Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Recibido: 19 junio 2020 Revisado: 8 abril 2021 Aceptado: 27 de mayo de 2021

DOI: 10.1002/bmb.21552

EJERCICIO DE LABORATORIO

PCR cuantitativa en tiempo real: una herramienta para la cuantificación

absoluta y relativa

Ravikumar Harshita | Duraipandian Rex Arunraj

Departamento de Ingeniería Genética,

Instituto SRM de Ciencia y Tecnología,
Abstracto
Kattankulathur, India La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica utilizada para monitorear la reacción de PCR

en tiempo real. RT-qPCR se clasifica ampliamente en dos tipos según su propósito:

Correspondencia
Duraipandian Rex Arunraj, Departamento cuantificación absoluta y relativa. La cuantificación absoluta se utiliza en una amplia gama de
de Ingeniería Genética, Instituto SRM de campos, como la microbiología, la tecnología de los alimentos y la biotecnología, para
Ciencia y Tecnología, Kattankulathur,
cuantificar la carga microbiológica/los adulterantes en un producto básico/números de copias,
Tamil Nadu, India.
Correo electrónico: rexarund@srmist.edu.in respectivamente, mientras que la cuantificación relativa se utiliza en el campo de la genómica

y la transcriptómica funcional para realizar análisis genéticos. análisis de expresión en

experimentos biológicos. Se incorpora un trabajo de laboratorio que cubre los principios

básicos involucrados en RT-qPCR y el análisis de datos utilizando los métodos del manual y del

software. El experimento de laboratorio se diseñó para proporcionar información sobre ciertos

principios importantes, como las características de los cebadores, la eficiencia de la PCR, y

análisis de la curva de fusión. Este ejercicio de laboratorio proporciona todos los componentes

significativos de RT-qPCR, que pueden ser útiles al realizar un experimento en un laboratorio

de pregrado y posgrado.

PALABRAS CLAVE

cuantificación absoluta y relativa, número de copias, cambio de pliegue, eficiencia de PCR,

PCR cuantitativa en tiempo real

1 | INTRODUCCIÓN estudios de expresión génica relativa o numérica1,2; sirve más

regularmente como un método para detectar, identificar, cuantificar
La PCR cuantitativa en tiempo real combina la PCR y la química y genotipificar microorganismos, como una ayuda en el diagnóstico,
indicadora fluorescente para monitorear la amplificación de la control de calidad y seguridad de los alimentos,3especialmente en la
plantilla con mayor sensibilidad y especificidad. Los análisis detección, cuantificación y tipificación de patógenos virales.4La PCR
cuantitativos de expresión relativa y expresión absoluta cuantitativa en tiempo real sirve como un método de ensayo sólido
mediados por PCR son esenciales para los estudiantes para detectar de manera efectiva la edición del genoma para el
universitarios de ciencias biológicas con especialización en cumplimiento normativo, la trazabilidad y los impactos ambientales.5
bioquímica, biotecnología y genética. Los estudiantes de Se argumenta que la PCR cuantitativa en tiempo real es un método
pregrado reciben capacitación de laboratorio sobre técnicas de ensayo sólido pero sencillo para estudiar los patrones de
moleculares modernas, incluida la clonación, la tecnología expresión génica en el organismo no modelo.
transgénica y el perfilado de expresión génica. El módulo de PCR Anteriormente, los análisis de los genes de ARNm se realizaban
cuantitativa se presenta para capacitar a los estudiantes en la mediante técnicas de bajo rendimiento; Northern se usa
genómica funcional, la expresión génica, la identificación o principalmente como análisis cualitativo, pero se usan controles
autenticación y la estimación del número de copias. estrictos para el análisis cuantitativo de un solo plex. Serial Analysis
La PCR cuantitativa se usa con frecuencia para la cuantificación of Gene Expression (SAGE) es un análisis cuantitativo de rendimiento
absoluta de la expresión génica/microorganismo/copia medio de alto plex con genes más altos

Biochem Mol Biol Educ.2021;1–13. wileyonlinelibrary.com/journal/bmb © 2021 Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular 1
2 HARSHITAYARUNRAJ

especificidad pero garantiza múltiples pasos secuenciales y la concentración de plantilla conocida se utiliza para la cuantificación. Los
bioinformática para cuantificar la expresión génica. SAGE es instrumentos tienen un software incorporado para facilitar el análisis de
técnicamente desafiante, de alto costo de análisis y requiere datos.13
experiencia en bioinformática. Los avances tecnológicos de alto El objetivo del módulo qPCR es impartir una comprensión
rendimiento ahora ayudan a perfilar la expresión del gen mRNA básica del principio, la sensibilidad, el poder de resolución y los
con más precisión en organismos modelo; microarray y RNA seq matices técnicos en el uso e interpretación de datos científicos
ayudan a analizar la expresión génica a nivel del transcriptoma, de un experimento biológico. El módulo qPCR está organizado
lo que permite la investigación paralela de vías multicelulares sin en tres sesiones: conocimiento tecnológico, cuantificación
un conocimiento previo del genoma. Aunque los microarrays y absoluta y cuantificación relativa. Brindamos información sobre
RNA-seq son tecnologías de alto rendimiento, son más caras. principios importantes como las características de los cebadores,
Implica un análisis posterior al ensayo para corregir la tasa de la eficiencia de la PCR y el análisis de la curva de fusión. Al
descubrimiento falso, bioinformática, estadísticas complejas y estudiante también se le presenta el software LC480 SW 1.5 paso
bastante desafiante en organismos que no son modelo.6 a paso para el análisis de datos y el cálculo manual.

En la era de la genómica y la transcriptómica, la elaboración

de perfiles de expresión génica en experimentos biológicos, la
cuantificación de microorganismos, la identificación de 2 | OBJETIVOS
contaminantes y la estimación del número de copias es rutinario.
7; Los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real, ya sea de El objetivo del módulo es proporcionar un punto de referencia
cuantificación absoluta o de expresión relativa, permiten la para identificar la variación en los niveles de expresión génica
cuantificación precisa de la plantilla para lograr los objetivos. La entre una muestra de control y experimental mediante PCR
principal ventaja de esta técnica es que son altamente sensibles cuantitativa en tiempo real. Además, ayuda a comprender los
y específicos, amplio rango de cuantificación dinámica, cálculos detrás de los valores de cambio de pliegue y cómo se
multiplexación de genes diana,8disponibilidad generalizada de derivan matemáticamente.
equipos, suministros de bajo costo, requiere información
genómica limitada, dificultad técnica baja y estadísticas simples.6 a. Comprender la sensibilidad y las limitaciones del uso
Además, la PCR en tiempo real tiene un límite de detección más de qPCR para la cuantificación absoluta y la
alto (concentración mínima de ácido nucleico o células cuantificación relativa
detectadas)9y límite de cuantificación (concentración más baja b. Conocer el diseño experimental.
que se cuantifica).10 C. Know-how en el diseño de imprimaciones y sus características
La técnica detecta el aumento de la fluorescencia de la d. Conozca la importancia de la eficiencia de la PCR
molécula informadora durante la amplificación exponencial mi. Conocimientos técnicos sobre la configuración de la reacción.

de la plantilla. SYBR Green es uno de los productos químicos F. Comprender el análisis de datos
más utilizados; el tinte intercala el ADN de doble cadena
durante la extensión del cebador por la polimerasa. Aunque
estos tintes son comparativamente económicos y fáciles de 3| MATERIALES
usar, un inconveniente es que producen fluorescencia al
intercalarse con productos específicos y no específicos de la 3.1 | Cuantificación absoluta
reacción de PCR.11Las sondas de oligonucleótidos como las
sondas TaqMan y las sondas de hibridación FRET se utilizan El gen de neomicina fosfotransferasa II (nptII) se clonó en el
generalmente como indicadores fluorescentes para ensayos vector de clonación plásmido pUC18, se purificó y cuantificó;
de RT-qPCR de detección específica.12Sin embargo, diseñar la utilizado para preparar estándares.
sonda es difícil y costoso; por lo tanto, la cuantificación
absoluta y relativa basada en SYBR es indispensable.
3.2 | Cuantificación relativa
La qPCR en tiempo real tiene aplicaciones en varios campos
y se considera una técnica fundamental en los estudios El tabaco (Nicotiana tabaccum) modificado para producir muy poca
moleculares y genómicos. El método se usa ampliamente para la nicotina se usa para estudiar las variaciones en la expresión de los
cuantificación de genes y el análisis de la expresión mediante el genes Jaz1 y Jaz3 sensibles al ácido jasmónico (JA); las plantas de
empleo de dos métodos, a saber, la cuantificación relativa y tabaco con bajo contenido de nicotina tienen una expresión regulada
absoluta. El método de cuantificación relativa compara la a la baja de genes sensibles a JA. La plantilla de ARN se aisló de las
expresión génica de una muestra con otra, mientras que en el raíces de plantas de tabaco de tipo salvaje y con bajo contenido de
caso de la cuantificación absoluta, una curva estándar de nicotina, se cuantificó en una nanogota y se invirtió
HARSHITAYARUNRAJ 3

se transcribe para producir la primera cadena de ADNc. Este herramienta de búsqueda de cebadores para capacitar a los estudiantes
ADNc se usó en el ensayo de cuantificación relativa. El gen de en el diseño de cebadores para ensayos de qPCR (https://
referencia utilizado fue ATPasa. www.idtdna.com/Primerquest/Home/ Index). En general, se siguen los
siguientes criterios para diseñar cebadores para la amplificación
específica de objetivos con fines de cuantificación. Los estudiantes reciben
3.3 | quimicos las siguientes instrucciones: el tamaño de amplicón preferido debe ser de
75 a 150 pb, pero puede usar más si es necesario (los amplicones más
1. Plantilla (ADNc o ADN plásmido) cortos brindan eficiencias de PCR más altas, usamos amplicones
2. Cicladora de luz®480 SYBR Green Master Mix (Código de ligeramente más largos [150 a 200 pb] que nos permiten validar los
catálogo: Roche #04707516001) ensayos ), 40–60% de contenido de GC,Tmetrocerca de 60-C, abrazadera 2G/
3. Tampón Tris 10 mM pH 8,0 C en el extremo 3', evita corridas de mono, di o trinucleótidos, evita homo
4. Cebadores (Tabla S1) y heterodimerización de los cebadores y regiones únicas en el objetivo.
5. Agua MilliQ Los pares de cebadores elegidos se validan de forma cruzada utilizando
otro programa de diseño de cebadores (como Oligo™o Primer3).

3.4 | Consumibles
4.1.3 | Eficiencia de PCR
1. Micropipeta de 2–20 μl y puntas
2. Micropipeta de 20–200 μl y puntas La eficacia de la PCR del ensayo qPCR se valida mediante la
3. Placas PCR en tiempo real linealidad de la curva estándar. La eficiencia de amplificación
4. Tubos de microcentrífuga debe estar entre 90% y 110% para una cuantificación confiable y
precisa; las fluctuaciones en la eficiencia producen una variación
más significativa en los datos cuantificados y tienden a
4 | PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL sobrestimar o subestimar la expresión génica.

4.1 | Sesión de laboratorio 1: conocimientos técnicos

4.1.4 | Análisis de fusión
Para los estudiantes que se especializan en programas profesionales de
ciencias biológicas, la preparación de plantillas y el control de calidad son La curva de fusión es un análisis termodinámico de la
rutinarios; sin embargo, el profesor debe evaluar los efectos de la calidad temperatura a la que se disocian los amplicones durante el
y cantidad del ADN o ARN en la reacción de qPCR durante la sesión de programa térmico dinámico; aumento continuo de la
conocimientos. Los estudiantes reciben información sobre las pautas temperatura de 65 a 95-C. Durante la instrumentación, los
MIQE, la sensibilidad y el rango dinámico de qPCR para un ensayo sólido. estudiantes aprenden a programar el análisis de fusión como
Las instrucciones sobre la organización de las sesiones de laboratorio, la parte del programa de ensayo qPCR.
instrumentación, la configuración de la reacción y el análisis de datos se
descubren durante la sesión de conocimientos. Tres grupos de
estudiantes realizan de forma independiente las réplicas biológicas del 4.1.5 | Genes de referencia para la normalización de datos
experimento, calculan el cambio de pliegue manualmente y utilizan un de qPCR
software integrado.
La normalización es un proceso donde se corrigen las variaciones en
la cantidad de plantillas. Generalmente, los genes domésticos son de
4.1.1 | Instrumentación expresión constitutiva; por lo tanto, se utilizan como genes de
referencia para normalizar los datos de qPCR.
Se lleva a los estudiantes a las instalaciones de instrumentación,
se describe el hardware, se reemplazan los bloques térmicos y se
programa la reacción usando el software en lotes de 4. 4.2 | Sesión de laboratorio 2:
Cuantificación absoluta

4.1.2 | Diseño y evaluación de los primers 4.2.1 | Diseño experimental y configuración de la

reacción.
El diseño de los cebadores de qPCR para la cuantificación absoluta
debe calificar ciertos parámetros críticos para la cuantificación El objetivo del estudiante es comprender la estimación
precisa de la muestra. Utilizamos las tecnologías de ADN integrado del número absoluto de copias usando la curva estándar
4 HARSHITAYARUNRAJ

método. Utilizamos el gen de neomicina fosfotransferasa 2 Por lo tanto, use 5,4 μl del ADN plasmídico para agregar a
(nptII) clonado en pUC18 en otro curso de laboratorio como 44,6 μl de agua MilliQ para obtener una copia de 109(copias/μl).
estándar. Los estándares y muestras fueron preparados por los Consideremos esto como el primer estándar (Std.1). Ahora,
estudiantes como se describe más adelante en la sección. Aquí, diluya en serie el estándar 1 para hacer los estándares 2 a 5
usamos cinco estándares de números de copias conocidos y dos (std2, std3, std4, std5) de concentraciones de 1 a 108, 1 - 106, 1 -
muestras de números de copias desconocidos. El experimento 104, 1 - 102, y 1 - 101, respectivamente.
se realizó por duplicado con controles positivos y sin plantilla Para garantizar una cuantificación precisa, se preparan
apropiados (NTC). El tipo de placa más utilizado es una placa de suficientes rangos de dilución para cubrir el rango esperado de
96 pocillos; hay dos tipos: placas blancas y transparentes, un copias de las muestras. Se debe utilizar un mínimo de 5 a 6
artículo propietario. Los estudiantes cargan los estándares y las estándares para la construcción de una curva estándar. Para una
muestras en la placa, como se muestra en la Tabla S2 (S, solución madre de 10 ng/μl y una longitud de 1000 pb, use los
estándar; U, desconocido; NTC, control sin plantilla). cálculos que se dan en la Tabla S3.

4.2.4 | configuración de la reacción

4.2.2 | Consejos para configurar la reacción
1. Sacar la plantilla (de 20-C) y todas las existencias (desde 20-
1. Descongele la mezcla SYBR Green en hielo, mezcle bien con un vórtice C) necesarios para la PCR en tiempo real, manténgalos en
seguido de un breve centrifugado. Es sensible a la luz. hielo y déjelos descongelar.
2. Descongele la plantilla en hielo antes de usarla. 2. Se establece la reacción de PCR, como se muestra en la Tabla S4.

3. Los genes apropiados clonados en el plásmido se utilizan para 3. Si hay muchas muestras a analizar, es
preparar estándares para la cuantificación absoluta. recomendable hacer un cóctel.
4. Siempre que sea posible, se prefiere un cóctel de reacción. 4. La mezcla de SYBR Green I Master mix, el agua de RT PCR y el cebador
5. Utilice los controles apropiados. se mezclaron, agitaron en vórtex y se centrifugaron durante unos
segundos.
5. Esta mezcla de reacción se cargó en la placa de PCR en tiempo real
4.2.3 | Preparación de la plantilla como se indica en la Tabla S2.
6. Se agregó la plantilla (estándar/muestra) a la placa.
La forma más conveniente de crear un estándar de ADN es 7. NTC es obligatorio en todos los experimentos en tiempo real.
clonar un producto de PCR en un vector estándar. Después de 8. El contenido de la placa se mezcla en un agitador de
determinar la concentración de ADN plasmídico, el número de placas.
copias de los estándares se calcula utilizando el siguiente sitio 9. A continuación se proporciona el programa de PCR de cuantificación absoluta.

web: https://www.thermofisher.com/in/en/home/brands/
thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biologylearning
-center/molecular-biology-resource-library/thermoscientific-web- 4.2.5 | Condición de reacción de PCR
tools/dna-copy-number-calculator.html.
Usando el sitio anterior, ilustramos cómo preparar la plantilla Las condiciones de reacción incluyen una desnaturalización inicial de
para usar como los estándares a continuación. Por ejemplo, si la 95-C durante 7 min, 35 ciclos de desnaturalización a 95-C durante 20
concentración del ADN del plásmido es de 100 ng/μl, use 10 μl para s, recocido a 55-C por 20 s, y extensión a 72-C durante 20 s durante
agregar a 90 μl de agua MilliQ o tampón tris para diluirlo en 10-; por los cuales se adquiere la fluorescencia. Después del programa de
lo tanto, la concentración se convierte en 10 ng/μl. Ahora, veamos los PCR, la curva de fusión captura la fluorescencia continuamente de 65
datos de entrada requeridos para generar el número de copia para a 95-C con 0.5-Incremento de C por minuto.
usar como estándares.
Masa molar por par de bases: 650 (g/mol)/pb
Para un fragmento de ADN personalizado (suponga que la longitud del 4.2.6 | Análisis de los datos
fragmento es de 1 Kb): 1000 pb
Concentración de la solución madre: 10 ng/μl Para la Los estudiantes reciben insumos para verificar la calidad del
preparación del número de copias deseado: ensayo de expresión génica absoluta. Los parámetros que
Concentración deseada: 109copias/μl Volumen total: evalúan los estudiantes incluyen el punto crítico (Cq), la
50 μl naturaleza de la curva de amplificación, curva de fusión,
Resultados: desviación estándar entre réplicas técnicas, NTC y ecuación
Volumen de stock: 5,4 l. Agua MilliQ de la curva estándar. Posteriormente, se ilustra a los grupos
o tampón tris: 44,6 μl. de estudiantes sobre el cálculo manual de valores absolutos.
HARSHITAYARUNRAJ 5

expresión utilizando la curva estándar trazando el registro de recocido a 55-C por 20 s, y extensión a 72-C durante 20 s.
números de copia a lo largo de laX-eje y sus respectivoscq Después de 35 ciclos, se realiza una curva de fusión
valores a lo largo dey-eje. Además, se demostró el uso del reduciendo la temperatura a 65-C y aumentándolo a 95-C con
software Roche LC480 SW versión 1.5 para analizar la un 0.5-Incremento de C por minuto. La captura de
cuantificación absoluta de la expresión génica. fluorescencia se realiza durante el paso de extensión ya lo
largo de la curva de fusión.

4.3 | Sesión de laboratorio 3:

Cuantificación relativa 4.3.4 | Análisis de los datos

4.3.1 | Diseño experimental Se demostró a los estudiantes el funcionamiento paso a paso

del software (Apéndice S1) para la cuantificación relativa de
La cuantificación relativa describe un experimento de PCR en tiempo la expresión génica utilizando la versión 1.5 de Roche LC480
real en el que la expresión de un gen objetivo (gen de interés) en la SW, la normalización de los datos de expresión utilizando
muestra de prueba se compara con la expresión del mismo gen en la genes de referencia y el cambio normalizado en la expresión
muestra de control. Aquí, utilizamos la regulación mediada por ácido de los genes investigados. . Además, se ilustró el cálculo
jasmónico de la biosíntesis de nicotina en el tabaco (Tabaco manual del cambio de pliegue utilizando tres métodos:
Nicotiana).Aquí, los estudiantes investigan las variaciones en la
expresión de los genes Jaz1 y Jaz3 sensibles al ácido jasmónico en
plantas de tabaco de tipo salvaje y bajas en nicotina. El ARN total se Cuantificación relativa usando 2–ΔΔConnecticutmétodo
aisló de los tejidos de la raíz de plantas de tabaco de tipo salvaje y normalizar elConnecticutvalor del gen diana al del gen de
bajas en nicotina y la primera cadena de ADNc se sintetizó durante referencia tanto para la muestra de prueba como para la de
sesiones anteriores del mismo curso de laboratorio. La expresión control, realice los siguientes cálculos:
génica se expresa como cambio de pliegue en relación con el control.
Los datos de expresión génica se normalizaron utilizando el gen ΔCtdprueba¼Connecticutgen dianadpruebaÞConnecticutgen de referenciadpruebaÞ

ATPasa de referencia. La reacción se establece como se establece en

la Tabla S5 (T, muestra objetivo;W,tipo salvaje; NTC, control sin ΔCtdcontrol¼Connecticutgen dianadcontrolÞ
plantilla). Connecticutgen de referenciadcontrolÞ

En segundo lugar, normalice el ΔConnecticutde la muestra de prueba

4.3.2 | configuración de la reacción a la ΔCtdel mando:

• Descongele las muestras y los reactivos necesarios para el ΔΔConnecticut¼ΔConnecticutdpruebaÞ ΔConnecticutdcontrolÞ

experimento de PCR en tiempo real.

• Agregue todos los componentes (Tabla S6), agite y gírelos dos o Finalmente, calcule la relación de expresión:
tres veces para distribuir los reactivos en la mezcla de manera
uniforme. 2– ΔΔConnecticut¼Valor de expresión normalizado
• Luego, esta mezcla de reacción se cargó con cuidado en la
placa de RTqPCR. Coloque la placa de PCR en hielo
durante todo el transcurso del experimento. Además, Cuantificación relativa usando ΔConnecticutmétodo
realice la reacción en condiciones de poca luz, ya que SYBR Este método utiliza la diferencia entre elConnecticutvalores de
Green es sensible a la luz. los genes de referencia y diana para cada muestra.
• La plantilla (muestra) se agrega a la placa como se establece en la
Tabla S5. Relacióndreferenciagen =objetivogeneÞ
• NTC es obligatorio en todos los experimentos en tiempo real. ¼2cqdreferenciageneÞ-cqdobjetivogeneÞ
• Las condiciones de qPCR utilizadas para la cuantificación relativa se
mencionan a continuación. Cuantificación relativa mediante el método de Pfaffl
La fórmula para calcular la cuantificación relativa utilizando el método de Pfaffl
se proporciona a continuación.

4.3.3 | Condición de reacción de PCR

Relación¼ ðmiobjetivoÞΔCtobjetivodcontrol – pruebaÞ= ð
Las condiciones de reacción incluyen una desnaturalización inicial de 95-C
mireferenciaÞΔCtreferenciadcontrol – pruebaÞ
durante 3 min, 35 ciclos de desnaturalización a 95-C durante 20 s,
6 HARSHITAYARUNRAJ

5| RESULTADOS Y DISCUSIONES la precisión del ensayo de qPCR. La eficiencia de amplificación

(AE) (linealidad de la reacción) del gen objetivo afecta la
5.1 | Sesión de laboratorio 1: conocimientos técnicos Connecticuty, por tanto, número absoluto de ejemplares.14Una
en qPCR eficiencia de PCR de 2 se considera la eficiencia más alta (es
decir, E = 2), donde se obtiene una amplificación exponencial. Si
Dado que los estudiantes conocen el principio de qPCR, la sesión de la eficiencia de la PCR varía entre las muestras, las copias
conocimientos se centra en enfatizar la perspicacia técnica y calculadas del gen fluctuarían, lo que conduciría a una
experimental para generar datos reproducibles. Se lleva a los subestimación o sobreestimación del nivel de expresión.14Este
estudiantes a las instalaciones de instrumentación, se proporciona estudio también observó fluctuaciones en la eficiencia de la PCR
una visita guiada sobre el hardware y el software del dispositivo y se que varían entre 1.618 y 1.924 (Figura 1c, d); sin embargo, el
programan las condiciones para qPCR. En el laboratorio general, la rango aceptado está entre 1.9 y 2.1.
sesión de know-how se centra en parámetros esenciales; primero, el
efecto de la calidad de la plantilla en la eficiencia de qPCR; se ilustra
cómo afecta la eficacia de la amplificación por PCR. En segundo 5.1.3 | El análisis de fusión es un indicador de la
lugar, la demostración para diseñar cebadores utilizando la especificidad de qPCR
herramienta de búsqueda de cebadores de las tecnologías de ADN
integrado y, en tercer lugar, la especificidad del ensayo explicada El análisis de fusión nos proporciona datos sobre la especificidad del
mediante el análisis de fusión, la elección de los genes estándar y de amplicón; un pico de fusión corresponde a un producto. La curva de
referencia para la cuantificación absoluta y relativa. fusión también se usa ampliamente para probar la autenticidad del
producto en productos naturales y suplementos para la salud.

5.1.1 | Diseño de cebadores para amplificación de

objetivos estrictos 5.1.4 | Los genes de referencia o los genes
domésticos normalizan los datos de expresión
En cualquier experimento de qPCR, primero se deben analizar
las propiedades termodinámicas y la eficiencia de amplificación La normalización es un proceso en el que los datos de expresión se
de PCR de los cebadores. Uno de los problemas más comunes en normalizan a la plantilla de muestra; para corregir las variaciones en
el experimento qPCR basado en la química verde SYBR es la la cantidad y calidad de la plantilla. Para ello utilizamos gen(es)
fluorescencia obtenida de la dimerización intramolecular e denominado(s) gen(es) de referencia, cuya propiedad indispensable
intermolecular del cebador. Los dímeros de cebadores se es que su expresión no debe variar para el(los) tratamiento(s)
pueden detectar fácilmente observando los picos de fusión del investigado(s). Por lo general, los genes de mantenimiento son de
control sin plantilla (NTC). expresión constitutiva; por lo tanto, los genes domésticos se utilizan
En este experimento, evaluamos más conjuntos de cebadores a como genes de referencia para la normalización. Sin embargo, no
lo largo de los años en cuanto a su rendimiento y eficiencia de PCR. todos los genes domésticos pueden usarse como genes de
Aquí discutimos el rendimiento de los conjuntos de cebadores para referencia para un experimento. Por lo tanto, es común validar
la amplificación del gen npt II, donde un par funcionó bien. Por el múltiples genes de referencia/mantenimiento para un experimento y
contrario, el otro par de cebadores era termodinámicamente usar uno o más para normalizar los datos de expresión.15,16
inestable y mostraba una dimerización del cebador no específica en
el control sin plantilla (Figura 1a,b). De manera similar, los picos de
fusión de estos conjuntos de cebadores demuestran que uno de los 5.2 | Sesión de laboratorio 2:
pares de cebadores produce un amplicón específico, el otro par de Cuantificación absoluta
cebadores produce una amplificación no específica además del
producto (Figura 1e,f). La solidez de la qPCR se puede mejorar La cuantificación absoluta describe la cuantificación de la
mediante el diseño de cebadores estrictos y concentraciones plantilla en la muestra desconocida como equivalente al número
apropiadas de cebadores para la amplificación. de copias del gen objetivo en el estándar. Es esencial utilizar el
mismo gen objetivo tanto en los estándares como en la muestra
para una cuantificación precisa. Se utilizaron cinco estándares de
5.1.2 | La eficiencia de qPCR baja fluctúa en el cambio de número de copias conocido para generar una curva estándar de
pliegue cqvalores, que luego se utiliza para cuantificar el número de
copias en el desconocido. La principal ventaja de usar un gen
El segundo factor crítico en el ensayo de qPCR es la eficiencia clonado para el estándar es que es fácil de construir, mantener,
de la reacción de PCR. La calidad de la plantilla, la solidez del almacenar y estimar con precisión el número de copias.
ensayo y las herramientas estadísticas influyen
HARSHITAYARUNRAJ 7

FIGURA 1 Lo esencial
parámetros para el análisis de valores
absolutos y relativos

cuantificación, como las

características del cebador (a, b), la
eficiencia de la PCR (c, d) y
se ilustra la especificidad de amplificación
(e, f). Se ilustra un par de cebadores que
forma una dimerización homo/hetero que
conduce a una amplificación falsa (a, b)
cuyos picos de fusión confirman el
cebador

dimerización (b). Posible fluctuación

en la eficiencia de la PCR debido a
la calidad de la
También se demostró la plantilla (c, d).
La especificidad del ensayo está
determinada por las curvas de fusión y
los picos de fusión donde un solo pico
indica un producto mientras que más
de uno indica una posible reacción no
específica (e, f)

5.2.1 | Investigaciones estudiantiles del por el pico único en la curva de fusión, lo que confirma el gen
ensayo qPCR objetivo (Figura 2c).

Los parámetros críticos de la qPCR, como la curva de amplificación,cq

los valores, la desviación estándar, la eficiencia de la curva estándar y 5.2.2 | Análisis de los datos

los picos de fusión muestran que el ensayo fue específico, preciso y

confiable. El patrón de la curva de amplificación ilustra que la Aquí, los estudiantes utilizan el software Roche LC480 SW versión 1.5
reacción de PCR no se inhibió y sigue el patrón 'S' (Figura 2a). Los para analizar la cuantificación absoluta de la expresión génica. El
estudiantes trazan un gráfico estándar con la concentración funcionamiento paso a paso del software se proporciona en el
logarítmica contra el punto de cruce (Cq). Una línea lineal obtenida Apéndice S1. Este programa traza un gráfico estándar usando la
demuestra la eficacia de la PCR de las muestras; la linealidad está mediacqvalores de los estándares contra su concentración
dentro del rango aceptado (Figura 2b). Además, la especificidad del logarítmica y extrapola matemáticamente la concentración de las
ensayo se determina muestras desconocidas (Tabla 1). Por lo tanto, la
8 HARSHITAYARUNRAJ

FIGURA 2 Se muestran las características del ensayo de cuantificación absoluta. La curva de amplificación de los estándares (a), el estándar
curva generada por el software LC480 SW 1.5 (b), la especificidad del objetivo amplificada evidenciada a través de los picos de fusión (c) y la construcción de la curva

estándar manualmente usandocqse muestran los valores y el registro de los números de copia de los estándares utilizados (d)

El número de copias del gen objetivo en las muestras ecuación para la línea de regresión lineal [y = mx + c,o Cq = metro (
desconocidas UNK1 y UNK2 se calculó como 879 y 553. número de copia de registro) +C]fue generado (Figura 2d)). Sobre la
Los mismos datos se analizaron manualmente para calcular base de la ecuación, se calcularon los números de copias presentes
el número absoluto de copias. Los estudiantes dibujan una curva en la muestra desconocida (Tabla 2). Por lo tanto, los números de
estándar trazando el registro de números de copias a lo largo de copias calculados de las muestras desconocidas UNK1 y UNK2 fueron
laX-eje y sus respectivoscqvalores a lo largo dey-eje. El 882 y 553, respectivamente. El
HARSHITAYARUNRAJ 9

TABLA 1 Cuantificación absoluta del número de copias utilizando la curva estándar en la plataforma Roche LC480

Pos. Nombre Tipo PC SignificarCP EstándarCP Estándar Concentración concentración media

A1 ETS1 Estándar 23.61 4.00E+02 3.73E+02

A2 ETS1 Estándar 23.57 23.59 0.03 4.00E+02 3.83E+02 3.78E+02

A3 ETS2 Estándar 24.51 2.00E+02 2.05E+02

A4 ETS2 Estándar 24.49 24.5 0.01 2.00E+02 2.08E+02 2.06E+02

A5 STD3 Estándar 25.51 1.00E+02 1.06E+02

A6 STD3 Estándar 25.42 25.46 0.06 1.00E+02 1.12E+02 1.09E+02

A7 STD4 Estándar 26.93 5.00E+01 4.09E+01

A8 STD4 Estándar 26.51 26.72 0.3 5.00E+01 5.43E+01 4.76E+01

A9 ETS5 Estándar 28.89 1.00E+01 1.11E+01

A10 ETS5 Estándar 29.19 29.04 0.21 1.00E+01 9.03E+00 1.01E+01

C8 UNK1 Desconocido 22.31 8.87E+02

C9 UNK1 Desconocido 22.34 22.32 0.02 8.71E+02 8.79E+02

C10 UNK2 Desconocido 22.97 5.73E+02

C11 UNK2 Desconocido 23.08 23.02 0.08 5.33E+02 5.53E+02

TABLA 2 Cuantificación absoluta del número de copias utilizando el método de la curva estándar (y =3.4581x +32.506)

Significar copia estándar Copia media calculada Registro del número Copia de registro calculada Copiar
Muestra CP número número medio de copias número número
ETS1 23.59 4.00E+02 3.78E+02 2.5774918 2.578368999 378.7642657

ETS2 24.5 2.00E+02 2.06E+02 2.31386722 2.315211105 206.6384355

STD3 25.46 1.00E+02 1.09E+02 2.037426498 2.037593985 109.0420443

STD4 26.72 5.00E+01 4.76E+01 1.677606953 1.673221515 47.1217613

ETS5 29.04 1.00E+01 1.01E+01 1 1.002313476 10.05341189

UNK1 22.32 2.945633314 882.334608

UNK2 23.02 2.743204164 553.610303

los estudiantes confirman que ambos métodos proporcionan números de 5.3.1 | Análisis de los datos
copia idénticos en las muestras desconocidas.
Los estudiantes utilizan el software Roche LC480 SW versión 1.5
para analizar la cuantificación relativa de la expresión génica. El
5.3 | Sesión de laboratorio 3: funcionamiento paso a paso del software se proporciona en el
Cuantificación relativa Apéndice S1. El software calcula la mediacqvalores para las
réplicas y valida elcqbasado en la desviación estándar. Una vez
Los genes Jaz1 y Jaz3 sensibles al ácido jasmónico (JA) se válidocqse obtienen los valores, calcula el cambio de pliegue
analizaron en plantas de tabaco de tipo salvaje y bajas en usando el método de Eficiencia (Tabla 3). La normalización se
nicotina con ATPasa como gen de referencia. En la cuantificación realizó utilizando la media del gen de referencia.cqvalor para
relativa, un gen de referencia es obligatorio en cada anular la variación en la plantilla. La expresión génica
experimento para calcular la(s) expresión(es) del gen objetivo. normalizada se presenta como un cambio de pliegue en el gen
Los estudiantes inspeccionan la curva de amplificación,cq objetivo con referencia al tipo salvaje. El cambio de pliegue del
valores, desviación estándar, curva de fusión y pico de fusión de tipo salvaje es 1; un cambio de pliegue en el gen diana de más
los genes objetivo y de referencia (Jaz1, Jaz3 y ATPasa) para de dos se considera regulado al alza, mientras que un cambio de
calificar el ensayo (Figura 3a-c). Los estudiantes utilizan tanto el pliegue inferior a uno se considera regulado a la baja. La
software LC480 SW 1.5 como el método manual para calcular el expresión normalizada de los genes objetivo se calcula y se
cambio en la expresión de los genes objetivo. muestra como una tabla y como una barra
10 HARSHITAYARUNRAJ

FIGURA 3 Se representan las características del ensayo de cuantificación relativa en una plataforma LC480. Las curvas de amplificación (a), fusión
se presentan las curvas (b) y los picos de fusión (c) de los genes de referencia y diana. Se muestra la expresión génica normalizada de los genes diana Jaz1 y Jaz3 en
tabaco con bajo contenido de nicotina en comparación con el tabaco de tipo salvaje utilizando el software LC480 SW 1.5 (d) y utilizando varios métodos
manualmente (e). Las barras de error representan la desviación estándar

diagrama (Figura 3d,e). Los estudiantes calculan la expresión relativa Cuantificación relativa usando 2–ΔΔConnecticutmétodo
de los genes objetivo (Jaz1 y Jaz3) calculada manualmente de la El 2–ΔΔConnecticutEl método para el análisis de la expresión génica
siguiente manera: relativa se usa ampliamente y es fácil de realizar.17Un general
HARSHITAYARUNRAJ 11

TABLA 3 Expresión relativa de genes sensibles a JA Jaz1 y Jaz3 en tabaco Roche LC480 plataforma SW 1.5

Emparejamiento Nombre de la muestra Objetivos Referencias SignificarCP SignificarCP objetivo/ref normalizado

B2/A2 Tipo salvaje Jaz1 ATPasa 29.04 27.18 0.28 1.00

tratado Jaz1 ATPasa 30.59 26.74 0.07 0.25
B4/A4 Tipo salvaje Jaz3 ATPasa 25.64 27.18 2.91 1.00
tratado Jaz3 ATPasa 26.41 26.74 1.26 0.43

La suposición utilizada en este método es que tanto los genes diana Cuantificación relativa usando ΔConnecticutmétodo
como los de referencia se amplifican con eficiencias de El ΔConnecticutEl método que utiliza un gen de referencia es más
aproximadamente el 100 % (es decir,mi =2). sencillo de realizar. Este método utiliza la diferencia entre el
Para Jaz1: Connecticut valores de los genes de referencia y diana para cada
muestra. Supongamos que los valores de expresión resultantes
ΔCqdprueba¼cqgen dianadpruebaÞcqgen de referenciadpruebaÞ obtenidos se dividen por el valor de expresión de la muestra de
ΔCqdnicotina baja¼cqJaz1dnicotina bajaÞ control; el resultado será el mismo que el método de Livak.

cqATPasadnicotina baja¼30:59 26:74¼3:85

Relacióndreferenciagen =objetivogeneÞ
¼2cqdreferenciageneÞ-cqdobjetivogeneÞ
ΔCqdcontrol¼cqgen dianadcontrolÞ
cqgen de referenciadcontrolÞ
Para calcular la expresión relativa, normalice la expresión del
ΔCqdSalvaje¼cqJaz1dSalvajeÞcqATPasadSalvaje¼ gen de prueba para cada muestra:
29:04 – 27:18¼1:86 Cálculos:
Para Jaz1:
ΔΔcq¼ΔcqdpruebaÞ Δcqdcontrol Para plantas de tipo salvaje: 2(27.18–29.04)= 2( 1.86)= 0.2754
Þ ΔΔcq¼3:85d1:86¼1:99 Para plantas bajas en nicotina: 2(26.74–30.59)= 2( 3.85)= 0,0693
Expresión de Jaz1 en tipo salvaje = Proporción de control/

2–ΔΔcq¼Valor de expresión normalizado Proporción de control = 0,2754/0,2754 = 1

Expresión de Jaz1 en plantas bajas en nicotina = Proporción de
2–ΔΔcq¼2d1:99Þ¼0:251
prueba/Proporción de control = 0,0693/0,2754 = 0,251
Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz1 0,25 veces en Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz1 0,25 veces en
comparación con las plantas de tipo salvaje. comparación con las plantas de tipo salvaje.
Para Jaz3: Para Jaz3:
Para plantas de tipo salvaje: 2(27.18–25.64)= 2(1.54)= 2.907
ΔCqdprueba¼cqgen dianadpruebaÞcqgen de referenciadpruebaÞ Para plantas bajas en nicotina: 2(26.74–26.41)= 2(0.33)= 1,257
ΔCqdnicotina baja¼cqJaz3dnicotina bajaÞ Expresión de Jaz3 en tipo salvaje = Proporción de control/

cqATPasadnicotina baja¼26:41 26:74¼0:33 Proporción de control = 2,907/2,907 = 1

Expresión de Jaz3 en plantas con bajo contenido de nicotina = Proporción
de prueba/Proporción de control = 1,257/2,907 = 0,432
ΔCqdcontrol¼cqgen dianadcontrolÞ
Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz3 0,43
cqgen de referenciadcontrolÞ
veces en comparación con las plantas de tipo salvaje.
ΔCqdSalvaje¼cqJaz3dSalvajeÞcqATPasadSalvaje
¼25:64 27:18¼1:54 Cuantificación relativa mediante el método de Pfaffl
El método de Pfaffl se utiliza para determinar la relación
ΔΔcq¼ΔcqdpruebaÞ Δcqdcontrol de expresión entre la prueba y el control.18,19Dado que la
Þ ΔΔcq¼0:33d1:54¼1:21 eficacia de la amplificación depende de la plantilla y
puede variar de un experimento a otro, es necesario
2–ΔΔcq¼Valor de expresión normalizado incluir estándares relativos para las muestras de prueba y
de control.
2–ΔΔcq¼2d1:21Þ¼0:432

Relación¼ ðmiobjetivoÞΔCtobjetivodcontrol – pruebaÞ= ð

Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz3 0,43
mireferenciaÞΔCtreferenciadcontrol – pruebaÞ
veces en comparación con las plantas de tipo salvaje.
12 HARSHITAYARUNRAJ

Cálculos: final del módulo. Por ejemplo, se pidió a los estudiantes que
Para Jaz1: diseñaran cebadores de qPCR para un gen hipotético y comentaran
sobre la estadística del cebador y/oConnecticutSe proporcionaron los
Relación¼ ðmiJaz1ÞΔCqJaz1dNicotina baja salvajeÞ= valores de un experimento hipotético para calcular el nivel de
expresión de los genes. Las dificultades típicas de los estudiantes
dmiATPasaÞΔCqATPasadNicotina baja salvajeÞ
que se abordaron durante el módulo de qPCR fueron, en primer
dóndemi =Eficiencia de amplificación. lugar, la plantilla de ARN de baja calidad con la subsiguiente
eficiencia de amplificación deficiente y las fluctuaciones en el cambio

Expresión relativa de Jaz1¼ ð2Þd29:04 30:59Þ=ð2Þd27:18 26:74Þ de pliegue, y el segundo, el pipeteo inconsistente que condujo a un
punto crítico alto (Cq)desviación estándar entre las réplicas técnicas.
donde Eficiencia (mi) =2.
Finalmente, la PCR en tiempo real es uno de los mejores

Expresión relativa del gen de prueba¼ ð2Þd1:55Þ=ð2Þd0:44Þ métodos para la cuantificación de genes y el análisis de la expresión
de genes. Es altamente sensible y por lo tanto facilita una gran

Expresión relativa del gen de prueba¼0:3415=1:356 precisión en menos tiempo.20Es un método preciso, rápido, sensible
y económico y se considera un método muy efectivo en genómica
funcional.3,21,22Dada la importancia de la qPCR, es esencial conocer
Expresión relativa del gen de prueba¼0:251
las características técnicas y analíticas para realizar ensayos robustos
de cuantificación y expresión génica. Por lo tanto, este módulo
Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz1 0,25 proporciona todos los elementos básicos y esenciales de qPCR, como
veces en comparación con las plantas de tipo salvaje. la configuración de la reacción, el control de calidad, el análisis de
Para Jaz3: datos, el cálculo manual y la interpretación de datos para que sean
reproducibles en cursos de laboratorio de pregrado y posgrado.
Relación¼ ðmiJaz3ÞΔCqJaz3dSalvaje nicotina bajaÞ=

dmiATPasaÞΔCqATPasadSalvaje nicotina bajaÞ

RECONOCIMIENTO
Reconocemos las múltiples instalaciones de qPCR proporcionadas en
dóndemi =Eficiencia de amplificación. el Instituto SRM de Ciencia y Tecnología, Kattankulathur.

Expresión relativa de Jaz3¼ ð2Þd25:64 26:41Þ=ð2Þd27:18 26:74Þ ORCIDO

Duraipandian Rex Arunraj https://orcid.org/0000-
0002-2739-8325
donde Eficiencia (E) = 2.
REFERENCIAS
Expresión relativa del gen de prueba¼ ð2Þd0:77Þ=ð2Þd0:44Þ 1. Williams M. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. La revolución
PCR: tecnologías básicas y aplicaciones. Estados Unidos: Prensa de la
Universidad de Cambridge; 2009. pág. 3–11.
Expresión relativa del gen de prueba¼0:5864=1:356
2. Jia Y. Capítulo 3: PCR en tiempo real. Métodos en biología celular; Estados
Unidos: Elsevier; 2012. pág. 55–68.
Expresión relativa del gen de prueba¼0:432 3. Kralik P, Ricchi M. Una guía básica para la PCR en tiempo real en el
diagnóstico microbiano: definiciones, parámetros y todo. Microbiol
Por lo tanto, las plantas bajas en nicotina expresan Jaz3 0,43 veces en
frontal. 2017;8:108. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00108.
comparación con las plantas de tipo salvaje. Se observa que los genes Jaz1 4. Hoffmann B, Beer M, Reid SM, Mertens P, Oura CA, van Rijn PA, et al. Una
y Jaz3 sensibles a JA están regulados a la baja en plantas de tabaco con revisión de las tecnologías de RT-PCR utilizadas en virología veterinaria y
bajo contenido de nicotina en comparación con las plantas de tipo salvaje, control de enfermedades: diagnóstico sensible y específico de cinco

lo que respalda el argumento de que la respuesta de JA está regulada al enfermedades del ganado notificables a la organización mundial de salud
animal. Microbiol veterinario. 2009; 139: 1–23. https://doi. org/10.1016/
alza en plantas con bajo contenido de nicotina.
j.vetmic.2009.04.034.
5. Chhalliyil P, Ilves H, Kazakov SA, Howard SJ, Johnston BH, Fagan J. Un
método de PCR cuantitativo en tiempo real específico para la
5.3.2 | Evaluación de los estudiantes y errores detección y cuantificación de la primera planta editada con genoma
frecuentes comercializada. Alimentos. 2020;9:1245. doi.org/10.3390/
foods9091245.
Los estudiantes fueron evaluados a través de un cuestionario que 6. Fryer RM, Randall J, Yoshida T, Hsiao LL, Blumenstock J, Jensen KE,
evaluó el nivel de comprensión y las habilidades analíticas en el et al. Análisis global de la expresión génica: métodos,
HARSHITAYARUNRAJ 13

interpretación y trampas. Exp. Nephrol. 2002;10:64–74. 16. Adeola F. Normalización de la expresión génica mediante RT-PCR
https://doi.org/10.1159/000049901. cuantitativa en línea celular humana: comparación de 12 genes
7. Maddocks S, Jenkins R. PCR cuantitativa: aspectos a tener en cuenta. endógenos de referencia. Etíope J Health Sci. 2018;28:741–8.
Comprender la PCR. 1, EE. UU.: Prensa académica; 2017;45–52. 17. Livak KJ, Schmittgen TD. Análisis de datos de expresión génica
8. Klein D. Cuantificación mediante tecnología PCR en tiempo real: relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2-
aplicaciones y limitaciones. Tendencias Mol Med. 2002;8:257–60. ΔΔCT. Métodos. 2001;25:402–8.
https://doi.org/10.1016/S1471-4914(02)02355-9. 18. Pfaffl M. Estrategias de cuantificación en PCR en tiempo real. AZ Quant PCR.
9. Nutz S, Doll K, Karlovsky P. Determinación del LOQ en PCR en tiempo 2004; 1:87–112.
real mediante el análisis de la curva característica operativa del 19. MW de Pfaffl. Un nuevo modelo matemático para la cuantificación relativa
receptor: aplicación a ensayos de qPCR paraFusarium verticillioidesy en RT-PCR en tiempo real. Ácidos Nucleicos Res. 2001;29:e45.
F. proliferatum.Química anal bioanal. 2011;401:717–26. https:// 20. Manali KM, Arunraj R, Kumar T, Ramya M. Detección de cianobacterias
doi.org/10.1007/s00216-011-5089-x. productoras de microcistina en suplementos dietéticos de espirulina
10. Broeders S, Huber I, Grohmann L, Berben G, Taverniers I, Mazzara M, mediante PCR cuantitativa multiplex HRM. Phycol de aplicación J.
et al. Directrices para la validación de métodos cualitativos de PCR en 2017;29:1279–86.
tiempo real. Tendencias Food Sci Technol. 2014;37:115–26. https:// 21. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et
doi.org/10.1016/j.tifs.2014.03.008. al. PCR en tiempo real en microbiología clínica: aplicaciones para
11. Boulter N, Suarez FG, Schibeci S, Sunderland T, Tolhurst O, Hunter pruebas de laboratorio de rutina. Clin Microbiol Rev. 2006;
T, et al. Un método simple, preciso y universal para la 19:165–256.
cuantificación de PCR. BMC Biotecnología. 2016;16:27. 22. Kamle S, Ali S. Cultivos genéticamente modificados: estrategias de detección y
12. Navarro E, Serrano-Heras G, Castano MJ, Solera J. Química de problemas de bioseguridad. Gene. 2013;522:123–32.
detección de PCR en tiempo real. Clin Chim Acta. 2015;439:231–50.
13. Stephenson FH. Capítulo 9: PCR en tiempo real. En: Stephenson FH,
editor. Cálculos para biología molecular y biotecnología. 3ra ed. EE. INFORMACIÓN DE SOPORTE
UU.: Prensa académica; 2016. pág. 215–320. Puede encontrar información de apoyo adicional en línea
14. Arunraj R, Samuel MA. La integración de la eficiencia de amplificación en la sección Información de apoyo al final de este
en el análisis de qPCR permite la cuantificación precisa y relativa de la artículo.
abundancia de transcritos de genes de grandes familias de genes
utilizando ARN aislado de tejidos difíciles. Breve función genómica.
2018;17:147–50. Cómo citar este artículo:Harshitha R, Arunraj DR. PCR
15. De Spiegelaere W, Dern-Wieloch J, Weigel R, Schumacher V, Schorle H, cuantitativa en tiempo real: Una herramienta para la
Nettersheim D, Bergmann M, Brehm R, Kliesch S, Vandekerckhove L,
cuantificación absoluta y relativa. Biochem Mol Biol Educ.
Fink C. Validación de genes de referencia para RTqPCR, una nota
2021;1–13.https://doi.org/10.1002/bmb. 21552
sobre diferentes programas disponibles paquetes MÁS UNO.
2015;10:3:e0122515. http://dx.doi.org/10.1371/journal.
teléfono.0122515.