INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN

Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1500:2011

Primera revisión

LECHE. MÉTODOS DE ENSAYO CUALITATIVOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD.

Primera Edición

MILK. METHODS OF QUALITATIVE TEST FOR QUALITY DETERMINATION.

First Edition

DESCRIPTORES: Alimentos, productos lácteos, leche, métodos de ensayo cualitativos para la determinación de la calidad.
AL 03.01-333
CDU: 637.133.4
CIIU: 3112
ICS: 67.100.10
 CDU: 637.133.4 CIIU: 3112
ICS: 67.100.10 AL 03.01-333

NTE INEN
Norma Técnica LECHE.
1500:2011
Ecuatoriana MÉTODOS DE ENSAYO CUALITATIVOS PARA LA
Primera revisión
Voluntaria DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD
2011-06

1. OBJETO
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

1.1 Esta norma establece los métodos de ensayo cualitativos para la determinación de la calidad de la
leche.

2. ACIDEZ

2.1 Determinación de estabilidad proteica.

2.1.1 Definición. La estabilidad proteica es la propiedad que tiene la leche de no producir precipitación o
coagulación de la proteína en presencia de una solución de alcohol etílico o de una solución alcohólica
de alizarina, ó, por acción del calor, debido a la acidificación.

2.2 Método de la prueba de la leche con alcohol

2.2.1 Fundamento. El método consiste en añadir a la leche una cantidad de alcohol etílico neutro; si ésta
ha sufrido acidificación o es anormal por contener calostro o provenir de vacas afectadas con mastitis, se
forman coágulos y el ensayo se reporta como positivo.

2.2.2 Equipo
3
2.2.2.1 Tubos de ensayo con capacidad para 20 cm
3
2.2.2.2 Pipetas graduadas de 5 cm

2.2.2.3 Gradilla

2.2.3 Reactivos. Solución acuosa de alcohol etílico neutro de 68 % en peso o 75 % en volumen

3 3
2.2.4 Procedimiento. Transferir 5 cm de muestra a un tubo de ensayo y añadir 5 cm de la solución
acuosa de alcohol etílico. Tapar el tubo y agitar invirtiéndolo dos o tres veces, observar su aspecto.

2.2.5 Expresión de resultados. Si no existe precipitación o formación de coágulos de la leche, reportar

como negativa la prueba del alcohol y se dice que esta presenta estabilidad proteica.

2.3 Método de la prueba de la alizarina

2.3.1 Fundamento. El método consiste en añadir a la leche una cantidad de solución alcohólica de
alizarina; si ésta ha sufrido acidificación se forman grumos gruesos y una coloración amarilla. Si no hay
formación de grumos y se produce una coloración lila, indica la presencia de sustancias neutralizantes
(leche alcalina).

2.3.2 Equipo
3
2.3.2.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm

(Continúa)

DESCRIPTORES: Alimentos, productos lácteos, leche, métodos de ensayo cualitativos para la determinación de la calidad.

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3
2.3.2.2 Pipetas graduadas de 5 cm

2.3.2.3 Gradilla

2.3.3 Reactivos

2.3.3.1 Alizarol. Solución alcohólica de alizarina al 0,2 % m/v (en alcohol neutro al 75 % en volumen).

2.3.4 Procedimiento. Mezclar volúmenes iguales de leche y alizarol, agitar y observar el color y aspecto.

2.3.5 Expresión de resultados

2.3.5.1 Si se produce precipitación o formación de coágulos y una coloración amarilla de la leche,

reportar como positiva la prueba de la alizarina y se dice que la leche posee una fuerte acidez y no
presenta estabilidad proteica.

2.3.5.2 Si no presenta formación de coágulos y a su vez, presenta una coloración lila al morado intenso,
según las concentraciones agregadas, se dice que la leche posee sustancias neutralizantes.

2.4 Prueba de ebullición

2.4.1 Fundamento. El método consiste en someter una muestra de leche a ebullición; si ésta ha sufrido
acidificación se observará grumos o partículas coaguladas. Esta prueba es una alternativa de la prueba
de alcohol, pero consume más tiempo en el análisis y es menos sensible.

2.4.2 Equipo
3
2.4.2.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm
3
2.4.2.2 Pipetas graduadas de 5 cm

2.4.2.3 Gradilla

2.4.2.4 Pinzas para tubo

2.4.2.5 Fuente de calor

3
2.4.3 Procedimiento. Hervir agitando constantemente una muestra de 2 a 5 cm de leche en un tubo de
ensayo.

2.4.4 Expresión de resultados. Si se observan grumos o formación de coágulos, reportar como positiva
la prueba de ebullición. La leche no ácida no coagula por aplicación de calor, lo hace la leche ácida y los
calostros.

3. NEUTRALIZANTES ALCALINOS

3.1 Definiciones. Son sustancias que tienen como finalidad neutralizar el ácido láctico desarrollado por
la fermentación de la lactosa a través de microorganismos específicos. Dentro de estas sustancias
están: orina bovina, carbonatos, hidróxido de sodio y jabones de mala calidad.

3.2 Fundamento. Las diversas sustancias indicadas en 3.1.1, neutralizan el ácido láctico a medida que
éste se forma, ejemplo:

CH3 _ CH _ COOH + NaOH → CH3 _ CH _ COONa + H2O

|
OH

Ácido Láctico + Hidróxido de sodio → Lactato de sodio + agua

(Continúa)

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3.3 Método de la prueba de la alizarina. Ver numeral 2.3

3.4 Método de la prueba del ácido rosólico (aurina)

3.4.1 Fundamento. El ácido rosólico es un indicador de pH que tiene un rango de viraje entre 6,8 a 8,0.

3.4.2 Equipo y materiales

3
3.4.2.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm
3
3.4.2.2 Pipetas graduadas de 5 cm

3.4.2.3 Gradilla

3.4.2.4 Embudo

3.4.2.5 Papel filtro

3.4.3 Reactivos

3.4.3.1 Alcohol etílico neutralizado

3.4.3.2 Solución de ácido rosólico en alcohol etílico neutralizado

3.4.4 Procedimiento
3 3
3.4.4.1 Pipetear en un tubo de ensayo 5 cm de leche, adicionar 5 cm de alcohol etílico neutralizado y
homogenizar por inversión lentamente.

3.4.4.2 Filtrar la mezcla con papel filtro, recibiendo el filtrado en otro tubo de ensayo.

3.4.4.3 Agregar al filtrado, 2 a 3 gotas de ácido rosólico.

3.4.5 Expresión de resultados

3.4.5.1 En presencia de neutralizantes la reacción da una coloración rojo carmesí.

3.4.5.2 Preparar en un tubo de ensayo un blanco, usando en vez del filtrado el mismo volumen de alcohol
etílico y el mismo número de gotas de ácido rosólico. Si la coloración de la muestra es más intensa que
la del tubo con el blanco, reportar el resultado como positivo.

3.5 Identificación de orina en la leche mediante la prueba de "pupo"

3.5.1 Equipo
3
3.5.1.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm
3
3.5.1.2 Pipetas graduadas de 10 cm

3.5.1.3 Gradilla

3.5.2 Reactivos

3.5.2.1 Ácido clorhídrico (ρ= 1,19)

3.5.2.2 Etanol absoluto

3.5.2.3 Ácido nítrico (ρ= 1,42)

(Continúa)

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3 3
3.5.3 Procedimiento. Pipetear en un tubo de ensayo 5 cm de leche, adicionar 5 cm de ácido clorhídrico,
3 3
5 cm de etanol absoluto y 5 cm de ácido nítrico.

3.5.4 Expresión de resultados. Si se observa una coloración rosado-violácea con fluorescencia azulada,
indica la presencia de orina en la leche. Reportar el resultado como positivo.

3.6 Determinación de la adición de orina (método alternativo)

3.6.1 Fundamento. La leche en presencia de una solución alcohólica de timol y cloroformo presenta una
coloración violeta cuando ha sido añadida orina.

3.6.2 Equipo

3.6.2.1 Embudo

3.6.2.2 Papel filtro

3.6.2.3 Vaso de precipitación

3
3.6.2.4 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 cm

3.6.3 Reactivos

3.6.3.1 Ácido tricloroacético al 20 %

3.6.3.2 Solución alcohólica de Timol al 5 %

3
3.6.3.3 Ácido clorhídrico concentrado que contenga 0,5 g de cloruro férrico por cada 100 cm

3.6.3.4 Cloroformo al 37 %
3 3
3.6.4 Procedimiento. A 10 cm de leche añadir 5 cm de ácido tricloroacético al 20 % y filtrar, al filtrado
3 3
añadir 1 cm de la solución alcohólica de Timol y 10 cm ácido clorhídrico concentrado. Dejar en reposo
3
20 minutos y añadir 2 cm de cloroformo y observar el color.

3.6.5 Expresión de resultados. La aparición de una coloración violeta en la capa clorofórmica, indica la
presencia de orina en la leche, caso contrario permanece incolora.

4. CONSERVANTES

4.1 Identificación de formaldehído (prueba de hehner)

4.1.1 Equipo
3
4.1.1.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm
3
4.1.1.2 Pipetas graduadas de 10 cm

4.1.1.3 Gradilla

4.1.1.4 Fuente de calor

4.1.1.5 Gotero

4.1.2 Reactivos

4.1.2.1 Solución acuosa de cloruro férrico al 1 %, recién preparada

4.1.2.2 Ácido sulfúrico diluido (1 + 1) en volumen, ρ= 1,820 a 1,825

(Continúa)

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4.1.2.3 Solución diluida de formaldehído: diluir dos gotas de solución de formaldehído de 38 % a 40 % en

3
100 cm de agua.
3
4.1.3 Procedimiento. Pipetear en un tubo de ensayo 5 cm de leche previamente homogenizada, agregar
3
1 cm de ácido sulfúrico diluido y una gota de cloruro férrico. Mezclar y calentar a ebullición.

4.1.4 Expresión de resultados. Si se observa una coloración violeta en la interface entre el ácido y la
leche, indica la presencia de formaldehído en la leche. Reportar el resultado como positivo.

4.2 Prueba de confirmación (formaldehído) (ver nota 1).

4.2.1 Fundamento. Se separa el formaldehído por destilación en medio ácido y el destilado se hace
reaccionar con ácido cromotrópico, en caliente. La presencia de formaldehído está indicada por una
coloración púrpura.

4.2.2 Equipo

4.2.2.1 Balón y equipo de destilación de Kjeldahl

4.2.2.2 Material de vidrio

4.2.2.3 Baño de agua con temperatura controlada

4.2.3 Reactivos

4.2.3.1 Ácido sulfúrico grado reactivo

4.2.3.2 Ácido fosfórico grado reactivo

4.2.3.3 Sal sódica del ácido cromotrópico C10H6O8S2Na2.2H2O: Disolver 500 mg de la sal sódica en 100
3
cm de una mezcla de 85 partes de ácido sulfúrico y 15 partes de agua.

4.2.4 Procedimiento
3 3 3
4.2.4.1 Colocar en un balón de Kjeldahl 100 cm de leche y 100 cm de agua. Agregar 5 cm de ácido
fosfórico, se adapta la trampa de destilación y el refrigerante y se destila lentamente hasta obtener 50
3
cm de destilado.
3 3
4.2.4.2 En un tubo de ensayo colocar 5 cm de la solución de ácido cromotrópico, adicionar 1 cm de
destilado, mezclar y colocar en un baño de María hirviendo por 15 minutos, observar el color durante el
calentamiento.

4.2.5 Expresión de resultados. La presencia de formaldehído está indicada por la aparición de un color
púrpura, cuya intensidad depende de la cantidad de formaldehído presente.

4.3 Identificación de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada)

4.3.1 Método de Arnold y Mentzer (oxido de Vanadio)

4.3.1.1 Fundamento. El óxido de vanadio en medio ácido sulfúrico reacciona con el agua oxigenada,
dando un compuesto de coloración anaranjada (rosa salmón).

4.3.1.2 Equipo
3
a) Tubo de ensayo con capacidad de 20 cm
3
b) Pipetas graduadas de 5 y 10 cm

__________
NOTA: Cuando la concentración del formaldehído en la leche es alta, la prueba es menos sensible por lo que se recomienda hacer
diluciones de la muestra con leche libre de formaldehído.

(Continúa)

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4.3.1.3 Reactivos. Solución de pentóxido de vanadio al 1 % (m/v) (V2O5) en ácido sulfúrico diluido,
3 3
preparado agregando cuidadosamente 6 cm de ácido sulfúrico concentrado (del 95 % al 98 %) a 94 cm
de agua

4.3.1.4 Procedimiento
3
a) Pipetear en el tubo de ensayo 10 cm de leche, agregar 10 gotas de la solución de óxido de vanadio y
agitar.

b) Al mismo tiempo trabajar con un testigo negativo (leche fresca y pura) y con un positivo (leche pura
adicionada de unas gotas de agua oxigenada).

4.3.1.5 Expresión de resultados. Si se observa una coloración anaranjada (rosa salmón), indica la
presencia de peróxido de hidrógeno. Reportar el resultado como positivo. Una coloración amarillenta,
igual al reactivo, debe considerarse como negativa.

4.3.2 Método del Ácido Clorhídrico y formol

4.3.2.1 Fundamento. El ácido clorhídrico con el formol reacciona con el agua oxigenada, dando una
coloración violeta azulada.

4.3.2.2 Equipo
3
a) Tubos de ensayo con capacidad de 25 cm
3
b) Pipetas graduadas de 1 y 10 cm

c) Fuente de calor

4.3.2.3 Reactivos

a) Ácido clorhídrico concentrado.

b) Solución de formol al 1 %
3 3
4.3.2.4 Procedimiento. Pipetear en el tubo de ensayo 10 cm de leche, agregar 10 cm de ácido
clorhídrico y una gota de formol al 1 %, agitar y calentar hasta desprendimiento de vapores.

4.3.2.5 Expresión de resultados. Si se observa una coloración violeta azulada, indica la presencia de
peróxido de hidrógeno. Reportar el resultado como positivo.

4.3.3 Método del yoduro de potasio

4.3.3.1 Fundamento. La catalasa natural de la leche destruye el H2O2 añadido. El yoduro de potasio
reacciona con el peróxido de hidrógeno dando una coloración amarillo canario.

4.3.3.2 Equipo
3
a) Tubos de ensayo con capacidad de 25 cm
3
b) Pipetas graduadas de 1 y 10 cm

4.3.3.3 Reactivo. Solución de yoduro de potasio al 35 %, recién preparada.

3
4.3.3.4 Procedimiento. Pipetear en el tubo de ensayo 5 cm de leche y agregar unas gotas de la solución
de yoduro de potasio.

4.3.3.5 Expresión de resultados. Si se observa una coloración amarillo canario, indica la presencia de
peróxido de hidrógeno. Reportar el resultado como positivo.

(Continúa)
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4.4 Identificación de cloro, hipocloritos, cloraminas y dióxido de cloro

4.4.1 Método del yoduro de potasio

4.4.1.1 Fundamento. El método se fundamenta en la formación de yodo libre a partir del yoduro de
potasio, por la acción del cloro libre o hipocloritos.

4.4.1.2 Equipo
3
a) Tubo de ensayo con capacidad de 20 cm
3
b) Pipetas graduadas de 1 y 5 cm

c) Baño de agua con temperatura controlada

4.4.1.3 Reactivos

a) Solución de yoduro de potasio al 7,5 %, recién preparada

b) Ácido acético

c) Solución de almidón al 1 %
3 3
4.4.1.4 Procedimiento. Pipetear en un tubo de ensayo 5 cm de leche y agregar 0,5 cm de la solución
de yoduro de potasio al 7,5 %, agitar. Observar la coloración del medio.

4.4.1.5 Expresión de resultados

a) Si se observa una coloración amarilla, indica la presencia de cloro libre. Para confirmar se añade 1
3
cm de la solución de almidón al 1 %, deberá desarrollarse una coloración azul violeta. Si no se
3 o
presenta cambio en la coloración, adicionar 4 cm de ácido acético, colocar en baño de María a 80 C
o
por 10 minutos (no sobrepasar los 80 C ), enfriar en agua corriente y observar la coloración de la
3
cuajada. En presencia de hipoclorito ésta deberá ser amarilla. Para confirmar adicionar 1 cm de la
solución de almidón al 1 %, deberá desarrollarse una coloración azul violeta. Reportar el resultado
como positivo.

b) Hacer una prueba en blanco con ácido clorhídrico.

4.5 Método alternativo para la identificación cloro, hipocloritos, cloraminas y dióxido de cloro.

4.5.1 Equipo

4.5.1.1 Material de vidrio

4.5.1.2 Baño de agua con temperatura controlada

4.5.2 Reactivos
3
4.5.2.1 Solución de yoduro de potasio. Disolver 7,5 g de yoduro de potasio en 100 cm de agua destilada.
Preparar cuando se vaya a usar.
3 3
4.5.2.2 Ácido clorhídrico diluido. A 100 cm de ácido clorhídrico (36,5 a 38, 5 %), agregar 200 cm de
agua destilada.
3
4.5.2.3 Solución de almidón. Hervir un gramo de almidón soluble en 100 cm de agua destilada. Enfriar
antes de usar.

4.5.3 Procedimiento.
3 3
4.5.3.1 Prueba I. Pipetear 5 cm de leche en un tubo de ensayo, agregar 1,5 cm de solución de yoduro
de potasio, mezclar bien por agitación. Anotar el color de la leche.

(Continúa)
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3
4.5.3.2 Prueba II. Si no cambia el color de la leche, agregar 4 cm de ácido clorhídrico diluido, mezclar
bien con una varilla de vidrio de extremo plano y observar el color de la cuajada.
o
4.5.3.3 Prueba III. Colocar luego el tubo en el baño de María calentado previamente a 85 C y dejar en
reposo 10 minutos, (durante este tiempo la cuajada sube a la superficie), enfriar rápidamente colocando
el tubo en agua fría. Anotar el color de la cuajada y el líquido.
3
4.5.3.4 Prueba IV. Agregar luego al líquido por debajo de la cuajada 0,5 a 1 cm de la solución de
almidón. Observar el color inmediatamente. Determinar la concentración de cloro disponible según la
tabla siguiente.

TABLA DE REACCIONES DE LAS DISTINTAS PRUEBAS

Prueba Concentración de cloro disponible

1000 mg 500 mg 200 mg 100 mg 40 mg 20 mg

Prueba I Pardo amarillo Amarillo intenso Amarillo pálido - - -
difuso
Prueba II Pardo amarillo Amarillo intenso Amarillo claro - - -
Prueba III Pardo amarillo Amarillo intenso Amarillo Amarillo Amarillo Amarillento
pálido
Prueba IV Azul violáceo Azul violáceo Azul violáceo Rojo violáceo Rojo Rojo violáceo
oscuro violáceo pálido

5. ADULTERANTES

5.1 Definición. Se considera que la leche ha sido adulterada cuando se ha añadido espesantes como
productos feculentos (harina o almidones, claro de maíz, etc.), soluciones azucaradas o soluciones
salinas, etc., con el propósito de mantener la densidad en los rangos señalados, cuando se agua y así
evitar su rápida detección.

5.2 Detección de almidón

5.2.1 Fundamento. El almidón con el yodo libre forma un compuesto de absorción de coloración azulada.

5.2.2 Equipo
3
5.2.2.1 Tubos de ensayo de 20 cm
3
5.2.2.2 Pipetas graduadas de 1 y 10 cm

5.2.2.3 Baño de agua con temperatura controlada

5.2.3 Reactivos. Solución lugol o tintura de yodo

3
5.2.4 Procedimiento. Pipetear en un tubo de ensayo 10 cm de leche, calentar hasta ebullición en el
baño de María hirviente y mantener el calentamiento por 5 min. Enfriar en agua corriente y adicionar 5
gotas de la solución de lugol o tintura de yodo.

5.2.5 Expresión de los resultados. Si se observa una coloración azul, indica la presencia de almidón o
harina. Reportar el resultado como positivo.

5.3 Identificación de harina y almidones (método alternativo)

5.3.1 Equipo

5.3.1.1 Fuente de calor

5.3.1.2 Recipiente con agua-hielo

(Continúa)

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5.3.2 Reactivos

5.3.2.1 Solución de yoduro de potasio (yodo 1 g y yoduro de potasio 2 g)

3
5.3.2.2 Agua destilada 300 cm

5.3.3 Procedimiento
3
5.3.3.1 Pipetear en un tubo de ensayo 5 cm de leche, calentar hasta ebullición, enfriar en el agua con
hielo y agregar 5 gotas del reactivo.

5.3.3.2 Preparar un testigo negativo con leche pura fresca y un testigo positivo con la misma leche
adicionada de almidón.

5.3.4 Expresión de resultados

5.3.4.1 Positivo: Una coloración azul indica la presencia de almidón o harina.

5.3.4.2 Negativo: Color amarillento

5.3.4.3 El color azul debe desaparecer por calentamiento.

5.4 Detección de sacarosa

5.4.1 Equipo
3
5.4.1.1 Tubos de ensayo con capacidad de 20 cm
3
5.4.1.2 Probeta graduada de 10 cm

5.4.1.3 Baño de agua caliente con temperatura controlada

5.4.2 Reactivos

5.4.2.1 Solución acuosa de bilis de buey, preparada así: 2 gramos de bilis de buey desecada para
3
bacteriología, disuelta en 100 cm de agua destilada

5.4.2.2 Ácido clorhídrico fumante del 37 %, grado analítico, ρ= 1,19.

5.4.3 Procedimiento
3
5.4.3.1 En un tubo de ensayo colocar 4 gotas de leche, 4 gotas de la solución de bilis de buey y 3 cm de
o
ácido clorhídrico. Mezclar y colocar en el baño de agua a 50 C exactamente durante 5 min.

5.4.3.2 Preparar un testigo negativo con leche cruda, fresca y pura.

5.4.3.3 Preparar un testigo positivo con la misma leche anterior a la que se adiciona sacarosa en una
proporción de 0,2 %.

5.4.4 Expresión de resultados. Si se observa una coloración rojo violeta, indica la presencia de sacarosa.
Reportar el resultado como positivo. La aparición de un color rojo tenue se considera negativa.

5.5 Colorantes. Los colorantes como el achiote (bixa Orellana) y anilinas son adicionados a la leche
descremada o aguada para restablecer el color normal de la leche.

5.5.1 Equipo

5.5.1.1 Tubos de ensayo

3
5.5.1.2 Pipetas graduadas de 2 cm

(Continúa)

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5.5.2 Reactivos

5.5.2.1 Éter etílico

5.5.3 Procedimiento. Mezclar partes iguales de leche y éter, dejar en reposo y observar.

5.5.4 Expresión de resultados. Si se ha adicionado achiote, el éter depositado en la superficie resulta

teñido. Cuando se ha añadido anilina, el coágulo sin grasa por la extracción con el éter tiene color
anaranjado.

5.6 Identificación de colorantes (Método alternativo)

5.6.1 Fundamento. Se investiga la presencia de colorantes en el precipitado obtenido, al adicionar ácido

acético a la leche tibia.

5.6.2 Equipo

5.6.2.1 Material de vidrio

5.6.2.2 Cápsula de porcelana

5.6.3 Reactivos

5.6.3.1 Ácido acético diluido (1 + 3)

5.6.3.2 Éter etílico

5.6.3.3 Solución de hidróxido de sodio al 2 %

5.6.3.4 Solución de cloruro estannoso al 40 %

5.6.3.5 Ácido clorhídrico concentrado

5.6.4 Procedimiento
3 o
5.6.4.1 Colocar aproximadamente 150 cm de leche en un vaso de precipitación y calentar a unos 50 C;
3
adicionar 5 cm de ácido acético (1 + 3) y continuar calentando lentamente, agitando hasta cerca del
punto de ebullición, procurando aglutinar el precipitado en una sola masa, con ayuda de un agitador.
Separar el líquido utilizando un tamiz o un dispositivo similar, prensar el precipitado para separar el
3
líquido residual y transferir a un erlenmeyer pequeño. Adicionar 50 cm de éter etílico, tapar y dejar en
reposo por varias horas, agitando por intervalos regulares. Decantar el éter en un vaso de precipitación o
en una cápsula, evaporar con las precauciones del caso y en el residuo investigar colorantes.

5.6.4.2 Para comprobar la presencia de achote (annato), proceder de la siguiente manera.

5.6.4.3 Tomar una porción del residuo y calentar con la solución de hidróxido de sodio al 2 %. Con esta
solución impregnar una tira de papel filtro. Si el achote está presente, el papel absorbe color y cuando se
lava cuidadosamente con agua, permanece coloreado. Dejar secar, agregar una gota de la solución de
cloruro estannoso al 40 % y secar. Si la coloración se torna púrpura, se confirma la presencia de achiote.

5.6.4.4 Si después de extraer con éter el precipitado de la leche, ésta todavía presenta coloración
amarillenta o anaranjada, nítida, debe sospecharse la presencia de un colorante sintético. para la
identificación de colorantes sintéticos, seguir métodos convencionales conocidos.

(Continúa)
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5.7 Grasas vegetales. Identificación de grasas vegetales en la leche y productos lácteos, por el
método Cromatografía de gases con extracción hidrolítica

5.7.1 Resumen. La grasa y los ácidos grasos de los alimentos se extraen por método hidrolítico
(hidrólisis ácida en la mayoría de los productos, hidrólisis alcalina para productos lácteos y una
combinación de ambos para el queso). El ácido pirogálico se adiciona para reducir la degradación
oxidativa de los ácidos grasos durante el análisis. Como estándar interno se adiciona Triglicéridos y
Triundecanoico (C11:0). La grasa se extrae con éter, luego se metilan los ácidos grasos a esteres
metílicos (FAMEs) usando BF3 en metanol. Los FAMEs se miden cuantitativamente por cromatografía
de gases (GC) contra el estándar interno C11:0. La grasa total se calcula como la suma de ácidos grasos
individuales expresada como su triglicérido equivalente. La grasa monosaturada e insaturada se
calculan como la suma de sus respectivos ácidos grasos. La grasa moniinsaturada incluye solamente a
la forma cis.

5.7.2 Equipo

5.7.2.1 Cromatógrafo de gases. Con detector de hidrógeno para ionización de llama, columna capilar,
inyector modo separado; horno programado para implementar una secuencia en la rampa de retención.
Condiciones de operación: temperatura (°C) inyector 225; detector 285; temperatura inicial 100 (espera 4
min), rampa 3°C/min; temperatura final 240; espera 15 min. Gas: helio; velocidad del flujo: 0,75ml/min;
velocidad linear: 18 cm/s; relación 200:1

5.7.2.2 Columna capilar. Capaz de separar los dos esteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs)
adyacentes al pico C18:3 y C20:1 y los tres FAMEs adyacentes al los picos C20:1, C20:3 y C20:4, con una
resolución de 1,0 o mayor. (SP2560 100 m x 0,25 mm con 0,20 µm de diámetro interno).

5.7.2.3 Matraces Mojonnier

5.7.2.4 Tapones – de caucho sintético o corcho

5.7.2.5 Canastas de centrífuga para los balones Majonnier

5.7.2.6 Gránulos de ebullición

5.7.2.7 Cestas de aluminio o plástico

5.7.2.8 Baño de agua con agitador – para mantener una temperatura de 70° - 80°C

5.7.2.9 Baño de vapor – con soporte para material de vidrio

5.7.2.10 Baño de agua – con suministro de corriente de nitrógeno, que mantenga la temperatura a 40°
± 5°C

5.7.2.11 Agitador – diseñado para las cestas de matraces majonnier

5.7.2.12 Centrífuga Majonnier impulsado con motor (opcional), que mantenga 600 rpm

5.7.2.13 Estufa – que mantenga una temperatura 100° ± 2°C

5.7.2.14 Mezcladores Vortex

5.7.2.15 Tubos de dispersión de gases – de 25 mm, porosidad “A” 175 µm de diámetro

5.7.2.16 Viales de tres copas – de 11 ml

5.7.2.17 Tapas fenólicas – con filo de polivinil para los viales

5.7.2.18 Septas de teflón/silicona – para ajustar los viales

(Continúa)
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NTE INEN 1500 2011-06

5.7.3 Reactivos y materiales

5.7.3.1 Ácido pirogálico

5.7.3.2 Ácido chorhídrico – 12 M y 8,3 M: adicionar 250 ml de HCl 12 M a 110 ml de H2O, mezclar bien y
almacenar a temperatura ambiente (20°C a 25 °C)

5.7.3.3 Hidróxido de amonio – 58 % (m/m)

5.7.3.4 Dietil éter – de pureza adecuada para la extracción de grasa

5.7.3.5 Éter de petróleo – anhidro

5.7.3.6 Etanol – 95 % (v/v)

5.7.3.7 Tolueno – Nanogrado

5.7.3.8 Cloroformo

5.7.3.9 Sulfato de sodio – Anhidro

5.7.3.10 Trifluoruro de boro – 7 % BF3 (m/m) en metanol, prepararla a partir de la forma

comercialmente disponible solución al 14 % de BF3. Preparar en campana extrartora.

5.7.3.11 Mezcla de dietil éter – éter de petróleo – 1 + 1 (v/v)

5.7.3.12 Solución de estándar interno de triglicéridos – C11:0 triundecanoico 5,00 mg/ml en CHCl3:
Pesar con precisión 2,50 g de C11:0 triundecanoico en un frasco volumétrico de 500 ml. Adicionar cerca
de 400 ml de CHCl3 y mezclar hasta disolver. Levar a volumen con CHCl3. Invertir el frasco por lo
menos 10 veces. La solución interna de triglicéridos es estable por un mes guardada en refrigeración (2°
- 8°C).

5.7.3.13 Soluciones estándar de metil esteres de ácidos grasos (FAMEs) –

a) Mezcla de solución estándar de FAMEs: La mezcla de referencia contienen la serie de FAMEs incluido
el C18:1 cis y trans(disponible como GLC-85 de Un Chek Prep, Elysian, NM 56028, USA o equivalente).
Para preparar la mezcla de soluciones estándar de FAMEs: romper la tapa del vial, abrir y
cuidadosamente transferir el contenido al vial de tres copas. Lavar el vial original con hexano para
asegurar la completa transferencia y adicionar el líquido de lavado al vial de tres copas. Diluir a 3 ml
con hexano

b) Solución estándar FAME C11:0 – metil ester undecanoico en hexano. Usar solamente para la
preparación de soluciones estándar individuales de FAME (ver c)). Para preparar la solución estándar
FAME de C11:0 romper la tapa del vial, abrir y cuidadosamente transferir en contenido a un balón
volumétrico de 50 ml. Lavar el vial original con hexano para asegurar la completa transferencia y
adicionar el líquido de lavado al balón volumétrico de 50 ml. Aforar con hexano. Esta solución es
estable por una semana almacenada a 0°C.

c) Soluciones estándar FAME individuales – Soluciones estándar de cada uno de los siguientes FAMEs:
C4:0Tetranoico metil ester; C6:0 hexanoico metil ester; C8:0 Octanoico metil ester; C10:0 decanoico metil
ester; C12:0 dodecanoico metil ester; C13:0 tridecanoico metil ester; C14:0 tetradecanoico metil ester;
C14:1-9-tetradecenoico metil ester; C15:0 pentadecanoico metil ester; C15:1-10-pentadecenoico metil
ester; C16:0 hexadecanoico metil ester; C16:1-9-hexadecenoico metil ester; C17:0 heptadecanoico metil
ester; C17:1-10-heptadecenoico metil ester; C18:0 Octadecanoico metil ester; C18:1-9-octadecenoico
metil ester; C18:2-9,12-octadecadenoico metil ester; C18:1-9, 12,15-octadecatridenoico metil ester; C20:0
eicosanoico metil ester; C20:1-8- eicosenoico metil ester; C20:2-11,14-eicosadienoico metil ester; C20:3-
11,14,17-eicosatrienoico metil ester y C22:0 docosanoico metil ester. Preparar las soluciones
estándares FAME individuales como sigue: Romper la tapa del vial, abrir y transferir el contenido
cuidadosamente al vial de tres copas. Lavar el vial original con hexano para asegurar la completa
transferencia y adicionar el líquido de lavado al vial de tres copas. Adicionar 1,0 ml de la solución
estándar FAME C11:0 (ver b)), y diluir a 3 ml con hexano. Estas soluciones son estables una semana
guardadas en refrigeración (2° - 8°C).
(Continúa)

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NTE INEN 1500 2011-06

5.7.3.14 Muestra patrón de leche o producto lácteo sin adición de grasas vegetales

5.7.4 Preparación de la muestra

5.7.4.1 Extracción de la grasa

a) Productos lácteos. Pesar con precisión una porción de muestra que contenga entre 100 – 200 mg de
grasa dentro del matraz Majonnier. Adicionar 100 mg de ácido pirogálico, y 2,00 ml de la solución de
estándar interno. Adicionar unos pocos gránulos de ebullición al matraz. Adicionar 2,0 ml de etanol y
mezclar bien hasta que toda la porción del ensayo esté disuelta. Adicionar 4,0 ml de H2O y mezclar
bien. Adicionar 2,0 ml de NH4OH y mezclar bien. Colocar el matraz dentro de la canasta en el baño
de agua a 70°-80°C con agitación moderada durante 1 0 min. Mezclar el contenido del matraz usando
un mezclador Vortex cada cinco minutos, para incorporar las partículas adheridas a los lados del
matraz dentro de la solución. Luego de la digestión retirar el matraz del baño de agua y adicionar
unas pocas gotas de fenolftaleína. Mantener la solución básica (rosada) con la adición de hidróxido
de amonio. Adicionar suficiente etanol para llenar el reservorio del matraz y mezclar bien.

b) Extracción. Adicionar 25 ml de dietil éter al matraz Mojannier. Tapar el matraz y colocarlo en la

canasta de la centrífuga. Poner la canasta en el agitador, asegurando el matraz con la tapa de goma.
Agitar por 5 min. Enjuagar la tapa dentro del matraz con la mezcla de dietil éter-éter de petróleo.
Adicionar 25 ml de éter de petróleo, tapar el matraz y agitar 5 min más. Centrifugar por 5 min a 600
rpm. (Nota: si no se dispone de centrífuga, dejar en reposo al menos una hora hasta que se separen
las capas). Enjuagar la tapa dentro del matraz con la mezcla de dietil éter-éter de petróleo. Decantar
la capa de éter en un vaso de 150 ml y cuidadosamente enjuagar la boca del matraz dentro del vaso
con la mezcla de dietil éter-éter de petróleo. Evaporar lentamente el éter en el baño de vapor, usando
una corriente de nitrógeno para ayudar la evaporación. El residuo en el vaso contiene la grasa
extraída.

5.7.4.2 Metilación. Disolver el residuo de la grasa extraída en 2-3 ml de cloroformo y adicionar 2-3 ml de
dietil éter. Transferir la mezcla al vial de vidrio y evaporar a sequedad en un baño de agua a 40°C c on
corriente de nitrógeno. Adicionar 2,0 ml de BF3 al 7%, y 1,0 ml de tolueno. Tapar el vial con una tapa
rosca que contenga septas de teflón/silicona. Calentar el vial en estufa a 100°C por 45 min. Cada 10 m in
agitar suavemente el vial (Nota: la evaporación del líquido de los viales indica un tapado inadecuado; si
esto ocurre, descartar la solución y repetir el procedimiento completo). Dejar que el vial adquiera
temperatura ambiente (20° - 25°C). Adicionar 5,0 ml de H2O, 1,0 ml de hexano y 1,0 g de Na2SO4. Tapar
el vial y agitar 1 min. Dejar en reposo para que las capas se separen y cuidadosamente transferir la capa
superior a otro vial que contenga 1,0 g de Na2SO4. (Nota: la capa superior contiene los FAMEs incluido
el FAME de la solución de estándar interno de triglicéridos.). Inyectar los FAMEs dentro de la columna o
transferir a un inyector automático para el análisis de cromatografía.

5.7.5 Procedimiento

5.7.5.1 Determinación cromatográfica. Los tiempos de retención relativos (vs FAMES de la solución de
estándar interno de triglicéridos) y los factores de respuesta de los FAMEs individuales pueden obtenerse
por análisis de Cromatografía de gases de las soluciones estándar de FAMEs individuales y de la
solución estándar de la mezcla de FAME. Inyectar 2 µl de casa solución estándar de FAME individual y 2
µl de la solución estándar de la mezcla de FAME. Usar la solución estándar de la mezcla de FAMEs
para optimizar la respuesta cromatográfica antes de inyectar las soluciones de ensayo. Luego que todas
las condiciones cromatográficas se han optimizado inyectar la solución de ensayo (ver 4.1.4.2)

5.7.6 Interpretación de resultados. Se considera ausencia o negativo de presencia de grasas

vegetales cuando el cromatrograma de la muestra es similar al cromatograma de la muestra de leche o
productos lácteos sin adición de grasa vegetal.

(Continúa)
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APÉNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

Esta norma no requiere de otras para su aplicación.

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Métodos de ensayo presentados por miembros del Subcomité técnico de Leche y productos lácteos.
Quito, 1999.

AOAC Método oficial 996.06 Grasa (total, saturada e insaturada) en alimentos Método Cromatografía de
gases con extracción hidrolítica. AOAC 2005

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 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Documento: TÍTULO: LECHE. MÉTODOS DE ENSAYO CUALITATIVOS Código:
NTE INEN 1500 PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD AL 03.01-333
Primera revisión
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 2002-10-22
Oficialización con el Carácter de VOLUNTARIA
por Acuerdo No. 02 498 del 2002-12-26
publicado en el Registro Oficial No. 739 del 2003-01-07

Fecha de iniciación del estudio: 2010-11

Fechas de consulta pública: de a

Subcomité Técnico: Leche y Productos Lácteos

Fecha de iniciación: 2011-12-09 Fecha de aprobación: 2011-01-20
Integrantes del Subcomité Técnico:

NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Dr. Rafael Vizcarra Centro de la industria láctea, CIL-ECUADOR
Ing. Julio Gutiérrez UTA - FACULTAD DE ALIMENTOS
Ing. Juan Carlos Romero LACTEOS SAN ANTONIO
Dra. Teresa Rodríguez INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE, Guayaquil
Dra. Indira Delgado ALPINA ECUADOR S.A.
Dra. Mónica Sosa INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE, Quito
Dr. Alexander Salazar REYBANPAC – LACTEOS
Ing. Paola Simbaña UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
Ing. Noela Bautista UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA -
ECOLAC
Tlga. Tatiana Gallegos MINISTERIO DE SALUD – SISTEMA ALIMENTOS
Ing. Gustavo Navarro HOLSTEIN
Sr. Rodrigo Gómez de la Torre PRODUCTORES DE LECHE
Ing. Leonardo Baño AVELINA S.A.
Ing. Julio Vera LA HOLANDESA
Dr. Galo Izurieta PATEURIZADORA QUITO
Ing. Lourdes Reinoso SFG – MAGAP
Ing. Daniel Tenorio AILACCEP
Ing. Luis Sánchez DIRECCIÓN PROVINCIAL DE SALUD DE
PICHINCHA
Ing. Rocío Contero UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
Dr. David Villegas MIPRO
Dra. Katya Yépez NESTLÉ ECUADOR
Dr. Darío Solórzano NESTLÉ ECUADOR
Dr. Paúl Fuertes BUSTAMANTE & BUSTAMANTE
Dr. Rodrigo Dueñas REYBANPAC
Dra. Cecilia Zamora INDUSTRIAS LÁCTEAS TONI S.A.
Dra. Ma. Isabel Salazar INDUSTRIAS LÁCTEAS TONI S.A.
Ing. Jorge Chávez MAGAP
Dra. Verónica Iñiguez ALIMEC S.A.
Ing. Santiago Tinajero MAGAP
Ing. Franklin Hernández UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE
Ing. Fernando Párraga PROLAC
Ing. Ángel Oleas PROLAC
Dr. Marlon Revelo PASTEURIZADORA QUITO
Tlgo. Ernesto Toalombo EL SALINERITO
Dra. Ana María Hidalgo LABORATORIO OSP – UNIVERSIDAD CENTRAL
Dr. Antonio Camacho ACA FOOD SAFETY
Ing. César Guzmán ASAMBLEA NACIONAL
Ing. María E. Dávalos (Secretaria Técnico) INEN
Otros trámites: Esta NTE INEN 1 500:2011 (Primera Revisión), reemplaza a la NTE INEN 1 500:2003

La Subsecretaría de Industrias, Productividad e Innovación Tecnológica del Ministerio de Industrias y

Productividad aprobó este proyecto de norma en sesión de
Oficializada como: Voluntaria Por Resolución No. 11 139 de 2011-05-20
Registro Oficial No. 481 de 2011-06-30
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8- E8-29 y Av. 6 de Diciembre
Casilla 17-
17-01-
01-3999 - Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815
Dirección General: E-
E-Mail:direccion@inen.go
Mail:direccion@inen.gob
@inen.gob.ec
Área Técnica de Normalización: E- E-Mail:normalizacion
Mail:normalizacion@inen.go
normalizacion@inen.gob
@inen.gob.ec
Área Técnica de Certificación: E-E-Mail:certificacion
Mail:certificacion@inen.go
certificacion@inen.gob
@inen.gob.ec
Área Técnica de Verificación: E-E-Mail:verificacion
Mail:verificacion@inen.go
verificacion@inen.gob
@inen.gob.ec
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E- E-Mail:inenlaboratorios
Mail:inenlaboratorios@inen.go
inenlaboratorios@inen.gob
@inen.gob.ec
Regional Guayas: E-
E-Mail:inenguayas
Mail:inenguayas@inen.go
inenguayas@inen.gob
@inen.gob.ec
Regional Azuay: E-Mail:inencuenca@inen.gob
Mail:inencuenca@inen.gob.ec
Regional Chimborazo: E-E-Mail:inenriobamba@inen.gob.ec
Mail:inenriobamba@inen.gob.ec
URL:www.inen.gob.ec