FUNGITEST TM 60780

10 PRUEBAS
DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DE LOS
HONGOS A LOS AGENTES ANTIFUNGICOS
1- INTERES CLINICO
En los últimos años se ha observado un nuevo brote de infecciones por
hongos, y ello debido al aumento del número de individuos inmuno-
deficientes (9).
Esto se debe principalmente al uso de quimioterapias anticancerosas más
potentes, a tratamientos inmunosupresores más intensivos en receptores
de trasplantes y al uso de antibióticos de amplio espectro (2, 3).
Este brote se acompaña de un aumento del número de especies
patógenas identificadas (10) y de la aparición de resistencia en las
especias previamente conocidas.
En este nuevo contexto puede ser de utilidad una prueba in vitro de la
sensibilidad de los hongos a los agentes antimicóticos (1, 4, 7, 8).
FUNGITESTTM logra este objetivo, ya que permite la determinación de la
sensibilidad de los hongos a los agentes antimicóticos según un método
estandarizado derivado de un método de referencia (5, 6), fácil de llevar a
cabo y de interpretar.

2- PRINCIPIO
FUNGITESTTM se usa para estudiar el crecimiento de hongos en presencia
de 6 agentes antimicóticos a 2 diferentes concentraciones, en un medio
tamponado RPMI 1640 modificado, en presencia de un indicador de
oxidorreducción.
La verificación del crecimiento se basa en la reducción del indicador de
color, que hace pasar el medio desde el color azul al rosa. Cuando el
agente antimicótico inhibe el crecimiento, el medio permanece de color
azul.
Esta prueba, que se lleva a cabo en una microplaca de 16 pocillos,
consiste en:
• 2 pocillos para el control del crecimiento
• 12 pocillos que contienen los agentes antimicóticos deshidratados
(6 agentes antimicóticos a 2 concentraciones diferentes)
• 2 pocillos para el control negativo
Un inóculo calibrado de la cepa que se va a someter a prueba se diluye en
el “medio de suspensión” y luego se distribuye en cada uno de los
pocillos de la microplaca.
El “medio de suspensión” inoculado vuelve a hidratar los agentes antimi-
cóticos presentes en cada pocillo.

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 Las concentraciones antimicóticas obtenidas corresponden a concentraciones
discriminadoras, que permiten la clasificación de las cepas en:
• cepas sensibles (S)
• cepas intermedias (I)
• cepas resistentes (R)
Los umbrales de discriminación han sido escogidos de acuerdo con el estudio
de la distribución de los agentes antimicóticos M.I.C. obtenidos con
microplacas prototipos utilizadas con el mismo procedimiento que el
FUNGITESTTM.
Este estudio preliminar (11) fue llevado a cabo en dos laboratorios de
referencia, la Unidad de Micología del Instituto Pasteur de París y el
Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Farmacia de Montpellier; se
seleccionaron 193 cepas para que fuesen representativas de cepas aisladas
en la práctica médica corriente, con la inclusión de cepas resistentes. En dicho
estudio, 8 diluciones de 6 fármacos antimicóticos fueron sometidas a prueba y
se obtuvo la distribución de los M.I.C. resultantes obtenidos. Sobre la base de
las gráficas de distribución y de los datos de la literatura médica reciente se
seleccionaron 2 concentraciones para cada fármaco antimicótico para la
presentación final de la galería.
Ante la ausencia de recomendaciones internacionales actuales que den una
interpretación de los M.I.C., los umbrales de discriminación constituyen un
compromiso y podrían ser modificados en el futuro: se necesitan otros
estudios que definan la correspondencia entre los resultados obtenidos in vitro
y su importancia clínica.

3- COMPOSICION DEL ESTUCHE

FUNGITESTTM incluye:
• Microplate : 10 microplacas individualmente envasadas de 16 pocillos
(el diagrama de la microplaca está indicado en la etiqueta).
• 10 películas adhesivas
• Suspension medium : 10 frascos que contienen 3 ml de medio de
suspensión listo para su uso
Cada microplaca está individualmente envasada en una bolsa de aluminio
precintada con una película adhesiva y un deshumidificador.

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 Diagrama de la microplaca
T+ ➩ Control positivo
5 FC ➩ 5- fluorocitosina (2-32 µg/ml)
AB ➩ amfotericina B (2-8 µg/ml)
MCZ ➩ miconazol (0,5-8 µg/ml)
KET ➩ ketoconazol (0,5-4 µg/ml)
ITR ➩ itraconazol (0,5-4 µg/ml)
FLU ➩ fluconazol (8-64 µg/ml)
T- ➩ Control negativo

4- CONSERVACION
Los reactivos, conservados a +2 – 8°C, son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en el estuche.

5- MATERIAL REQUERIDO, PERO NO INCLUIDO

• Micropipetas de 20 µl y 100 µl
• Micropipetas de 20 µl y 100 µl
• Conos estériles
• Opacity control 1 Mac Farland: código 56499
• Incubadora a 37°C y 32°C.

6- PROCEDIMIENTO
A) PREPARACION DE LA SUSPENSION DE HONGOS
• Se utiliza una pipeta para tomar 2 colonias similares de un cultivo puro y
fresco obtenido en un medio de Sabouraud con o sin antibióticos y se
introducen en 3 ml de agua destilada estéril con vistas a obtener un
primer inóculo calibrado con un equivalente de opacidad con el estándar
Mac Farland nº 1 (Opacity control 1 Mac Farland), por ejemplo, ≈ 3 x 106
hongos/ml.

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• Con una pipeta calibrada se diluyen 100 ìl de este inóculo en 1,9 ml de
agua destilada esterilizada.
• Se inoculan 20 ml de la dilución obtenida en el medio de suspensión
incluido en el estuche. La concentración del inóculo es ahora
equivalente a ≈ 1 x 103 hongos/ml.

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 B) INOCULACION DE LA MICROPLACA
• Con una pipeta calibrada se distribuyen 100 µl de esta suspensión en
cada pocillo de la microplaca.
• Se cubre con la película adhesiva.
C) INCUBACION DE LA MICROPLACA
Se incuba : - a 32 °C durante 72 h para Cryptococcus neoformans
- a 37 °C durante 48 h para los demás hongos.
D) LECTURA E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
• Sólo se examinará la placa cuando los pocillos del control positivo (T+)
sean de color rosa.
• Se observará cualquier cambio de color en los pocillos que contienen el
agente antimicótico, en comparación con los pocillos negativos de
control (de color azul).
• Se interpretará de acuerdo con el color de los 2 pocillos de cada agente
antimicótico:
- Azul-Azul = ausencia de crecimiento: cepa inhibida por el agente
antimicótico in vitro
- Rosa-Azul = crecimiento lento: cepa intermedia
- Rosa-Rosa = crecimiento: cepa no inhibida por el agente antimicótico
in vitro.

7- PRECAUCIONES DE USO
No se deben usar los reactivos después de la fecha de caducidad.
RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD
Las cepas y los reactivos inoculados son potencialmente infecciosos; se
deben manipular con las precauciones habituales y se deben desechar de
acuerdo con los reglamentos actuales de higiene y seguridad para este
tipo de productos.

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8- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA
Los resultados de FUNGITESTTM se controlan utilizando las siguientes
cepas:
CEPAS RESULTADO DEL CULTIVO A LAS 48 HORAS A 37°C
T+ 5FC AB MCZ KET ITRA FLU T-
C. tropicalis ATCC 750 Rosa S S/I S/I S S/I S Azul
C. krusei ATCC 6258 Rosa I S/I I S/I S/I I Azul
C. albicans CIP 884.65 Rosa S S/I S/I S S S Azul
C. glabrata SDP A35 Rosa S S S/I I I/R I/R Azul
C. parapsilosis ATCC 22019 Rosa S S S/I S S/I S Azul
C. neoformans SDP B53* Rosa S/I S S/I S/I S/I I/R Azul

* Incubación durante 72 horas a 32 °C

9- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE

Todos los reactivos han sido fabricados de acuerdo con nuestro Sistema
de Calidad, desde la recepción de las materias primas hasta la
comercialización final del producto. Cada lote se somete a verificaciones
de control de calidad y únicamente se comercializa en el mercado cuando
está conforme con criterios predefinidos de aceptación. Los informes
relativos a la producción y el control de cada lote individual se conservan
en Bio-Rad.

10- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Ver la versión Francesa.

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10- REFERENCES
1. ANAISSIE ELIAS J, KARYOTAKIS NICHOLAS C, HACHEM RAY, DIGNANI MARIA
C., REX JOHN H., AND PAETZNICK VICTOR. Correlation between In Vitro and In
Vivo Activity of Antifungal Agents against Candida Species. The Journal of
Infection Diseases 1994 ; 170 : 384-389.
2. BERENGUER J, FERNANDEZ-BACA V , SANCHEZ R, BOUZA E. In Vitro Activity
of Amphotericin B, Flucytosine and Fluconazole against Yeasts Causing
Bloodstream Infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995 ; 14 : 362-365.
3. DROMER F, DUPONT B. The increasing problem of fungal infections in the
immunocompromised host. J. Mycol. Méd. 1996 ; 6, Suppl. I : 1-6.
4. ESPINEL-INGROFF A, PFALLER MA. Antifungal agents and susceptibility testing.
In MURRAY PR, BARON EJ, PFALLER MA, TENOVER FC, YOLKEN RH, eds.
Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. Washington, DC : American Society for
Microbiology, 1995.
5. ESPINEL-INGROFF A, RODRIGUEZ-TUDELA JL, and MARTINEZ-SUAREZ JV.
Comparison of Two Alternative Microdilution Procedures with the National
Committee for Clinical Laboratory Standards Reference Macrodilution Method
M27-P for In Vitro Testing of Fluconazole-Resistant and -Susceptible Isolates of
Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 1995 ; 33 : 3154-3158.
6. NCCLS. Antifungal Susceptibility Testing; Committee Report. NCCLS document
M27-T. NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, Pennsylvania. October
1995.
7. PAUGAM A. Intérêt de l'étude in vitro de la sensibilité des levures aux
antifongiques. Revue française des laboratoires. 1996 ; 282 : 157-159.
8. PFALLER MA, BUSCHELMAN B, BALE MJ, et al. Multicenter comparison of a
colorimetric microdilution broth method with the reference macrodilution method
for in vitro susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994 ;
19 : 9-13. 4
9. WALSH TJ, GONZALEZ C, ROILIDES E, MUELLER BU, ALI NASR, LEWIS LL,
WHITCOMB TO, MARSHALL DJ, and PIZZO PA. Fungemia in Children Infected
with the Human Immunodeficiency Virus : New Epidemiologic Patterns, Emerging
Pathogens, and Improved Outcome with Antifungal Therapy. Clin. Infect. Dis.
1995 ; 20 : 900-906.
10. WINGARD JR. Importance of Candida Species Other than C. albicans as
Pathogens in Oncology Patients. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 115-125.
11. GARRIGUES ML, MALLIE M, DUPONT B, BASTIDE JM, CARLS B, DROMER
F. Evaluation d’une galerie pour tester la sensibilité des levures aux
antifongiques. Colloque de la Société Française de Mycologie Médicale,
Institut Pasteur, 22-23 Novembre 1996.
(GB) • This product contains human or animal components. Handle with care.
(FR) • Ce produit contient des composants d'origine biologique humaine ou animale. Manipuler avec précaution.
(ES) • Este producto contiene componentes humanos o animales. Manejar con cuidado.
(IT) • Questo prodotto contiene componenti umane o animali. Maneggiare con cura.
(DE) • Dieses Produkt enthält Bestandteile menschlichen oder tierischen Ursprungs. Vorsichtig handhaben.
(PT) • Este medicamento contém componentes de origem humana ou animal. Manuseie com cuidado.
(SE) • Denna produkt innehåller beståndsdelar från människa eller djur. Hantera produkten varsamt.
(DK) • Dette produkt indeholder humane og animalske komponenter. Skal behandles med forsigtighed.
(GR) • Αυτό το προϊόν περιέχει ανθρώπινα ή ζωικά στοιχεία. Χειριστείτε το µε προσοχή.
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