Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

Reporte laboratorios bioquímica Nº 1, 2 y 3

Nombre Integrantes del grupo: Tiare Lillo – Javiera Medina – Elena Tobar.

 Laboratorio Nº1: Cromatografía de Exclusión Molecular.

Tabule en la siguiente tabla los datos obtenidos en su grupo de trabajo:

Tabla 1.
Fracción Absorbancia a Absorbancia a Absorbancia a Absorbancia a
280 nm 405 nm 550 nm 620 nm
1 0,1800 0,0469 0,0414 0,0576
2 0,133 0,0401 0,0346 0,0442
3 0,1039 0,0393 0,0328 0,038
4 0,0911 0,0401 0,0303 0,0335
5 0,0835 0,0484 0,0291 0,0308
6 0,0778 0,0658 0,0301 0,0291
7 0,0826 0,0999 0,0321 0,0284
8 0,0895 0,1559 0,0347 0,0286
9 0,1111 0,2757 0,0354 0,0278
10 0,1497 0,4695 0,035 0,0277
11 0,2119 0,7613 0,0322 0,0261
12 0,2872 1,1006 0,0309 0,0265
13 0,3923 1,5305 0,0289 0,0257
14 0,5065 1,9119 0,0276 0,0255
15 0,6168 2,2070 0,0322 0,0305
16 0,7203 2,4866 0,0261 0,0247
17 0,8313 2,7679 0,0262 0,0253
18 0,9154 2,9470 0,0254 0,0247
19 0,852 2,6724 0,0265 0,0259
20 0,6949 2,1517 0,0249 0,0247
21 0,5353 1,6092 0,025 0,0252
22 0,3946 1,1441 0,0244 0,0246
23 0,3003 0,8383 0,0241 0,0243
24 0,2351 0,6305 0,0243 0,0248
25 0,1862 0,4817 0,024 0,0244
26 0,1524 0,3744 0,0261 0,0259
27 0,1327 0,2979 0,0260 0,0261
28 0,13 0,2456 0,0318 0,0321
29 0,0954 0,1920 0,0248 0,0249
30 0,0853 0,1550 0,0248 0,0251
31 0,0722 0,1180 0,0251 0,025
32 0,0783 0,0943 0,0239 0,0242
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

Actividad Nº 1.- Construcción de un cromatograma.

Utilizando los valores de la tabla 1, construya un gráfico de Absorbancia versus Fracción.

Incluya los dos valores de absorbancia en el mismo gráfico. Adjunte gráfico a continuación
(2 pts):
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

Actividad Nº 2.- Determinación de VT, Ve, V0 y KD.

Siguiendo las instrucciones de la guía y aquellas entregadas durante el práctico, calcule los
valores requeridos en las siguientes dos tablas (1 pts):

Diámetro de columna 1,5 cm

Largo de columna 21 cm
VT (3,14/4) * (1,5cm)2 * 21cm = 37,09 cm3
(Volumen de columna)

Pico Fracción V0 Ve KD
(Volumen vacío) (Volumen de elución (Constante de
de la proteína) distribución de la
proteína)
1 (280nm) 18
2 (405nm) 18
3 (550nm) 15
4 (550nm) 28
5 (620nm) 15
6 (620nm) 28

*Agregue el número de picos (FILAS) que sea necesario de acuerdo con sus datos

VO: Es el volumen de elución del azul dextrano.

VE: Es el volumen al cual eluye la cantidad máxima de una determinada proteína, lo que
corresponde a la suma de los volúmenes de las fracciones hasta donde se alcanza un
determinado pico de absorbancia.
KD: Ve-Vo/Vt-Vo

Actividad Nº 3.- Análisis de datos.

Conteste las siguientes preguntas relacionadas con el práctico y los resultados obtenidos
(3 pts):

¿Cuáles son los pesos moleculares de las proteínas de la muestra? (0,25)

1. Albúmina sérica de bovino: PM 66kDa o 6,6 x 104 Da.
2. Fosfatasa ácida de germen de trigo: PM 0,058 kDa o 58 Da.
3. Citocromo C: PM 12,4kDa o 1,24 x 104 Da.

¿Por qué que se usó el azul de dextrano? (0,25)

 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

Se usa porque al ser una molécula de mayor tamaño que la capacidad de los poros del
sephadex 100, este eluye mucho más rápido que cualquier otra molécula, ya que, no se
absorbe haciendo posible el cálculo del volumen de vacío para ver cuánto es lo que se
demora como mínimo una molécula en pasar la fase estacionaria desde que se añade a la
solución hasta que eluye por completo, en comparación con las otras moléculas que se
extraen fraccionadamente entre el volumen total y el volumen inicial.

¿Por qué se midió a 280 nm y a 550 nm? (0,25)

Se midió a 280 nm debido a que la mayoría de las proteínas absorben a esa longitud de
onda (entre los rangos UV), un ejemplo de esto son las proteínas de los residuos
aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano. Por otro lado, se midió a 550 nm, porque a
esa longitud de onda se absorben los citocromos (proteínas con fuerte absorción de la luz
visible), debido a la presencia del grupo prostético hemo que contiene hierro.

¿A qué proteína corresponde cada pico obtenido en el cromatograma? (0,25)

Según la información encontrada en la literatura, ¿Sus datos son como los resultados
esperados?

Sí, su respuesta es SI justifique su respuesta.

Sí, su respuesta es NO explique por qué sus resultados no fueron los esperados. (2,0)
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

 Laboratorio Nº 2: Determinación de la Concentración de Proteínas por el Método

de Bradford.

Actividad Nº 1.- Elaboración de una curva de calibración (3 puntos)

a) Complete la siguiente con los resultados obtenidos luego de medir absorbancia. (0,5
puntos)

Tabla Nº 1
Concentración BSA Absorbancia
(µg/ml) 595 nm
0 0,199499995
2 0,273200005
4 0,304100007
6 0,310600013
8 0,32980001
10 0,358799994
12 0,364300013
14 0,403299987
16 0,393999994
18 0,427899987
20 0,440100014

b) Gráfique los datos obtenidos en la tabla Nº1: Concentración BSA versus Absorbancia. (1
punto)

Figura 1. Curva de calibración, concentración de BSA (μg/mL) v/s Absorbancia.

 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

Figura 2. Curva de calibración, concentración de BSA (μg/mL) v/s Absorbancia linealizada

(eliminación de las concentraciones 0 y 14 ul/ml de BSA).

Actividad 2: Determinación de la concentración de proteínas de la muestra. (3 puntos)

Fracción Absorbancia a 595 Concentración proteínas

nm (µg/ml)
1 0,50319999 12,11
2 0,5395 13,86
3 0,3673 5,54
4 0,3655 5,45
5 0,32210001 3,36
6 0,3405 4,25
7 0,2827 1,45
8 0,3705 5,72
9 0,3364 4,05
10 0,3633 5,35
11 0,326299995 3,56
12 0,32280001 3,39
13 0,301600009 2,37
14 0,284200013 1,53
15 0,272599995 0,97
16 0,277999997 1,23
17 0,269800007 0,83
18 0,257400006 0,23
19 0,264699996 0,58
20 0,242699996 0,47
21 0,26589999 0,64
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

22 0,25209999 0,019
23 0,25240001 0,0048
24 0,25529999 0,13
25 0,31020001 2,78
26 0,2529 0,019
27 0,2402 0,59
28 0,2463 0,29
29 0,2482 0,20
30 0,24259999 0,47
31 0,248600006 0,18
32 0,214100003 1,85

a) Gráfique los datos obtenidos en la tabla Nº2: concentración de proteínas de las distintas
fracciones versus la absorbancia. (1 punto)

b) ¿Cómo se compara el gráfico obtenido en esta actividad con los datos obtenidos con la
actividad anterior? Comente y justifique su respuesta. (0,5 puntos)

c) De acuerdo con los datos obtenidos en este informe, entre Bradford y la medición de la
absorbancia a 280 nm. ¿Cuál de los dos métodos sería el más apropiado para la medición
de la concentración de proteína?, según su criterio (0,5 puntos)

 Laboratorio Nº3: SDS-PAGE

A partir de la foto del gel entregada por el profesor, realice las siguientes actividades:

Actividad Nº 1.- Elaboración del Gráfico de Peso Molecular (log) versus migración
relativa. (2 puntos)

a) Complete la siguiente tabla, utilizando los datos obtenidos del laboratorio de

Electroforesis SDS PAGE. (1 punto)

Tabla Nº 1
Estándar de Peso Migración Relativa
Molecular (Rf)
245
180
135
100
75
63
48
35
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

25
20
17
11

b) Utilizando los datos de la Tabla 1, haga un gráfico de logaritmo del peso molecular
versus migración relativa de los estándares de peso molecular. (0,8 punto).

c) Complete la siguiente tabla con los datos de su gráfico. (0,2 punto)

Ecuación de la recta
R2

Actividad Nº 2.- Determinación del peso molecular de las proteínas de las muestras
problema. (2 puntos)

a) Indique en qué pocillos (bolsillos) cargó los marcadores de peso molecular o estándares
de peso molecular, la proteína BSA y sus 3 muestras. Rotule la fotografía que los
profesores le entregaron. (0,5 punto)

b) Determine la migración relativa de la proteína BSA y de las muestras problemas, y

calcule sus pesos moleculares. Coloque los datos calculados en la Tabla 2. (1,5 punto)

Tabla Nº 2
Muestras Migración Relativa Peso Molecular Relativo
BSA

Fracción 1

Fracción 2

Fracción 3

Actividad Nº 3.- Discusión

Considerando los resultados obtenidos, conteste las siguientes preguntas: (2 puntos)

a) ¿Por qué se grafica el logaritmo del peso molecular? (0,5 puntos)

b) ¿El tamaño obtenido para la muestra de BSA es el esperado? Justifique su respuesta.

(0.5 puntos)
 Carrera de Química y Farmacia, Primer Semestre 2022

c) ¿Pudo visualizar sus muestras problema y calcular el peso molecular respectivo? (1

punto)

1. Si su respuesta es sí, ¿coincide con los pesos reportados en la literatura?

2. Si su respuesta es no, ¿Cuál cree usted que son las razones (mínimo dos) de sus
resultados negativos y qué propone para solucionarlos?