UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
Y FISIOLOGÍA ANIMAL

CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA AMBIENTAL

P7. - Efecto de inhibidores sobre la cadena

respiratoria
INTRODUCCIÓN
ETAPA I: Las grandes moléculas de
los alimentos se fragmentan hasta
unidades más pequeñas.

ETAPA II: Las unidades más

pequeñas se degradan hasta unas
pocas unidades simples: Acetil-CoA.

ETAPA III: Las unidades simples:

Acetil-CoA, sufren una oxidación
completa para forma ATP.
Fosforilación oxidativa
Proceso mediante el cual se forma ATP por
medio de la transferencia de electrones
desde el NADH o el FADH2 hasta el O2 por
medio de una serie de transportadores
eléctricos. Tiene lugar en la mitocondria.
OXIDACIÓN → Reacción química donde un
elemento pierde electrones
REDUCCIÓN: Reacción química donde un
elemento gana electrones
Agente oxidante: Aquel que tiende a A
captar/acepta electrones. Aquel que se
reduce → O2

ESTADO OXIDADO → ESTADO REDUCIDO

Agente reductor: Aquel que pierde/

suministra/ cede electrones.
Aquel que se oxida → NADH + H / FADH2

ESTADO REDUCIDO → ESTADO OXIDADO

Cadena transportadora de electrones
Proceso mediante el cual los cofactores que provienen del ciclo de Krebs (NADH, FADH2) se
oxidan, y los electrones que ellos ceden son transportados a lo largo de la secuencia de reacciones
de óxido-reducción, hasta el aceptor final de electrones, que es el oxígeno
La Fosforilación Oxidativa depende de la transferencia de
electrones

En la fosforilación oxidativa el potencial de transferencia de electrones del NADH ó FADH2

se convierte en el potencial de transferencia de grupos fosforilo del ATP.

El potencial de transferencia electrónica de un e- se mide como potencial redox,

potencial de reducción o potencial de óxido-reducción (Eo’).

Si Eo’ es -: Forma reducida tiene < afinidad por los e- que H2.
Si Eo’ es +: Forma reducida tiene > afinidad por los e- que H2.

El flujo de electrones a través de los componentes de la cadena de transporte

electrónico se realiza en orden de potencial de reducción creciente.
 NADH (agente reductor fuerte), Eo’ = -0.32 volts)
O2 (aceptor final de los electrones agente oxidante fuerte,) Eo’ = +0.82 volts)

Una diferencia de potencial de 1.14V entre el NADH y el O2 impulsa el transporte de e-

a través de la cadena respiratoria y permite la formación de un gradiente de protones.
Transporte de electrones Bombeo de protrones

fuerza electrón- se convierte

fuerza protón-
motriz motriz

se convierte

potencial de
transferencia de
fosforilo

La fosforilación oxidativa muestra de manera fehaciente que en los sistemas biológicos, los
gradientes de protones constituyen una forma intercambiable de energía libre.
 I: NADH-Q Oxidorreductasa
La cadena respiratoria II: Succinato-Q Reductasa
consiste de 4 complejos
multienzimáticos: III: Q-citocromo c Oxidorreductasa
IV: Citocromo c Oxidasa

Cit. C
 Complejo I Complejo II Complejo III
succinato
NADH Ubiquinona – Complejo IV
deshidrogenasa =
deshidrogenasa = Citocromo C Citocromo C
succinato
NADH-Ubiquinona reductasa = oxidasa
ubiquinona
reductasa citocromo bc1
reductasa

Membrana
externa

4 H+ 4 H+ 2 H+ 4 H+ Espacio
Citocromo Intermembranoso
C Cit. a
ubiquinona Cit.c1 ATP
Fe-
Fe. C sintasa
S IIIS ICVu Membrana
FMN Fe- Q Cit. Cit.a3 interna
FADII S b

2 e-
NADH NAD+ FADH2 FAD+ ½ O2 + 2 H+ → H2O 1 ATP
Matriz

NADH → FMN → FeS FeS

Cit
Q → Cit C1 → Cit C
C
Cit a → Cit a3 O2
FADH2 → FeS Cit b
Inhibidores de la Cadena transportadora de electrones

Sustancias que interfieren con la cadena transportadora de

electrones

Función: Detener el transporte de electrones

Se unen a alguno de los componentes de la cadena

transportadora de electrones bloqueando su habilidad de
cambiar de forma reversible (forma oxidada → forma reducida)
Inhibidores de la Cadena transportadora de electrones
Inhibidores e indicadores REDOX Complejo I Complejo II Complejo III Complejo IV

Rotenona (insecticida) Cianuro (CN-), azida(N3-): bloquean la forma Membrana

Amital (barbitúrico) férrica (Fe3+) del hemo a3
externa
monóxido de carbono (CO): bloquea la forma
ferrosa (Fe2+)del hemoa3

4 H+ Antimicina A 4 H+ 2 H+ 4 H+ Espacio
(antibióico) Intermembranoso
Cit. a
Cit.c1
Fe-S C ATP sintasa
IFIeI.S Cu
IV Membrana
FMN Q interna
Cit.b Cit.a3
FAD
II Fe-S

Matriz
NADH NAD+ FADH2 FAD+ ½ O2 + 4 H+ -- H2O 1 ATP

Aceptores
2,6-diclorodenolindofenol Ferricianuro artificiales de
Azul de metileno Tetrametil p-fenilendiamina
Azul (oxidado) Azul o granate(oxidado) electrones
Azul (oxidado) Incoloro (reducido)
Incoloro (reducido) Incoloro (reducido)

El uso de inhibidores ha ayudado a deducir la secuencia de cadena respiratoria, y ha permitido mejorar el

mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos.
Barbiturato de sodio

Es un inhibidor que bloquea la transferencia de electrones entre la flavina

(FMN) y la ubiquinona (Complejo I)

Q III IV

II
Malonato

Es un inhibidor competitivo de la reacción de la succinato deshidrogenasa y

bloquea la transformación del succinato a fumarato (Complejo II)

Q III IV

II
Cianuro
Es un potente veneno que inhibe la cadena de transporte de electrones y la
fosforilación oxidativa, bloqueando el paso de electrones del citocromo (hemo a3)
al oxígeno (Complejo IV)

Q III IV

II
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El objetivo de la presente experiencia es demostrar el

funcionamiento de la cadena respiratoria a través del efecto de
inhibidores sobre la cadena oxido-reducción biológica, utilizando
aceptores y dadores artificiales.
EQUIPAMIENTO

INDICADOR OX-RED
INDICADOR OX-RED SUSTRATO
SUSTRATO
INHIBIDOR DEL COMPLEJO 2
INHIBIDOR DEL COMPLEJO 4

INHIBIDOR DEL COMPLEJO 1

COMPLEJOS DE LA CTe-
MÉTODO
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO
Tabla 1.
Sistema de incubación para la enzima succinato deshidrogenasa (C-2)

C1V1 = C2V2
Ox. → Azul 0.1(0.2) = C2(2.7)
C2 = 0.007 M (SUSTRATO)

C1V1 = C2V2
0.1(0.5) = C2(2.7)
C2 = 0.02 M (INHIBIDOR)
MÉTODO
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

Tabla 2.
Sistema de incubación para la enzima citocromo oxidasa (C-4)

Red → Incoloro
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

SI HAY AE

FORMA REDUCIDA
SUCCINATO DESHIDROGENASA INCOLORO

NO HAY AE

FORMA OXIDADA AZUL

2,6-Diclorofenolindofenol

• Indicador de óxido reducción

• Aceptor artificial de electrones
INCOLORO
MEDIO BÁSICO: AZUL

MEDIO ÁCIDO: ROJO

A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 1

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA

AZUL
FORMA
OXIDADA
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 2

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA

AZUL
FORMA
OXIDADA
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 3

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA

AZUL
FORMA
OXIDADA
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 4

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA

AZUL
FORMA
OXIDADA
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 5

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA

AZUL
FORMA
OXIDADA
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO OXIDABLE SUCCINATO

ANÁLISI DEL TUBO 6

5 4
1 2 3 6

FORMA
REDUCIDA SUCCINATO INCOLORO

DESHIDROGENASA
SI hay transporte de
electrones todo el
sistema completo
(enzima y sustrato).
Hay inhibición del
complejo IV por el
inhibidor (Cianuro de
sodio), pero el complejo
AZUL
FORMA II sigue funcionando.
OXIDADA
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

CITOCROMO C
O2
FORMA REDUCIDA
FORMA OXIDADA
P-FENILENDIAMINA
(FORMA REDUCIDA)

CITOCROMO OXIDASA

CITOCROMO C
FORMA OXIDADA H20
P-FENILENDIAMINA FORMA REDUCIDA
(FORMA OXIDADA)
P-fenilendiamina

• Indicador de óxido reducción

• Dador artificial de electrones
• Sustrato NO HAY AE

SI HAY AE

ESTADO OXIDADO → PÚRPURA ESTADO REDUCIDO → INCOLORO

B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

ANÁLISI DEL TUBO 1

FORMA
OXIDADA
(O2)
FORMA
REDUCIDA
INCOLORA
CITOCROMO OXIDASA

FORMA
REDUCIDA
(H2O)
FORMA OXIDADA
AZUL OSCURO A
GRANATE
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

ANÁLISI DEL TUBO 2

FORMA
OXIDADA
(O2)
FORMA
REDUCIDA
INCOLORA
CITOCROMO OXIDASA

FORMA
REDUCIDA
(H2O)
FORMA OXIDADA
AZUL OSCURO A
GRANATE
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

ANÁLISI DEL TUBO 3

FORMA
OXIDADA
(O2)
FORMA
REDUCIDA
INCOLORA
CITOCROMO OXIDASA

FORMA
REDUCIDA
(H2O)
FORMA OXIDADA
AZUL OSCURO A
GRANATE
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

ANÁLISI DEL TUBO 4

FORMA
OXIDADA
(O2)
FORMA
REDUCIDA
INCOLORA
CITOCROMO OXIDASA

FORMA
REDUCIDA
(H2O)
FORMA OXIDADA
AZUL OSCURO A
GRANATE
B. SISTEMA DE INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO INDICADOR p-Fenilendiamina

ANÁLISI DEL TUBO 5

FORMA
OXIDADA
(O2)
FORMA
REDUCIDA
INCOLORA
CITOCROMO OXIDASA

FORMA
REDUCIDA
(H2O)
FORMA OXIDADA
AZUL OSCURO A
GRANATE
(incoloro)

(púrpura)
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Sistema de incubación para la enzima

succinato deshidrogenasa (C-2)

Características TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

Color inicial
Color final

Ocurrió óxido-reducción (SI/ NO)

2,6-diclorofenolindofenol (oxid/ red)

Rx Enzimática (SI/NO)

Ocurrió inhibición enzimática (SI/ NO)

Sistema de incubación para la enzima
citocromo oxidasa (C-4)

Características TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5

Color inicial
Color final

Ocurrió óxido-reducción (SI/ NO)

p-fenilendiamina (oxid/ red)

Rx Enzimática (SI/NO)

Ocurrió inhibición (SI/ NO)