Factores Que Afectan La Actividad de Las Enzimas

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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

2
OBJETIVOS: METODOLOGÍA
α-amilasa
 Observar la influencia de la temperatura y el Almidón maltosa + otros productos
pH sobre una reacción enzimática + +
 Constatar la especificidad de las enzimas
 Examinar el efecto de los iones metálicos R. Lugol R. Lugol
pesados sobre la actividad de la α-amilasa
 Determinar el valor de Vmax y Km para la α-
amilasa Color azul oscuro color amarillo ocre
FUNDAMENTO: Preparación de la amilasa salival:
Las enzimas son proteínas cuya función es Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para
catalizar las muy diversas reacciones que se llevan eliminar los restos de alimentos o de crema dental.
a cabo dentro de los organismos vivos. Su acción Se miden en una probeta 60 ml de agua destilada y
es específica y se afecta por factores tales como la con ellos se enjuaga la boca, en varios buches, por
temperatura y el pH del medio, la concentración de espacio de 3 minutos, cada buche. El líquido
enzima y de sustrato, la presencia o ausencia de recogido se recoge en un beaker de 100 mL. Esta
cofactores y/o inhibidores, etc. En esta práctica se solución, que en adelante se denominara amilasa
va a ensayar la acción de varios de los factores salival, será la que se utilice para la realización de
mencionados sobre la α-amilasa, una enzima que las distintas partes de la práctica, la que debe estar
en los seres humanos se encuentra presente en la en frío (El clima de la ciudad de Pasto es ideal para
saliva y en el páncreas. este propósito).
La α-amilasa (nombre sistemático: 1,4-glucano- Influencia de la temperatura sobre la actividad

glucanohidrolasa; código: 3.2.1.1 de la Unión de la amilasa salival
Internacional de Bioquímica; peso molecular:
45000) hidroliza los enlaces glucosídicos α 1- 4. Se rotulan cuatro tubos de ensayo 0, 20, 40, 90. En
Estos enlaces se encuentran presentes en el cada uno se vierte 1 ml de suspensión de almidón
almidón. al 0.5%. El tubo 0 se coloca, durante 10 minutos,
en un baño de hielo; el tubo 20 se deja a
El almidón es una mezcla de dos polisacáridos: temperatura ambiente; el tubo 40 y el tubo 90 se
amilosa y amilopectina. La amilosa con el yodo da colocan respectivamente en un baño de agua a 40
una coloración azul oscura que se comunica a todo °C y en un baño de agua hirviente, durante 10
el almidón. Esta propiedad permite seguir la acción minutos, para que el contenido de los tubos
de la α-amilasa sobre el almidón: a medida que adquiera la temperatura correspondiente. Mientras
éste se va hidrolizando el color azul va tanto se colocan 2 gotas de lugol en varias
desapareciendo hasta llegar a un color amarillo concavidades de una placa de porcelana. Al cabo
ocre, característico de la solución de yodo cuando de los 10 minutos se agrega a cada tubo SIN
la hidrólisis ha sido total: RETIRARLO DEL BAÑO, 0.5 ml de amilasa
salival. Se agitan bien los tubos y se dejan durante
20 segundos a las condiciones de temperatura
anteriormente señaladas. Al cabo de este tiempo se
colocan tres gotas del contenido de cada tubo en
una concavidad de una placa de porcelana a la que
3
previamente se le habían adicionado dos gotas del

reactivo de Lugol, y se observa el color producido. Influencia del pH en la actividad enzimática
La temperatura óptima será aquella en la cual se
observe más fácilmente el color amarillo ocre. Si el Rotule cinco tubos de ensayo 3, 5, 6, 7 y 9;
color permanece azul en todos los pozos, se repite deposítelos en un baño de agua a la
el procedimiento en la placa de porcelana hasta TEMPERATURA ÓPTIMA (obtenida en la parte
obtener el resultado deseado. anterior) y agregue, en su orden sin retirarlos del
baño las sustancias que se indican a continuación:
4
TUBO 3 5 6 7 9
Solución
Almidón 0.5% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Amortiguador pH 3.0 2 ml - - - -
Amortiguador pH 5.0 - 2 ml - - -
Amortiguador pH 7.0 - - - 2 ml -
Amortiguador pH 9.0 - - - - 2 ml
Amilasa salival* 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5ml
* Agregarla de última, cuando ya los tubos con los demás componentes hayan adquirido la
temperatura (unos 10 minutos después de haber agregado el último componente)
Después de 1 minuto deposite cinco gotas del tubo 3 en una concavidad de la placa de
porcelana en la que previamente había depositado dos gotas del reactivo del Lugol y
observe el color producido. Repita el mismo procedimiento con los demás tubos. El pH
óptimo para la α- amilasa corresponde a aquel tubo donde se obtenga mas rápidamente el
color amarillo ocre. En caso de que no se observe este color en ninguno de los ensayos
repita el procedimiento anterior, con todos los tubos, cada minuto hasta que en alguna
concavidad aparezca el color amarillo ocre. Este será el pH óptimo.
Concentración óptima de enzima
Rotule cuatro tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4, deposítelos en un baño de agua a la temperatura

óptima y, sin sacarlos de allí, agregue, en su orden:
TUBO 1 2 3 4
Solución
Almidón 0.5% 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Amortiguador de pH óptimo 2.9 ml 2.7 ml 2.1 ml 1.2 ml
Amilasa salival 0.1 ml 0.3 ml 0.9 ml 1.8 ml

5
Realice los mismos ensayos que para Efecto de los iones metálicos sobre la
determinar la temperatura y el pH acción de la amilasa
óptimos. Encuentre la concentración
óptima de enzima. Rotule cuatro tubos de ensayo como
Control, Hg++ , Pb++ y Cu++. Deposítelos
en un baño de agua a la temperatura
óptima y agregue en su orden:
TUBO Control Hg++ Pb++ Cu++
Solución
Almidón 0.5% 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Amortiguador de pH óptimo 3 ml 2 ml 2 ml 2 ml
HgCl2 0.1% - 1 ml - -
Pb(NO3)2 0.1% - - 1 ml -
Cu(NO3)2 0.1% - - - 2 ml
Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Una vez agregada la enzima determine la luego solamente al primer tubo agregue la
acción de los iones metálicos sobre la amilasa sin sacarlo del baño maría. Agite
amilasa. SIN SACARLO DEL AGUA y al cabo de
15 segundos extraiga 3 gotas de la
solución y haga la prueba con el lugol. Si
Efecto de la concentración de sustrato no hay cambio a rojo pardo, espere otros
10 segundos y realice el mismo
Rotule cinco tubos de ensayo 0.25, 0.5, procedimiento hasta que aparezca el rojo
1.0, 2.0 y 4.0. Deposítelos en un baño de pardo. Debe tomar el tiempo lo más
agua a la temperatura óptima y, agregue exacto posible. Realice el mismo
en su orden, almidón y amortiguador. procedimiento para los demás tubos, uno
Deje que estén a la temperatura óptima y por uno.
Tubo 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0
Solución
Almidón 0.5% 0.5 ml 1 ml 2.0 ml 4.0 ml 8.0 ml
Amortiguador de pH óptimo 8.5 ml 8.0 ml 7 ml 5 ml 1 ml

6
Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál fue la temperatura óptima de la amilasa? ¿Cuál el pH óptimo? ¿Con cual

solución de amilasa salival fue más rápida la digestión del almidón?
2. ¿Qué efecto tuvieron el mercurio, el plomo y el cobre sobre la actividad de la α-
amilasa?
3. Llene la siguiente tabla:
Volumen de Concentración tiempo, velocidad 1/[ S ] 1/v

Sustrato, ml del sustrato, [ S ] t, min v = [ S ]/ t
0.5 ml
1.0 ml
2.0 ml
4.0 ml
8.0 ml
4. Con base en los datos de la tabla anterior, construya dos graficas:

Gráfica 1: velocidad de reacción, v, en función de la concentración de sustrato, [ S ]
Gráfica 2: 1/v en función de 1/[ S ]. Gráfica de Lineaweaver-Burk.
A partir de las dos graficas deduzca los valores de la velocidad máxima, Vm y de la

constante de Michaellis-Menten, Km. Compare sus resultados con los reportados en la
literatura.

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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

FUNDAMENTO: Preparación de la amilasa salival:

La α-amilasa (nombre sistemático: 1,4-glucano- Influencia de la temperatura sobre la actividad

previamente se le habían adicionado dos gotas del

Amilasa salival* 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5ml

Concentración óptima de enzima

Rotule cuatro tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4, deposítelos en un baño de agua a la temperatura

Amortiguador de pH óptimo 2.9 ml 2.7 ml 2.1 ml 1.2 ml

Amilasa salival 0.1 ml 0.3 ml 0.9 ml 1.8 ml

TUBO Control Hg++ Pb++ Cu++

Tubo 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0

Almidón 0.5% 0.5 ml 1 ml 2.0 ml 4.0 ml 8.0 ml

Amortiguador de pH óptimo 8.5 ml 8.0 ml 7 ml 5 ml 1 ml

1. ¿Cuál fue la temperatura óptima de la amilasa? ¿Cuál el pH óptimo? ¿Con cual

Volumen de Concentración tiempo, velocidad 1/[ S ] 1/v

4. Con base en los datos de la tabla anterior, construya dos graficas:

A partir de las dos graficas deduzca los valores de la velocidad máxima, Vm y de la

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