“Determinación de E-

coli y pruebas
bioquímicas de
identificación
bacteriana”

INTEGRANTES:

Jhon Andersson Basurto 20161452E S2

Hugo Andres López Falcón 20141094F S3

Cesar Rubén Campos Pérez 20202237F S2

Leonardo Cornejo Quiñones 20200486I S2

Yolay Afner Rojas Bautista 20202218A S2

Jhon Mallqui Payano 20175001K S2

Victor Vasquez Retamozo 20140457H S2

FECHA: 20/06/21
 Jamil Ángel Pisco Zanabria
Curso: Microbiologia
 Cristian Luis Núñez Munguía
Prof. : MSc. Blgo. Alvaro Martín Martínez Vila
Escuela : Ingeniera de Higiene y Seguridad
 Cesar Rubén Campos Pérez
Industrial

 Leonardo Javier Cornejo Quiñones

 Hector Fabrizzio Landeo Vilela

 2

INDICE

RESUMEN……………………………………………………………………………………….…3
INTRODUCCION………………………………………………………………………………...4
OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………6
MARCO TEORICO……………………………………………………………………………….6
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL…………………………………………………….12
RESULTADOS……………………………………………………………………………………13
DISCUSION DE RESULTADOS…………………………………………………………….15
CONCLUSIONES..………………………………………………………………………………16
RECOMENDACIONES………………………………………………………………………..17
CUESTIONARIO…………………………………………………………………………….…..18
FUENTES DE INFORMACION……………………………………………………….…….22
ANEXOS……………………………………………………………………………………….…..23
APRENDICE………………………………………………………………………………..…….25
Diagrama de flujo………………………………………………………….25
Datos originales y observaciones…………………………………..29
Procedimiento Cálculo………………………………………………….
Datos Calculados………………………………………………………….
Análisis de Error…………………………………………………………..
.

P á g i n a 2 | 36
 3

RESUMEN
Cuando se desea cuantificar el numero de bacterias presentes en múltiples muestras,
los procedimientos de rutina suelen consumir mucho tiempo. En ese periodo las
muestras podrían sufrir modificaciones en su población. En el presente trabajo se evaluó
una metodología alternativa para cuantificar bacterias cultivables de forma masiva,
rápida y económica en la que se implica el sellado, estampado o impresión de diluciones
seriadas de muestras de diversa procedencia. El tiempo requerido para preparar 22
muestras para su sellado en placa es de 15 minutos. El método se basó en realizar
diluciones seriadas (base 10) de las muestras líquidas originales contenidas en una
placa multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal. Después, con un replicador se
tomó un volumen (aproximadamente 1,65 µl) de muestra de cada pozo, que se inoculó
por sellado en un medio de crecimiento gelificado de interés. Las placas se incubaron el
tiempo necesario, se contó el número de colonias presentes en la dilución contable y se
calculó el número de Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/ ml) para cada
muestra. La metodología se denominó “Goteo por Sellado en Placa Masivo” (GSPM) y
ha sido aplicada para cuantificar exitosamente bacterias provenientes de diferentes
muestras de laboratorio, por ejemplo, de cultivos líquidos, muestras clínicas (como
exudados y secreciones) y bacterias presentes en la rizosfera de plantas de maíz. Sin
embargo, la metodología GSPM podría aplicarse para contabilizar masivamente a
bacterias de cualquier otra procedencia.
Cuantificar la población de microorganismo aerobios viables en determinada muestra.
Conocer el numero de microorganismo aerobios que contiene un alimento, familiarizarse
con métodos directos para la obtención de microorganismo utilizando el método de
recuento de colonias en placa.
Determinar si el producto alimenticio que se analiza está en condiciones aptas para el
consumo humano.

Determinar cuánto microorganismo presenta la muestra que analizamos.

P á g i n a 3 | 36
 4
INTRODUCCIÓN
La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología
microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un
efecto benéfico o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección
severa, sino también es importante saber el número de microorganismos implicados,
para establecer si éstos serán capaces de desarrollar una función benéfica o perjudicial.
Distintas han sido las estrategias para contabilizar a los microorganismos cultivables en
muestras ambientales y de laboratorio; las
cuales presentan ventajas y desventajas. El
conteo de bacterias podría realizarse
mediante el método del Número Más
Probable (NPM), éste es útil para contabilizar
bacterias que son difíciles de aislar de una
muestra, pero que pueden ser detectadas
por la actividad de alguna característica
metabólica. Por ejemplo el conteo de las
especies bacterianas que son capaces de
captar nitrógeno atmosférico, bajo
condiciones microaerofílicas (Cavalcante y
Döbereiner, 1988) se ha realizado mediante
el método NPM usando medios
semigelificados carentes de nitrógeno; las tablas de Mac Grady son útiles en estos
casos. La metodología de recuento en placa por plaqueo es una metodología
ampliamente utilizada (Hoben y Somasegaran, 1982), que consiste en realizar diluciones
seriadas 1:10 y extender 100µl de cada dilución en una placa; las placas se incuban
hasta que las colonias son apreciables para
su recuento. Esta metodología tiene la
ventaja de tener un buen límite de
detección, sin embargo, consume mucho
tiempo durante los plaqueos; en el caso de
realizar el recuento de bacterias a partir de
muestras cuya población se desconoce se
requiere realizar el extendido de 7
diluciones y la muestra original (para cada
conteo) lo que significa consumir 8 placas
de cultivo y alrededor de 25 minutos para
los plaqueos, sin tomar en consideración
repeticiones. Para disminuir el tiempo de
procesamiento de muestra, la metodología
ha sufrido modificaciones al paso del tiempo

P á g i n a 4 | 36
 5
y en la actualidad se usan bolitas de acrílico en lugar de un asa de vidrio para extender
las muestras.
El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos para
determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean sólidos
como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos
métodos tenemos la numeración de microorganismos aerobios mesófilos, la cual nos
permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre
su superficie o en su interior. Por otro lado las técnicas para poder encontrar la
numeración de aerobios mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por
profundidad, superficie o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de
gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. El recuento total de
bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o pronta
alteración de los alimentos, dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. En el
grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se
estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Un recuento bajo de
aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de
la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora
bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos
elevados. Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminación de la materia
prima. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. La posibilidad de que
existan patógenos, pues estos son mesófilos. La inmediata alteración del producto. El
recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

OBJETIVOS
OBJETIVO ESPECÍFICO
Determinar la presencia o ausencia de Escherichia coli en las
muestras mediante métodos bioquímicos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar la correcta interpretación para el recuento de E.
coli.
• Conocer las características bioquímicas que permitan
observar las diferencias de las enterobacterias.
• Identificar la producción de indol como producto de la
degradación del triptófano.
• Evaluar la presencia del E. coli como indicador fecal.
• Verificar la producción de indol como producto de la
degradación del triptófano.
• Evaluar la utilización de citrato como fuente única de carbono.
• Manejar el método del NMP y su correcta interpretación en el análisis microbiológico.

P á g i n a 5 | 36
 6

MARCO TEÓRICO:
ECHERICHIA COLI: E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente
estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y
modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de índole (Neidhardt, 1999).
Forma parte de la familia Enterobacteriaceae (Ewing,1985). Ella está integrada por bacilos
Gram negativos no esporulados, móviles con flagelos 5 perítricos o inmóviles, aerobios-
anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin
agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos,
catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una
proporción G + C de 39 a 59% en su ADN.
Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua, vegetales
y gran variedad de animales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patología
humana puede cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente de todos
los aislamientos clínicamente significativos en los laboratorios microbiológicos, y hasta el 80%
de todos los bacilos Gram negativos identificados. Integran también esta familia otros géneros
que se consideran en otros capítulos por su asociación con infecciones intestinales, como son
Salmonella, Shigella y Yersinia.
E. coli es la especie tipo del género Escherichia. Incluye gérmenes generalmente móviles, que
producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros
azúcares.
Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de VoguesProskauer. Son inhibidos
por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y energía,
pero sí en caldo acetato. Son 𝐻2𝑆, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol
positivos y decarboxilan la lisina. Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las
características antigénicas de su LPS, y en serotipos por la combinación de antígenos O y H
flagelares.
E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del niño, y establece con el
huésped una relación estable de mutuo beneficio (Drasar y Hill, 1974). Como integrante de la
flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de
contaminación fecal cuando está presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros
similares agrupados bajo la denominación de "bacterias coliformes".
Estas son enterobacterias que pertenecen al género Escherichia y a otros relacionados como
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en común la capacidad de
fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con producción de ácido y gas.
Son gérmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferación, y a la vez de fácil cultivo e
identificación y por lo tanto muy útiles como indicadores de contaminación.
Características generales:
• Las bacterias del género E. coli son Gramnegativas, tienen forma de barra y pertenecen a la
familia Enterobacteria. Esta bacteria es un habitante común de los intestinos de todos los
animales, incluido el de los humanos.

P á g i n a 6 | 36
 7
• Escherichia coli (E. coli) es quizás el organismo procarionte más estudiado por el ser humano,
se trata de una bacteria unicelular que se encuentra generalmente en los intestinos animales y
por ende en las aguas negras.
• Ésta y otras bacterias son necesarias para el correcto funcionamiento del proceso digestivo,
además, producen vitaminas B y K. Los serotipos se asocian con virulencia.
• Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaeróbico
facultativo, móvil por flagelos perítricos, no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y
la lactosa.
• Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología
molecular. Cuando se usan métodos de cultivos aeróbicos, esta bacteria es la especie
dominante encontrada en las heces.
• Normalmente cumple una función importante en el cuerpo, suprimiendo el crecimiento de
especies dañinas de bacterias, así como también sintetizando cantidades apreciables de
vitaminas.
Clasificación:
Se distinguen seis cepas según su capacidad patógena, también se les puede llamar virotipo:
1. Escherichia coli enteropatogénica (ECEP)
Estas bacterias son moderadamente invasivas, es decir penetran en las células hospedadoras
provocando una respuesta inflamatoria. Carece de fimbrias y no produce las toxinas ST y LT,
pero utilizan la proteína intimina, una adhesina, para adherirse a las células intestinales.
Este virotipo posee una serie de factores de virulencia que son similares a los que se
encuentran en Shigella, como la toxina shiga. La adherencia a la mucosa intestinal causa una
reordenación de la actina en la célula hospedante, que induce una deformación significativa.
Esta cepa causa diarrea en humanos, conejos, perros y caballos, al igual que la
enterotoxigénica, pero la etiología y los mecanismos moleculares de colonización son
diferentes. La causa principal de diarrea en los afectados por esta cepa son seguramente los
cambios provocados en la estructura de las células intestinales.
2. Escherichia coli enterotoxigénica (ECET)
Se parece mucho a Vibrio cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la
invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios histológicos en las
células de la mucosa y muy poca inflamación. Produce diarrea no sanguinolenta en niños
y adultos, sobre todo en países en vías de desarrollo, aunque los desarrolló también se
ven afectados. Emplea varias toxinas, incluida la enterotoxina resistente al calor y la
enterotoxina termolábil.

3. Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI)

Es inmóvil, no fermenta la lactosa. Invade el epitelio intestinal causando diarrea
sanguinolenta en niños y adultos. Libera el calcio en grandes cantidades impidiendo la
solidificación ósea, produciendo artritis y en algunos casos arterioesclerosis. Es una de
las E. coli que causa más daño debido a la invasión que produce en el epitelio intestinal.

4. Escherichia coli enterohemorrágica o verotoxigénica (ECEH)

P á g i n a 7 | 36
 8
La convención internacional de nomenclatura de patógenos ha recomendado el uso de
STEC (Shiga Toxin Escherichia coli) para este grupo, debido a que estas bacterias
producen una toxina citotóxica para células Vero de cultivo de similaridad estructural a
la toxina producida por Shigella dysenteriae. Las STEC producen verotoxinas que
actúan en el colon. Sus síntomas son: primero colitis hemorrágica, luego síndrome
urémico hemolítico (lo anterior más afección del riñón, posible entrada en coma y
muerte), y por último, púrpura trombocitopenia trombótica (lo de antes más afección del
sistema nervioso central). Esta cepa no fermenta el sorbitol y posee un fago, donde se
encuentran codificadas las verotoxinas, también llamadas "Toxinas Shiga", no posee
una fimbria formadora de mechones, en vez de esto posee una fimbria polar larga que
usa para adherencia.

5. Escherichia coli entero agregada o entero adherente (ECEA)

Sólo encontrada en humanos. Son llamadas entero agregativas porque tienen fimbrias
con las que aglutinan células en los cultivos de tejidos. Se unen a la mucosa intestinal
causando diarrea acuosa sin fiebre. No son invasivas. Producen hemolisina y una entero
toxina ST similar a la de las enterotoxigénicas. Se le asocian dos toxinas: Toxina
termoestable enteroagregativa (EAST). Toxina codificada por plásmidos (PET).

6. Escherichia coli de adherencia difusa (ECAD)

Se adhiere a la totalidad de la superficie de las células epiteliales y habitualmente causa
enfermedad en niños inmunológicamente no desarrollados o malnutridos. No se ha
demostrado que pueda causar diarrea en niños mayores de un año, ni en adultos y
ancianos.

P á g i n a 8 | 36
 9
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica
de bacterias (por medio de la cual puede hacerse una identificación final de especie), se
lleva a cabo mediante el subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios
diferenciales, cuyos resultados pueden interpretar después de uno o dos días de
incubación.

PRUEBAS DEL IMVIC:

El IMVIC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone
de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, VogesProskauer y Citrato. El resultado de esta
prueba se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado
de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así,
por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-
- y para Klebsiella y Enterobacter es --++.

PRUEBA INDOL:
La prueba del indol es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para
determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta
división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un
sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.
Se genera el indol por una desaminación reductiva del triptófano vía la molécula
intermediaria ácido indol pirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de
desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de
triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco
(NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

INTERPRETACIÓN:
Tal como ocurre con muchas pruebas bioquímicas, los resultados de una prueba de indol
se indican con el cambio de color que sigue a la reacción. El cultivo bacteriano puro debe
ser sembrado en un caldo con triptófano o peptona estériles o ambos por 24 a 48 horas
antes de realizar la prueba. Luego de la incubación, se añaden cinco gotas de reactivo
de Kovacs para indol (alcohol isoamílico, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico
concentrado) al caldo del cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo
de Ehrlich (usando alcohol etílico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul
Ehrlich), en especial si se tiene un organismo que no sea fermentador y en organismo

P á g i n a 9 | 36
 10
anaeróbico. Este reactivo lleva el mismo nombre que el reactivo para la prueba de
oxidasa, aunque no debe confundirse, ya que su formulación química es totalmente
diferente, por ello se diferencian haciendo mención a la prueba para la que son
utilizados, como reactivo de Kovacs para oxidasa (diclorhidrato de tetrametil-p-
fenilendiamina) y reactivo de Kovacs para indol (alcohol isoamílico, p-
dimetilaminobenzaldehído y HCl concentrado). Los resultados positivos originan anillos
de Liesegang de un color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el
cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir
cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la presencia de escatol,
también conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible producto de la
degradación del triptófano.

PRUEBA DE ROJO DE METILO:

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y
6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la
formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un
carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún
carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa, aunque se pueden utilizar otros
carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo
como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo,
indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta
y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánicos producidos.
Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo).

INTERPRETACIÓN

P á g i n a 10 | 36
 11
La positividad viene dada por la formación de un anillo de color rojo o fucsia que se forma
al añadir el revelador: reactivo de Kovacs. Si al agregar el revelador no se observa
formación del anillo rojo, la prueba es negativa. Ejemplo: bacterias positivas para la
prueba de indol: Escherichia coli, Proteus vulgaris.

PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER:
Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicará que la
glucosa es fermentada por la vía butanodiólica. Las bacterias que utilizan la glucosa por
la vía del butilenglicol generan productos finales neutros como el butanodiol y el etanol,
produciéndose etanoína como intermediario, y el cual se detecta cuando se añaden al
medio los reveladores KOH al 40% y alfanaftol, que reaccionan con este compuesto
produciendo un color rojo (bacterias Vogues Prokauer positivas). Si las bacterias no
utilizan la glucosa por esta vía el medio permanece amarillo después de agregar los
reveladores (bacterias Vogues Prokauer negativas) Si en lugar de rojo de metilo se le
agrega al medio KOH al 40% y alfa-naftol, la prueba evalúa la capacidad de las bacterias
de utilizar la glucosa por la va del butilenglicol, se llama Vogues Prokauer y se interpreta
como positiva si, al añadir los dos reactivos reveladores el medio se torna rojo, negativa
si se torna amarillo. Ejemplo: bacterias del género Klebsiella son positivas. Es decir, que,
en ambos casos la positividad viene dada por la formación de color rojo.

P á g i n a 11 | 36
 12
PRUEBA DE CITRATO:
El agar de citrato se emplea comúnmente como parte de un grupo de pruebas
bioquímicas. Es un medio definido, selectivo y diferencial que prueba la capacidad de
un organismo para usar citrato como única fuente de carbono y iones de amonio como
única fuente de nitrógeno. El uso de los resultados de citrato en la creación de
carbonatos y bicarbonatos como subproductos. Los organismos capaces de utilizar el
fosfato de amonio dihidrogenado y citrato sódico como las únicas fuentes de nitrógeno
y carbón, respectivamente, crecerán en este medio y producirán una reacción alcalina,
detectada por el cambio de color del indicador de azul de bromotimol, el aumento del pH
provoca el cambio de color verde (neutro) a azul (alcalino). El cambio de color a azul es
útil porque el crecimiento en el agar de citrato de Simmons a menudo es limitado y sería
difícil de observar si no fuera por el cambio de color. A veces, es posible detectar el
crecimiento en el agar citrato de Simmons sin el cambio de color que lo acompaña a
azul. Esto se debe calificar como negativo para la prueba de uso de citrato. Bacterias
tales como Salmonella y Providencia se desarrollan en el medio.

P á g i n a 12 | 36
 13
PROCEDIMIENTO

a. Materiales, equipos y reactivos

MATERIALES
Asa de siembra Mechero de Bunsen.

Encendedor Alcohol.

Algodón Plumón marcador.

P á g i n a 13 | 36
 14

Equipos
Baño María 44.5° Incubadora 35°-37°C

Reactivos
Reactivo de Kovacs Reactivo A (α-Naftol 5%)

Reactivo B (KOH 40%) Reactivo Rojo de Metilo.

P á g i n a 14 | 36
 15
Medios

Tubos con 5 mL de caldo tripona Tubos con 5 mL de caldo MRVP

Tubos con 8 mL de Agar citrato. Tubos con 8 mL de Medio SIM

PROCEDIMIENTO
CONFIRMATIVO PARA E.coli
1. De cada tubo de caldo E.C. que presente formación de gas, transferir un inóculo a una
placa de agar Eosina Azul de Metileno (EMB) para obtener colonias aisladas.

2. Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35ºC.

P á g i n a 15 | 36
 16
3. Al término del período de incubación observar las colonias sospechosas, con centro
oscuro con o sin brillo metálico en el caso de usar Agar EMB.

4. De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo, e

incubar por 18 a 24 horas a 35ºC para realizar pruebas: morfológicas mediante
Tinción de Gram y bioquímica utilizando las reacciones IMViC. (Indol, Rojo Metilo,
Vogues Prokauer y Citrato).

P á g i n a 16 | 36
 17

PRUEBA DE INDOL

• Inocular el medio de cultivo (agua de peptona).

• Incubar a 37 °C durante 48 horas
• Añadir unas gotas de reactivo de Kovacs.

• Agitar y dejar reposar el cultivo.

P á g i n a 17 | 36
 18
PRUEBA DE ROJO DE METILO

• Inocular el caldo MR-VP. Incubar a 37 °C durante 48 horas.

• Añadir unas gotas de rojo de metilo (rojo a pH 4-5; amarillo a pH>5.5)

Prueba de Voges - Proskauer

• Inocular el caldo MR-VP. Incubar a 37 °C durante 48 hora
• Añadir unas gotas alfa-naftol (0.6 ml).

P á g i n a 18 | 36
 19
• Agitar y añadir KOH (0.2 ml).

• Agitar e incubar 1-2 horas a 37 °C.

Prueba de citrato
• Inocular el agar Citrato de Simmons por medio de una siembra por estría con
asa de platino.

• Incubar a 37 °C durante 48 horas.

P á g i n a 19 | 36
 20
5. Repetir la inoculación en caldo Lauril sulfato de sodio (x) para confirmar la producción
de gas.

6. Agregar TSI, LIA y SIM. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva para E.
coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a las
demás colonias.
Interpretación

Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de 48 hrs. A 35ºC,
aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea ++ - - son
considerados E. coli

Cálculo y expresión de resultados Escherichia coli

Calcular el NMP de E. coli, basándose en el número de tubos de caldo EC, en que se

confirmó la presencia de E. coli en 3 diluciones sucesivas y anotar los resultados.

TABLA DE DATOS Y RESULTADOS

P á g i n a 20 | 36
 21
Pruebas Resultado IMÁGENES

Indol (+) positivo

Rojo de metilo (+)positivo

Voges- proskauer (-) negativo

Citrato (-)negativo

H2S (-)negativo

Motilidad (+)positivo

P á g i n a 21 | 36
 22

LIA (-)negativo

1. En la prueba de Indol se formó un anillo rosa-rojizo en la superficie, indica que se ha

formado un complejo coloreado entre el indol y el p-dimetilamina benzaldehído. El
alcohol amílico concentra el complejo coloreado en la superficie.
2. La prueba de Rojo de Metilo, luego del tiempo de incubado a 37°C por 48 horas, se
agregó unas gotas del indicador rojo de metilo, a lo que la muestra viró a color rojo,
demostrando la acidez de la muestra con un pH 4-5 y dando como resultado positivo.
3. Para la prueba de Voges-Proskauer, no se tornó de color roja en los 20 minutos por lo
que la prueba salió negativa.
4. En la prueba de citratos, en medio de Simmons el cultivo no cambió a color azul en el
término de las 48 horas, sino que se quedó de color verde mostrando su incapacidad
para utilizar el citrato contenido en el medio y la posterior formación de productos
alcalinos; por lo tanto, la prueba produjo resultado negativo.
5. En el medio SIM, el cual sirve para detectar la presencia de hidrógeno sulfurado (H2S),
indol y motilidad. Luego de inoculada y sembrada la muestra, se produjo turbidez a los
lados de la línea de siembra, por lo que la prueba dio resultado positivo.
6. El color del pico es púrpura al igual que el color de la base del tubo (todo el medio es
de color púrpura), esto nos indica que no hubo cambio en el medio, por lo tanto, la
descarboxilacion de la lisina es positivo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se
visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.
Es negativo en la producción de ácido sulfhídrico y positivo en la lisina descarbosilaxa
en E.coli.

Calculo con el NMP de E.coli

Dilución -1 -2 -3 Resultados
Medio
Caldo EC 2 0 0 9.2

P á g i n a 22 | 36
 23

P á g i n a 23 | 36
 24

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 El recuento de microorganismos aerobios mesófilos, estima la microflora total sin

especificar tipos de microrganismos.

1. En cierto recuentro bajo de aerobios mesófilos no implica o no aserva la

ausencia de patógenos o sus respectivas toxinas.

2. En cambio, en cierto recuento elevado puede significar:

 Excesiva contaminación de la materia prima.
 Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.
 La posibilidad de que existan patógenos, ya que estos son mesófilos.
 La inmediata alteración del producto.

3. El recuento se puede hacer mediante la técnica de inoculación y vertido o por

agotamiento en superficie, esta última técnica es la que procederemos a
desarrollar.

 Como interpretar los resultados:

 UFC/g = número de colonias contadas en la placa * factor de dilución * 10.
 En el caso de nuestro experimento:
UFC/g = 100 * 10 * 10 = 10000 UFC/g.

CONCLUSIONES:

 Se estima la biota total, pero sin especificar el tipo de microorganismo.

 Esta determinación refleja:
 La calidad sanitaria de los productos analizados.
 Las condiciones higiénicas de la materia prima.
 La manipulación durante la elaboración.
 Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas.
Permite conocer las condiciones de salubridad de algunos alimentos

P á g i n a 24 | 36
 25
RECOMENDACIONES

 El laboratorio es un lugar de trabajo donde se realizan experimentos, por lo que

se requieren algunas condiciones básicas, como disciplina, orden y limpieza.

 Observar firmemente los cambios de coloraciones al momento de tomar las

diferentes pruebas indicadas

 Tenga mucho cuidado al manipular los instrumentos a utilizar

 Debemos de esterilizar todos los instrumentos a utilizar pues el experimento a

seguir tiene que tener la mayor pureza posible

 Siga las instrucciones para experimentar y obtener los resultados deseados.

 Siempre utilizar guantes al momento de manipular los agares

 Al momento de hacer alguna prueba o también estriado, tener en cuenta que los
raspados al medio de cultivo deben de ser suaves y con una pequeña profundidad
y seguirá punto a punto la guía llevada

 Tener todo calibrado desde la esterilización a la temperatura y presión requerida

y tener un amplio espacio en la realización

 Se recomienda que al momento de verter el concentrado en las placas Petri o los

tubos de ensayo, haya un captador de microorganismos para una mayor pureza

P á g i n a 25 | 36
 26
CUESTIONARIO:

1 ¿Cuál es el fundamento de la prueba TSI?

El agar TSI contiene tres azúcares: dextrosa, lactosa y sacarosa; rojo de fenol para
detectar la fermentación de estos carbohidratos, y sulfato ferroso para detectar la
producción de ácido sulfhídrico.

(agar TSI)

2 ¿Cuál es el fundamento de la prueba LIA?

La prueba consiste básicamente en demostrar la presencia de la enzima lisina

descarboxilasa, capaz de reaccionar con el grupo carboxilo del aminoácido L-lisina.
También puede ocurrir una desaminación del aminoácido por la presencia de la enzima
lisina desaminasa

P á g i n a 26 | 36
 27
3 ¿Cuál es el fundamento de la prueba SIM?

Medio SIM es un medio semisólido utilizado para la diferenciación de bacterias entéricas

a través de la producción de sulfuro, la formación de indol y la motilidad. La prueba de
reducción de azufre es útil para diferenciar organismos entéricos, especialmente
Salmonella y Shigella.

P á g i n a 27 | 36
 28
FUENTES DE INFORMACIÓN

Libro Libro Libro

AUTOR SANZ, Susana A. Instituto Nacional MENDO, Manuel y
de Referencia VALENZUELA
Epidemiológicos Manuel.

AÑO 2011 1994 2014

TÍTULO PRACTICAS DE Manual de técnicas Medios de cultivo
MICROBIOLOGIA de laboratorio en microbiología.

EDICIÓN 2º edición Volumen II 6º edición

PAÍS Argentina Mexico Perú

EDITORIAL Universidad de la SECRETARÍA DE Chuquizuta V.

Rioja SALUD

1. https://www.youtube.com/watch?v=RA0xkw8NSJ0
2. https://www.youtube.com/watch?v=gkleMkdtcVc&ab_channel=Elmi
crobiologist%D8%A7%D9%84%D9%85%D9%8A%D9%83%D8%
B1%D9%88%D8%A8%D9%8A%D9%88%D9%84%D9%88%D8%
AC%D9%8A%D8%B3%D8%AA
3. https://www.youtube.com/watch?v=CbotgiHNmWo&ab_channel=U
niversitatPolit%C3%A8cnicadeVal%C3%A8ncia-
UPVUniversitatPolit%C3%A8cnicadeVal%C3%A8ncia-UPV
4. https://www.youtube.com/watch?v=CbotgiHNmWo&ab_channel=U
niversitatPolit%C3%A8cnicadeVal%C3%A8ncia-
UPVUniversitatPolit%C3%A8cnicadeVal%C3%A8ncia-
UPVVerificada
5. https://www.youtube.com/watch?v=YWuTwBuqQrA&ab_channel=
UniversitatPolit%C3%A8cnicadeVal%C3%A8ncia-UPV

P á g i n a 28 | 36
 29
ANEXOS

(imagen 1)

(imagen 2)

P á g i n a 29 | 36
 30

APÉNDICE
DIAGRAMA DE FLUJO

P á g i n a 30 | 36
 31

• OBSERVACIONES

P á g i n a 31 | 36
 32
Se observa el crecimiento solo de bacterias Gram (-) en agar EMB, porque los
gérmenes de acompañamiento indeseables Gram (+) resultan inhibidos en su
crecimiento por los colorantes del medio.
En Agar EMB:
 Si se observan colonias trasparentes o de color ámbar corresponden a Salmonella
o Shigella.
 Si se observan colonias que presentan una consistencia mucosa, con el centro
pardo-grisáceo a la luz transmitida pertenece a cepas de Enterobacter o Klebsiella.
 Si se observan colonias son verdosas con una tonalidad metálica a la luz reflejada
con el centro azulado a la luz trasmitida pertenecen a Escherichia coli.
En la prueba de Voges-Proskauer al añadir el reactivo A de Voges Proskauer (alfa-
naftol 5% en etílico absoluto el medio adquiere un aspecto lechoso, y cuando se añade
el reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%) desaparece el aspecto lechoso.
El crecimiento en el medio de cultivo Lauril Sulfato de coliformes es rápido y se
observa una intensa formación de gas o espuma en las campanas de Durham y un
aumento de la turbidez por la fermentación de la lactosa. Asimismo, no se observa el
crecimiento de la flora acompañante.

• CÁLCULO
Medio de cultivo EMB (agar eosina azul de metileno lactosa sacarosa)
COMPOSICIÓN (g/L):
 Peptona 10.0
 Hidrogenofosfato dipotásico 2.0
 lactosa 5.0
 Eosina amarillenta 0.4
 Azul de metileno 0.07
 Agar – Agar 13.5
PREPARACIÓN:
Disolver 36 g/L, esterilizar en autoclave (15 minutos. A 121 ºC) y verter en placas. pH
7.1 + 0.2 a 25 ºC. Incubar por 24 horas a 37 ºC en condiciones aerobias.
Caldo EC.
COMPOSICIÓN (g/L):
 Lactosa 5.0
 Potasio di-hidrogeno fosfato 1.5
 di-potasio hidrogeno fosfato 4.0
 Sales biliares 1.0
 Cloruro de sodio 5.0
 Triptosa 20.0
PREPARACIÓN:
Suspender 37.4 g en un litro de agua destilada, calentar y agitar hasta dilución total.
Distribuir en tubos de ensayo con campanas de Durham y esterilizar a 121 ºC durante
15 min. El caldo es de color claro amarillento, pH 6.9 + 0.2 a 25 ºC. Incubar a 37 ºC

P á g i n a 32 | 36
 33
para determinación de coliformes totales y 44 ºC para coliformes fecales. 44.5 + 0.5 ºC
de 24 + 2 h para E. coli. La presencia de gas en los tubos de Durham y la reacción
positiva para Indol con el reactivo de Kovacs son confirmativas de E. coli.
Reactivo de Kovács
COMPOSICIÓN (g/L):
 Alcohol amílico 150ml
 p-dimetil amino benzaldehído 10g
 HCl concentrado 50ml

Caldo Triptona
COMPOSICIÓN (g/L):
 Peptona de caseína 10.0g
 Cloruro sódico 1.0g

PREPARACIÓN:
Se disuelven 15g en 1000ml de agua destilada, se distribuyen en
tubos y se esteriliza en autoclave (15min. A 121º C)

Caldo MR-VP
COMPOSICIÓN (g/L):
 Dextrosa 5
 Mezcla de peptona 7
 Fosfato potásico 5
PREPARACIÓN:
Suspender 17 gramos de medio en 1000ml de agua destilada. Mezclar bien y disolver
calentando con agitación frecuente. Hervir durante un minuto hasta disolver por
completo. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121 °C
durante 15 minutos.

P á g i n a 33 | 36
 34

Agar Citrato Simmons

COMPOSICIÓN (g/L):
 Sulfato de magnesio 0.20g
 Dihidrógeno fosfato de amonio 1.00g
 Hidrógeno fosfato dipotásico 1.00g
 Cloruro de sodio 5.00g
 Citrato de sodio 2.00g
 Azul de bromotimol 0.08g
 Agar 13.00g
PREPARACIÓN:
Se disuelven los componentes en 1000ml de agua destilada, distribuir en tubos y
esterilizar en autoclave (121º C, 15 lbs de presión por 15 min.). Dejar solidificar los
tubos en posición inclinada.

P á g i n a 34 | 36
 35

Agar SIM
COMPOSICIÓN (g/L):
 Peptona de caseina 20.0g
 Peptona de carne 6.6g
 Citrato de amonio y hierro (III) 0.2g
 Tiosulfato sódico 0.2g
 Agar-agar 3.0g
PREPARACIÓN:
Se disuelven 30.0g de medio en 1000ml de agua destilada, se distribuye en tubos
hasta una altura de 4.0cm y se esteriliza en autoclave (15min. A 121º C). Se deja
solidificar en posición vertical.

P á g i n a 35 | 36
 36

P á g i n a 36 | 36