteínas como las el efecto de diferentes substituciones en los anillos de los
de la leche (Gonzales et al., 2015)2015. Sin embargo, aspec- flavonoides, como el doble enlace entre C2 y C3 (anillo C),
tos como la estructura plana del anillo C, otorgada por el sobre sus interacciones con lipasa pancreática y como afec-
doble enlace C2=C3 no ha sido completamente evaluado. tan estas interacciones en la actividad enzimática de la lipasa
La importancia de esta característica ha sido valorada para pancreática.
otras proteínas como las del factor de crecimiento endotelial
vascular (Cerezo et al., 2015).

Figura 1. Estructura química de los flavonoides evaluados.

Luteolina (LUT), Quercetina (QUE) y Rutina (RUT) se muestran
en una misma estructura (Figura 1a), se diferencian en el
sustituyente en el C3 del anillo C. El grupo R de LUT es un
H, para QUE R=OH, y RUT el grupo R corresponde a un
rutinósido. La CAT y HES se muestran en las estructuras (b) y
(c), respectivamente.
Figure 1. Chemical structure of evaluated flavonoids. The
same structure (Figure 1a) was employed to show Lutein
(LUT), Quercetin (QUE) and Rutin (RUT), and their differences
are due to the substitution at C3 position. The radical group
(R) of LUT is a hydrogen, whereas a hydroxyl and a rutinoside
are the R groups for QUE and RUT. CAT and HES are shown,
(b) and (c) respectively.

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MATERIALES Y MÉTODOS al complejo enzima-sustrato, respectivamente, fueron calcu-

Materiales ladas mediante las ecuaciones 3 y 4 (Tipton, 1996).
La lipasa pancreática porcina tipo II, p-nitrofenil laura-
to (pNPL), Tris, Triton X-100, ácido clorhídrico, acetato de so- 𝐾𝐾𝑀𝑀 · (1 +
[𝐼𝐼]
)
Ecuación 3. 𝐾𝐾𝑀𝑀 𝐾𝐾𝑖𝑖
dio, reactivo de Bradford, albúmina sérica bovina (BSA), ácido =
𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ′ 𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
1-anilino-8-naftalenosulfónico (ANS), y los flavonoides o
ligandos: Luteolina (LUT), Quercetina (QUE), Catequina (CAT),
Hesperetina (HES) y Rutina (RUT) fueron adquiridos de Sigma 𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
Aldrich Co. (Control Técnico y Representaciones, CTR, S.A. de Ecuación 4. . 𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ′ = [𝐼𝐼]
(1+ )
C.V., Nuevo León, México). Etanol y metanol se adquirieron 𝐾𝐾𝑖𝑖
de J.T. Baker (CTR, Nuevo León, México). Todos los reactivos
fueron de pureza grado reactivo o superior. Donde vmax’ y KM’ corresponden a los valores obtenidos
en presencia de los inhibidores, y la concentración del inhibi-
Análisis de la actividad enzimática de lipasa pancreática dor (flavonoide) se representa con [I].
La inhibición de la actividad de la enzima lipasa
pancreática se realizó de acuerdo a Martinez-Gonzalez et al. Ensayo de la fluorescencia extrínseca del ANS
(2017a). La lipasa se disolvió en una disolución amortigua- La posible unión de los flavonoides en sitios
dora Tris 20 mM (pH = 7.2), a una concentración final de 2.0 hidrofóbicos de lipasa pancreática, se evaluó de acuerdo a
mg/mL. La concentración de la proteína se determinó por el Martinez-Gonzalez et al. (2019) con algunas modificaciones.
método Bradford, empleando una disolución de 1 mg/mL de Se midió la intensidad de la fluorescencia (IF) emitida por una
albúmina de suero bovina (BSA) como disolución estándar, disolución de lipasa pancreática 0.05 mg/mL (Tris 200 mM pH
midiendo la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro 8.2) con ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (ANS) 150 µM
UV-Vis (Agilent 8453 HP G1103A; Agilent Technologies, Santa en un espectrofluorómetro (Shimadzu RF-5301, Shimadzu
Clara, California, Estados Unidos de América). El sustrato, Corporation, Kioto, Japón). Se monitoreó la IF a λex de 380 nm
pNPL, se disolvió (0.08 % de relación masa volumen) en ace- y λem de 400 a 700 nm a 37 °C durante 900 s, en una celda de
tato de sodio 5 mM (pH = 5.0, Triton X-100 al 1 %) para tener cuarzo de 1 cm. Se tituló a diferentes concentraciones de los
concentraciones finales de 11.7-124.2 µM. Los flavonoides se flavonoides (hasta 300 µM), midiendo la IF en el máximo de
emisión (519 nm) y se realizaron las correcciones del cambio
disolvieron en metanol a una concentración final de 12.5, 25
de volumen y efectos del filtro interno.
y 50 µM. Por problemas de solubilidad, la quercetina se disol-
Se calculó el valor de la constante aparente de diso-
vió en etanol a las mismas concentraciones. El ensayo se llevó
ciación KD para el complejo enzima-ANS, en presencia de los
a cabo en la disolución amortiguadora Tris 200 mM (pH = 8.2),
ligandos, empleando la Ecuación 5.
de acuerdo a Martinez-Gonzalez et al. (2017a), y la reacción
se midió a 400 nm durante 1000 s a 37 °C en un espectrofo-
tómetro de UV-Visible (Agilent 8453 HP UV-Vis spectrometer 𝛥𝛥𝛥𝛥𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 · [𝐼𝐼]
Ecuación 5 ΔFI =
G1103, Agilent Technologies, Santa Clara, E.U.A.). Todas las 𝐾𝐾𝐷𝐷 + [𝐼𝐼]
muestras se midieron por triplicado. Además se determinó
el porcentaje de inhibición para cada uno de los ligandos a Donde ΔFI es el cambio en la intensidad de la fluores-
partir de medición realizada al término de la cinética (1000 s) cencia a 340 nm (F0-F); ΔFmax es el máximo valor de ΔFI; y KD
(Dalar y Konczak, 2013), así como el valor de IC50 a partir de un (Ecuación 5) corresponde al valor de la constante aparente
gráfico de porcentaje de inhibición frente a concentración de de disociación para la unión entre la enzima y el ANS.
sustrato. A partir de los valores cinéticos (velocidad inicial, v0)
se calcularon los valores de velocidad máxima (vmax) y cons- Docking molecular
tante de Michaelis-Menten (KM), ajustando los valores de v0 a El posible sitio de unión de los flavonoides en la pro-
las diferentes concentraciones de inhibidor y de sustrato a la teína se analizó mediante el software USCF-Chimera v. 4 con
ecuación de Michaelis-Menten (análisis no lineal, Ecuación 1), AutoDock Vina (Estados Unidos de América), de acuerdo a
y la ecuación de Lineweaver-Burk (análisis lineal, Ecuación 2) Martinez-Gonzalez et al. (2019). Se emplearon las estructuras
con el programa GraphPad Prism v. 5 (GraphPad Software). tridimensionales del cristal de lipasa pancreática (Código
𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ∙ [𝑆𝑆] 1ETH.pdb) y de los ligandos: luteolina, quercetina, catequi-
Ecuación 1. 𝑣𝑣0 = na, hesperetina y rutina obtenidos de la base de datos de
𝐾𝐾𝑀𝑀 + [𝑆𝑆]
PubChem (Estados Unidos de América) y minimizados con
1 1 𝐾𝐾𝑀𝑀 el software PyMOL v. 13 (Estados Unidos de América). Las
Ecuación 2. . = 𝑣𝑣 + estructuras de los ligandos se consideraron como flexibles y
𝑣𝑣0 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑣𝑣𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 ·[𝑆𝑆]
la estructura de la proteína como fija, para obtener valores de
energía de unión (cambio en la entalpía, ΔH y energía libre
Las constantes de inhibición para una inhibición de Gibbs, ΔG) y determinar el mejor modelo para la posible
reversible mixta Ki y Ki’ correspondientes a la enzima libre y unión entre la proteína y el ligando.

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RESULTADOS Y DISCUSIONES esta característica estructural para su unión con proteínas ha

Estudios de inhibición enzimática de flavonoides frente sido previamente reportada (Tadera et al., 2006; Proença et
a lipasa al., 2017; Martinez-Gonzalez et al., 2019).
La actividad enzimática de lipasa pancreática fue La RUT se comportó de manera similar a QUE, pro-
evaluada en presencia de distintas concentraciones de los bablemente debido a la similitud estructural entre ambas
flavonoides. En la Figura 2 se muestra la actividad de la lipasa moléculas, ya que RUT es el flavonol QUE glicosilado con el
pancreática en presencia de distintas concentraciones de disacárido rutinósido en posición C3. Otros autores tampoco
flavonoides con la enzima (valores de V0). El control presentó han observado diferencias significativas para la inhibición de
diferencias estadísticas significativas respecto a todos los lipasa pancreática entre flavonoides glicosilados y sin glico-
flavonoides (p < 0.05) es decir, todos los ligandos disminu- silación, como la QUE y QUE-arabinósido (Zhang et al., 2015).
yeron la actividad enzimática. En esta figura, se observa que Se ha señalado que aunque estos compuestos glicosilados,
el efecto inhibitorio de CAT y HES fue menor que la de los de mayor tamaño que sus respectivas agliconas, no se pudie-
demás flavonoides analizados. Estos compuestos (CAT y HES) ran acomodar en un sitio de unión, el aumento en el número
comparten similitudes estructurales, como la carencia del de grupos hidroxilo por la glicosilación, les permitiría formar
doble enlace entre C2 y C3. Este doble enlace al parecer es un mayor número de puentes de hidrógeno con la lipasa (Li
esencial para el acomodo de los flavonoides en su sitio de et al., 2011).
unión en la proteína. Resultados similares se observaron A partir del análisis lineal (Lineweaver-Burk; datos no
con la α-amilasa, en donde LUT y QUE que presentan este mostrados) y no lineal (Figura 2) se calcularon los parámetros
doble enlace, presentaron una mejor capacidad inhibitoria cinéticos para cada uno de los flavonoides (Tabla 1). Del
(Martinez-Gonzalez et al., 2019). La estructura plana del ani- análisis de esta tabla, se observó que su capacidad inhibitoria
llo C, debido a la presencia de este doble enlace, aumenta disminuyó en el siguiente orden: QUE > RUT > LUT > CAT >
la capacidad inhibitoria de los flavonoides (Lo Piparo et al., HES. Los valores calculados de IC50 respaldarían esta aseve-
2008). Estos resultados son similares a los previamente repor- ración, ya que estos fueron 10.30 ± 2.45, 13.50 ± 0.70, 14.70
tados de una mayor inhibición de lipasa pancreática para el ± 0.90, 28.50 ± 1.05, y 30.50 ± 2.10, respectivamente. Estos
flavonoide QUE (Martinez-Gonzalez et al., 2017). Esta mayor valores coinciden en que CAT y HES fueron los inhibidores
inhibición puede explicarse considerando la estructura plana con menor eficiencia frente a lipasa. QUE, RUT y LUT com-
del anillo C del flavonol QUE y de la flavona LUT, mismo que parten la estructura de catecol en el anillo B (hidroxilaciones
les confiere una mayor capacidad para interaccionar con la en las posiciones C2’ y C3’), que ya había sido señalada para
cadena polipeptídica. La menor inhibición por parte de CAT la inhibición de enzimas como la α-amilasa y α-glucosidasa
y HES se explica por una ausencia de este doble enlace en su (Gonzales et al., 2015).
estructura y es similar a lo reportado para la inhibición de la El tipo de inhibición se determinó por el cálculo de
α-amilasa (Martinez-Gonzalez et al., 2019). La relevancia de los parámetros cinéticos Vmax y KM (Tabla 1), y el análisis de
Lineweaver-Burk (datos no mostrados). Para la mayoría de los
flavonoides, se observó una disminución estadísticamente
significativa del valor de Vmax y un aumento en el valor de
la KM, esto indicó que fueron inhibidores reversibles mixtos.
Para CAT se observó una inhibición acompetitiva, en donde
el flavonoide sólo tendría preferencia por la unión con el
complejo enzima-sustrato. Este flavonoide no se uniría como
LUT y QUE (menor valor de IC50 que estos). La capacidad inhi-
bitoria de la CAT se puede atribuir a la carencia del grupo oxo
en el C4 y el doble enlace (C2 = C3) que disminuye su afinidad
por la enzima libre. Se ha descrito que la presencia del grupo
oxo en el C4 aumenta las interacciones de los flavonoides
Figura 2. Efecto de los flavonoides Hesperetina (HES), Luteolina (LUT), (por ejemplo QUE) frente a diferentes proteínas como el
Quercetina (QUE), Catequina (CAT), y Rutina (RUT) (25 µM) sobre la hidró- factor de crecimiento endotelial vascular (Cerezo et al., 2015).
lisis del pNPL catalizada por lipasa. Los símbolos representan los valores Los valores de las constantes de inhibición Ki y Ki’
de velocidad inicial (V0) expresada como µM s-1 ± desviación estándar.
Las líneas representan el ajuste no lineal de Michaelis-Menten a los datos
(Tabla 1), muestran que el componente competitivo de la
experimentales. Los asteriscos representan diferencias estadísticas entre los inhibición mixta fue predominante (Ki < Ki’). Algunos de estos
tratamientos respecto al control (Análisis de la diferencia mínima significati- flavonoides, como QUE y RUT, ya han sido reportados como
va de Fisher, p < 0.05). inhibidores mixtos de la actividad de lipasa (Li et al., 2011;
Figure 2. Effect of the flavonoids Hesperetin (HES), Lutein (LUT), Quercetin
(QUE), Catechin (CAT) y Rutin (RUT) (25 µM) on pNPL hydrolysis catalyzed
Martinez-Gonzalez et al., 2017a). Estos flavonoides podrían
by pancreatic lipase. Symbols represent the initial velocity (V0) values ejercer desde un mismo sitio de unión su efecto competitivo
expressed as µM s-1 ± standard deviation. Lines are the Michaelis-Menten y no competitivo de la inhibición. De acuerdo con cálculos del
curves fitted to the experimental data. * Statistical difference (Fisher’s Least coeficiente de Hill (ɳ), en ausencia y presencia de los ligandos,
Significant Difference, LSD, p < 0.05) between all treatments respect to
control.
que fue de aproximadamente 1.00 (datos no mostrados), se

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Tabla 1. Valores de los parámetros cinéticos, Vmax, KM, Ki y Ki′, así como el tipo de inhibición observada para la actividad de lipasa sobre el sustrato pNPL en
presencia de los flavonoides.
Table 1. Kinetic parameters, Vmax, KM, Ki y Ki′, and inhibition type determined for pancreatic lipase activity with pNPL as substrate in presence of the evaluated
flavonoids.
Ligando Concentración (μM) Vmax (·10-4 mM min-1) KM Tipo de Inhibición Ki and Ki′
(mM) (mM)

CONTROL 0.00 0.07 ± 0.03a 2.05 ± 0.80e Ninguno 0.00 0.00

12.60 0.07 ± 0.00a 3.27 ± 0.35e

HES 25.00 0.05 ± 0.01a 3.54 ± 0.22e Mixto 17.82 ± 1.06a 25.10 ± 3.02a

50.00 0.03 ± 0.00b 9.87 ± 1.14d

12.67 0.03 ± 0.00b 3.23 ± 0.60e

LUT 25.35 0.02 ± 0.00c 32.64 ± 3.10b Mixto 11.00 ± 1.30b 19.50 ± 2.90b
50.00 0.02 ± 0.01bc 40.54 ± 3.02a

12.51 0.03 ± 0.00b 2.41 ± 0.50e

QUE 24.83 0.03 ± 0.00 b
28.93 ± 1.00b Mixto 8.90 ± 0.65c 15.70 ± 4.00b
49.66 0.02 ± 0.01bc 30.03 ± 1.08b
12.32 0.05 ± 0.01a 1.87 ± 0.05e
CAT 24.45 0.03 ± 0.01ab 1.25 ± 0.00f Acompetitivo n.d. n.d.
50.00 0.03 ± 0.00b 1.03 ± 0.01g

12.84 0.04 ± 0.21a 10.36 ± 0.71d

RUT 25.57 0.02 ± 0.01bc 11.15 ± 0.09d Mixto 10.63 ± 2.00bc 16.40 ± 0.80b

50.00 0.01 ± 0.00c 14.14 ± 1.35c

Los datos son representados como media ± desviación estándar de los análisis realizados por triplicado. Las diferentes letras en una columna representan las
diferencias significativas (Análisis de la diferencia mínima significativa de Fisher, p < 0.05), n.d. significa no determinado. HES, Hesperetina, LUT, Luteolina, QUE,
Quercetina, CAT, Catequina, RUT, Rutina.
Values are mean ± standard deviation of triplicate analysis. Different letters in columns represent significant differences (Fisher, p < 0.05), n.d. not determined.
HES, Hesperetin, LUT, Lutein, QUE, Quercetin, CAT, Catechin, RUT, Rutin.

concluye que existe un sólo sitio de unión para el sustrato. Además, QUE mostró un desplazamiento batocrómi-
Resultados similares de coeficiente de Hill (ɳ igual a 1.00) han co (16 nm), que correspondería a un aumento en la polaridad
sido reportados para flavonoides como LUT y genisteína con alrededor del ANS, explicado por el desplazamiento de esta
proteínas humanas, como quinasas de tirosina (Kuhnert et molécula de la región apolar de la enzima hacia el exterior
al., 2011). Esto podría indicar que los ligandos, aunque im- de la proteína más polar (Lee et al., 2014). La disminución en
pidieran el ingreso del sustrato al sitio activo (competitivo), la fluorescencia generada por los flavonoides como QUE, se
luego permitirían la unión entre ambos y los flavonoides se puede deber a cambios de polaridad del medio que rodea al
mantendrían unidos a este complejo (enzima-sustrato; no ANS, por un desplazamiento de este por parte del flavonoide
competitivo). o por cambios estructurales de la proteína por la interacción
flavonoide-lipasa (Martinez-Gonzalez et al., 2017). La posible
Análisis de los sitios hidrofóbicos de unión en la enzima interacción lipasa-QUE tendría el mayor efecto sobre el me-
La fluorescencia extrínseca permite evaluar la interac- dio que rodea a los sitios hidrofóbicos en la enzima, debido a
ción del compuesto apolar ANS con los sitios hidrofóbicos de que las interacciones hidrofóbicas son las que tienen la ma-
la enzima. Una disminución en la IF del ANS se relaciona con yor contribución a la estabilidad de las proteínas (Pace et al.,
un desplazamiento del ANS de estos sitios apolares por parte 2004). Un desplazamiento similar, pero de menor intensidad
de los flavonoides (Halim et al., 2017). La Figura 3 muestra el (p < 0.05) se observó para LUT. En el caso de RUT, esta se com-
efecto en la IF del ANS en presencia de los flavonoides. Se portó similar a QUE, aun cuando la variación de intensidad de
observa que los flavonoides que disminuyeron la intensidad fluorescencia (ΔIFc) fue mayor que para QUE, lo que indicaría
fueron, en orden decreciente, RUT, QUE y LUT. Asimismo, se que este flavonoide glicosilado tiene mayor afinidad por
puede observar en las Figuras 3-internas, el ajuste no lineal lipasa que QUE, como fue señalado por otros autores por
(Ecuación 5) realizado, para calcular la KD app de los flavonoides medio de estudios de fluorescencia intrínseca (Li et al., 2011).
que mostraron disminución de la IF del ANS. El mayor tamaño de RUT, por su componente glicosilado,

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Figura 3. Efecto de flavonoides en la fluorescencia extrínseca del complejo

lipasa-ANS. Se emplearon diferentes concentraciones (hasta 300 µM) de los
flavonoides, HES Hesperetina (a), LUT Luteolina (b), QUE Quercetina (c), CAT
Catequina (d), y RUT Rutina (e). La Figura interna muestra la variación en el
diferencial de la intensidad de la fluorescencia corregida (ΔIFc, UA) frente a
diferentes concentraciones del flavonoide.
Figure 3. Effect of flavonoids on lipase-ANS complex extrinsic fluores-
cence. Flavonoids employed were HES Hesperetin (a), LUT Lutein (b), QUE
Quercetin (c), CAT Catechin (d), and RUT Rutin (e) at different concentra-
tions (1 – 300 µM). Inset shows the change in the intensity of the corrected
fluorescence (ΔIFc, AU) at different flavonoid concentrations.

podría impedir la unión del ANS en su sitio de la enzima, el con el ANS. La competencia por el sitio de unión con el ANS
cual podría ser el mismo sitio para el resto de los flavonoides. señala el componente competitivo de la inhibición mixta
En un análisis de docking molecular realizado para las inte- de los flavonoides y coincide con la inhibición acompetitiva
racciones lipasa-ANS (datos no mostrados), se observó que observada para el ANS.
el ANS podría unirse en un sitio cercano a la tríada catalítica Los valores calculados de la KD app para RUT, QUE y
de la enzima, y que sería el mismo que para la mayoría de los LUT fueron 96.70 ± 1.30, 92.41 ± 2.10, y 65.40 ± 7.30, respec-
flavonoides. Esto también explicaría el menor efecto obser- tivamente. Estos resultados indican que, en presencia de la
vado para CAT, mismo que coincide con su poca actividad RUT, el ANS presenta poca afinidad (valor alto de KD app). Es
inhibitoria. El desplazamiento hipsocrómico observado por decir, la RUT tiene alta afinidad por un sitio hidrofóbico en
CAT podría estar asociado también con el tipo de inhibición la enzima, y desplaza al ANS. Diversas interacciones no co-
de este flavonoide, que expuso mayores sitios para la unión valentes como interacciones hidrofóbicas entre flavonoides

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y la lipasa pancreática han sido descritas (Li et al., 2011; Hu pNPL (Figura 4a). Mientras que el sitio para RUT, diferente al
et al., 2015). Sin embargo, este efecto no ha sido descrito, del resto de los flavonoides, se encuentra ubicado en una
mediante un análisis de interacciones de sitios hidrofóbicos región comprendida entre el sitio activo y la colipasa (Zhang
con ANS. Este análisis es importante debido a que la lipasa et al., 2018). La inhibición mixta observada para la mayoría de
cuenta con una región hidrofóbica que favorece la unión del los flavonoides, indica que los flavonoides se unen al enzima
sustrato, específicamente de las cadenas alifáticas del sus- antes y después de que el sustrato esté unido (Birari et al.,
trato (Acharya y Madhusudhana, 2003), y es en esta región 2011; Li et al., 2011). El componente competitivo de esta inhi-
donde se podrían ubicar sitios de unión para los flavonoides bición se presenta cuando los flavonoides se unen al residuo
hidrofóbicos por sus anillos aromáticos. Es decir, la unión de de Ser153, que pertenece a la tríada catalítica (Kokotos, 2003).
LUT, QUE y RUT con lipasa sería principalmente en sitios hi- Teniendo en cuenta los resultados cinéticos, que indican que
drofóbicos (desplazamiento del ANS). Características estruc- la CAT presenta una inhibición acompetitiva, a partir de los
turales presentes en estos flavonoides, como el grupo oxo en resultados del docking, se propone que la CAT sólo se podría
el anillo C, la doble hidroxilación del anillo B (catecol), y el unir al complejo enzima-sustrato, probablemente debido a
doble enlace C2 = C3 en el anillo C, permitirían estas uniones, que la interacción lipasa-CAT no es tan estable como la de
en concordancia con los resultados cinéticos descritos pre- QUE. Un comportamiento similar se observa para HES. Am-
viamente. bos flavonoides (HES y CAT) tienen el mismo sitio de unión
Por otra parte, el aumento en la intensidad de la fluo- que LUT y QUE, sin embargo, la falta de estructura plana en
rescencia del ANS en presencia de HES y CAT indicaría que su estructura no les permite mantener los enlaces con lipasa.
el ANS tuvo mayor interacción con la proteína (Figura 4h). En el caso de la RUT, su mayor tamaño por la presencia del
Probablemente, hubo una mayor exposición de regiones disacárido en posición C3, no le permite ingresar en el mismo
hidrofóbicas de la proteína para su unión con el ANS. Esto sitio que el resto de los flavonoides (Figura 4b). La estructura
se podría deber a que la mayor flexibilidad de los anillos B plana del anillo C de LUT y QUE les permite ingresar e interac-
y C de ambos flavonoides por la carencia del doble enlace tuar con los residuos de aminoácidos del sitio activo (Cerezo
C2 = C3, permitiría mayor movimiento sobre la superficie de et al., 2015). En este sentido, la mayoría de los flavonoides in-
la proteína, generando cambios en su estructura terciaria teractúan con el subsitio 1 (mayor actividad) de los tres sitios
(Hawe et al., 2008), mismos que permitirían una mayor unión descritos por otros autores, y RUT con el subsitio 3, ambos
del ANS. Estos resultados concuerdan con los obtenidos de hidrofóbicos (Zhang et al., 2018). Se señala que el Orlistat se
inhibición acompetitiva de CAT, en donde este flavonoide une a los tres subsitios e impide el ingreso del sustrato. De
tendría mayor afinidad por la enzima unida al sustrato, que esta manera, se propone que el mecanismo de inhibición de
en este caso sería el ANS (por su sitio de unión cercano al la enzima por los flavonoides está regulado por la entrada
sitio activo). En el caso de la HES, su comportamiento se po- del sustrato al sitio activo, siendo esta la principal diferencia
dría atribuir a dos razones; i) La mayor unión del ANS con la con el Orlistat.
enzima por el movimiento del flavonoide, ii) formación de un En la Tabla 2 se muestran las principales interaccio-
complejo enzima-ANS en el cual el ANS emite fluorescencia nes analizadas en las predicciones para la unión lipasa-
debido a sus dos grupos auxocromos (amino y sulfonato) flavonoides. En concordancia con resultados previos, todas
unidos a la cadena polipeptídica (Gasymov y Glasgow, 2007), las interacciones son no covalentes (He et al., 2006; Birari y
junto con un segundo complejo, ANS-HES, en el que el ANS Bhutani, 2007; Zhang et al., 2014; Martinez-Gonzalez et al.,
emita fluorescencia por la interacción de su grupo metoxi 2017a). Se observaron uniones a través de fuerzas de Van der
con estos grupos auxocromos. Se requieren otros estudios Waals con la His152 para los flavonoides. Pero, la mayoría de
para determinar la presencia de estas interacciones entre las interacciones son hidrofóbicas debido a que ambos sitios
grupos metoxi y auxocromos. de unión están conformados principalmente por residuos hi-
drofóbicos, ya que corresponden a una región empleada en
Análisis de las interacciones lipasa-flavonoides mediante la interfase para la unión con el sustrato (Miled et al., 2000).
docking molecular Lo anterior concuerda con los estudios de fluorescencia ex-
El análisis de docking predice las interacciones entre trínseca y con los resultados observados para la interacción
lipasa y los flavonoides y los resultados se presentan en la con el ANS (ΔG = -9.4, Figura 4h).
Figura 4. Se muestran dos posibles sitios de unión en la pro- En la interacción con flavonoides, se observaron inte-
teína, uno para LUT, QUE, CAT y HES, y otro para RUT (Figura racciones del tipo pi-stacking con los residuos de Phe en las
4a). Ambos sitios se encuentran en cavidades cercanas al si- posiciones 78, 216 para el primer sitio (QUE, CAT, HES, LUT,
tio activo. El sitio para la mayoría de los flavonoides está más pNPL), y 259 para el sitio de RUT. La unión con los flavonoides
cercano al sitio catalítico, como ha sido descrito para la inte- genera un cambio conformacional en la lipasa, abriendo la
racción de lipasa con compuestos polifenólicos como la QUE estructura. La conformación abierta de la lipasa permite la
(Martinez-Gonzalez et al., 2017a). Adicionalmente, los autores entrada del sustrato (Egloff et al., 1995; van Tilbeurgh et al.,
señalaron que este sitio es el mismo para sustratos, como el 1999), lo que coincide con la descripción para la inhibición
pNPL, e inhibidores de la actividad de lipasa, como el Orlistat. mixta.
Esto concuerda con el análisis de docking realizado para el

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Figura 4. Docking molecular de la lipasa pancreática con los flavonoides Hesperetina

(HES), Luteolina (LUT), Quercetina (QUE), Catequina (CAT), Rutina (RUT), y el sustrato,
pNPL. Representación como superficie de la estructura tridimensional completa
de lipasa (gris oscuro), indicando los aminoácidos del sitio activo (palos amarillos)
y la unión de los ligandos (a). El sitio de unión para los flavonoides y los principales
residuos (palos) para las interacciones se muestran (b). Se señalan las interacciones
específicas para la HES (c), LUT (d), QUE (e), CAT (f ), RUT (g) y ANS (h). Las distancias
están marcadas en líneas punteadas (negro) y con sus distancias (Å) en distintos
colores para los diferentes tipos de interacciones evaluados (puentes de hidrógeno,
rojo; electrostáticas, morado; e hidrofóbicas, azul). Estas imágenes se obtuvieron
usando USCF Chimera.
Figure 4. Molecular docking of the pancreatic lipase with the flavonoids Hesperetin
(HES), Lutein (LUT), Quercetin (QUE), Catechin (CAT), Rutin (RUT), and the substrate
pNPL. Surface representation for the full tridimensional structure of lipase (dark gray),
the amino acids of the active site are represented (yellow sticks) and the binding of
the ligands (a). Flavonoids binding sites and main amino acid residues (sticks) (b),
as well as specific interactions for HES (c), LUT (d), QUE (e), CAT (f ), RUT (g), and the
ANS (h) are shown. The dot lines (black) and distances (Å) with colors correspond
to different interactions such as hydrogen binding (red), electrostatics (purple), and
hydrophobic binding (blue). The images were obtained with USCF Chimera.

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Tabla 2. Resultados de la energía libre de Gibbs (ΔG, kCal mol-1), los residuos de aminoácidos presentes en la cavidad de lipasa, así como la
distancia (Å) para las posibles conformaciones enzima-ligandos.
Table 2. Gibbs free energy values (ΔG, kCal mol-1), amino acid residues and distances (Å) involved in the flavonoids binding with lipase.

Aminoácidos, distancia y energía libre de Gibbs para la interacción enzima-ligando

Ligandos Interacción

Fuerzas de Puentes de Hidrógeno

Hidrofóbica ΔG
Van der Waals (Å)

Tyr115 (3.7, 3.8), Phe78 (4.0), Phe216 Tyr115 (3.2),

HES His152 (3.0) -9.9
(3.6; 3.9; 3.9), His152 (3.9), Leu265 (3.7) Ser153 (3.7)

Tyr115 (4.2; 3.8), Phe78 (3.8), Phe216 Tyr62 (3.2),

LUT His152 (3.0) -10.0
(3.9; 3.9; 3.9), Leu265 (3.7) Ser153 (3.5)

Phe78 (3.7), Phe216 (3.9; 4.0; 3.8; 4.3), Tyr115 (3.3),

QUE His152 (3.0) -9.8
His152 (4.0), Leu265 (3.8) Ser153 (3.6)

Tyr115 (3.8; 3.6), Phe78 (4.1), Phe216

CAT His152 (3.0) Ser153 (3.3) -9.7
(3.7; 3.7), His152 (3.6), Leu265 (3.8)

RUT Asn263 (3.4), Gln245 (3.8), Cys262 (3.6) Phe259(3.9; 3.8) Gln239 (2.9) -9.0

Los datos son representados como media ± desviación estándar de los análisis realizados por triplicado. Las diferentes letras en una columna
representan las diferencias significativas (Análisis de la diferencia mínima significativa de Fisher, p < 0.05), n.d. significa no determinado. HES,
Hesperetina, LUT, Luteolina, QUE, Quercetina, CAT, Catequina, RUT, Rutina.
Values are mean ± standard deviation of triplicate analysis. Different letters in columns represent significant differences (Fisher, p < 0.05), n.d. not
determined. HES, Hesperetin, LUT, Lutein, QUE, Quercetin, CAT, Catechin, RUT, Rutin.

Sin embargo, en la Tabla 2 se indica que todos los característica más relevante, al comparar los resultados con
flavonoides se podrían unir a este sitio, y entonces ¿en dónde los de Hesperetina y Catequina.
radica la diferencia del poder inhibitorio de CAT sobre lipasa?
La respuesta podría radicar en la movilidad del anillo C, que AGRADECIMIENTOS
no le permite mantener interacciones hidrofóbicas entre Los autores están agradecidos por el apoyo financiero
anillos aromáticos, aunque haya proximidad del flavonoide por parte de CONACYT, México (CB-2016-01-286449). A.I.M.G.
con el sitio de unión. Se deben considerar aspectos de la está muy agradecida por la beca de estudio de doctorado
estructura de la CAT, que a pesar de contar con anillos A y B por parte de CONACYT y por el apoyo de la UACJ.
similares a los de QUE, exhibió un efecto diferente al de este
flavonoide. La carencia del grupo oxo en la posición 4 (anillo
REFERENCIAS
central, C) es un componente estructural de la CAT, el cual se Acharya, P., Madhusudhana, N. 2003. Stability Studies on a
podría relacionar con la carencia de interacciones estables. Lipase from Bacillus subtilis in Guanidinium Chloride. Journal
El 4-oxo es un grupo funcional que ha sido señalado como of Protein Chemistry. 22: 51-60.
relevante respecto al mayor poder antioxidante de QUE en Amat, A., Sgamellotti, A., Fantacci, S. 2008. Theoretical Study
comparación con CAT (Cook y Samman, 1996; Plumb et al., of the Structural and Electronic Properties of Luteolin and
1999; Heim et al., 2002). Se requieren otros estudios para Apigenin Dyes. Berlin, Heidelberg.
determinar si la responsabilidad del efecto inhibitorio de CAT Birari, R.B., Bhutani, K.K. 2007. Pancreatic lipase inhibitors from
(o HES) es debido a la presencia o ausencia del 4-oxo, aunado natural sources: unexplored potential. Drug Discovery
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dor debe poseer tres características estructurales para tener R. 2015. Total phenols and flavonoids content, antioxidant
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