Manual BIOQUIMICA v2

Manual de Laboratorio
“Bioquímica”

QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

3er Cuatrimestre

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE MORELIA
“Quimica area Biotecnologia”
MANUAL DE LABORATORIO
Asignatura: Bioquimica Revisión: 2
Cuatrimestre: Tercer Plan de estudios: 2017 Página 2 de 63
ÍNDICE
Página
1 UNIDAD TEMÁTICA I – Introducción a la Bioquímica ...................................................................... 5
Resultado del aprendizaje. ...................................................................................................................... 5
1.1 TEMA 1 – La Bioquímica y su relación con otras ciencias ........................................................ 6
1.2 TEMA 2 – El agua y su importancia en la bioquímica. ............................................................... 6
1.2.1 Practica No. 1 ..................................................................................................................... 6
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS ............................................................................................. 6
2 UNIDAD TEMÁTICA II – Biomoléculas ........................................................................................... 13
Resultado del aprendizaje. .................................................................................................................... 13
2.1 TEMA 1 – Carbohidratos. ......................................................................................................... 14
2.1.1 Practica No. 2 ................................................................................................................... 14
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS. .................... 14
2.2 TEMA 2 – Proteinas ................................................................................................................. 21
2.2.1 Practica No. 3 ................................................................................................................... 21
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ............................................................................................. 21
2.2.2 Practica No. 4 ................................................................................................................... 28
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS .................................................................................................. 28
2.3 TEMA 3 –Lípidos ...................................................................................................................... 33
2.3.1 Practica No. 5 ................................................................................................................... 33
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS. ...................................... 33
2.4 TEMA 4 – Vitaminas ................................................................................................................ 39
2.4.1 Practica No. 6 ................................................................................................................... 39
IDENTIFICACIÓN DE VITAMINAS ............................................................................................... 39
2.5 TEMA 5 – Ácidos nucleicos ..................................................................................................... 44
2.5.1 Practica No. 7 ................................................................................................................... 44
EXTRACCIÓN DE ADN ................................................................................................................ 44
2.5.2 Practica No. 8 ................................................................................................................... 49
AISLAMIENTO DE ÁCIDO RIBONUCLEICO ............................................................................... 49
3 UNIDAD TEMÁTICA III –Bioenergética ........................................................................................... 52
Resultado del aprendizaje. .................................................................................................................... 52
3.1 TEMA 1 – Moléculas y compuestos transportadores de energía ............................................ 53
3.2 TEMA 2 – Glucolisis ................................................................................................................. 53
3.2.1 Practica No. 9 ................................................................................................................... 53
RESPIRACIÓN CELULAR ............................................................................................................ 53
3.3 TEMA 4 – Ciclo de Krebs ........................................................................................................ 58
3.4 TEMA 5 – Fosforilación oxidativa ............................................................................................. 58
Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

3.4.1 PRACTICA NO. 10 ........................................................................................................... 58

PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA (SUPUESTO PRACTICO) .............................. 58
4 FUENTES BIBLIOGRÁFICAS. ........................................................................................................ 61
4.1 Sugeridas. ................................................................................................................................ 61
4.2 De apoyo. ................................................................................................................................. 62
5 ANEXO. ........................................................................................................................................... 63
6 Compiladores: ................................................................................................................................. 63

COMPETENCIAS A LAS QUE CONTRIBUYE LA ASIGNATURA.
Transformar materias primas a través de procesos biotecnológicos para obtener

metábolitos de importancia en el área de la salud y agroalimentaria.
OBJETIVO DE LA ASIGNATURA
El alumno identificará la función del agua, biomoléculas y bioenergética a través del

análisis de los bioprocesos para comprender el funcionamiento celular y la
producción de metabolitos de interés biotecnológico.

1 UNIDAD TEMÁTICA I – Introducción a la Bioquímica
Resultado del aprendizaje.
Elaborará mapas conceptuales de:

-La bioquímica y como se relaciona con otras ciencias.
-El agua estructura y propiedades.

1.1 TEMA 1 – La Bioquímica y su relación con otras ciencias
1.2 TEMA 2 – El agua y su importancia en la bioquímica.

1.2.1 Practica No. 1
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
OBJETIVO
• Preparar de soluciones amortiguadoras de pH conocido.

• Apreciar del poder regulador y efecto de la concentración.
• Experimente y entienda cómo se comporta un sistema amortiguador de pH.
• Aprenda el uso de la ecuación de Henderson-Hasselbalch.
• Aprenda a calcular el pK de un par ácido-base.
• Mida el pH de diferentes sustancias y calcule su concentración de H+.
FUNDAMENTO.
Los procesos celulares son sensibles a los cambios de pH y se realizan en un medio cuyo
pH está controlado. El estudio de los mismos y su reproducción “in vitro” requiere, por lo
tanto, el empleo de medios igualmente regulados en cuanto a su pH. La selección de una
solución reguladora adecuada para un determinado proceso bioquímico, debe ajustarse a los
siguientes criterios: Escoja el buffer de tal modo que su pKa esté muy próximo al pH, al cual
va a trabajar (generalmente, entre 6 y 8). Si se espera que el pH va a descender durante el
proceso bioquímico, escójase el buffer cuyo pKa sea algo menor que el pH inicial de trabajo;
si el pH va a aumentar, el pKa debe ser algo mayor que el pH inicial. Las sustancias que va a
emplear deben ser hidrosolubles y con un alto grado de pureza, a fin de evitar efectos o
reacciones espurias. No deben usarse en la elaboración del buffer, sustancias citotóxicas o
que tengan acciones inhibitorias de Enzimas.
Por lo que el producto iónico del agua se toma como base para la escala de pH. Para esta
escala se tomo únicamente la concentración de los iones hidrógeno (1X10 –7) y para que
esta concentración sea más fácil de expresar, se toma el exponente del logaritmo negativo
de la concentración de hidrogeniones. Por lo tanto, el pH es el logaritmo de la concentración
de hidrogeniones:
pH = - log (H+)
El pH del agua pura es de 7 a una temperatura de 25ºC, puesto que
pH = - log (H+) y - log (H+) = 7
El valor de pH 7, que se obtiene con agua a 25 º se concidera un pH neutro, dado que en
este punto la concentración de hidroxilos es semejante a la de iones hidrógeno.

Al aumentar la concentración de hidrógenos el pH es más ácido y, al expresar dicha

concentración en forma logaritmica y negativa, se obtienen valores menores de 7 (0 a 7). Del
mismo modo, al disminuir la concentración de hidrógenos, aumenta el valor del logaritmo
negativo, lo cual indica alcalinidad (7 a 14). La acidez se mide por titulación con un álcali
hasta un punto final que depende del indicador seleccionado, y el resultado se expresa en
términos de un ácido dado. El valor de la titulación nos indica si los ácidos presentes son
fuertes o débiles; sin embargo, si se efectúa un titulación potenciométrica, la gráfica de la
curva de titulación da información sobre la fuerza relativa de los ácidos presentes. En
muchos casos, el conocimiento de la actividad del ión hidrógeno resulta más útil que la
acidez titulable. Durante el almacenamiento y el deterioro de los alimentos, ocurren cambios
por acción enzimática y por desarrollo de bacterias. La estabilidad de las proteínas también
depende de la actividad del ión hidrógeno; de aquí que la medición del pH sea importante
para conocer la eficacia de los Si los valores de pH son expresados en forma logarítmica,
una diferencia de una unidad en la escala de pH representa la diferencia de 10 veces la
concentración real de iones hidrógeno. (Díaz, 1995; Bohinski, 1978; Kirk, 1996).
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
Cantidad Materiales Reactivos Equipo

18 Vasos pp 100 ml Agua destilada Parrilla calentamiento
3 Probetas 100 ml Buffer pH 7, 4, 10 Balanza analítica
30 Popotes Fenolftaleina Potenciómetro
4 Buretas 25 ml HCl
3 Matraces Erlenmeyer de 125 mL NaHCO3
3 Vasos pp 250 ml NaOH
4 Vasos pp 500 ml Tiras reactivas pH
3 Espátulas
10 Pipetas pasteur
6 Bulbos para pipeta Pasteur
4 Soportes universales
4 Pinzas para bureta
2 vasos de precipitados de 100 mL KH2PO4 0.1M
6 Pipeta de 10 mL Na2HPO4 0.1M
3 Probeta de 50 mL

PARTE A. Preparación de disoluciones amortiguadoras.
Procedimiento
Prueba 1
Llena una bureta limpia hasta arriba de la marca de cero con HCl 0.50 M. Abre por un
momento la llave y deja que la disolución caiga en un vaso de precipitados hasta que no
quede aire en la punta de la bureta y la superficie líquida se encuentre en la marca de 0mL o
debajo de ella; anota este valor.

Coloca 40 mL de agua destilada en uno de los matraces Erlenmeyer. Agrega 10 gotas de

indicador universal.
Compara el color del contenido del matraz con la escala del indicador. Anota el valor de pH.
Coloca el matraz bajo la bureta. Abre lentamente la llave y agrega cinco gotas de ácido al del
matraz y agítalo. Anota el pH de esta disolución. Conserva este matraz como estándar de
color para compararlo con la siguiente disolución.
Prueba 2
Agrega 40 mL de una disolución 0.10 M de NaHCO3 a un matraz Erlenmeyer de 125 mL
limpio. Utiliza un popote o pajilla para soplar con tu aliento (que contiene dióxido de carbono,
el ácido conjugado del bicarbonato).
Agrega 5 gotas de indicador universal. Agita el matraz. Anota el color de la disolución y su
pH.
Anota el volumen inicial de la bureta.
Agrega cinco gotas de HCl 0.50 M hasta que el color y el pH sean idénticos a los del matraz
de estándar de color obtenido en la parte 1. Anota el volumen final de la bureta.
Determina el volumen de HCl agregado y anota este valor.
Vacía la disolución de HCl de la bureta. Enjuágala haciendo pasar a través de ella agua
destilada y dejando que se vacíe en un vaso de precipitados. Repite el enjuague dos veces.
Prueba 3
Llena la bureta limpia hasta arriba de la marca de cero con NaOH 0.50 M. Elimina el aire de
la punta de la bureta de manera similar a como hiciste al inicio de la parte 1. Anota el
volumen inicial.
Coloca 40 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Agrega 10 gotas de
indicador universal. Anota el valor del pH.
Coloca el matraz bajo la bureta. Abre lentamente la llave y agrega cinco gotas de base del
matraz y agítalo.
Anota el pH de esta disolución básica y conserva el matraz como estándar para compararlo
con la siguiente disolución.
Parte 4
Agrega 40 mL de una disolución 0.10M de NaHCO3 a un matraz Erlenmeyer de 125 mL
limpio. Utiliza un popote o pajilla para soplar con tu aliento (que contiene dióxido de carbono,
el ácido conjugado del bicarbonato).
Agrega 5 gotas de indicador universal y agita el matraz. Anota el color de la disolución y su
pH.
Anota el volumen inicial de la bureta.
Agrega cinco gotas de NaOH 0.50 M de la bureta al matraz y agita. Anota el color y el pH.
Continúa agregando disolución de NaOH hasta que el color y el pH sean idénticos a los del
matraz de estándar de color obtenido previamente con el agua y la base. Anota el volumen
final de la bureta.
Determina el volumen de disolución de NaOH agregado. Anota este valor.

Partes 1 y 2
pH inicial pH después de las Vol inicial de Vol. Final de ácido Vol total de ácido
5 gotas de ácido ácido en la bureta en la bureta agregado

Partes 3 y 4
pH inicial pH después de las Vol inicial de base Vol. Final de base Vol total de base

5 gotas de base en la bureta en la bureta agregado

Vacía la disolución de NaOH de la bureta. Enjuágala haciendo pasar a través de ella agua
destilada y dejando que se vacíe en un vaso de precipitados. Repite el enjuague dos veces.
PARTE B. Preparación de soluciones amortiguadoras de pH conocido.
Procedimiento
Prueba 1
a) Calcule los gramos de KH2PO4 y Na2HPO4 necesarios para preparar 50mL de

soluciones amortiguadoras con pH de: 7.0. El pKa del par conjugado es de 7.2.
b) Tomando como base el resultado de sus cálculos, prepare la solución que le indique su
profesor y compruebe el valor de pH con el potenciómetro.
Prueba 2
a) Prepare las siguientes soluciones:

• Solución de Na0H 1N - Un litro.
• Solución para los buffer de fosfato:
A: Disolver 27.6 g (0.2 moles) de fosfato de sodio monobásico, monohidratado, y
aforar a un litro.
B: Disolver 28.4 g (0.2 moles) de fosfato de sodio dibásico y aforar a un litro con agua
destilada.
Cantidades que deben mezclarse de A y B para obtener el pH indicado:

pH requerido m1 de A m1 de B

5.8 92.0 8.0
6.0 87.7 12.3
6.2 81.5 19.5
6.4 73.5 26.5
6.5 68.5 31.5
6.6 62.5 37.5
6.8 51.0 49.0
7.0 39.0 61.0
7.2 28.0 72.0
7.5 16.0 84.0

• Soluciones para los buffer de ftalatos:
Biftalato de potasio 0.2 M - 500 ml. HCl 0.2M - Un litro. NaOH 0.2.M un litro.
A 50 ml de solución de biftalato de potasio 0.2 M, agregue la cantidad de HCI o de
NaOH 0.2 M que se indica, según el pH deseado, y complete a 200 ml con agua
destilada.
pH ml de HCl pH ml de NaOH
0.2 M 0.2M

2.2 49.5 4.2 3.0

2.4 42.2 4.4 6.6
2.6 35.4 4.6 11.1
2.8 28.9 5.0 22.6
3.0 22.3 5.4 34.1
3.4 10.4 5. 6 38.8
3.8 2. 9 5.8 42.3
4.0 0.1

b) Al recibir su problema, estudie las condiciones que se piden, busque un buffer cuyo pka
sea adecuado (consulte la tabla del apéndice) y aplicando la ecuación de Henderson -
Hesselbach, calcule las cantidades que deben pesar de ácido y base conjugada, para
preparar 100 ml. de disolución.
c) Pese las cantidades que calculó o mida los volúmenes adecuados, y disuelva. Afore
aproximadamente a 75 ml.
d) Transfiera esta disolución a un vaso de 150 ml y verifique el pH en un pH – metro
previamente calibrado y ajustada la temperatura a las condiciones de trabajo. Si el pH no es
exactamente el pedido, ajústelo agregando el componente que sea necesario para subir o
bajar el pH hasta el valor requerido.
e) Afore a 100 ml con agua destilada y verifique nuevamente el pH.
f) Determinación de la capacidad buffer. La capacidad buffer es la cantidad de base fuerte
requerida para alterar el pH:
C.B.= db /DpH.
Siendo Dph el incremento de pH resultante la adición de un volumen db de base. Ponga su

disolución en un vaso, introduzca los electrodos del pH - metro y disponga una bureta con
disolución de NaOH 1N y un agitador magnético, dentro del vaso. Determine el pH inicial.
Ponga el agitador en marcha sin que éste golpee los electrodos, y agregue un volumen de
NaOH 1N medido exactamente en la bureta (Un ml). Anote el pH que resulte. Repita las
adiciones de base, en volúmenes iguales (1 ml) y anote los valores de pH correspondientes,
hasta obtener por lo menos 5 lecturas.
Problema No._____pH requerido______Concentración molar__________
Cálculo efectuados: ____________________________________________
Cantidades por pesar o medir: ___________________________________
Determinación de la capacidad buffer: _____________________
Vol. De NaOH 1N adicionado: ___________________
Capacidad buffer: ___________
ANALISIS DE RESULTADOS. Interpreta de manera correcta los resultados del experimento y

realiza de manera adecuada los cálculos. Presenta los datos de una forma clara que permite
su fácil interpretación (usa tablas, diagramas, grafícas, etc.)
CONCLUSIONES. Elabora una conclusión valida basada en un correcto análisis de los resultados, y
justifica que los objetivos e hipótesis se hayan alcanzado o no.
CUESTIONARIO
• ¿Cuál de las muestras de agua tiene un valor de pH más parecido al valor que
esperabas? ¿A qué puedes atribuir las desviaciones del valor esperado en estas
disoluciones?

• ¿Cuál puede ser la sustancia proveniente de tu aliento, que provoca el cambio en el

pH del agua? Escribe la reacción correspondiente.
• ¿Qué cambio hubo en la acidez de la muestra en la que soplaste?
• ¿Cómo es el cambio en el pH al agregar ácido o base a las disoluciones de
CO2/HCO3_, comparado con el cambio de pH en el agua pura?
• ¿Qué es una disolución amortiguadora?
• 1. Indique el nombre completo, pka y peso molecular (o fórmula) de los siguientes
compuestos usados como reguladores de pH en Bioquímica: TRIS; CAPS; MES;
TES; Tricina.
• 2. ¿ Para qué valores de concentración de los componentes de un buffer, tiene éste
la máxima capacidad buffer?
• 3. ¿ Por qué los aminoácidos actúan como reguladores del pH?
• 4.-¿Para qué nos sirve conocer el pH en los organismos vivos, así como en los
alimentos?
• 5.-¿Qué es más importante, conocer la acidez titulable o la actividad del ión
hidrógeno? y ¿por qué?
BIBLIOGRAFÍA
E. Conn; p.k Stumpf, 1976 Outlines of Biochemistry Cap.1 Wiley internacional (Edición en
Español. Ed. Limusa 1976 bioquímica fundamental).
J.W. Suttie, 1976 Fundamentos de Bioquímica Cap.1 Nueva Ed. Interamericana.
Calbiochem, 1975 ( D.E.Gueffroy, editor) A guide for the preparation and use of buffers in
biological systems. Calbioche, Cal.
B.L.Williams; k.Wilson, 1975 principales and techniques of practical Biochemistry Cap.1
Arnold publishers.
W.Cowgill, B. Pardee,1964 Técnicas de investigación bioquímica p. 116 y ss. Ed. Alhambra.
Díaz Zagoya, J., y Hicks Gómez, J.J., 1995. Bioquímica . 2ª edición. Interamericana•
McGraw• Hill.
Bohinski, R. C., 1978. Bioquímica. 1ª edición. Fondo Eductativo Interamericano.
Kirk, R.S., Sawyer, R., y Egan, H. 1996. Composición y Análisis de Alimentos de Pearson. 2ª
edición. C.E.C.S.A

LISTA COTEJO.
MATRIZ DE NIVELES DE LOGRO PARA LAS HABILIDADES DEL TRABAJO EXERIMENTAL.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
HABILIDADES CRITERIOS NIVEL DE LOGRO OBSERVACIONES
Puntaje (0-2)
Planteamiento Planteamiento
de hipótesis de hipótesis
Identificación
de variables
Trabajo Seguimiento de
experimental instrucciones
Desarrollos de
la técnica
Análisis de Interpretación
resultados de resultados y
cálculos
Presentación
de datos
Elaboración de Elaboración de
conclusiones conclusiones
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
Evaluación Identificación
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

2 UNIDAD TEMÁTICA II – Biomoléculas
A partir de un ejercicio práctico realizará en una muestra la identificación de:

• Carbohidratos
• Proteínas
• Lípidos
• Vitaminas
• Ácidos nucleicos

2.1 TEMA 1 – Carbohidratos.

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE
CARBOHIDRATOS.
OBJETIVO
• Determinar la caracterización de los carbohidratos, derivados de su estructura,
realizando algunas reacciones generales de identificación.
FUNDAMENTO
Los carbohidratos se definen como polihiroxialdehídos, polihidroxicetonas o aquellos

compuestos que por hidrólisis los producen. Los carbohidratos se clasifican, con base en su
estructura química, por el número de unidades en: monosacáridos, oligosacáridos y
polisacáridos. Los monosacáridos, la unidad de carbohidrato, puede ser aldosas
(polihidroxialdehídos) o cetosas (polihidroxicetonas) y éstas a su vez se clasifican con base
al número de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y tetrulosas, pentosas y pentulosas,
hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, etc. Para finalmente reclasificarse cada una de
ellas por el número de sus centros quirales. Los oligosacáridos están constituidos de 2-6
monosacáridos, unidos a través del enlace glicosídico que puede ser hidrolizado por enzimas
o por ácidos en ciertas condiciones. Los polisacáridos son carbohidratos que contienen un
gran número de monosacáridos, unidos por enlaces glicosídicos; son hidrocoloides, no
forman verdaderas soluciones, no tienen color ni sabor y su peso molecular puede llegar
hasta varios millones. Los polisacáridos son polímeros lineales o ramificados constituidos por
un solo tipo de monosacáridos (homopolisacáridos) o por diferentes monosacáridos
(heteropolisacáridos). Los carbohidratos son en general más solubles en agua y solvente
inorgánicos y menos solubles o insolubles en solventes inorgánicos. Para la identificación de
los carbohidrtaos por las pruebas cualitativas se toman en cuenta los siguientes criterios:
PRUEBA DE BIAL PARA PENTOSAS. Cuando se calienta pentosas con HCl concentrado se
forma furfural que se condensa con orcinol (3,5-dihidroxitolueno), en presencia de iones
ferricos para dar un complejo coloreado.
REACCIÓN DE MOLISCH. Se utiliza como reactivo una disolución de α-naftol al 5% en
etanol de 96o. En un tubo de ensayo a temperatura ambiente, se deposita la solución
problema y un poco del reactivo de Molisch. A continuación, se le añade ácido sulfúrico e
inmediatamente aparece un anillo violeta que separa al ácido sulfúrico, debajo del anillo, de
la solución acuosa en caso positivo. Es una reacción cualitativa, por lo que no permite saber
la cantidad de glúcidos en la solución original.
PRUEBA DE SELIWANOFF. Las cetosas se deshidratan mas rápidamente que las aldosas
dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto

coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaría la

deshidratación de las aldosas.
PRUEBA DE YODO. El yodo forma complejos coloreados de absorción con los
polisacáridos.
REACCIÓN DE TOLLENS. La prueba de Tollens es una reacción característica para
azucares reductores dándonos compuestos coloreados (negros) cuando se trate de ellos.
REACCIÓN DE FEHLING. La reacción de Fehling esta basada en la acción reductora que
tienen los azucares sobre los iones cúpricos EN MEDIO ALCALINO.
REACCIÓN DE BENEDICT PARA AZUCARES REDUCTORES. Esta prueba se basa en la
reacción de reducción del cobre de Benedict. La glucosa y otras sustancias reductoras
reducen los iones cúpricos a iones cuprosos y forman un oxido cuproso rojo. El color azul de
Cu++ es negativo para sustancias reductoras.
HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA. La sacarosa se hidroliza en solución ácida dando fructosa
y glucosa. Estos componentes pueden someterse luego a la prueba de Felhing.

60 tubos ensaye medianos Glucosa Balanza analítica
12 tubos ensaye grandes Manosa Parilla
12 vasos pp 100 ml Maltosa Vortex
2 Vasos pp 500 ml Ribosa
6 Gradillas Galactosa
3 Espátulas Fructosa
12 Pipetas 10 ml Lactosa
12 Pipetas 2 ml Sacarosa
6 perillas Jugo de naranja
12 Vasos pp 50 ml Jugo de uva
3 Probetas de 100 ml Jugo de manzana
Papa
Camote
H2SO4
HCl
Almidón
Yodo
KI
α-naftol
Orcinol
NaOH
NaCO3 anhidro
Citrato de sodio
CuSO4.5H2O
Agua
Etanol

Resorcinol
FeCl3
PARTE A. Preparación de reactivos y soluciones.

Preparar las siguientes soluciones y reactivos para la ejecución de las diferentes etapas de
la práctica:

Reactivo de Benedict:
• Pesar 10 g de NaCO3 anhidro y disolver en 20 ml de agua destilada hervida.
• Pesar 17.3 g citrato de sodio y disolverlo en 20 ml de agua destilada hervida.
• Pesar 17.3 g de CuSO4.5H2O y disolverlo en 30 ml de agua destilada hervida.
• Mezclar las tres soluciones cuando estén frías. Aforar a 100 ml con agua destilada
hervida.
Solución de almidón 1 %:
• Pesar 1 g de almidón y llevar a 100 ml con agua destilada caliente. Preparar fresco.
Solución de yodo:
• Disolver un gramo de yodo en una solución de Kl 2%.
Reactivo de Molish
• Pesar 10 g de α-naftol y disolverlo en 100 ml de etanol al 96 %.
Reactivo de Seliwanoff
• Pesar 0.5 g de resorcinol, adicionarle 330 ml de HCl conc. y llevarla a un litro con
agua.
Reactivo de Bial.
• Pesar 0.3 g de orcinol y adicionarle 100 ml de HCl conc. y FeCl3 al 1%.
Reactivo de Fehling:
• Solución a: pesar 34.65 g de sulfato de cobre y disolver en 300 ml de agua destilada,
llevar a 500 ml con agua y conservar en frasco con tapón de hule. Solución b.- pesar
125 g dé KOH y 173 g de tartrato de sodio y potasio, y llevar con agua destilada a
500 ml, conservar en frasco revestido de parafina y con tapón de hule.
PARTE B. Pruebas para la identificación de carbohidratos.
1. Prueba de Benedict
Procedimiento
Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de la muestra a ensayar, agregar 2 ml del reactivo de
Benedict y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 100° C durante dos
minutos. Saque el tubo y póngalo en una gradilla y después de un corto tiempo observe si se
ha formado un precipitado, La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo
evidencia la presencia de un azúcar reductor.

2. Prueba de Molish:
Procedimiento
En un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue dos gotas
de reactivo de Molisch y mezcle bien. Luego incline el tubo y deposite 1 ml de H2SO4
concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo. No mezcle. Sólo coloque el tubo
en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta que aparece en la zona de
contacto de los dos líquidos. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los
enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o
hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del
reactivo de Molisch dando un producto coloreado.
3. Prueba de Seliwanoff:
Procedimiento
En un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 2 ml del reactivo
de Seliwanoff y proceda a colocar el tubo de ensayo en un baño de María a 100° C durante
dos minutos.
La sacarosa (un disacárido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacárido
de la fructosa) dan positiva la reacción, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la
hidrólisis del compuesto liberando fructosa.
4. Prueba de Bial:
Procedimiento
En un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 1 ml del reactivo
de Bial + 2.5 ml de ácido clorhídrico concentrado y proceda a colocar el tubo de ensayo en
un baño de María a 100° C durante 5-10 minutos.
Consiste en la formación de un producto de color azul-verdoso entre el furfural de los
carbohidratos y el orcinol del reactivo de bial en medio clorhídrico. Es específica de
pentosas.
Carbohidrato Resultados
1% Molish Benedict Seliwanoff Bial
Glucosa
Maltosa
Manosa
Ribosa
Galactosa
Fructosa
Lactosa
Sacarosa
Jugo de naranja
Jugo de uva
Jugo de manzana
Agua

5. Reacción de Fehling
Preparación del testigo:
Colocar En Un Tubo De Ensaye 2 Ml De Agua Destilada. Agregar 0.5 Ml De Fehling A Y 0.5

Ml De Fehling B Y Mezclar. Calentar En Baño María A Ebullición Durante 5 Min. No Debe
Producirse Un Precipitado Rojo Ladrillo
Preparación de los problemas:

Colocar en el tubo correspondiente 1ml de las soluciones a probar (glucosa, Arabinosa,
maltosa, sacarosa, fructosa y almidón). Agregar 0.5 ml de fehling a y 0.5 ml de fehling b y
mezclar. Calentar en baño maría en ebullición durante 5 min. Un precipitado rojo ladrillo será
una prueba positiva. Anotar los resultados.
6. Hidrólisis de la sacarosa
Colocar en un tubo de ensaye 5 ml de una solución de sacarosa al 1%. Agregar 2 gotas de

HCl conc. Y calentar el tubo en un baño de agua a ebullición durante 10 minutos. Enfriar el
tubo y neutralizar con una solución de NaOH al 10% hasta que la mezcla sea básica al papel
tornasol (se necesitaran aprox., 20 gotas). Sobre esta solución ensayar el reactivo de Fehling
(1 ml de la solución problema (Hidrolizado)+0.5 ml de Fehling A +0.5 ml de Fehling B.
Calentar 5 minutos en baño de agua hirviente).
7. Identificación de polisacáridos mediante la prueba de yodo
Procedimiento
En tres tubos medianos distribuya los reactivos indicados según el cuadro 1:
Agite muy bien los tubos y note la diferencia de color que se atribuye a la formación de un
complejo entre el almidón y el yodo. Anote el resultado.
Posteriormente coloque los tres tubos en un baño de agua caliente (70° C) con cuidado por
10 minutos y observe cualquier cambio de color. Anote el resultado.
Enfríe los tubos y observe nuevamente. Anote el resultado.
La prueba se basa en una reacción física y no química, en la cual el almidón reacciona con
el yodo para formar un complejo de color azul intenso. Bajo las mismas condiciones, el
glucógeno da una coloración café.
Cuadro 1, Diseño experimental para prueba de yodo

Reactivo
No Agua Almidón Sol de yodo
Tubo (ml) 1% (gotas) (gotas)
1 5 5 1
2 5 1 1
3 5 0 1
Sustancia Resultados
Solución almidón
Papa
Camote

8. Hidrólisis del almidón.
Procedimiento
Coloque 10 ml de una solución de almidón al 1% en un tubo de ensayo grande. Añadir 1 ml
de HCI concentrado al tubo. Agite bien y luego coloque el tubo en un baño de agua hirviendo
durante 1:30 h a 2 h aprox.). Efectúe la prueba de coloración del yodo. Para ello, añada en
otro tubo 5 ml de agua, una gota de la solución de yodo y 0.5 ml de la solución de almidón
que tiene hidrolizando en el baño maría a ebullición. Anote el resultado de la prueba del
yodo.
Después de que la hidrólisis del almidón se haya llevado a cabo por 15 minutos, saque 0.5
ml del almidón que se está hidrolizando en el baño maría y repita la prueba del yodo.
Continúe la hidrólisis hasta obtener una prueba de yodo negativa.
Posteriormente y para confirmar la presencia de glucosa, efectúe la prueba de Benedict.
Para ello, añada en un tubo 0.5 ml del almidón hidrolizado, 1 ml de NaOH 0.4 mol/l ,para
neutralizar el ácido) y 2.5 ml de reactivo de Benedict. Incubar por 8 minutos en agua
hirviendo. Anote y analice los resultados.
ANALISIS DE RESULTADOS. Interpreta de manera correcta los resultados del experimento y

realiza de manera adecuada los cálculos. Presenta los datos de una forma clara que permite
su fácil interpretación (usa tablas, diagramas, grafícas, etc.)
BIBLIOGRAFÍA
-Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de CostaRica. 1999

-ELITECH Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versión 12/2002
- Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman and Company,
NY. Cuarta edición, 2005.

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

2.2 TEMA 2 – Proteinas

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
OBJETIVO
• Introducir al alumno en los diferentes métodos para la cuantificación de proteínas: su

fundamento, sus ventajas e inconvenientes.
FUNDAMENTO.
Son macromoléculas orgánicas, constituidas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y

nitrógeno; aunque pueden contener también azufre y fósforo y, en menor proporción, hierro,
cobre, magnesio, yodo, etc. Se clasifican, de forma general, en Holoproteinas y
Heteroproteinas según estén formadas por aminoácidos o bien por aminoácidos más otras
moléculas. Las proteínas forman parte de la estructura básica de los tejidos, desempeñan
funciones metabólicas y reguladoras.También son los elementos que definen la identidad de
cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código genético (ADN) y de los
sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario. La
organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados:
estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada
una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el espacio.
Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e inconvenientes. Determinar la
concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica, cuando
se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer
la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades,
etc. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos
métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV,
b) por la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir
ciertos colorantes. En el cuadro 1 se muestran los métodos más usados así como sus
respectivas sensibilidades. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes,
las principales se muestran en la Cuadro 2.

Cuadro 1. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad

Cuadro 2. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

50 Tubos ensaye chicos Na2CO3 Balanza analítica
5 Gradillas aluminio CuSO4.5H2O Vortex
5 Probetas 100 ml Tartrato de Sodio y Potasio Parrilla de calentamiento (3)
3 espátulas Hidróxido de sodio Espectro UV-VIS
10 Vasos pp 50 ml Reactivo de Folín
5 Vasos pp 100 ml Na EDTA
5 Pipetas 10 ml KI
5 Pipetas 5 ml Comassie Blue G-250
50 Puntas micropipeta 1 ml ácido fosfórico
2 microespátulas etanol absoluto
2 Micropipeta 0.1ml Agua destilada
5 perillas ninhidrina
50 Puntas micropipeta .1 ml Albumina de huevo
2 Celdas de cuarzo HCl
25 Tubos ensaye medianos Ácido acético glacial
1 Embudo chico Reactivo de Millon
5 Papel filtro mediano
PARTE A. PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS.
1. Detección de proteínas en los alimentos.
Procedimiento. Coloca en un tubo de ensayo 3ml de solución de grenetina al 1%. Agrega

12 gotas de reactivo de Biuret. Observa el cambio de color que indica la presencia de
proteínas. Ahora coloca 3ml de cada muestra de las sustancias en las que vas a determinar
la presencia de proteínas: clara de huevo, caldo de pollo natural, caldo de pollo
industrializado papilla de jamón diluida, jugo de limón, papilla de salchicha diluida y agua.
Anota en una tabla tus resultados marcando con un signo (+) si se detectara presencia de
proteína y (-) si no la hay.

2. Desnaturalización, coagulacion y precipitación de una proteína
• Coloca en tres tubos de ensaye 2ml de clara de huevo.

Al tubo No.1 agréguele 2ml de agua destilada.
Al tubo No.2 agréguele 2ml de solución de acido clorhídrico, al 1%.
Al tubo No.3 agréguele 2ml de hidróxido de sodio, al 3%.
Observa los cambios en la clara del huevo.
Mide el pH en las tres muestras por medio de papel pH.
Explica tus resultados en términos de la desnaturalización de una proteína.
• Si las muestras están muy frías, prepara un baño María en el vaso de precipitados y
sumerge los tubos un minuto para verificar reacción.
Anota en una tabla tus resultados y el pH.
• Colocar 2ml de una solución de albúmina de huevo en un tubo de ensaye y hervirla

suavemente durante 5 minutos. Observar lo que sucede en la solución.
En otro tubo de ensaye colocar 2 ml de solución de albúmina y agregar 7 ml de etanol al
95%. Observar el comportamiento de la solución.
• Colocar 2 ml de solución de albúmina en un tubo de ensaye y añadir, gota a gota, una

solución de AgNO3 al 2%. Observar lo que ocurre.
Repetir la experiencia anterior utilizando una solución de HgCl2 al 5 %.
PARTE B. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS
1. Método de Lowry
Reactivo de Lowry. Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarse, mezclando las

soluciones A, B y C en proporción 100:1:1 respectivamente. Solución A: 2% (P/V) Na2CO3
en agua destilada. Solución B: 1% (P/V) CuSO4.5H2O en agua destilada. Solución C: 2%
(P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada. Solución de Hidróxido de sodio 2N.
Reactivo de Folín 2N.
Procedimiento. Preparación de Estándares. Usar una solución madre de albúmina de huevo

(10 mg/ml) en agua destilada, Preparar los estándares diluyendo la solución madre con
agua destilada tal como se indica en el siguiente cuadro:
PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA

Solución madre (μl) 0 25 50 75 100 125 150 200 250
Agua (μl) 500 475 450 425 400 375 350 300 250
Concentración de proteína (μg/ml) 0 250 400 600 800 1000 1200 1600 2000

1. A 0.1 ml de muestra o sol. estándar, adiciónele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a
100°C durante 10 min a baño maría hirviendo para hidrolizar la muestra.

2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agréguele 1 ml del reactivo de Lowry recién

preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.
3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Folín, agite con un mezclador de vórtice y deje reposar
a temperatura ambiente durante 30–60 min.
4. Lea la absorbancia a 750 nm si la concentración de la proteína fuera menor a 500
µg/ml, ó 550 nm si fuese entre 100 y 2000 µg/ml.
5. Trace una curva estándar de absorbancia como función de concentración inicial de
proteína y úsela para determinar el contenido de proteína en la muestra.
NOTA
a. Si la muestra se encuentra como precipitado, disuélvalo en NaOH 2N e hidrolice
como en el paso 1. Use alícuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2.
b. Mezcle rápidamente en cuanto el reactivo de Folín sea adicionado; esto es importante
para obtener una adecuada reproductibilidad.
c. Se requiere un grupo de estándares para cada ensayo, preferentemente por triplicado
o duplicado.

2. Método de Bradford
Reactivo de Bradford. Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie

Blue G-250 con 10 ml de ácido fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Añadir H2O
hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en la oscuridad.
Procedimiento. Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras

problemas preparadas como se indica en el cuadro 4.
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es
estable 1 hora. Todas las muestras se realizaran por duplicado.

Cuadro 4. Protocolo para la cuantificación de proteínas por
el método de Bradford
Reactivos
Tubos Estándar H2O R.
(0.5 mg/ml) bradford
Blanco 0 µl 100 µl 1 ml
1 25 µl 75 µl 1 ml
2 50 µl 50 µl 1 ml
3 75 µl 25 µl 1 ml
4 100 µl 0 µl 1 ml
Muestras
M1 100 µl 0 µl 1 ml
M2 100 µl 0 µl 1 ml

3. Método de de Biuret
Reactivo de Biuret. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O.

Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar
en frasco de plástico.

Procedimiento. Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras

problemas preparadas como se indica en el cuadro 5. Dejar a temperatura ambiente y leer
la Absorbancia a 545 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.
Cuadro 5. Protocolo para la cuantificación de proteínas por el método de Biuret

Reactivos
Tubos Estándar H2O R.
(20 mg/ml) Biuret
Blanco 0 µl 100 µl 1 ml
1 25 µl 75 µl 1 ml
2 50 µl 50 µl 1 ml
3 75 µl 25 µl 1 ml
4 100 µl 0 µl 1 ml
Muestras
M1 100 µl 0 µl 1 ml
M2 100 µl 0 µl 1 ml

4. Método de ninhidrina
Procedimiento. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución a analizar en un tubo

de ensayo y se le agregan 5 gotas de la solución de ninhidrina (0.1 g/100ml agua destilada).
Se calienta en un baño de maría por 1 a 2 minutos y si la prueba es positiva se desarrollará
un color azul.
PARTE C. PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA
Procedimiento.
Prueba 1. Disolver 4 grs. De gelatina en 20 ml de agua caliente. Dividir la solución en dos
partes de colocarlas en vasos de precipitado de 100 ml. Dejar enfriar hasta una temperatura
de 50oC. Agregar a uno de los vasos 2 ml de jugo fresco de piña y al otro 2 ml de jugo de
piña enlatado. Dejar los vasos en reposo durante 5 minutos. Colocar los vasos en un baño
de hielo y observar la gelacion cada 5 minutos.
Prueba 2. Disolver 2 gr. de gelatina en 10 ml de agua caliente y colocarla en un vaso de

precipitado de 100 ml. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50oC. Agregar 2 ml de jugo
fresco de piña y 5-10 gotas de una solución al 2% de Hg(NO3)2. Dejar el vaso en reposo 5
minutos. Colocar el vaso en un baño de hielo y observar la gelacion cada 5 minutos.
ANALISIS DE RESULTADOS. Interpreta de manera correcta los resultados del experimento

y realiza de manera adecuada los cálculos. Presenta los datos de una forma clara que
permite su fácil interpretación (usa tablas, diagramas, grafícas, etc.)

CUESTIONARIO
1.- Escribe la clasificación de las enzimas dentro del grupo de las proteínas.
2.- Cual es la importancia de las proteínas para el ser humano.
3.- De las pruebas de Bradfor y de Biuret ¿ Cuál de ellas es más sensible para detectar
proteínas y por qué?.
BIBLIOGRAFÍA
Stryer L, Berg JM y Tymoczko JL (2003). Bioquímica, Editorial Reverté, Barcelona. Cap. 9:
“Estrategias catalíticas” (p. 227-260).
Price NC y Stevens L. Fundamentals of enzymology. Ed. Oxford University Press. 1999. 3ra
Edición.
Wolfgang Aehle. Enzymes in Industry: production and applications. Ed. Wiley-VCH , 3ra
Edición 2007
Herbert A.Kirst; Wu-Kuang Yeh; Milton J. Zmijewski, Jr. Ezyme technologies for
pharmaceutical and biotechnological applications. Ed. Marcel Dekker, Inc. New York. 2001.
Robert J. Whitehurst; Barry A. Law. Enzymes in Food Technology. Sheffield Academic press.
2002.
R. Eisenthal, M.J. Dabson. Enzyme Assays. Practical Approach. Oxford University Press.
2002. 2da Edición.

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0


AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS
OBJETIVO
• Poner en practica los métodos bioquímicos para la purificación parcial de proteínas,
basados en sus propiedades de solubilidad.
FUNDAMENTO.
En bioquímica es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, su

estructura y de ser posible su función, como es e caso de las enzimas. Para dicha
purificación se emplean métodos basados en sus propiedades de solubilidad.
Cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica qu las hace diferentes unas
de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo
general las proteínas fibrosas son solubles en agua y resistentes a la degradación
enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las
proteínas globulares son relativamente mas solubles en agua y en soluciones de baja fuerza
iónica, aunque algunas coagulan cuando se calientan.
La composición de aminoácidos, es también responsable del comportamiento de las
proteínas en diferentes condiciones de pH. Así al acidificar o alcalinizar una determinada
proteína, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, es decir, alcanzar una carga neta de cero
y por lo tanto precipitar.
La leche es un producto rico en proteínas, tales como las caseínas y globulinas, además de
contener carbohidratos y ácidos grasos. De la leche se puede separar la caseína por
precipitación en su punto isoeléctrico (pH 4.6).
El huevo también es un producto con una buena cantidad de nutrientes, tal como la
ovoalbúmina, la cual se clasifica como fosfoglucoproteína por tener hidratos de carbono y
fósforo. La precipitación de esta proteína con una solución saturada de (NH4)2SO4 permite
aislarla del resto de las proteínas que se encuentran en la clara del huevo.
Existen factores que afectan el estado nativo de las proteínas, sin embargo, éstas pueden
someterse a una purificación parcial empleando técnicas bioquímicas sencillas como la
centrifugación, diálisis y cromatografía.

1 Probeta de 100 mL NaCl Parrilla Electrica
1 Probeta de 50 mL HCl Potenciómetro
2 Vasos de Precipitados de 250 mL (NH4)2SO4 Centrífuga clínica
1 Vaso de Precipitados de 100 mL Acido Acético Glacial
2 Pipetas Graduadas de 5 mL Acetato de Sodio
4 Tubos de Centrifuga de 50 mL Etanol
1 Gasa Acetona
1 Agitador de Vidrio Leche Cruda
1 Matraz Kitazato Éter Etílico
1 Piceta Huevo Fresco

4 Viales de Vidrio 120 mL Buffer pH 4 y 7

2 Pipetas Pasteur
1 Embudo Buchner
1 Embudo de Vidrio

PARTE A. Preparación de reactivos y soluciones.
la práctica:
• Solución de HCl al 20% (v/v)
• Solución de ácido acético 1.0M
• Solución amortiguada de (NH4)2SO4
Preparación: Agregar 780 g de (NH4)2SO4a un litro de agua y calentar por agitación.
Adicionar 12.3 g de acetato de sodio. Enfriar y añadir 9 mL de ácido acético glacial. Dejar
que sedimenten los cristales, use solo el sobrenadante.
PARTE B. Obtención de la Caseina.
Procedimiento
1. El día anterior a la práctica, dejar enfriando la leche para que se separe la parte lipidica.
2. Al iniciar la práctica, eliminar los lípidos que se encuentran en la superficie con una pipeta
Pasteur
3. Después de haber eliminado los lípidos, tomar 3 mL de la leche y guardar en el
refrigerador en un vial previamente etiquetado.
4. Colocar 100 mL de la leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL junto con el
agitador magnético y agitar suavemente sobre la parilla.
5. Calibrar el potenciómetro con las soluciones patrón de pH7 y pH4
6. Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el agitador
magnético.
7. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solución de HCl al 20% hasta ajustar el
pH a 4.6.
8. En el punto isoeléctrico se formará un precipitado voluminoso. En ese momento se detiene
la agitación y se deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Mezclar la suspensión por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de centrífuga,
procurando recuperar todo el precipitado.
10. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 2000 rpm durante diez minutos.
11. Verter el sobrenadante en una probeta y anotar el volumen total. Tomar 3 mL de éste y
guardarlo en un vial previamente etiquetado. El resto se desecha.
12. el precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 mL de agua y agitar
sobre una parrilla con un agitador magnético, hasta obtener una suspensión homogénea.
Este lavado es para eliminar el HCl.
13. Colocar la suspensión en un solo tubo de centrífuga efectuar el proceso de centrifugación
a 2000 rpm durante diez minutos. Desechar el sobrenadante y repetir los lavados con agua
dos veces más.
14. Al eliminar el agua del último lavado adicionar 10 mL de etanol al precipitado y
homogeneizar con un agitador de vidrio. Volver a centrifugar para eliminar el etanol.

15. Finalmente, lavar con acetona y éter etílico de la misma forma que se hizo con el alcohol.
16. Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma extedida, para que se
seque y forme un polvo.
PARTE C. Obtención de Albúmina.
Procedimiento
1 Colocar la clara de huevo en una probeta y medir su volumen, evitando que se rompa la
yema
2 Verter la clara en un vaso de precipitados, agregar la décima parte de su volumen de ácido
acético 1.0 M y agitar.
3 Filtrar la albúmina acidificada a través de cuatro capas de gasa, agitando fuertemente con
una varilla de vidrio para acelerar el proceso.
4 Al filtrado añadir un volumen igual de la solución de sulfato de amonio amortiguado, y
agitar. Dejar reposar la solución durante 15 minutos en un baño de hielo.
5 Separar el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a 3000 rpm
durante diez minutos.
6 Al sobrenadante que contiene la albúmina, añadir pequeñas cantidades de la disolución de
sulfato de amonio: se notará una ligera turbidez que desaparecerá al agitar. Siga vertiendo
sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no desaparezca, agregar un poco más
para permitir que la albúmina precipite.
7 Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas
8 Eliminar el sobrenadante por centrifugación.
9 Suspender la albúmina en 5 mL de acetona y recuperar filtrando en un embudo Buchner.
10 Colocar el residuo en un papel aluminio y dejar que seque completamente al aire.
Guardar en un vial etiquetado.
Las soluciones utilizadas en esta práctica pueden eliminarse en la tarja, manteniendo la llave
del agua abierta para diluir y al terminar lavar la tarja.

1 ¿Cuántos gramos de caseína obtuvo?

2 ¿Qué porcentaje representa del volumen inicial?
3 ¿Cuántos gramos de albúmina obtuvo?
4 ¿Qué porcentaje representa del volumen de la clara?
1. ¿Qué volumen de leche utilizó para la extracción de caseína?
2. ¿El precipitado de caseína apareció exactamente a `H 4.6 o requirió acidificar más?
Explique.
3. ¿Para que tuvo que lavar la caseína con agua?
4. ¿Los lavados con los solventes orgánicos eran necesarios? ¿Por qué?
5. Según la literatura, ¿Cuántos gramos debía obtener? ¿Fue bueno el rendimiento?
6. ¿Cuál fue el volumen total de la clara de huevo?
7. ¿Cuál es la razón de agregar ácido acético y filtrar a través de gasas?
8. Aproximadamente ¿a que concentración de sulfato de amonio precipita la ovomucina y la
ovoglobulina, de acuerdo el volumen de sulfato de amonio que adicionó? y ¿Cuál es la
concentración de sulfato de amonio a la que precipita la albúmina?

9. De acuerdo con lo reportado en la literatura. ¿Cuánta albúmina tiene el huevo?.

Compárelo con su resultado.
CONCLUSIONES. Elabora una conclusión valida basada en un correcto análisis de los

resultados, y justifica que los objetivos e hipótesis se hayan alcanzado o no.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de proteínas son al caseína y la albúmina estructural y funcionalmente?

2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?
4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?
5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?
6. ¿En que se basa la centrifugación para separar partículas de diferente tamaño?
7. ¿Cuántos tipos de centrífugas se conocen?
8. ¿Todos los métodos de extracción de proteínas las desnaturalizan?
9. ¿Es posible saber si una proteína está pura? ¿Cómo?
10. ¿Será costeable purificar proteínas industrialmente?
BIBLIOGRAFÍA
Badui, D. S. 1990. Química de los Alimentos. Editorial Alambra Mexicana S. A., México
2. Clark J. M. Jr 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman and Company E.U.A.
3. Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica aplicada. Nueva Editorial Interamericana, S. A.
México.
4. Voet, D. y Voet, G. J. 1995 Bioquímica, Omega Ediciones, Barcelona.
5. Vogel A. I. 1983. Textbook of Cuantitative Inorganic Análisis. 4ª Edición, Editorial Richard
Clay (The Chauser Press) Ltd. Bungay, Gran Bretaña.
6. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioquímica. Addison-Wesley, España.

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

2.3 TEMA 3 –Lípidos

PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS.
OBJETIVO
• Identificar a los lípidos como los componentes principales de las membranas

celulares y relacionará el contenido y las características químicas de los lípidos con la
impermeabilidad y fluidez de la membrana.
• Realizar la extracción de la lecitina y el colesterol.
FUNDAMENTO.
Los lípidos son sustancias biológicas solubles en solventes orgánicos, pero escasamente
solubles en el agua. Pertenecen a este grupo moléculas tan diversas como las grasas, los
aceites, algunas vitaminas y hormonas, así como todos los componentes no proteicos de las
membranas.
Los lípidos pueden clasificarse en dos grandes grupos: los saponificables y los no
saponificables. Los primeros tienen la característica de que, en soluciones alcalinas, se
hidrolizan produciendo ésteres de ácidos grasos, mientras que los segundos no son objeto
de hidrólisis alcalina. A los lípidos saponificables pertenecen los acilgliceroles, los
fosfoacilgliceroles, los esfingolípidos y las ceras, mientras que en el grupo de los lípidos
insaponificables encontramos los terpenos, los esteroides y las prostaglandinas, así como
los compuestos relacionados con éstos.
Los ácidos grasos biológicamente importantes son ácidos monocarboxílicos con cadenas
alifáticas de diverso tamaño, con un número par de átomos de carbono, que pueden ser
saturados o insaturados. En el caso de los insaturados, los de origen natural son isómeros
geométricos cis; pueden ser monoinsaturados o poliinsaturados y son líquidos a temperatura
ambiente. Los ácidos grasos poliinsaturados no son sintetizados en el organismo por lo que
se consideran esenciales.
Los esfingolípidos son lípidos complejos derivados de un alcohol insaturado llamado
esfingosina, el que se une con un ácido graso de cadena larga por medio de un enlace
amida para formar una ceramida. Las esfingomielinas contienen una ceramida esterificada
con fosforilcolina o fosforiletanolamina. Cuando la ceramida se combina con un azúcar forma
los glucoesfingolípidos, que pueden subdividirse en cerebrósidos (si sólo contienen una
unidad de azúcar), sulfátidos (contienen un sulfato esterificado en la unidad de azúcar) y
gangliósidos (contienen oligosacáridos con uno o más ácidos N-acetilneuramínicos). Los
esteroides son derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno. El núcleo esteroide es una
estructura rígida, casi plana, no polar
Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos, de naturaleza antipática, es decir que
contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte de los lípidos
abundantes en la naturaleza (triacilgliceroles), están formados por ácidos grasos de cadenas
hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los lípidos llevan a cabo múltiples
funciones en el organismo, como: almacenamiento de energía, de transporte, cumplir
funciones hormonales, actuar como vitaminas, formar parte de las membranas celulares
confiriéndoles la propiedad de permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas
sustancias y en determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte

activo como la bomba de Na+/K+. A diferencia de los carbohidratos, proteínas y ácidos

nucleicos, no forman polímeros, son más bien moléculas pequeñas que presentan una fuerte
tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Algunas de las propiedades de los
lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que pueden reaccionar con una
variedad de agentes originándose productos coloreados, desprendimiento de vapores,
formación de jabones, entre otros.
CANTIDAD MATERIAL REACTIVOS EQUIPO

50 Tubos ensaye con tapón de rosca Agua Balanza analítica
4 Probetas 100 ml Éter Parrillas calentamiento
con agitación (4)
5 Pipetas 5 ml Cloroformo
2 Vasos pp 500 ml Etanol
8 Vasos pp 50 ml Acetona
4 Perillas Metanol
5 Gradillas aluminio Sudan IV
4 Magnetos Carbonato sodio
2 Mecheros Nitrato de Potasio
4 Pinzas para tubos ensaye Molibdato Amonio
5 Pipetas Pasteur Yodo
5 Bulbos pipeta Pasteur Cloruro de mercurio
4 Vasos pp 500 ml Anhídrido acético
8 Matraces 250 ml Acido sulfúrico conc.
4 Buretas 25 ml NaOH
4 Soportes universales Acido acético
4 Pinzas para bureta Yoduro de potasio
8 Matraces 125 ml Tiosulfato de sodio
3 Micropipetas 1 ml Almidón
50 Puntas 1 ml KOH
6 Vasos pp 250 ml HCl
2 Micropipetas 0.1 ml Fenolftaleína
20 Puntas 0.1 ml Hexano
PARTE A. PRUEBA DE FUSIÓN (PARA INVESTIGAR FÓSFORO)
Procedimiento.
La positividad de esta reacción indica la presencia de fósforo inorgánico. Las sustancias
orgánicas dan la reacción positiva, siempre que se haga una hidrólisis previa. La reacción
positiva se manifiesta por la reacción de un precipitado amarillo de fosfomolibdato de
amonio.
En un tubo de ensayo colocar 2 ml de la muestra problema, agregar 2 ml de una Mezcla de
carbonato de sodio y nitrato de potasio (se prepara en el momento de usarla Carbonato de
sodio al 2% y nitrato potásico al 2%. El reactivo se prepara con dos partes de carbonato
sódico y una parte de nitrato potásico), adicionar 2 ml de agua caliente, Mezclar y dejar en
reposo durante 10’, adicionar 1 ml de ácido nítrico. Mezclar y calentar suavemente a la llama
sin dejar hervir durante 2 minutos, adicionar 1 ml de Molibdato de amonio 4%. Mezclar y

observar. La positividad se manifiesta por la formación de un precipitado de fosfomolibdato

de amonio.
PARTE B. IDENTIFICACION DE LIPIDOS.
1. Extraccion e identificación de fosfolípidos de cerebro

Etapa 1. Triture perfectamente 5 g de cerebro, en un mortero con 15 mL de una mezcla de
cloroformo- metanol-ácido clorhídrico (200:100:1) por 10 minutos. Agregue 3 mL de HCl 1N,
mezcle completamente y centrifugue a 2000 r.p.m. durante 10 minutos. Separe la fase
metanólica (transparente), decantándola con cuidado a un tubo de ensaye, rotule para uso
posterior. La fase clorofórmica (café claro), la obtendrá, perforando con un hisopo de madera
la capa intermedia (sedimento) y por el orificio que se forma, introducir cuidadosamente una
pipeta Pasteur para tomar el líquido que se encuentra en la parte inferior del tubo y rotule
para su uso posterior. Deseche el sedimento.
Etapa 2. Utilizando 1 mL del líquido de la fase metanólica, obtenido en la extracción de

lípidos de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de
Molisch- Udransky cuya técnica y fundamento fue descrito en la práctica de Glúcidos.
2. Prueba de Iodo
Procedimiento.
En un tubo de ensaye, mezclar 2g o 2 ml de cada una de las grasas y 5 gotas de lugol. La
mezcla tomara la coloración rojiza del lugol Calentar en la flama cada uno de los tubos y
observar el cambio de color. Enfriar y añadir 10 gotas de almidón, observar la coloración.
3. Prueba de Lieberman
Procedimiento.
Se basa en la reacción coloreada (verde) que dan aquellas sustancias que tienen como
núcleo el ciclo pentanoperhidrofenantreno. Diluya un gramo de la yema de huevo en 10 ml
de cloroformo. Tome 1 ml de la solución clorofórmica y colóquelo en un tubo de ensayo
limpio y seco. Adicione 1 ml de anhídrido acético. Adicione 3 a 4 gotas de ácido sulfúrico
concentrado. Agite suavemente y observe los cambios de coloración.
4. Prueba de Saponificación
Procedimiento.
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en
los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los
iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales
sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos
se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación
de ácidos grasos y glicerina.
a.- Colocar en un tubo de ensayo 3ml de aceite y 3ml de NaOH al 20%. Agitar
enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos. Pasado este tiempo, se
pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa

sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y
una superior lipídica de aceite inalterado.
b.- En un vaso de pp mexclar 1.5 g de manteca de cerdo y 10 ml de KOH al 10% en etanol
Cubrir el vaso con un vidrio de reloj. Hervir cuidadosamente hasta que la amnetca se
disuelva total mente. Quitar el vidrio de reloj y calentar hasta eliminar el etanol, disolver con
20 ml de agua la masa gelatinosa formada. Transferir 5 gotas de la solución a otro vaso de
precipotados y añadir gota a gota HCl al 10% (hasta observar precipitación)
5. Índice de peróxido.
Procedimiento.
Indica en que extensión a experimentado el aceite la rancidez oxidativa. Se define como
miliequivalente de peróxido por Kg de grasa. Pesar 5,00 ± 0,05 g de la grasa (o aceite) en un
erlenmeyer de 250 ml de tapa de vidrio. Añadir 30 ml de la solución HOAC-CHCl3 y agitar
para disolver. Añadir 0,5 ml de la solución saturada de KI, agitar vigorosamente y dejar
reposar en la oscuridad durante 2 minutos añadir unos 30 ml de agua. Titular
inmediatamente el yodo liberado con tiosulafato 0,1 N; agitando vigorosamente hasta que el
color amarillo casi desaparezca. Añadir alrededor 0,5 ml de solución de almidón al 1% y
continuar titulando (al final de la titulación agitar vigorosamente para extraer todo el yodo de
la capa de cloroformo) hasta que el color azul desaparezca. Si se gasta una cantidad menor
de 0,5 ml de tiosulfato, repetir la determinación con tiosulfato 0,01 N. Correr un blanco
conjuntamente con la muestra (debe ser igual o menor a 0,5 ml de tiosulfato 0,01 N). Restar
al resultado obtenido al de la muestra.
Cálculos: Restar al volumen de Na2S2O3 gastado en la muestra el obtenido para el blanco.
Expresar el índice de peróxido como meq de peróxido/ Kg de grasa.
6. Índice de acidez
Procedimiento.
Pese 2-5 g. de dos muestras de aceite vegetal. Agregue 10 ml de solvente 1:1 alcohol –
hexano y titule con KOH 0,1 N utilizando fenolftaleina al 1% como indicador. La aparición de
un color rosado pálido indica el fin de la titulación (Punto Final). Calcule el índice de Acidez
de acuerdo a la siguiente fórmula:
I.A índice de acidez

N= normalidad del KOH
A= ml de KOH gastados en la titulación.
0,056= p equivalente del KOH
P= Peso de la muestra de aceite
La acidez puede también ser expresada como los gramos de ácidos grasos libres por cada
100 gramos de muestra; en el caso del ácido oleico sería:
Gramos de ácido oleico por 100 g de muestra con la siguiente ecuación:


BIBLIOGRAFÍA
Badui, D. S. 1990. Química de los Alimentos. Editorial Alambra Mexicana S. A., México
2. Clark J. M. Jr 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman and Company E.U.A.
3. Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica aplicada. Nueva Editorial Interamericana, S. A.
México.
4. Voet, D. y Voet, G. J. 1995 Bioquímica, Omega Ediciones, Barcelona.
5. Vogel A. I. 1983. Textbook of Cuantitative Inorganic Análisis. 4ª Edición, Editorial Richard
Clay (The Chauser Press) Ltd. Bungay, Gran Bretaña.
6. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioquímica. Addison-Wesley, España.

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

2.4 TEMA 4 – Vitaminas

IDENTIFICACIÓN DE VITAMINAS
OBJETIVO
Identificar y cuantificar la presencia de acido ascórbico en muestras de jugos

naturales y comerciales.
FUNDAMENTO.
Vitamina A (retinol) sólo se encuentra como tal en alimentos de origen animal, aunque
en los vegetales se encuentra como provitamina A, en forma de carotenos. Los distintos
carotenos se transforman en el cuerpo humano y se almacenan en el hígado y en el tejido
graso de la piel, por lo que es posible sobrevivir por largos periodos sin su aporte. Su labor
principal es la protección de la piel y de la vista. También participa en la elaboración de
enzimas en el hígado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El consumo de alimentos
ricos en vitamina A es recomendable en personas propensas a padecer infecciones
respiratorias, problemas oculares o con la piel seca y escamosa. Fuentes dietéticas: Hígado,
leche entera, vísceras de animales, zanahorias, espinacas cocidas, perejil, mantequilla,
manteca, queso, yema de huevos, pescado y diversas frutas y vegetales amarillos, legumbre
(soya). Consumo ideal: Hombres: 5,000 UI; Mujeres: 4,000 UI La estructura de la vitamina A
presenta muchas conjugaciones dobles en su estructura molecular, debido a ello tiene un
acentuado efecto sobre las bandas de absorción en UV-VIS, en particular sobre las de origen
π*.
La vitamina C o ácido ascórbico, es un compuesto hidrosoluble de 6 átomos de

carbono relacionado con la glucosa. Su papel biológico principal parece ser el de actuar
como cofactor en diversas reacciones enzimáticas que tienen lugar en el organismo. El ácido
ascórbico actúa como coenzima de las hidroxilasas de prolina y lisina, encargadas de
hidroxilar la lisina y prolina en el protocolágeno, modificación necesaria para que éste pueda
formar los enlaces cruzados para formar las fibrillas de colágeno. En este sentido, la vitamina
C es importante para el mantenimiento del tejido conjuntivo normal, para la curación de
heridas y para la formación del hueso, ya que el tejido óseo contiene una matriz orgánica con
colágeno. En su condición de agente reductor, el ácido ascórbico posee otras propiedades
importantes, que parecen ser no enzimáticas. Por ejemplo, ayuda a la absorción del hierro al
reducirlo a su estado ferroso en el estómago; protege la vitamina A, vitamina E y algunas
vitaminas B de la oxidación; también favorece la utilización del ácido fólico ayudando a la
conversión del folato en tetrahidrofolato o mediante la formación de derivados poliglutamato
del tetrahidrofolato. Finalmente, la vitamina C es un antioxidante biológico que protege al
organismo del estrés oxidativo provocado por las especies oxigeno reactivas.
La vitamina C se encuentra principalmente en alimentos de origen vegetal y puede

presentarse en dos formas químicas interconvertibles: ácido ascórbico (forma reducida) y
ácido dehidroascórbico (forma oxidada), siendo ambas formas funcionales biológicamente y
manteniéndose en equilibrio fisiológico. Si el ácido dehidroascórbico es hidratado se
transforma en ácido dicetogulónico, no activo biológicamente, siendo esta transformación

irreversible. Esta hidratación ocurre espontáneamente en disolución neutra o alcalina.
Alimentos como los cítricos, kiwi, fresones, brócoli, lechuga, entre otros, son fuente natural
de vitamina C, y su contenido depende de la especie, área geográfica en las que son
cultivados, las condiciones de almacenamiento una vez recogidos y del estado de
maduración (generalmente aumenta con la maduración).
La vitamina C se puede reconocer mediante azul de metileno. Este colorante cuando está
oxidado es de color azul y se reduce fácilmente formando un compuesto incoloro. Por otra
parte, la cromatografía y la titulación volumétrica de óxido-reducción son métodos utilizados
para cuantificar el contenido de vitamina C de un alimento. La cromatografía líquida de alta
presión (HPLC) es el método más utilizado por ofrecer una gran precisión de los resultados.
Sin embargo la técnica de HPLC resulta cara, por ello en esta práctica determinaremos el
contenido de vitamina C presente en la fruta, en bebidas preparadas o en complejos
vitamínicos mediante una titulación volumétrica de óxido reducción.
Las titulaciones en las que interviene el yodo como agente oxidante se denominan
yodimetrías. Dado que la reacción entre el yodo y el ácido ascórbico presenta una
estequiometría 1:1, en el punto final de la titulación el número de moles de yodo reducido es
equivalente a los moles de ácido ascórbico oxidado. Es importante señalar que con este
método se determina la capacidad reductora total de la disolución, por ello, si la disolución a
titular contiene otras sustancias reductoras además del ácido ascórbico el volumen de la
disolución oxidante (yodo) consumida puede estar aumentada, y por tanto, el contenido de
ácido ascórbico sobrestimado. Además hay que tener en cuenta que la vitamina C es
oxidada fácilmente por el aire, por tanto, las disoluciones que contienen vitamina C deben
ser preparadas inmediatamente antes de ser tituladas, con el fin de obtener resultados
fiables.
El almidón se utiliza como indicador para el yodo, debido a que forma un complejo de color
azul intenso con el mismo. Cuando añadimos yodo sobre vitamina C reducida desaparecerá
pues pasará a yoduro (la vitamina C se oxidará en el proceso). Cuando ya no quede vitamina
C reducida el yodo no desaparecerá, se unirá al almidón y aparecerá el color azul indicando
el fin de la titulación. El almidón se hidroliza con facilidad y uno de los productos de la
hidrólisis es la glucosa, la cual tiene carácter reductor, por tanto, una disolución de almidón
parcialmente hidrolizada puede ser una fuente de error en una titulación redox.
NOTA: El color amarillo del zumo de naranja puede enmascarar en parte el color azul por lo
que hay que tener cuidado para observar el cambio de color. Las dosis recomendadas por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) para la vitamina C se sitúan en 90 mg diarios para
hombres y 75 mg para mujeres.

3 Buretas de 25 o 50 ml Yodo Baño María
3 Matraces Erlenmeyer de 125 ml Almidón Balanza analítica
3 Embudos HCl Espectrofotómetro UV-VIS
2 Micropipetas de 1000µL Comprimidos Vit C
20 Puntas de 1000 µL Agua destilada

2 Probetas de 50 ml NaOH
Gasa Leche de soya
3 Vasos pp 100 ml Etanol
3 Vasos pp 250 ml Hexano
3 Vasos pp 50 ml
30 Tubos de ensaye con tapon de
rosca medianos
6 Gradillas de aluminio
2 Celdas de cuarzo
2 Picetas

PARTE A. PARTE A. Preparación de reactivos y soluciones.
la práctica:
• Disolución de yodo 24,1 mM
• Disolución de almidón 1% (w/v) (recién preparada)
• Disolver 1 g de almidón soluble en 100 ml de agua hirviendo. Homogeneizar la
suspensión. Una vez fría, filtrarla utilizando algodón.
• HCl 15%
• Naranja o limón y zumos comerciales
• Preparado de vitamina C (comprimidos o sobres de vitamina C; 500mg/L agua
destilada)
PARTE B. Determinación de Vitamina A por espectrofotometría UV-VIS
Procedimiento.
Pesar 1 g de leche de soya en polvo y colocarlo en un matraz erlenmeyer de 250 ml, diluir
con 50 ml de NaOH 0.1 N.
Preparar un blanco de reactivos solamente con NaOH 0.1 N y llevar a traves de los mismos
pasos del procedimiento que las muestras.
Incubar a 55ºC/15 min (colocar el matraz erlenmeyer en baño María) enfriar a temperatura
ambiente.
Transferir las diluciones a matraces volumétricos de 100 ml y aforar con NaOH 0.1 N
Tomar dos alicuotas de 4 ml colocarla en tubos de ensayo con tapón de rosca, proteger de la
luz, adicionarle 4 ml de etanol y agitar.
Adicionar 5 ml de Hexano, agitar suavemente por 3 min. Dejar en reposo.
Extraer la fase orgánica y colocarla en tubos con tapón de rosca (proteger de la luz)
descartar la fase acuosa.
Calibrar el espectrofotómetro UV-VIS con hexano.
Realizar la lectura del blanco y muestras de Vitamina A a 325 nm.
PARTE C. Determinación de Vitamina C por Titulación
Procedimiento.
Preparación del zumo de fruta. Exprimir una naranja o limón. O puede utilizarse también
zumos de fruta de venta en establecimientos comerciales. Filtrarlo a través de una gasa.

Para determinar el ácido ascórbico de los comprimidos de vitamina C, disolver una tableta
que contenga 500 mg de ácido ascórbico en un litro de agua destilada.
Titulación del ácido ascórbico

1.- Si se hace con zumos naturales. Poner en un Matraz Erlenmeyer de 100 ml:
• 10 ml de zumo
• 15 ml de agua destilada
• 0,25 ml de HCl (15% v/v)
• 0,25 ml de almidón (1% w/v) que actúa como indicador.
Llenar la bureta con la disolución de yodo (24 mM).
Titular lentamente y agitando la disolución de zumo contenida en el Erlenmeyer, hasta que
vire al azul.
2.- Si se hace con zumos comerciales y en preparados de vitamina C

Poner en un matraz Erlenmeyer de 125 ml:
• 25 ml de la disolución de ácido ascórbico o de zumo
• 0,25 ml de HCl (15% v/v)
• 0,25 ml de almidón (1% w/v) que actúa como indicador
Proceder de la misma manera que se hizo con el zumo natural.
Calcular la cantidad de vitamina C en la muestra (zumo por ejemplo) en g/L utilizando la
siguiente fórmula:
g Volumen yodo consumido

= 0,424 ×
L volumen de la muestra
Donde:
El volumen de yodo consumido es e el volumen añadido al erlenmeyer desde la bureta al
titular el preparado de vitamina C.
El volumen de la muestra es el volumen de zumo que hemos puesto en el erlenmeyer con
una concentración de vitamina C desconocida.

BIBLIOGRAFÍA
Ciancaglini P et al. Using a classical method of vitamin C quantification as a tool for
discussion of its role in the body. Biochem. Mol. Biol. Edu. 29: 110-114, 2001.
Harris DC. Análisis químico cuantitativo. Editorial Reverté, 2001.

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

2.5 TEMA 5 – Ácidos nucleicos

EXTRACCIÓN DE ADN
OBJETIVO
• Realizar la extracción de ADN de diferentes muestras biológicas
FUNDAMENTO.
La molécula del ADN tiene una composición muy compleja. Principalmente esta formada por
dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre si formando una doble hélice. Estas están
unidas gracias a puentes de hidrógeno Sus componentes están condicionados
químicamente al momento de unirse: la Adenina (A) solo se une con la Timina (T) y la
Guanina (G) con la Citosina (C).
Una secuencia de bases nitrogenadas guarda la información genética, el orden de esta
secuencia es imprescindible ya que constituye las instrucciones del programa genético de los
organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a
descifrar su mensaje genético.
La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la célula, y la molécula
de ADN ha pasado a ser muy simple de estudiar. Desde el año 1953, cuando Watson y Crick
propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN se han obtenido
innumerables avances en el campo de la biología molecular y se han desarrollado muchas
técnicas genéticas sofisticadas. La construcción de moléculas de ADN recombinantes y
artificiales se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas
combinaciones genéticas por medios bioquímicos. El proceso también se denomina
clonación molecular o clonación genética, porque se pueden propagar en una estirpe de
organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y al
crecer la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella.
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos
son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior
extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente,
vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN.
En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al
ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él
por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y
detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico.


Muestra Vegetal Agua destilada Molino de sólidos
6 Vasos de pp 100 ml Sal de mesa Centrífuga
3 Varillas vidrio Bicarbonato sódico Colador
10 Tubos ensaye medianos Detergente líquido
3 Gradillas Alcohol isoamílico
Gasa Escherichia coli

12 Tubos eppendorf Levaduras

3 Morteros con pistilo Fenol
3 Vasos pp 200 ml Cloroformo
3 Probetas 100 ml Etano 96%
Etanol al 70%
Arena
SDS
Cloruro de sodio
Hígado de pollo

PARTE A. EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL DE BACTERIAS
Procedimiento.
1) Tomar 500 µl de la suspensión de bacterias y adicionarle 500 µl de
fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1). Mezclar con vortex durante 5 segundos
2) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.
3) Colectar la fase acuosa (aproximadamente 400 µl de la fase superior) y agregarle 1
volumen de cloroformo. Mezclar con vortex 5 segundos.
4) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.
5) Transferir la fase acuosa (superior) a otro tubo y adicionar 1000 µl de etanol 96%
6) Incubar un mínimo de 30 minutos a -20°C para precipitar el ADN
7) Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm y 4°C
8) Descartar el sobrenadante y lavar el pellet agregando 1000 µl de etanol 70%
9) Centrifugar 5 segundos a 14.000 rpm y descartar el sobrenadante
10) Secar el pellet de ADN a 50°C y resuspenderlo en 20 ul de H2O destilada.
11) Almacenar a -20 ºC.
PARTE B. EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL
Procedimiento.
1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño
de hielo triturado:
120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.
1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.
5 g de bicarbonato sódico.
5 ml de detergente líquido o champú.
2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales (cebolla, ajo, tomates,
etc.) y cortarla en cuadraditos.
3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos
de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción
del detergente.
4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar
vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más
grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es
centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.
5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol
isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del
recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el
alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán
enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla
atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el
aspecto de un copo de algodón mojado.

PARTE C. EXTRACCIÓN DE ADN ANIMAL
Procedimiento 1.
1.- Triturar 20 g de hígado de pollo en un mortero. Añadir 5 g de arena para que al triturar se
puedan romper las membranas del hígado y queden los núcleos sueltos.
2.- Añadir al triturado, 50 ml de agua destilada. Remover hasta hacer una especie de papilla.
3.- Filtrar varias veces sobre la tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado
por romper.
4.- Medir el volumen del filtrado con una probeta.
5.- Añadir al filtrado el mismo volumen de cloruro sódico 2M. Con esto se consigue romper
los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
6.- Se añade 1 ml de SDS. Su acción es formar un complejo con las proteínas y separarlas
del ADN. Así quedara el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.
7.- Añadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol al 96% El alcohol debe de resbalar por las
paredes del vaso y se forman dos capas. En la interfase, precipita el ADN.
8.- Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección.Sobre la varilla se va
adheriendo unas fibras blancas visble a simple vista, que son el resultado de la agrupación
de muchas fibras de ADN.
Tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varilla de vidrio y
depositarlas sobre un porta. Teñir durante un minuto con un colorante básico.
Procedimiento 2.
1.- A 20 ml de TCA al 10%, añadir 6 g de carne, mezclar y calentar durante 15 min; agitar
ocasionalmente.
2.- Filtrar, enfriar el filtrado y transferirlo a un tubo.
PARTE A. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
Procedimiento.
Prueba de difenilamina
A 2 ml del filtrado anterior añadir 5 ml del reactivo de difenilamina en un tubo.
Calentar en un baño de agua hirviendo de 5 a 10 minutos
La aparición de una coloración azul representa una prueba positiva

Prueba para fosfatos
El resto del filtardo transferirlo a un vaso de pp y añadir 20 ml de ácido sulfúrico al 10%
Calentar sin que se de la ebullición durante 1 minuto y dejar reposar los tubos
La aparición de una coloración azul indica la presencia de fosfato inorgánico.

Prueba para purinas
a) A 2 ml del hidrolizado anterior añadir 3 ml de hidróxido de amonio al 10% y 3 gotas de
nitrato de plata al 2%.

b) Mezclar y observar la aparición de coloración, que indica la presencia de purinas.


CUESTIONARIO
1. Describa la composición del DNA.
2. ¿Porque es imprescindible el orden de las secuencias de las bases nitrogenadas?
3. En que se basa la extracción de DNA de una muestra celular.
4. Menciona los tipos de extracción de DNA que existen
5. Mencione brevemente algunas técnicas de análisis del DNA
BIBLIOGRAFÍA
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Biología molecular de la célula (1996) Omega.
Glick B. And Pasternak. Molecular Biotechnology (1994) ASM Press.
Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaria P., Darnell J. Molecular Cell Biology (1995) Scientific
American Books.
Old R.W., Primrose S.B. Principios de manipulación genética (1987) Editorial Acriba S.A.
Hardy, K.G. Plasmids, a practical approach (1987) IRL Press.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual (1982) Cold Spring Harbor
Laboratory.


LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0


AISLAMIENTO DE ÁCIDO RIBONUCLEICO
OBJETIVO
• Realizar la extracción de ARN de diferentes muestras biológicas
FUNDAMENTO.
El ácido ribonucleioco es un componente celular que lleva a cabo importantes

funciones metabólicas, principalmente en el proceso de biosíntesis de proteínas. Por
calentamiento en álcali diluido el RNA puede aislarse de diferentes maneras.
El RNA en su forma intramolecular generalmente se halla unido a proteínas de forma

de complejos de ribonucleoproteína, estos complejos se disocian por el tratamiento en medio
alcalino.
La presencia de RNA en solución se puede detectar por su reacción con el orcinol,

una prueba específica para pentosas. Una vez hidrolizado en medio ácido, se pueden
efectuar pruebas para determinar la presencia de fosfato inorgánico y bases nitrogenadas.

3 Morteros y pistilos Levadura Baño María
3 Matraces Erlenmeyer de 125 ml arena Balanza analítica
3 Mecheros Gasa
3 Anillos y telas de asbesto NaOH
3 Embudos de tallo corto H2SO4
20 Tubos ensaye grandes Orcinol
3 Vasos pp de 150 ml NH4OH
3 Vasos de 600 ml HNO3
3 Vasos de 100 ml Glucosa
Ribosa
Molibdato de amonio

PARTE A. AISLAMIENTO DE RNA DE LEVADURAS

Procedimiento.
Moler 2 g de levadura en un momento con una cantidad igual de arena, añadir 10 ml de
NaOH al 0.2% y moler hasta obtener una consistencia cremosa. Transferir a un matraz de
125 ml, lavando el mortero con 25 ml de la solución de NaOH. Calentar a 95° C/30 min.
Filtrar a través de gasa y enfriar. Añadir 20 ml de ácido sulfúrico al 10% y calentar a
ebullición durante 5 min.

PARTE B. PRUEBA DE ORCINOL

Procedimiento.
A 1 ml del hidrolizado añadir 1 ml del reactivo de orcinol, mezclar y calentar. La aparición de
un color azul-verdoso indica la presencia de pentosas. Repetir la prueba con las soluciones
de glucosa y ribosa.
PARTE C. PRUEBA PARA FOSFATOS

Procedimiento.
El resto del filtardo transferirlo a un vaso de pp y añadir 20 ml de ácido sulfúrico al 10%
Calentar sin que se de la ebullición durante 1 minuto y dejar reposar los tubos La aparición
de una coloración azul indica la presencia de fosfato inorgánico.
PARTE D. PRUEBA PARA PURINAS

Procedimiento.
A 2 ml del hidrolizado anterior añadir 3 ml de hidróxido de amonio al 10% y 3 gotas de nitrato
de plata al 2%. Mezclar y observar la aparición de coloración, que indica la presencia de
purinas.

CUESTIONARIO
1. Describa la composición del RNA.
4. Menciona los tipos de RNA
5. Mencione brevemente algunas técnicas de análisis del RNA
BIBLIOGRAFÍA
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Biología molecular de la célula
(1996) Omega.
Glick B. And Pasternak. Molecular Biotechnology (1994) ASM Press.
Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaria P., Darnell J. Molecular Cell
Biology (1995) Scientific American Books.
Old R.W., Primrose S.B. Principios de manipulación genética (1987) Editorial Acriba S.A.
Hardy, K.G. Plasmids, a practical approach (1987) IRL Press.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual (1982) Cold
Spring Harbor Laboratory.


LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

3 UNIDAD TEMÁTICA III –Bioenergética
A partir de un estudio de caso realizará la degradación de la glucosa y entregará un

reporte que incluya:
- El producto del proceso de glucolisis, del ciclo de Krebs y de la fosforilación oxidativa

- La cantidad de moléculas de energía generadas en cada proceso.

3.1 TEMA 1 – Moléculas y compuestos transportadores de energía
3.2 TEMA 2 – Glucolisis

RESPIRACIÓN CELULAR
OBJETIVO
• Entender qué es la respiración celular, su importancia y los pasos principales de la

misma.
• Diferenciar entre la respiración aeróbica y la anaeróbica.
• Diferenciar entre la fermentación láctica y alcohólica, y conocer sus aplicaciones.
• Entender cómo ocurre la fermentación alcohólica a partir de distintos carbohidratos.
• Medir cómo se afecta la tasa de respiración aeróbica.
FUNDAMENTO.
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por
gemación. En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo en donde
reside la información genética de la célula , mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis
de A TP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de
proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior.
A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la
hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta proteína es
semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la A TPasa de Na+/K+ de las
células animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones
micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la
levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el
transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte
llamados simportadores o uniportadores. Para darse una idea de la importancia de esta
enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que
la ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula. Además de
esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de
protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la
síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones a
través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de
esta enzima es la oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la
levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a
nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al
exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la
membrana.

3 Morteros y pistilos Levadura Baño María

3 Matraces Erlenmeyer de 125 ml arena Balanza analítica

3 Mecheros Gasa
3 Anillos y telas de asbesto NaOH
3 Embudos de tallo corto H2SO4
20 Tubos ensaye grandes Orcinol
3 Vasos pp de 150 ml NH4OH
3 Vasos de 600 ml HNO3
3 Vasos de 100 ml Glucosa
Ribosa
Molibdato de amonio

PARTE A. FERMENTACIÓN
Procedimiento.
Prueba 1. En un vaso de precipitado de 50 ml. Pipetee 10 ml de la solución de glucosa y
añada 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura. Mezcle perfectamente hasta que la
mezcla sea homogénea. Incube a 37 grados. Colocar un tubo de ensaye con 15ml de la
suspension de levadura coloca un tubo durham, incube a 37 grados por 24 horas y observa
los resultados.
Realice una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la hora y media de
incubación. Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, realice una
prueba de Benedict a la solución de glucosa.
Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningún azúcar reductor realice un
blanco de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10
ml. De agua destilada. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 mi de esta solución de
levadura.
Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la sig. Manera: Pipetear 0.5 ml. de la solución
problema en un tubo de 15 X 150 Añadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. Calentar en baño de
agua hirviente durante 3 min.
Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3

minutos para obtener la línea basal. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4
veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.
INTERPRETACION:
1. Muestra no fermentada: reacción de Benedict positiva (rojo ladrillo)
2. Muestra fermentada: reacción de Benedict negativa (azul).
Tiempo Glucosa Glucosa

pH pH
min (+) (-)
Hacer una gráfica del experimento; utilizar los valores de las lecturas de pH contra tiempo.
Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control.

Procedimiento.
Prueba 2. Se observará la fermentación alcohólica por la levadura Saccharomyces cerevisiae
y si esta puede usar diferentes azucares para llevar a cabo la fermentación. Prepare la
suspensión de levadura por lo menos media hora antes de comenzar el experimento.
Caliente 100 ml de agua hasta que llegue a 38-40C. Saque del “hot plate” y añada un sobre
de levadura. Cada mesa representa un grupo: Grupo 1: hará el experimento con glucosa
Grupo 2: hará el experimento con sucralosa o sacranina (“Same”). Grupo 3: hará el
experimento con fructosa Grupo 4: hará el experimento con lactosa. Grupo 5: hará el
experimento con almidón. Grupo 6: hará el experimento con el control.
Cada equipo hará solo un experimento: Procedimiento (como ejemplo (glucosa) para explicar
el procedimiento para todas las soluciones): Pese 1 gr de glucosa y añada a un vaso con 10
ml de agua y disuelva. Añada 10 ml de la suspensión de la levadura al vaso (mueva la
suspensión de levadura para asegurarse que tenga levadura en su mezcla). Mueva el vaso
de vez en cuando por 5 minutos. (debe observar algún burbujeo en la mezcla). En este caso,
esta mezcla es la que se usara para el grupos 1. Todas las mesas: Tenga preparada la
pipeta (con una gota de agua con un poco de colorante vegetal) con el pedazo de tubo.
Luego de los 5 minutos añada 3 cc de la mezcla preparada a la jeringuilla (sino tienen la
marca, se llenan ¾ partes). Hale para añadir un poco de aire y monte la jeringuilla a la
pipeta. Mueva la gota de agua para que quede en la primera marca de la pipeta. No es
necesario poner parafina en la unión. De hecho puede complicar el experimento ya que
resulta difícil ver la unión del tubo con jeringuilla. Empiece a contar el tiempo. Tome la lectura
de donde se encuentra la gota de agua cada dos minutos por 20 minutos. Dos estudiantes
harán este experimento, mientras dos estudiantes montan el segundo experimento. Cada
rayita representa 0.01ml. Con sus datos para cada experimento, prepare una gráfica de los
ml de CO2 producido vs. Tiempo transcurrido. Compare los resultados de su mesa con los
de las demás mesas.
PARTE B. RESPIRACIÓN CELULAR (SE HARÁ POR GRUPO/ MESA).
Procedimiento.
En esta parte veremos como el ejercicio (el aumento en actividad muscular) afecta la tasa de
respiración celular. La respiración celular va a ocurrir en las células musculares para proveer
energía para contraer los músculos. Esta reacción requerirá oxigeno y produce CO2, el cual
exhalamos. Prepare la solución de NaOH: 25 ml de la solución 0.25M y 75 ml de agua. Esta
solución la usará para la titulación de todos los grupos. Prepare dos vasos con 100 ml de
agua c/u. Ponga c/u sobre un papel blanco. Marque uno como control y el segundo como
experimento. A cada vaso añada 6 gotas de fenolftaleína. Añada gota a gota la solución de
NaOH al vaso marcado como control. Cuente cuantas gotas necesita para que el agua
cambie al más leve tono de rosa (que se mantenga en el agua). No descarte su control.
Sople por 10 segundos a través de un sorbeto dentro del agua del vaso marcado como
experimento. NO INHALE durante este tiempo. Añada gota a gota la solución de NaOH,
contando hasta que cambie al más leve tono rosado.
Repita para los siguientes experimentos (todos con la misma persona que hizo el primer
experimento). Luego de caminar vigorosamente por el salón por 3 minutos. Luego de hacer
“jumping jacks” por 3 minutos, Después de recuperarse del ejercicio anterior (luego de 2
minutos) (para este experimento tenga otro vaso marcado como experimento con 100 ml y 6
gotas de fenolftaleína).
Compare los resultados de su mesa con los de las demás mesas. Prepare una gráfica de
barras que muestre los resultados.


Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que las
levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de
sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya
función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos
BIBLIOGRAFÍA
1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth
edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical
techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

3.3 TEMA 4 – Ciclo de Krebs
3.4 TEMA 5 – Fosforilación oxidativa

3.4.1 PRACTICA NO. 10
PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA (SUPUESTO PRACTICO)
OBJETIVOS.
• Observar la capacidad de utilización de diferentes sustratos y condiciones de oxígeno
por las bacterias
FUNDAMENTO.
El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye
procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en
los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo,
se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales
(anabolismo).
Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son
intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas
por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.
Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su
inoculación en medios de cultivo con diver- sos sustratos que puedan ser utilizados como
fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes
esenciales necesarios para su crecimiento.
Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores
de pH para detectar la produc- ción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis,
cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinación de diferentes
actividades metabólicas. Las actividades que se evalúan con mayor frecuencia son:
capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para catabolizar
aminoácidos y urea, la producción de enzimas hidrolíticas específicas de tipo endo o exo
como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etcétera.
Por la importancia que tienen estas pruebas bioquímicas para la identificación de especies
bacterianas en áreas de alimentos, clínica y ambiental, se han desarrollado sistemas
bioquímicos miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma más rápida y
segura pero que mantienen los criterios de evaluación de las pruebas bioquímicas
convencionales.
METODOLOGÍA.
Seguir la indicaciones del profesor quien planteara un caso teórico que se basara en la
experiencia practica de laboratorio de microbiología. En el establece trabajar con cultivos
puros de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens y Klebsiella sp, y se
toma en cuenta la metodología planteada en el anexo “Supuesto practico Practica No.9” y los
supuestos resultados que el profesor plantea para el llenado y elaboración de un cuadro de
resultados. Posterior realizar un análisis y discusión de los fundamentos para así responder
las cuestiones planteadas .


Describa las actividades enzimáticas que se evalúan en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en la práctica, indicando la reacción bioquímica general.
¿Por qué se recomienda evaluar las pruebas bioquímicas primero a las 24 horas y después
de 48 horas?
¿Qué pruebas bioquímicas le permitieron comprobar la capacidad de oxidación completa de
la glucosa? ¿Porque?
¿Por qué se busca la precipitación de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la
superficie?
BIBLIOGRAFÍA
1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth
edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical
techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA

LISTA COTEJO.
Práctica:
ALUMNO:
FECHA: Grupo:
Puntaje (0-2)
Identificación
de variables
Desarrollos de
la técnica
cálculos
Presentación
de datos
Cumplimiento
de objetivos e
hipótesis
de fuentes de
error
Mejoras o
modificaciones
Nota:
TOTALMENTE (T) = 2
MEDIANAMENTE (M)=1
NULO (N)= 0

4 FUENTES BIBLIOGRÁFICAS.
4.1 Sugeridas.
Ciudad
Autor Año Título del Documento Editorial
/País
Methods of Fermentation.
Chapter 5: In.
Ed. by Thomas D.
CRUEGER, W. Y Biotechnology: A
1984. USA. Brock. Science
ANNALIESE, C. textbook of Industrial
Tech Inc.
Microbiology. pp: 54-57.
Microbial Biotechnology. TIBTECH.

Demain, A.L. 2000.
18: 26-31.
Cinética Microbianas en
Leveau, Jean- Biotecnología. De René Ed. El Manual
1985. México.
Yves y Bouix, M. Scriban. pp: 132-165. Moderno.
Principles of
Fermentation
Stanbury, P.F. y Ed. Pergamon
1984. Technology, 1a ed. pp:
Whitaker, A. Press.
11-14.
Microbiología de
enfermedades
México,
DUERDEN. 1993. infecciosas. 1ª Edición. Edit. Limusa.
D.F.
paginas: 515.
Microbiología Médica.
BROOK,
Jewetz, Melnick y
G.F;BUTEL, J.S México, Edit manual
2005. Adelberg. 18º Edición.
AND MORSE, D.F. Moderno.
páginas 876.
S.A.
Microbiología Oral. 2º Madrid Edit McGraw-Hill
UREÑA, J. L. 2002.
Edición. España Interamericana.
Alcamo´s Fundamentals
POMMERVILLE Edit. Jones and
2006. of Microbiology. 8ª USA.
J.C. Bartlett.
Edición.
MADIGAN, M.T; Brock Biología de los
Madrid Edit. Pearson
MARTINKO, J.M; 2004. Microorganismos. 10ª
España. Prentice Hall.
AND PARKER J. Edición.
Microbiología e
LEVINSON Madrid,Es Edit. McGraw Hill
2006. Inmunología medicas. 8ª
WARREN. paña. Interamericana.
Edición.

4.2 De apoyo.
Ciudad
Autor Año Título del Documento Editorial
/País
México, Edit manual
Adelberg. 18º Edición.
D.F. Moderno.
Brook,
2005.
G.F;Butel, J.S
and Morse, S.A.
Microbiología Médica.
Jewetz, Melnick Madrid Edit McGraw-Hill
2002. Microbiología Oral. 2º
y Ureña, J. L. España. Interamericana.
Edición.
Microbiología de
México,
Duerden. 1993. enfermedades Edit. Limusa.
D.F.
infecciosas. 1ª Edición.
Microbiología e
Levinson Madrid, Edit. McGraw Hill
2006. Inmunología medicas. 8ª
Warren. España Interamericana.
Edición.
Madigan, M.T; Brock Biología de los
Edit. Pearson
Martinko, J.M; 2004. Microorganismos. 10ª España.
Prentice Hall.
and Parker J. Edición.
Alcamo´s Fundamentals
Pommerville Edit. Jones and
2006. of Microbiology. 8ª USA.
J.C. Bartlett.
Edición.

5 ANEXO.
Matriz de niveles de logro ara las habilidades del trabajo experimental.
HABILIDADES NIVEL DE LOGRO
Totalmente (t) Medianamente (m) Nulo (n)
Puntos 2 1 0
Planteamiento Plantea una hipótesis Plantea una hipótesis No Plantea ninguna
de hipótesis fundamentada en la parcialmente hipótesis ni tampoco
teoría e identifica todas fundamentada en e identifica ninguna de las
las variables del identifica algunas de las variables del experimento.
experimento. variables del experimento.
Trabajo Sigue perfectamente Toma en cuenta algunas No Sigue las instrucciones
experimental todas las instrucciones de las instrucciones que y desatiende la seguridad al
que se le dan y se le dan y requiere desarrollar la técnica
desarrolla la técnica ayuda al desarrollar la experimental.
experimental de forma técnica experimental.
segura.
Análisis de Interpreta de manera Interpreta con algunos Interpreta erróneamente
resultados correcta los resultados errores los resultados del los resultados del
del experimento y realiza experimento y tiene ciertos experimento y comete
de manera adecuada los errores al realizar los muchos errores al realizar
cálculos, cuando estos cálculos, cuando estos los cálculos. La
son necesarios. son necesarios. Presenta presentación los datos no
Presenta los datos de los datos de una forma permite su interpretación.
una forma clara que poco clara dificultando la
permite su fácil interpretación.
interpretación (usa
acertadamente tablas,
graficas, diagramas,
etc.)
Elaboración de Elabora una conclusión Elabora una conclusión Elabora una conclusión
conclusiones valida basada en un parcialmente valida errónea basada en una
correcto análisis de los basada en una interpretación deficiente de
resultados, y justifica interpretación en parte los resultados, y menciona
que los objetivos e correcta de los resultados, el logro de los objetivos ni
hipótesis se hayan y menciona vagamente el validez de la hipótesis.
alcanzado o no. logro de los objetivos y
validez de la hipótesis.
Evaluación Evalúa la técnica usada Evalúa parciamente la No evalúa la técnica ni
mencionando sus técnica y solo sugiere sugiere modificación
limitaciones y sugiere algunas modificaciones. alguna.
modificaciones posibles
para mejorar la práctica.
6 Compiladores:
QFB. NORMA GARCIA MONTAÑEZ
M.C. DAVID GARCIA HERNANDEZ
Revisor:
X

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Manual de Laboratorio

QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

3.4.1 PRACTICA NO. 10 ........................................................................................................... 58

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

COMPETENCIAS A LAS QUE CONTRIBUYE LA ASIGNATURA.

Transformar materias primas a través de procesos biotecnológicos para obtener

El alumno identificará la función del agua, biomoléculas y bioenergética a través del

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

1 UNIDAD TEMÁTICA I – Introducción a la Bioquímica

Resultado del aprendizaje.

Elaborará mapas conceptuales de:

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

1.1 TEMA 1 – La Bioquímica y su relación con otras ciencias

1.2 TEMA 2 – El agua y su importancia en la bioquímica.

• Preparar de soluciones amortiguadoras de pH conocido.

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

Al aumentar la concentración de hidrógenos el pH es más ácido y, al expresar dicha

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

Cantidad Materiales Reactivos Equipo

PARTE A. Preparación de disoluciones amortiguadoras.

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

Coloca 40 mL de agua destilada en uno de los matraces Erlenmeyer. Agrega 10 gotas de

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

5 gotas de base en la bureta en la bureta agregado

PARTE B. Preparación de soluciones amortiguadoras de pH conocido.

a) Calcule los gramos de KH2PO4 y Na2HPO4 necesarios para preparar 50mL de

a) Prepare las siguientes soluciones:

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

2.2 49.5 4.2 3.0

Siendo Dph el incremento de pH resultante la adición de un volumen db de base. Ponga su

ANALISIS DE RESULTADOS. Interpreta de manera correcta los resultados del experimento y

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

• ¿Cuál puede ser la sustancia proveniente de tu aliento, que provoca el cambio en el

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

2 UNIDAD TEMÁTICA II – Biomoléculas

Resultado del aprendizaje.

A partir de un ejercicio práctico realizará en una muestra la identificación de:

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

2.1 TEMA 1 – Carbohidratos.

Los carbohidratos se definen como polihiroxialdehídos, polihidroxicetonas o aquellos

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaría la

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

Cantidad Materiales Reactivos Equipo

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

PARTE A. Preparación de reactivos y soluciones.

PARTE B. Pruebas para la identificación de carbohidratos.

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

Preparación del testigo:

Colocar En Un Tubo De Ensaye 2 Ml De Agua Destilada. Agregar 0.5 Ml De Fehling A Y 0.5

Preparación de los problemas:

Colocar en un tubo de ensaye 5 ml de una solución de sacarosa al 1%. Agregar 2 gotas de

7. Identificación de polisacáridos mediante la prueba de yodo

Cuadro 1, Diseño experimental para prueba de yodo

Elaboro: QFB. Norma Garcia Montañez / M.C. David Garcia Hernadez

8. Hidrólisis del almidón.

ANALISIS DE RESULTADOS. Interpreta de manera correcta los resultados del experimento y