TALLER DE LABORATORIO 5: TÉCNICA DE PCR (REACCIÓN EN

CADENA DE LA POLIMERASA)
ASIGNARURA: LABORATORIO DE GENÉTICA

1.Análisis del Video instructivo sobre la técnica, que se puede revisar a partir del Link:

https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E
2. Además de la observación y análisis del video complementar con búsqueda bibliográfica
acerca del fundamento de la técnica de Reacción en cadena de la Polimerasa(PCR) y
responder los siguientes aspectos:
a. Qué es la PCR y a quien se debe su descubrimiento?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase
Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en
biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un
fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molécula. La PCR se
basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos nuevas
hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. En procariontes se han
encontrado al menos 12 proteínas involucradas en la replicación. Estas proteínas actúan en
diferentes actividades, como: 1) la identificación del sitio de origen de la replicación; 2) el
desenrollamiento de la doble hélice; 3) la estabilización de la estructura desenrollada; 4) la
generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo 3’ libre que sirve de
iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad catalizadora; 5) el avance de
la bifurcación replicadora por desenrollamiento; 6) los pasos finales del ensamblaje de dos
cadenas complementarias; 7) la identificación de los sitios de terminación y 8) el
superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN (Figura 1). Sin embargo, la
enzima más importante en la replicación es la polimerasa del ADN dependiente de ADN,
comúnmente conocida como ADN polimerasa, porque es la encargada de incorporar
nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de ADN.[ CITATION Ale01 \l 9226 ]
La PCR surgió en 1971 cuando Gobind Khorana describe la técnica al explicar la
replicación de un fragmento de ADN usando dos iniciadores (Kleppe et al. 1971). Pero fue
en 1983 cuando Kary Mullis y sus compañeros de la compañía californiana Cetus
Corporation la llevaron a cabo por primera vez mientras trabajaban en la fabricación de
oligonucleótidos y en el uso de iniciadores para la secuenciación de ADN. Mullis y
colaboradores usaron dos iniciadores que se alineaban con cada una de las hebras del ADN,
adicionaron ADN polimerasa I de Escherichia coli y nucleótidos trifosfatados. Como
resultado obtuvieron la replicación exponencial del fragmento de ADN flanqueado por los
iniciadores (Mullis y Faloona 1987).[ CITATION Che94 \l 9226 ]
b. Realiza una lista de los materiales y equipos que se emplean para realizar una PCR?
c. Qué función cumple cada reactivo?
d. Cuáles son las etapas en que se lleva a cabo una PCR. Explica cada una e indica las
respectivas temperaturas
Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha
convertido en una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones
van desde la genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina
forense. ¿Pero cómo funciona el PCR? Supongamos que ya tenemos los tubos listos con
todo lo necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq
polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y
oligonucleótidos). [ CITATION Die95 \l 9226 ]
El siguiente paso es colocar los tubos en una máquina conocida como
termociclador, que básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy
precisas. ¿Cómo es que se amplifica el (o los) fragmento(s) que queremos? [ CITATION Die95
\l 9226 ]

Primero, para hacer más sencilla la explicación, vamos a suponer que esperamos un
solo fragmento de un tamaño determinado, y lo que sucede es lo siguiente (ver el primer
ciclo de la figura 1): el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas
distintas, que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera
es a 95ºC (y a este paso se le llama desnaturalización) durante la cual las dobles cadenas
del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el
termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40º y 60ºC (llamada de
alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de
hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que
son complementarias) durarán mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados”
formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño
pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas
bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión
y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. [ CITATION Die95 \l 9226 ]
Después la temperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como extensión), ya que
72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continúa la
síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se habían
alineado. En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán los primeros
fragmentos a partir del ADN genómico. Estos primeros fragmentos no tendrán el tamaño
esperado, serán un poco más grandes ya que la taq copiará hasta donde le sea posible, pero
como veremos más adelante, se obtendrán en cantidades tan pequeñas que al final no
podremos detectarlos. Después se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este
segundo ciclo, los oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio,
también se unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo (ver segundo ciclo
de la figura 1), por lo tanto en este segundo paso la polimerasa sintetizará 2 fragmentos
largos copiados directamente del ADN y 2 fragmentos del tamaño esperado, que es el
tamaño que hay entre los dos oligonucleótidos que hemos usado. [ CITATION Die95 \l 9226 ]
De esta forma con cada ciclo aumentará el número de fragmentos del tamaño que
queremos. Cabe mencionar que antes y después de estos ciclos se programan dos pasos,
uno de 95ºC durante varios minutos para iniciar con desnaturalización, y al final de los
ciclos, un paso último de extensión a 72ºC para permitir que la taq termine de sintetizar
todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.[ CITATION Die95 \l 9226 ]
e. Cuál es la importancia de la concentración de magnesio en la reacción.
La especificidad de la PCR depende, fundamentalmente, de la temperatura
empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a
la reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores). Por una parte, cuanto
mayor sea la temperatura utilizada en la fase de hibridación, más específica es la reacción.
Esto se debe a que a mayor temperatura más dificultada se ve la unión entre el cebador y la
cadena molde; en condiciones de temperaturas de hibridación elevadas el cebador sólo se
unirá a la cadena molde si son complementarios en todos sus nucleótidos. Por otra parte, en
un determinado rango, incrementos en la concentración de MgCl2 hacen disminuir la
especificidad de la reacción; los iones facilitan la unión del cebador a la cadena molde y
permiten la incorporación de los nucleótidos a la cadena creciente.[ CITATION Pér18 \l 9226 ]
f. Formación de dímeros de cebadores.
Un dímero Primer (PD) es un potencial subproducto en PCR , un método
biotecnológico común. Como su nombre indica, un PD consta de cebadores moléculas que
se han adherido ( hibridadas ) entre sí a causa de las cadenas de complementarios bases en
los cebadores. Como resultado, la ADN polimerasa amplifica la PD, lo que lleva a la
competencia por los reactivos de PCR, por lo tanto potencialmente la inhibición de la
amplificación del ADN secuencia diana para la amplificación por PCR. En la PCR
cuantitativa , PDs pueden interferir con la cuantificación precisa.[ CITATION COR04 \l 9226 ]
Un dímero de cebadores se forma y se amplificó en tres pasos. En el primer paso,
dos cebadores recocidos a sus respectivos extremos 3' (paso I en la figura). Si esta
construcción es lo suficientemente estable, la ADN polimerasa se unirá y extender los
cebadores de acuerdo con la secuencia complementaria (etapa II en la figura). Un factor
importante que contribuye a la estabilidad de la construcción en la etapa I es un
alto contenido de GC en los extremos 3' y la longitud del solapamiento. El tercer paso se
produce en el siguiente ciclo, cuando se utiliza una sola hebra de producto de la etapa II
como una plantilla a la que los cebadores frescas recocido conduce a la síntesis de más
producto PD.[ CITATION COR04 \l 9226 ]

g. Como se calcula teóricamente la temperatura de hibridación (Tm) según:

A) Método de Wallace
B) Método del contenido de GC
C) Método termodinámico
¿Cuantas copias del fragmento hay al final del 3º ciclo de una reacción de PCR?
Explíquelo.
Por cada molécula de DNA inicial, al final del 3º ciclo hay 2 copias del segmento
diana y 6 copias de segmentos de DNA de longitud variable.
h. Cuál es el rango en el número de nucleótidos en los primers?

i. Resuelve el siguiente glosario:

Amplicón, amplicon: Conjunto de moléculas de ADN idénticas, resultado de una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Esencialmente, se trata de un clon molecular. [ CITATION
Ram15 \l 9226 ]

Desnaturalización térmica: Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las

estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.
Primers (Oligonucleótidos): Un iniciador o cebador es una secuencia corta de ADN de
cadena simple que se utiliza en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el
método PCR se emplea un par de cebadores para hibridar con el ADN de la muestra y
definir la región del ADN que será amplificada. También se les conoce como
oligonucleótidos.[ CITATION Mau10 \l 9226 ]
Hibridación: La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a
partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de
un proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN
para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena[ CITATION Ped11 \l 9226 ]
Ciclo de amplificación: un ciclo de amplificación consta de tres etapas: separación de las
hebras de ADN (desnaturalización), unión de los iniciadores a una secuencia
complementaria del ADN molde (alineamiento) y la síntesis semiconservativa de una nueva
cadena por adición de nucleótidos debido a la acción de la ADN polimerasa (extensión).
[ CITATION Tam13 \l 9226 ]

dNTP: Un nucleósido trifosfato es una molécula que contiene una base nitrogenada unida a
un azúcar de 5 carbonos, con tres grupos fosfato unidos al azúcar. Son los componentes
básicos tanto del ADN como del ARN, que son cadenas de nucleótidos creadas a través de
los procesos de replicación y transcripción del ADN[ CITATION Ana19 \l 9226 ]
Efecto Platteau: Amplificar por encima del mismo lleva a la formación de productos
inespecíficos y a la pérdida de fragmentos deseados por la actividad exonucleasa de la
polimerasa.
Contenido de G : C: En genética, GC, Contenido GC o Porcentaje GC (contenido
de guanina y citosina) es una característica del genoma de un organismo o de cualquier
pedazo de ADN o ARN. G y C denotan guanina y citosina, respectivamente. Expresado
generalmente como porcentaje, representa la cantidad de pares Guanina-Citosina en la
molécula de ADN o genoma que está siendo investigado[ CITATION Ale01 \l 9226 ]
Temperatura de fusión (Tm): Temperatura de fusión (Tm): Es la temperatura a la cual
un polímero pasa de un estado sólido a un estado líquido (fundido); sólo se aprecia en
polímeros cristalinos.[ CITATION COR04 \l 9226 ]
Agentes quelantes: Traducción del inglés-La quelación es un tipo de unión de iones y
moléculas a iones metálicos. Implica la formación o presencia de dos o más enlaces
coordinados separados entre un ligando polidentado y un solo átomo central. Estos ligandos
se denominan quelantes, quelantes, agentes quelantes o agentes secuestrantes. [ CITATION
Gab11 \l 9226 ]

Enzima Taq polimerasa La Taq DNA Polimerasa es una enzima termoestable de

aproximadamente 94 kDa, aislada de la eubacteria Thermus aquaticus, cepa YT-1 (1). Esta
enzima replica el DNA a 72 ° C. La enzima cataliza la polimerización de nucleótidos en
DNA de doble hebra en dirección 5' → 3', en presencia de iones de magnesio, y muestra
actividad exonucleasa 5' → 3'. La enzima está altamente purificada y libre de exonucleasas
endonucleasas o nucleasas inespecíficas. [ CITATION Win \l 22538 ]
Enzima Vent polimerasa Esta enzima tiene actividad exonucleásica de 3’ a 5’, que les
permite eliminar los residuos mal apareados hasta que se forme un extremo con bases
correctamente unidas. Sin embargo, la actividad exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la
degradación de los cebadores. Por tanto, la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la
reacción, o bien habría que utilizar cebadores modificados químicamente. [ CITATION MSo \l
22538 ]

Enzima Pfu polimerasa: PFU es una enzima termoestable con un peso molecular de 92
kDa. Esta enzima replica ADN en dirección 5´ - 3´ a 75ºC, y posee actividad exonucleasa 3
´- 5´ (proofreading). Recomendada para su uso en reacciones de PCR debido a su alta
fidelidad. Esta ADN polimerasa genera fragmentos de PCR con extremos romos Es
purificada a partir de una cepa de E. coli recombinante mediante diferentes etapas
cromatográficas que aseguran su pureza y calidad. [ CITATION emb \l 22538 ]
Termociclador: También llamado secuenciador térmico es un equipo que permite la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de forma eficiente y rápida; mediante la
realización automática y cíclica de los cambios de temperatura que se requieren para la
amplificación de una cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN); a partir de una enzima
termoestable. [ CITATION kal20 \l 22538 ]
Master Mix. Es un producto diseñado para disminuir tiempos en la preparación de la
reacción de PCR y evitar contaminaciones en las etapas de pipeteo, permitiendo obtener
mayor reproducibilidad en los resultados. La Master mix PCR contiene todos los
componentes necesarios para una reacción de PCR. Las concentraciones de sus reactivos
han sido optimizadas para obtener una alta performance. [ CITATION PBL \l 22538 ]
Marcador de peso molecular están diseñados para visualizar la migración del DNA en geles
de agarosa y poliacrilamida. Su mezcla de compuestos como el glicerol ayudan a precipitar
la muestra y EDTA para inhibir la actividad de nucleasas. Los marcadores para PCR
contienen una mezcla de ocho fragmentos de ADN que van desde 50 a 2000 bp, en
cómodos intervalos de tamaño, para analizar pequeños segmentos de ADN. [ CITATION
PBL \l 22538 ]

Tubos para PCR. Son pequeños contenedores cilíndricos de plástico, con un

fondo cónico y típicamente una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su
desprendimiento. Son empleados profusamente en biología molecular y bioquímica no sólo
para la centrifugación, sino que, dado su bajo costo, se emplean a menudo como simples
viales contenedores de sustancias químicas.
Solución tampón para PCR
Cadena molde de DNA: Se refiere a la cadena de ADN de cadena sencilla que es utilizada
para sintetizar otra molécula de ADN de cadena sencilla o de ARN.
José Alquicira. (2016). ADN molde. 2020, Julio 3, Conogasi.org Sitio web:
http://conogasi.org/diccionario/adn-molde/
Agua libre de DNAsas y RNAsas
Soluciones libres de nucleasas (DNasa, RNasa) que puedan provocar la fragmentación de
los oligonucleótidos está ampliamente reconocida; sin embargo, la influencia de otros
contaminantes trasmisores de enfermedades a través del agua raramente se considera. Estos
pueden provocar problemas con los resultados de las pruebas, por lo que es vital que el
agua a utilizar este libre de contaminantes trasmisores de enfermedad.

BIBLIOGRAFÍA

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