Manual Microplaca Iaes

Técnicas Analíticas
en Microplaca
A pli ca ci one s p a ra A cua cu lt u ra
Jorge Hernández López

Teresa Gollas Galván
Daniel Coronado Molina
Marcel Martínez Porchas
Francisco Vargas Albores
INSTITUTO DE ACUACULTURA DEL ESTADO DE SONORA, O.P.D.
2018
Tabla de contenido
1 Introducción ........................................................................................ 1
1.1 Análisis en Microplacas 3

1.2 Calidad del Agua 8
1.3 Estado fisiológico 10
1.4 Estado Inmune 11
2 Métodos para determinar Calidad Química del Agua ......................... 13
2.1 Cuantificación de Nitritos en agua marina 19

2.2 Cuantificación de Nitratos (Método de la Hidracina) 24
2.3 Medición de amonio en agua marina adaptación de Solórzano (1969). 29
2.4 Medición de fósforo en agua marina 33
3 Evaluación del Estado Fisiológico y Nutricional .................................. 39
3.1 Medición de proteínas totales en plasma (método del biuret) 43

3.2 Medición de glucosa en plasma 47
3.3 Medición de lactato 51
3.4 Medición de colesterol en plasma 55
3.5 Medición de acilglicéridos en plasma 59
4 Evaluación del Estado Inmune ........................................................... 63
4.1 Significado de los marcadores inmunes 68

4.2 Determinación de actividad Fenoloxidasa (FO) en hemolinfa completa 71
4.3 Determinación de Fenoloxidasa total (proFO+FO) en hemolinfa completa. 73
4.4 Determinación de pro-Fenoloxidasa (proFO) en hemolinfa completa. 75
4.5 Determinación de Fenoloxidasa total (proFO+FO) en hemocitos 76
4.6 Determinación de la actividad inhibidora de 2-Macroglobulina 77
4.7 Actividad de proteinasas tipo tripsina 79
4.8 Medición de actividad de lisozima 81
4.9 Medición de actividad antibacteriana 83
4.10 Medición de actividad de óxido nítrico sintasa (NOS) 85
4.11 Medición de actividad de SUPEROXIDO DISMUTASA (SOD) 87
5 Anexos .............................................................................................. 89
5.1 Obtención de muestras de sangre y hemolnfa 90

5.2 Obtención de Sangre de pez. 91
5.3 Obtención de Sangre de ostión. 92
5.4 Esquema del sistema de defensa de camarón 93
5.5 Tipo de reacciones en microplaca. 94
6 Bibliografía ....................................................................................... 95
1
1 I NTRODU CCIÓN
La acuicultura en México ha tenido un crecimiento significativo en

los últimos 10 años, de tal suerte que, en la actualidad, la
producción de organismos acuáticos por cultivo ha rebasado la
capacidad de captura.
Uno de los principales problemas de la producción de organismos

acuáticos es la mortalidad causada por factores como malas
condiciones ambientales, manejo deficiente del cultivo y aparición
de enfermedades. Debido a lo anterior, la vigilancia de la calidad
del agua, las buenas prácticas de manejo, el buen estado
fisiológico de los organismos y la ausencia de organismos
patógenos en el agua, es la base para el mantenimiento de la salud
en los cultivos acuícolas.
El objetivo de la sanidad acuícola es evitar la mortalidad de los
organismos, sin necesidad de utilizar tratamientos correctivos
que incluyan medicamentos (p ej. Antibióticos) o substancias
tóxicas (p ej. Cloro o formol) por lo que la medición de la calidad
del agua, del estado fisiológico e inmune de los organismos en
cultivo y la detección de patógenos, antes de que se presenten
manifestaciones clínicas, son primordiales para evitar pérdidas
económicas por mortalidad en la acuicultura.
Varias y variadas metodologías han sido descritas para la

medición de calidad de agua y calidad fisiológica de los
organismos en cultivo; cada una con sus ventajas y desventajas.
Sin embargo, los métodos con volúmenes reducidos han ganado
terreno porque además de ahorrar espacio, hay un ahorro
sustancial en los reactivos utilizados y una reducción importante
en la generación de deshechos. Adicionalmente, la
miniaturización permite automatizar los procesos y sistematizar
la organización, lo que reduce confusiones.
El uso de microplacas, para llevar a cabo las reacciones, ha ganado

popularidad porque además permite el análisis de la reacción
directamente en la misma placa, sin necesidad de transferir a
celdas u otro tubo. Además, el consumo de reactivos requerido se
reduce hasta en un 80%, generando a su vez menos cantidad de
desechos contaminantes.
|2|
1.1 A N ÁLI SI S EN M I CR OPL AC AS
El origen de las microplacas se encuentra en la necesidad de hacer
diluciones seriadas, principalmente para hemaglutinación. Así, se
diseñó un dispositivo que permitiera realizar diluciones y
reacciones en volúmenes pequeños (hasta 200 µL). Una serie de
10 diluciones 1:2 parecía cumplir con la mayoría de los casos, más
un pozo para el control positivo y uno para el negativo, dieron
origen al formato de 12 pozos por línea. Finalmente, la placa de
hemaglutinación quedó en un arreglo de 8 X 12 pozos, y la
titulación se hacía relativamente simple. En el pozo donde hay
aglutinación positiva, los eritrocitos sedimentan formando una
red que se distribuye en el fondo; si la reacción es negativa, los
eritrocitos sedimentan formando un botón (Figura 1).
El formato fue rápidamente aceptado y las dimensiones se

estandarizaron en 128mm x 86mm, lo que permitió el desarrollo
de dispositivos y utensilios para su manejo, análisis, llenado,
Figura 1. Esquema en una microplaca de hemaglutinación. Las reacciones

positivas y negativas son fácilmente diferenciadas. El título obtenido se indica
a la derecha de la placa.
|3|
lavado, etc. Lo más importante es que se encontraron otras
aplicaciones como las reacciones inmunoenzimáticas o ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), que a su vez facilitaron
la generación de nuevos utensilios y dispositivos.
A diferencia de las placas para hemaglutinación, las placas para

ELISA requerían que el fondo fuera plano y homogéneo (Figura 2).
Esto permitía reducir la dispersión, lecturas similares en cualquier
punto del fondo, la distancia que recorre la luz en la solución es
la misma, por lo que las determinaciones colorimétricas son
reproducibles y precisas.
Todos los análisis colorimétricos se basan en la ley de Beer-

Lambert, la cual dice que cualquier solución absorbe la luz que la
atraviesa. La intensidad de luz incidente (Io) menos la intensidad
de luz transmitida (It) será la cantidad de luz absorbida por la
solución. La cantidad de luz absorbida por una unidad de volumen
o concentración es una propiedad de la solución, por lo tanto, la
cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la
concentración de la sustancia. Para poder hacer una medición
Figura 2. Diferencias en las formas de los pozos de una microplaca. Para

hemaglutinación es necesario que el fondo sea curvo, mientras que para lectura
de reacciones coloridas debe ser plano.
|4|
cuantitativa es necesario fijar la distancia (l) que debe recorrer la
luz.
En el sistema de tubo, la distancia (l) se estableció en 1 cm y

básicamente todos los colorímetros usan celdas para ese tamaño
de paso de luz (Figura 3a). En las técnicas implementadas para
microplaca la luz atraviesa la solución en forma vertical (Figura
3b). Considerando que, la distancia que recorre dentro de la
solución es el factor más importante para determinar la cantidad
de luz absorbida, las dimensiones del pozo de la microplaca
pueden afectar el resultado. Adicionalmente, la distancia que
recorre la luz, dentro de la solución (l) en un microplaca, no
necesariamente es 1 cm; por ello es muy importante mantener
constante el tipo de placa y los volúmenes de cada reacción.
Utilizar la misma marca y número de catálogo para las placas
ayudará a que volumen sea constante, lo cual garantizará una
cuantificación precisa y confiable.
Figura 3. Diferencias en la lectura de absorbancia en tubo, donde la luz

atraviesa en forma horizontal (a), y en microplaca, donde la luz atraviesa la
solución en forma vertical (b).
|5|
Hay una gran variedad de microplacas. Todas tienen el mismo
tamaño y la misma distribución de los pozos. Sin embargo, hay
ligeras diferencias en el grueso de las paredes, profundidad del
pozo, claridad o transparencia del material. La relación entre
concentración y absorbancia específica permite el cálculo de la
concentración
En términos generales, es posible determinar la concentración de

cualquier sustancia química en solución, solamente es necesario
considerar la longitud de onda adecuada. La luz visible (Figura 4)
para el ojo humano va desde el violeta (380 nm) hasta el rojo (750
nm). Por debajo de 340nm está el espectro ultravioleta y por
encima de los 750 nm es el espectro infrarrojo. Los compuestos
químicos pueden absorber la luz en diversas longitudes de onda,
pero solamente las soluciones coloridas pueden ser detectadas en
el rango visible.
Para la detección y cuantificación de sustancias por un método

colorimétrico es necesario que la reacción genere un producto
colorido de tal manera que el color de la solución sea proporcional
a la concentración del analito y pudiera ser cuantificada. Con la
llegada de nuevas metodologías es posible leer casi con la misma
Figura 4. Intervalo de luz visible. Todas las reacciones que produzcan un color
podrán ser detectadas en el espectro visible. Fuera de ese intervalo, se requiere
luz ultravioleta (debajo de 380 nm) o infrarroja (por encima de 750nm).
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facilidad en otros intervalos del espectro de luz. Típicamente, las
reacciones se realizan en un tubo, se les agrega los reactivos, se
espera el desarrollo del color y se cuantifica.
Un gran avance en las reacciones realizadas en microplacas se

debió a la necesidad de cuantificar las reacciones antígeno-
anticuerpo. Una técnica inmuno-enzimática (ELISA) abrió un
torrente de opciones y herramientas en el trabajo con
microplacas. La reacción antígeno-anticuerpo es detectada por
medio de una enzima acoplada (Figura 5) al anticuerpo, la cual
lleva a cabo la transformación de un sustrato incoloro a un
producto colorido. La reacción es suspendida después de un
tiempo definido (30 a 60 min) y la cantidad de color es
directamente proporcional a la concentración de la enzima que, a
su vez, es directamente proporcional a la concentración del
anticuerpo.
Estas técnicas tienen la ventaja de analizar varias muestras al

mismo tiempo y el ahorro considerable de reactivos, Además de
la disminución de residuos producidos en las reacciones.
Figura 5. Esquema de una reacción ELISA directa. La cantidad de sustrato

transformado en un producto colorido es directamente proporcional a la
cantidad de anticuerpo que ha reaccionado.
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1.2 C AL I DAD DE L A GU A
La buena calidad del agua es la base para un buen desarrollo de
los organismos en cultivo. Sin embargo, la calidad del agua se
deteriora gradualmente a medida que aumenta el tiempo de
cultivo. En gran parte, las malas prácticas de alimentación y la
falta de recambios de agua permiten la acumulación de nutrientes
que generan condiciones que pueden ser tóxicas para los
organismos acuáticos. A su vez, este ambiente enrarecido
promueve cambios en el microbioma presente en los sistemas de
cultivo; favoreciendo la proliferación y reproducción de bacterias
potencialmente patógenas para los organismos en cultivo.
Afortunadamente existen técnicas de laboratorio que permiten

analizar y mantener una estrecha vigilancia de la calidad del agua.
Las técnicas tradicionales para dicho análisis fueron
originalmente reportadas por Bendschneder (1952), Grasshof
(1976), Murphy (1962), Strickland (1972) y Wood (1967). Estas
técnicas pueden realizarse en laboratorios analíticos sofisticados,
o con el apoyo de kits comerciales de diagnóstico en campo. Sin
embargo, estas técnicas tienen la desventaja de que se requiere el
análisis individual de las muestras, aumentando el tiempo
necesario para obtener el resultado y, como consecuencia, una
disminución de la capacidad analítica debido al bajo número de
muestras que pueden ser procesadas diariamente. Recientemente
se han publicado métodos basados en formatos de microplacas
de 96 pozos, que permiten una mayor rapidez y eficiencia para
estas mediciones (Hernández-López and Vargas-Albores, 2003). El
uso de estos métodos aumenta la cantidad de muestras en cada
análisis, debido a la facilidad con que se llevan a cabo, al pequeño
volumen de muestra (200 µL) y reactivos requeridos para la
medición, en comparación con las técnicas tradicionales de
|8|
análisis, las cuales requieren volúmenes cercanos a los 100 mL.
Además, de lo anterior, otra de las ventajas de las técnicas de
análisis basadas en microplaca, es la posibilidad de medir 96
muestras simultáneamente, lo cual permite ahorrar tiempo y
reduce la tasa de error de una manera significativa.
|9|
1.3 E ST ADO FI SI OL Ó GI C O
El buen funcionamiento fisiológico incide directamente en el
crecimiento eficiente de los organismos en cultivo. El sistema
circulatorio es el que se encarga de transportar todos los
materiales tanto nutritivos como de desecho. Debido a lo anterior,
existen algunos compuestos en la sangre de los organismos que
pueden reflejar, de manera eficiente, alteraciones en la condición
fisiológica o nutricional. Por ejemplo, el aumento en la
concentración de lactato y glucosa en la sangre puede sugerir un
estado de estrés de los animales (Racotta and Hernández-Herrera,
2000), lo que los predispone a ser afectados por patógenos,
incluso por aquellos llamados oportunistas, que en condiciones
normales no les producirían ningún daño. Por otra parte, la
disminución en la concentración de proteínas totales, colesterol o
acilglicéridos, comúnmente puede reflejar una deficiencia en el
estado nutricional (Rosas et al., 2000; Rosas et al., 2001).
| 10 |
1.4 E ST ADO I NM UNE
El objetivo fundamental del sistema de defensa en cualquier
organismo vivo, es vigilar y mantener la integridad biológica
individual, de tal forma que le sea posible discriminar entre lo
“propio” y lo “extraño”. Al detectar algo “no propio” y eliminarlo,
permite el equilibrio homeostático. El sistema inmune de los
organismos invertebrados presenta estrategias de defensa tan
eficientes como las que se observan en los vertebrados. Existen
diferentes grados de semejanza, que van desde la presencia de
moléculas como las inmunoglobulinas y el sistema del
complemento en los peces (Magnadottir, 2010; Nayak, 2010);
hasta elementos que no se parecen en nada a los anticuerpos, pero
que actúan de manera semejante, como las moléculas de
reconocimiento (Vargas-Albores et al., 1998a) y las lectinas (Wang
et al., 2009; Xu et al., 2010) en la hemolinfa de los crustáceos y
moluscos. Se han reportado también, los sistemas enzimáticos
responsables directos del daño a patógenos como el sistema de
coagulación (Maningas et al., 2008; Perazzolo et al., 2005) y el
sistema de la profenoloxidasa (proFO), responsable de la
melanización (Gollas-Galván et al., 1997; Hernández-López et al.,
1996). Una de las semejanzas más notorias es que las células
responsables de los procesos de fagocitosis y destrucción de
patógenos se encuentran circulando en el torrente sanguíneo
tanto de vertebrados (leucocitos) como en invertebrados
(hemocitos), incluyendo los crustáceos y de moluscos.
Aunque los sistemas de defensa en invertebrados son más

complejos de lo que parecen, actualmente se pueden medir
algunas actividades enzimáticas, o la concentración de algunas
moléculas involucradas en el mantenimiento de la integridad
biológica individual. Para estas mediciones, existen métodos que
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permiten la vigilancia eficiente del estado inmune de los
organismos en cultivo. En este manual se presentan técnicas que
usan volúmenes pequeños de muestra y reactivos, basadas en un
formato de microplacas de 96 pozos.
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2
2 M É TODOS PARA DE TE RMINAR
C ALIDAD Q UÍMICA DE L A GU A
Debido a que el agua es el elemento principal en la acuicultura, la

calidad de la misma es crucial para la supervivencia y buen
desarrollo de los organismos cultivados.
La calidad del agua es uno de los principales factores limitantes

de los sistemas de cultivo, ya que al ser ésta considerada como
solvente universal, puede contaminarse con sustancias externas a
los sistemas acuáticos, como pesticidas, aceites, aguas residuales
y otros xenobióticos, o bien, pueden concentrarse los productos
de desecho metabólicos de todos los organismos existentes en
ambiente acuático incluyendo bacterias, las cuales proliferan
gracias a la acumulación de materia orgánica en la columna de
agua y sedimento, generando un ambiente estresante para los
individuos que viven en el ecosistema. Por lo anterior, en la
acuicultura es importante la vigilancia de todos los metabolitos y
compuestos tóxicos presentes en el agua en aras de asegurar la
supervivencia de los organismos cultivados.
Uno de los componentes más importantes para la vida de los

organismos acuáticos es el oxígeno disuelto, el cual puede variar
dependiendo de factores fisicoquímicos y biológicos como la
temperatura, profundidad, salinidad, turbidez, y productividad
primaria; este último considerado como la principal fuente de
producción de oxígeno. El agua también tiene una gran variedad
de iones que deben mantenerse en equilibrio para el buen
comportamiento del sistema. Sin embargo, las condiciones en que
se mantienen los estanques o unidades de cultivo conllevan la
generación de una gran cantidad de compuestos nitrogenados,
que, en determinadas concentraciones, pueden ser nocivos para
la salud de los organismos cultivados.
Los sistemas acuícolas reciben una gran cantidad de nitrógeno y

fósforo; ya sea por adición de alimento o por medio de
fertilización. En comparación con otros nutrientes, los niveles de
nitrógeno y fósforo son los limitantes más importantes para el
crecimiento de fitoplancton, el cual representa una fuente de
alimento para postlarvas al inicio del cultivo; por lo que los
estanques usualmente se fertilizan para contrarrestar la falta
natural de nitrógeno y fósforo.
Por otra parte, los peces y crustáceos son amoniotélicos, es decir

que hasta un 90% de los catabolitos nitrogenados resultan ser el
nitrógeno presente en la materia orgánica (nitrógeno orgánico) se
convierte en amonio, mientras las bacterias descomponen la
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Tabla 1. Porcentaje de NH3 (amonio no ionizado) en diferentes escenarios de
temperatura y pH.
pH
Temp°C 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0
5 0.01 0.04 0.12 0.39 1.2 3.8 11 28 56
10 0.02 0.06 0.19 0.59 1.8 5.6 16 37 65
15 0.03 0.09 0.27 0.86 2.7 8.0 21 46 73
20 0.04 0.13 0.40 1.2 3.8 11 28 56 80
25 0.06 0.18 0.57 1.8 5.4 15 36 64 85
30 0.08 0.25 0.80 2.5 7.5 20 45 72 89
materia orgánica. El amonio, presente naturalmente en el agua,

puede convertirse en nitrato al ser nitrificado por las bacterias.
La forma no disociada del amonio es el amoniaco (NH 3) que

produce hinchazón en las branquias de los organismos acuáticos,
cuyas láminas se pegan provocando asfixia. Por su parte el amonio
(NH4+) es hasta 100 veces menos tóxico que el NH3 y su presencia
depende en gran medida del pH y la temperatura del agua,
mientras más bajo sea el pH y la temperatura, la forma química de
este compuesto en el agua será en su mayor parte NH4+ (Tabla 1).
A pesar de la poca información sobre la toxicidad de los nitratos

(NO3) en los camarones, se ha reportado que en P. monodon las
dosis letales (LD50) a 96 horas varían de 37.71 a 54.76 ppm de
Nitrógeno como NO3 (Chen and Lei, 1990). Por otro lado, Lin y cols.
(2003) demostraron que cuando la salinidad decrece de 3.5 a 1.5%,
la toxicidad de NO3 para L. vannamei aumenta 421% después de
una exposición de 96 horas.
Otro compuesto importante presente en el agua es el fósforo, el

cual entra a los estanques, en forma de fosfato inorgánico disuelto
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y en materia orgánica. Aunque el suelo puede liberar fosfato, la
concentración natural es baja y se encuentra en formas muy poco
solubles por lo que prácticamente no está disponible para los
organismos del estanque. Así, los alimentos y fertilizantes son las
principales fuentes de fósforo el cual debe ser aplicado
continuamente para mantener la cantidad requerida de
fitoplancton en el estanque. No obstante, una sobre fertilización
o un exceso de alimento puede generar una excesiva
concentración de fósforo en el agua y un exceso de fitoplancton,
con la consecuente disminución de oxígeno por las noches. Esto
no debería ser problema para aquellas granjas que cuentan con
adecuados sistemas de aireación; pero podría haber repercusiones
catastróficas para aquellas que cuentan con sistemas de aireación
limitados o no cuentan con alguno.
La presencia de compuestos azufrados es otro problema

recurrente en sistemas acuícolas; en particular el ácido
sulfhídrico, el cual es un gas tóxico producto de la
descomposición de materia orgánica en condiciones anaeróbicas.
Esto ocurre en sistemas con capacidad aireación inadecuada o con
Figura 6. Comportamiento químico del sulfuro de hidrógeno, respecto al pH.
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exceso de sedimentos. El ácido sulfhídrico es mucho más tóxico
en su forma no ionizada, la cual se detecta usualmente cuando los
niveles del pH son bajos (Figura 6); sin embargo, a pH alcalino el
ácido sulfhídrico pierde un hidrógeno convirtiéndose en
bisulfuro, el cual es mucho menos tóxico.
La demanda bioquímica de oxígeno (DBO), que indica la tasa de

consumo de oxígeno en el estanque por todos los organismos
vivos presentes, desde bacterias hasta los camarones en cultivo,
es otro parámetro importante a evaluar. Ha sido considerado un
indicador del estrés ambiental para los organismos en cultivo;
valores altos de DBO pueden indicar un desequilibrio en el ciclo
del oxígeno y por lo tanto los niveles de la columna de agua
pueden disminuir drásticamente. La DBO de cinco días (DBO5) por
ejemplo, es la cantidad de oxígeno disuelto que requerirían todos
los organismos biológicos aerobios presentes en la columna de
agua para descomponer la materia orgánica del sistema a una
temperatura constante durante un período de cinco días.
La alcalinidad es un factor relevante en los sistemas acuícolas que

indica la capacidad amortiguadora del agua dada por la presencia
de carbonatos y bicarbonatos. El comportamiento de la
productividad primaria y pH pueden verse influenciados por la
alcalinidad. Una adecuada alcalinidad puede evitar cambios
drásticos en el pH, manteniendo un equilibrio en el medio de
cultivo. La alcalinidad total, usualmente se expresa como
miligramos de carbonato de calcio (CaCO3) por litro de agua.
La dureza es también un parámetro importante, que tiene cierta

relación con la alcalinidad, ya que ésta se calcula con base en la
concentración de calcio y magnesio en el agua. Aguas con alto
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Tabla 2. Concentraciones seguras de nutrientes en agua para el cultivo de
algunos camarones peneidos, peces de agua dulce y marina.
Peces de agua Peces de agua

Parámetro Camarones
dulce marina
Oxígeno 5-7 mg/L 5-7 mg/L 4-7 mg/L

pH 7a9 6.5-7.0 7.5-8.5
Amonio ionizado 0.2 a 2 mg/L <0.04 mg/L <0.04 mg/L
Amonio no ionizado <0.1 mg/L <1.0 mg/L <0.5 mg/L
Nitratos 0.2 a 10 mg/L <150 mg/L
Nitritos <0.23 mg/L <1 mg/L <1 mg/L

Fosfatos 0.005-0.2 mg/L
Ácido sulfhídrico 0 mg/L 0 mg/L 0 mg/L
Demanda bioquímica
<50 mg/L <50 mg/L
de oxígeno
Alcalinidad 50-300 mg/L
Dureza 150-300 mg/L 150-300 mg/L 40-400 mg/L
grado de dureza tienen la capacidad de amortiguar el efecto de

compuestos tóxicos para peces y crustáceos como cobre y zinc.
Debido al peligro de toxicidad que puede tener el exceso de

nutrientes en el agua, es necesario mantener un equilibrio iónico
en los estanques y medir las concentraciones de estos
compuestos, tratando de mantener los intervalos de
concentraciones seguras para los organismos acuáticos. Los
valores de algunos componentes, para el cultivo de camarones y
peces, se enlistan en la Tabla 2 (Boyd and Massaut, 1999).
| 18 |
2.1 C U AN TI FI C ACI ÓN DE N I T RI TOS E N AGU A M ARI N A
La detección de nitritos en agua de mar se realiza mediante una
reacción acoplada. En solución ácida, los nitritos son convertidos
en ácido nitroso (HNO2) el cual diazotiza con sulfanilamida. Esta
sal de sulfanilamida-diazonium reacciona posteriormente con N-
(1-Naphthyl)-ethylenediamina para producir un cromóforo que se
mide a 540 nm, de acuerdo a (Bendschneder and Robinson, 1952)
(Figura 7).
2.1.1 P REPARACIÓN DE REACTIVOS

Reactivo A:
Disolver 0.5 g de sulfanilamida en una mezcla de 5 mL de
ácido clorhídrico concentrado y 30 mL de agua desionizada,
aforar a 50 mL con agua desionizada. Esta solución es estable
durante varios meses.
Figura 7. Reacción de Griess para la detección y cuantificación de nitritos
| 19 |
Nota: Se debe tener precaución de mezclar el ácido clorhídrico vertiéndolo lentamente
en un recipiente conteniendo los 30 mL de agua, la reacción es exotérmica y el
recipiente puede calentarse por lo que debe tenerse cuidado al manejarlo.
Hacerlo de forma inversa produce una reacción térmica violenta que puede ser
explosiva.
Reactivo B:
Disolver 0.05 g de N-(1-naphtyl)-ethylenediamine
dihydrochloride en 50 mL de agua desionizada. Se debe
almacenar en recipiente oscuro y preparar nueva solución si
se aprecia un color café oscuro.
Reactivo Único para NO2:

Mezclar los reactivos A y B a partes iguales (50/50). Se debe
almacenar en recipiente oscuro.
Solución estándar para NO2:

Disolver 15 mg de nitrito de sodio (NaNO2), previamente
secado a 110°C durante una hora, en 1 litro de agua
desionizada. Adicionar 1 mL de cloroformo. Se debe
almacenar en recipiente oscuro y es estable
aproximadamente dos meses. La concentración en esta
solución es de 10 ppm de NO2.
2.1.2 C URVA ESTÁNDAR

Debido a las variaciones de las condiciones de cada laboratorio,
así como los diferentes proveedores de materiales y reactivos,
cada laboratorio debe realizar una curva estándar propia para
cada compuesto que va a analizar. Se debe señalar la importancia
| 20 |
Tabla 3. Diluciones seriadas para la preparación de la curva estándar de nitritos
(NO2). Después de la preparación de cada dilución, agitar para homogenizar
perfectamente antes de preparar la siguiente.
Tubo Volumen de solución madre Agua destilada (µL)

10 ppm (µL)
1 200 400
2 300 del tubo 1 300
3 300 del tubo 2 300
4 300 del tubo 3 300
5 300 del tubo 4 300
6 300 del tubo 5 300
7 300 del tubo 6 300
8 300 del tubo 7 300
9 300 del tubo 8 300
Blanco 0 400
de la preparación y conservación de la solución patrón o de

referencia. Especial atención con las condiciones de
almacenamiento y la caducidad. Por último, en caso de utilizar un
nuevo lote de reactivos por consumo o cambio de proveedor,
deberá realizarse una nueva curva patrón.
2.1.2.1 P R E P A R A C I Ó N DE DI L U CI O NE S
Realizar diluciones seriadas 1:2, a partir de la solución madre (10
ppm de NO2). Si se requiere hacer por triplicado cada punto,
preparar tres veces más el volumen de cada dilución El
procedimiento se muestra en la Tabla 3 y Figura 8.
| 21 |
Figura 8. Preparación de las diluciones para curva estándar
2.1.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A C U R V A
Para elaborar la curva estándar, en una hilera de pozos de la
microplaca, se colocan 200 µl de cada dilución del estándar y se
sigue el procedimiento descrito más adelante. Las
concentraciones en cada dilución se indican en la Tabla 4 y la
curva estándar debe ser similar a la que se muestra en la Figura 9.
Tabla 4. Preparación de la curva estándar para la determinación de la

concentración de nitritos en muestras de agua.
Pozo 200 µL del Concentración de

estándar de NO2 (ppm)
NO2
Tubo
1 1 3.300
2 2 1.650
3 3 0.825
4 4 0.413
5 5 0.206
6 6 0.103
7 7 0.052
8 8 0.026
9 9 0.013
10 Blanco 0.000
Nota: Incubación 10 min,. Leer a 550 nm.
| 22 |
2.1.3 P ROCEDIMIENTO
1. Colocar 200 µL de muestra.
2. Adicionar 20 µL de Reactivo único para NO2
3. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
(El color es estable hasta por 2 horas).
4. Leer la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas.
2.1.4 C ÁLCULOS
La concentración de nitritos se determina interpolando el valor de
la densidad óptica de la muestra, en la curva patrón realizada con
una solución estándar. Para esta reacción la linealidad se observa
entre 0.013 y 3.3 ppm (Figura 9).
Alternativamente, la concentración puede ser calculada al dividir

la densidad óptica de la muestra entre la pendiente de la curva
patrón (figura 9):
𝑨𝟓𝟓𝟎𝒏𝒎
[𝐍𝐢𝐭𝐫𝐢𝐭𝐨𝐬]𝒑𝒑𝒎 =
𝟎. 𝟑𝟕𝟗𝟐
Figura 9: Curva patrón de nitritos. Linealidad entre 0.013 y 3.3 ppm.
| 23 |
2.2 C U AN TI FI C ACI ÓN DE N I T R ATOS (M É TODO DE L A
H I DR ACI N A )
Para la determinación de nitratos en agua de mar se han
propuesto varios métodos, pero en todos ellos es necesaria la
reducción de los NO3 a NO2. Una vez reducidos los nitratos, la
concentración de nitritos se determina colorimétricamente a 550
nm por diazotización con sulfanilamida acoplada con N-(1-naftil)-
etilendiamina, de acuerdo a Bendschneder (1952) (Figura 10). La
concentración de nitratos se calcula restando al valor obtenido en
esta prueba del valor obtenido en la cuantificación de NO2.
La reacción central es la transformación de nitrato (NO3) a nitrito

(NO2), a través de una reducción que puede ser por cualquiera de
los tres métodos: a) Por hidracina y cobre, b) Usando una columna
reductora de cadmio (Cd) activada con cobre (Wood et al., 1967) y
c) La reducción enzimática, utilizando nitrato reductasa.
En este manual se describe el método de cuantificación de

nitratos, que utiliza hidracina y cobre para realizar la reducción a
nitritos.
Figura 10: Reacción de Griess para la detección y cuantificación de nitratos

(previa reducción de nitratos a nitritos). Modificado de Tarpey (2004).
| 24 |
2.2.1 P REPARACIÓN DE R EACTIVOS
Solución 1:
Disolver 0.1 g de sulfato cúprico pentahidratado en agua
destilada y aforar a 1 litro.
Solución 2:
Disolver 3.625 g de sulfato de hidracina en 500 mL de agua
destilada.
Solución 3:
Disolver 1.42 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.
Solución 4:
Preparar fenol en proporción de 1:20 con agua destilada
(1 mL de fenol + 19 mL de agua).
Solución 5:
Acetona comercial.
Solución de Referencia
Preparación de solución estándar para NO3: Disolver 16.3 mg
de nitrato de potasio (KNO3), en 1 L de agua desionizada para
obtener una solución de 10 ppm de NO3 con linealidad entre
0.19 y 1.5 ppm.
2.2.2 C URVA E STÁNDAR

Es necesario llevar a cabo la preparación de una curva estándar,
para el cálculo de la concentración de nitratos en una muestra. Es
posible utilizar la curva que se proporciona (Figura 5); sin
embargo, las condiciones de cada lugar pueden variar, por lo que
| 25 |
Tabla 5. Diluciones seriadas para la preparación de la curva estándar de
nitratos (NO3).
Solución madre Agua Concentración

Tubo 10 ppm (µL) destilada (µL) de NO3 (ppm)
1 150 750 1.600
2 300 del tubo 1 300 0.800
3 300 del tubo 2 300 0.400
4 300 del tubo 3 300 0.200
5 300 del tubo 4 300 0.100
6 0 400 0.000
NOTA: Si se requiere hacer por triplicado cada punto, preparar tres veces más volumen
de cada dilución.
es recomendable hacer una curva para cada laboratorio en el que

se pretenda utilizar este método.
Realizar diluciones seriadas en base 2, a partir de la solución
madre, la cual debe contener 10 ppm de NO3. El procedimiento se
muestra en la Tabla 5.
Colocar en una microplaca, los volúmenes de cada dilución del
estándar y agregar los reactivos, como se indica en la Tabla 6. La
curva estándar debe ser similar a la que se muestra en la Figura
11.
| 26 |
1. Colocar 200 µL de muestra en una microplaca.
2. Agregar 5 µL de solución 1.
3. Agregar 5 µL de solución 2
5. Agregar 5 µL de solución 4.
7. Incubar 5 min a temperatura ambiente (25-28°C)
8. Agregar 10 µL de Reactivo único para NO2 (preparado
como se indicó en la técnica de nitritos).
9. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min
10.Leer la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas.
2.2.4 C ÁLCULOS
La concentración de nitratos se determina realizando una curva
patrón con nitrato de potasio (KNO3).

concentración de nitratos en muestras de agua.
Dilución de
Agua Reactivo
Incubar
dest. Sol. 1 Sol. 2 Sol. 3 Sol. 4 Sol. 5 único

NO3
(µL) (µL) (µL) (µL) (µL) (µL) NO3 (µL)
Pozo
Incubación 5 min 25
1 200 0 5 5 5 5 5 20
2 200 0 5 5 5 5 5 20
3 200 0 5 5 5 5 5 20
± 2°C
4 200 0 5 5 5 5 5 20
5 200 0 5 5 5 5 5 20
6 0 200 5 5 5 5 5 20
Nota: Leer a 550 nm.
| 27 |
Figura 11: Curva patrón de nitratos (NO3). Linealidad entre 0.19 y 1.5 ppm
La concentración se calcula, de acuerdo a la ecuación obtenida en

la curva patrón, de la siguiente forma:
𝑨𝟓𝟓𝟎𝒏𝒎
[𝐍𝐢𝐭𝐫𝐚𝐭𝐨𝐬]𝒑𝒑𝒎 =
𝟎. 𝟑𝟕𝟗𝟐
| 28 |
2.3 M E DI CI ÓN DE AM ONI O E N AGU A M AR I N A
ADA PT AC I ÓN DE S OL ÓR ZANO (1969).
El método se basa en la generación de un compuesto coloreado
llamado indofenol, que se forma por la oxidación de nitrógeno
amoniacal presente en la muestra. El indofenol tiene un color azul
intenso y la intensidad del color desarrollado es proporcional a la
cantidad de amoniaco presente en la muestra inicial (Figura 12).
El color se mide a una longitud de onda de 655 nm. En esta prueba
el pH alcalino de la reacción asegura que todo el amonio se
encuentre como amoniaco por lo que el resultado indica la
concentración total de nitrógeno amoniacal.
Figura 12. Formación de indofenol para la determinación de amonio en agua

marina.

Reactivo A:
Disolver 10 g de fenol grado reactivo, en 100 mL de etanol
95%.
| 29 |
Reactivo B:
Disolver 0.5 g de nitroprusiato de sodio Na2[Fe(CN)5NO].2H2O
en 100 mL de agua desionizada. Almacenar en recipiente
oscuro.
Reactivo C (mezcla oxidante):

Mezclar 10 mL de solución alcalina (10 g de citrato de sodio +
0.5 g de hidróxido de sodio en 50 mL de agua desionizada)
con 2.5 mL de hipoclorito de sodio comercial. Esta solución
debe prepararse en el momento de su uso y mantener tapada
mientras no se esté utilizando.
Solución estándar para NH4

Disolver 36.7 mg de sulfato de amonio, (NH4)2SO4, en 1 L de
agua desionizada. La concentración en esta solución es de 10
ppm de NH4. Linealidad 0.004 y 0.27 ppm (Figura 13).

Para determinar la concentración de amonio en una muestra es
necesario establecer una curva estándar o de referencia, la cual
deberá ser similar a la Figura 13. Debido a que las condiciones de
cada laboratorio son diferentes e incluso pueden variar las marcas
de los reactivos, por lo que cada laboratorio debe realizar su curva
para el método, y una nueva, cada vez que cambien de reactivos.
madre, la cual debe contener 10 ppm de NH4. El procedimiento se
muestra en la Tabla 7.
| 30 |
amonio (NH4).
Tubo Solución madre Agua Concentración

10 ppm (µL) destilada (µL) de NH4 (ppm)
1 20 680 0.286
2 300 del tubo 1 300 0.143
3 300 del tubo 2 300 0.071
4 300 del tubo 3 300 0.036
5 300 del tubo 4 300 0.018
6 300 del tubo 5 300 0.009
7 300 del tubo 6 300 0.004
8 0 400 0.000
Nota: Si se requiere hacer por triplicado cada punto, preparar tres veces más volumen
de cada dilución.
2.3.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A CU R V A

concentración de amonio en muestras de agua. Volúmenes en µL.
Pozo Cada concentración Agua Reactivo Reactivo Reactivo

de NH4 destilada A B C
1 200 0 20 20 30
2 200 0 20 20 30
3 200 0 20 20 30
4 200 0 20 20 30
5 200 0 20 20 30
6 200 0 20 20 30
7 200 0 20 20 30
8 0 200 20 20 30
Incubación 60 min25 ± 2°C
| 31 |
1. Colocar 200 µL de muestra.
2. Adicionar 20 µL de Reactivo A en una microplaca.
3. Adicionar 20 µL de Reactivo B y 30 µl de Reactivo C.
4. Incubar durante 1 hora y leer absorbancia a 655nm.
2.3.4 C ÁLCULOS
La concentración de amonio se determina realizando una curva
patrón con (NH4)2SO4, Linealidad entre .0.004 y 0.27 ppm.

𝐴655 𝑛𝑚
[𝐀𝐦𝐨𝐧𝐢𝐨]𝑝𝑝𝑚 =
𝟑. 𝟒𝟓𝟖
Figura 13 Curva patrón de amonio (NH4). Linealidad entre 0.004 y 0.27 ppm.
| 32 |
2.4 M E DI CI ÓN DE FÓSFOR O E N AGU A M AR I N A
El fósforo inorgánico disuelto se encuentra en el agua de mar
generalmente como ion ortofosfato (HPO42- y PO43-). El método
propuesto por Murphy (1962), ha sido uno de los más
convenientes debido a su rapidez y facilidad. En este método, se
genera un complejo fosfo-molibdato por la interacción entre el
molibdato de amonio y los ortofosfatos, en presencia de
antimonio. Este complejo es reducido posteriormente con ácido
ascórbico para formar un compuesto azul con un máximo de
absorbancia a 665 nm. El compuesto azul contiene fósforo,
molibdato y antimonio en proporciones 1:12:1, su densidad óptica
es independiente de la salinidad y sigue la ley de Beer-Lambert.
Aunque los iones de arseniato, pueden interferir, dicha
interferencia se considera insignificante debido a que estos iones
son escasos en el agua de mar y la formación del complejo
arsénico-molibdato es lenta.
Un problema que merece mayor atención es la adsorción de los

fosfatos en las paredes de recipientes de polietileno, por lo que se
recomienda tomar y almacenar la muestra en recipientes de
vidrio. Los recipientes de polietileno pueden ser usados, pero el
análisis debe ser realizado antes de 2 horas después de tomada la
muestra.

Solución A: Pesar 1.5 g de heptamolibdato de amonio
[(NH4)6Mo7O24.4H2O] y disolverlo en 50 mL de agua desionizada.
Almacenar en recipiente de plástico.
| 33 |
Solución B: Colocar 14 mL de ácido sulfúrico concentrado
(densidad=1.82) en 90 mL de agua desionizada y permitir
que la mezcla se enfríe. Almacenar en recipiente de vidrio.
NOTA: Se debe tener precaución de mezclar el ácido sulfúrico vertiéndolo lentamente

en un recipiente conteniendo los 90 mL de agua, la reacción es exotérmica y el
recipiente puede calentarse por lo que debe tenerse cuidado al manejarlo.
Hacerlo de forma inversa produce una reacción térmica violenta que puede ser
explosiva.
Solución C: Disolver 2.7 g de ácido ascórbico en 50 mL de agua

desionizada.
Solución D: Disolver 0.034 g de tartrato de antimonio y potasio en

25 mL de agua desionizada. Almacenar en recipiente de plástico.
MEZCLA REACTIVA: Mezclar 10 mL de solución A con 25 mL de

solución B, 10 mL de solución C y 5 mL de solución D. Esta mezcla
es estable por varios meses.
Solución estándar para PO4:

Disolver 14.3 mg de fosfato monobásico de potasio KH2PO4,
en 1000 mL de agua desionizada. La concentración en esta
solución es de 10 ppm de PO4.

El método requiere de la preparación de una curva estándar, para
el cálculo de la concentración de fosfatos en una muestra. Es
posible utilizar la curva que se proporciona (Figura 8); sin
embargo, las condiciones de cada lugar pueden llegar a variar, por
lo que es recomendable hacer una curva para cada laboratorio en
el que se pretenda utilizar éste método.
| 34 |
fosfatos (PO4).
Tubo µL de Solución µL de agua ppm de PO4

madre 10 ppm destilada
1 150 900 2.000
2 300 del tubo 1 300 1.000
3 300 del tubo 2 300 0.500
4 300 del tubo 3 300 0.250
5 300 del tubo 4 300 0.125
6 300 del tubo 5 300 0.063
7 300 del tubo 6 300 0.031
8 0 400 0.000
NOTA: Si se requiere hacer por triplicado cada punto, preparar tres veces más volumen
de cada dilución.
madre, la cual debe contener 10 ppm de NH4. Linealidad 0.055 y
1.7 ppm (Figura 14). El procedimiento se muestra en la Tabla 9.
2.4.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A CU R V A
1. Colocar 30 µL de mezcla reactiva en una microplaca.
2. Adicionar 200 µL de muestra.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. (el color
es estable hasta 2 horas).
4. Leer la absorbancia a 655 nm en un lector de microplacas.
| 35 |
concentración de fosfatos en muestras de agua. Volúmenes en µL
Pozo Cada concentración Agua Mezcla

de PO4 destilada Reactiva
1 200 0 30
2 200 0 30
3 200 0 30
4 200 0 30
5 200 0 30
6 200 0 30
7 200 0 30
8 0 200 30
Incubación 10 min; 25°C
2.4.4 C ÁLCULOS
La concentración de fosfatos se determina realizando una curva
patrón con KH2PO4, Linealidad entre 0.055 y 1.7 ppm.
Figura 14: Curva patrón de fosfatos (PO4). Linealidad entre 0.055 y 1.7 ppm
| 36 |
𝑨655 𝑛𝑚
[𝑭𝒐𝒔𝒕𝒂𝒕𝒐𝒔]𝑝𝑝𝑚 =
𝟎. 𝟏𝟎𝟑𝟗
| 37 |
3
3 E VALUACIÓN DE L E STADO
F ISIOLÓGICO Y N U TRICIONAL
La buena condición fisiológica de cualquier organismo vivo,

incluyendo los acuáticos, es fundamental para mantener un
estado de salud aceptable, lo que también se refleja en una alta
tasa de supervivencia.
Las modificaciones en las concentraciones plasmáticas de

metabolitos como glucosa, colesterol y acilglicéridos, entre otros,
han sido muy estudiados en humanos y, la medición de la
concentración de estos marcadores plasmáticos, constituye en la
actualidad, una herramienta para conocer el estado de salud de
los animales.
En relación a la acuicultura, estos marcadores han sido utilizados

en peces y se han relacionado con la salud de los organismos en
cultivo (Machado et al., 1988; Morata et al., 1982; Segner and
Braunbeck, 1988; Shimeno et al., 1990). Aunque en peces los
parámetros hemáticos han sido usados como marcadores de
estrés y deficiencias nutricionales, en crustáceos su significado
aún no está del todo comprendido.
Los parámetros plasmáticos en camarón han sido utilizados como

indicadores del estado fisiológico o sus modificaciones por dietas,
muda y reproducción (Chan et al., 1988; Hall and Van, 1998;
Racotta and Hernández-Herrera, 2000; Rosas et al., 1992). En
épocas más recientes, se han utilizado kits comerciales para
cuantificar la concentración de glucosa, lactato, colesterol y
acilglicéridos en el plasma del camarón, ya que estos métodos son
prácticos, rápidos y sensibles.
Los organismos constantemente sometidos a un ambiente

estresante, deben poseer mecanismos para hacer frente a los
factores que puedan tener consecuencias adversas para su
desarrollo; por ejemplo, generalmente durante la muda los
organismos se mantienen en ayunas y esto genera una
disminución en las concentraciones plasmáticas y en el
hepatopáncreas de glucosa, acilglicéridos y colesterol (Sánchez-
Paz et al., 2007). En los crustáceos, la concentración total de
proteína ha resultado ser un buen parámetro como indicador de
deficiencia nutricional producida por ayuno (Akiyama et al., 1989;
Cuzon et al., 1980; Ferraris et al., 1986; Stuck et al., 1996). La
concentración de proteína también ha sido usada como indicador
del estado fisiológico de organismos bajo ciertos estados de
desarrollo como muda (Chan et al., 1988; Ferraris et al., 1986) y
vitelogénesis (Shafir et al., 1992). También se ha utilizado como
indicador de estrés; por ejemplo, en condiciones extremas como
altas concentraciones de amonio (Chen and Cheng, 1995) o por
| 40 |
ablación del pedúnculo ocular (Quackenbush, 1989) se observa
una disminución en la concentración plasmática de proteína total
(Racotta and Palacios, 1998).
El colesterol en crustáceos es precursor de hormonas esteroides

y, en la membrana celular, tiene funciones estructurales, de
permeabilidad y de transporte. Este metabolito no puede ser
sintetizado por los crustáceos y debe ser suministrado en la dieta
(Akiyama et al., 1989).
La glucosa, al igual que en los mamíferos (Ganong, 1982), es el

carbohidrato más abundante en el plasma de los invertebrados y
su concentración está relacionada con la tasa metabólica, pero su
concentración es más baja que en humanos (1-1.2 mg/mL).
Aunque pueden presentarse variaciones importantes en algunas
condiciones fisiológicas, como la muda (Urich, 1994), la
concentración de glucosa en hemolinfa ha sido propuesta como
un indicador del estado nutricional (Hall and Van, 1998) o de
estrés causado por distintos factores tales como hipoxia, (Hall and
Van, 1998), manejo (Racotta and Palacios, 1998), ayuno (Cuzon et
al., 1980) y exposición a pesticidas (Reddy and Rao, 1991).
El principal producto final del metabolismo anaeróbico de la

glucosa es el lactato (Müller et al., 2012). Cuando el tejido no
cuenta con suficiente oxígeno para soportar la oxidación de
piruvato y NADH producido en glicólisis, el NADH es regenerado
del NADH producido por la reacción de piruvato a lactato. El
aumento en la concentración de lactato en sangre es un indicador
del metabolismo anaeróbico. En los organismos acuáticos, el
lactato puede servir como un indicador de estrés (Racotta and
Palacios, 1998).
| 41 |
Los métodos descritos en este manual pueden ser usados
indistintamente en plasma de crustáceos moluscos o peces.
| 42 |
3.1 M E DI CI ÓN DE PROTE ÍN AS TOT ALE S E N PL ASM A
( M É TO DO DE L BIURE T )
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar
mediante la reacción del biuret. El método descrito aquí utiliza el
kit para proteínas totales en suero o plasma (TP 245) de RANDOX.
El reactivo de biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina
(de NaOH o KOH). La reacción se basa en la generación de un
compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo
de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. La
reacción de biuret la producen los péptidos y las proteínas, pero
no los aminoácidos, ya que se requiere la presencia del enlace
peptídico (Figura 15).

Solución Reactiva de biuret: La solución de biuret ya viene
preparada en el kit comercial y lista para usarse. Es posible
preparar una en el laboratorio; sin embargo, esto lleva tiempo y
será necesario llevar a cabo estandarizaciones cada vez que se
prepara el reactivo.
Figura 15. Formación de compuesto violeta para la determinación de proteínas

en suero de animales en cultivo.
| 43 |
3.1.2 C URVA ESTÁNDAR
madre, la cual debe contener 60 mg/mL de proteína. El
procedimiento se muestra en la Tabla 11.
1. Colocar 10 µL de plasma o suero en una microplaca.
2. Adicionar 200 µL de reactivo de biuret e incubar durante
10 min a temperatura ambiente (25-28°C).
3. Leer la absorbancia a 550 nm.

proteína total.
Tubo Volumen de solución Agua destilada Concentración de

estándar (µL) proteína
(µL) (mg/mL)
1 400 400 30.000
2 300 del tubo 1 300 15.000
3 300 del tubo 2 300 7.500
4 300 del tubo 3 300 3.750
5 300 del tubo 4 300 1.875
6 300 del tubo 5 300 0.938
7 0 400 0.000
de cada dilución.
| 44 |
concentración de proteína total en muestras de hemolinfa.
Dilución de Agua Reactivo de

Pozo
proteína (µL) destilada (µL) biuret (µL)
1 10 0 200
2 10 0 200
3 10 0 200
4 10 0 200
5 10 0 200
6 10 0 200
7 0 10 200
Incubación 10 min; 25°C
3.1.4 C ÁLCULOS
La concentración de proteínas totales se determina realizando
una curva patrón utilizando el estándar contenido en el kit
comercial, Linealidad entre 0.9 y 30 mg/mL.
Figura 16: Curva patrón de proteína. Linealidad entre 0.9 y 30 mg/mL
| 45 |
La concentración se calcula, de acuerdo a la ecuación obtenida en la curva
patrón, de la siguiente forma:
𝑨550 nm
𝐏𝐫𝐨𝐭𝐞í𝐧𝐚 (mg/mL) =
𝟎. 𝟎𝟎𝟖𝟑
| 46 |
3.2 M E DI CI ÓN DE GLUC OS A E N PL ASM A
La descripción en este manual se refiere al kit GLUCOSA
(GOD/PAP) GL2623 de RANDOX. La glucosa se determina después
de una oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El
peróxido de hidrógeno formado reacciona, catalizado por la
peroxidasa, con fenol y 4-aminofenazona para formar un
compuesto llamado quinoneimina de color rojo-violeta (Figura 17).

Solución Reactiva: ya viene preparada en el kit comercial y lista
para usarse.
Contenido de la solución reactiva: Fenol, 4-aminoafenazona,

peroxidasa, glucosa oxidasa, buffer de fosfatos, buffer de MOPS.
Figura 17. Formación de compuesto rojo-violeta para la determinación de

glucosa en hemolinfa de invertebrados o sangre de peces.
| 47 |
glucosa.
Tubo Solución estándar Agua Concentración

de 2 mg/mL destilada de Glucosa
(µL) (µL) (mg/mL)
1 400 400 1.000
2 300 del tubo 1 300 0.500
3 300 del tubo 2 300 0.250
4 300 del tubo 3 300 0.125
5 300 del tubo 4 300 0.063
6 300 del tubo 5 300 0.031
7 300 del tubo 6 300 0.016
8 0 400 0.000
de cada dilución.
madre, la cual debe contener 2 mg/mL de glucosa. El
3.2.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A C U R V A E S TÁ N D A R
| 48 |
concentración de glucosa en muestras de hemolinfa.
Dilución de Agua
Glucosa destilada Reactivo del kit
Pozo
comercial (µL)
(µL) (µL)
1 10 0 200
2 10 0 200
3 10 0 200
4 10 0 200
5 10 0 200
6 10 0 200
7 10 0 200
8 0 10 200
Incubación 30 min; 25°C. Leer a 492 nm.
2. Adicionar 200 µL de solución reactiva para glucosa e

incubar a temperatura ambiente (25-28°C) durante 30 min.
o a 37°C durante 10 min.
3.2.4 C ÁLCULOS
Para determinar la concentración de glucosa es necesario hacer
una curva patrón, utilizando el estándar contenido en el kit
comercial, lo que permite obtener linealidad entre 0.01 y 1
mg/mL.

𝑨490 nm
𝐆𝐥𝐮𝐜𝐨𝐬𝐚 (mg/mL) =
𝟎. 𝟕𝟏𝟒𝟗
| 49 |
Figura 18: Curva patrón de glucosa. Linealidad entre 0.01 y 1 mg/mL
| 50 |
3.3 M E DI CI ÓN DE L AC T AT O
Aunque existen en el mercado varias marcas de kits para la
determinación lactato, la descripción en este manual se refiere al
kit LACTATE (PAP) Enzymatic Determination of Lactate LC2389 de
RANDOX, adaptada para microplaca por Hernández-López (2001).
El lactato es oxidado por la enzima lactato oxidasa del kit,

generando peróxido de hidrógeno, el cual a su vez reacciona con
el 4-aminoantipirina en conjunto con el N-etil-N-(2 hidroxi-3-
sulfopropil) m-toluidina produciendo un complejo de color
púrpura que absorbe a 550 nm. (Figura 19).

Solución Reactiva: Viene preparada en el kit y está lista para
usarse.
Buffer (Vial 1): contiene PIPES, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil) m-

toluidina y azida de sodio.
Figura 19. Formación de producto púrpura para la determinación de lactato

en suero o plasma de animales en cultivo.
| 51 |
lactato.
Solución estándar Agua Concentración

Tubo de lactato destilada de lactato
(µL) (µL) (mg/mL)
1 700 0 0.400
2 300 del tubo 1 300 0.200
3 300 del tubo 2 300 0.100
4 300 del tubo 3 300 0.050
5 300 del tubo 4 300 0.025
6 300 del tubo 5 300 0.013
7 300 del tubo 6 300 0.006
8 300 del tubo 7 300 0.003
9 0 400 0.000
de cada dilución.
Reactivo enzimático (Vial 2): 4-Aminoantipirina, peroxidasa,

lactato oxidasa y ácido ascórbico
Preparación de la solución reactiva: Reconstituir el contenido del

vial 2 con 6 ml del vial 1. Esta solución es estable durante 6 meses
almacenado a 2-8°C.
madre, la cual debe contener 0.4 mg/mL de lactato. El
| 52 |
concentración de lactato en muestras de hemolinfa
Dilución de Agua Solución reactiva

Pozo lactato destilada del kit
(µL) (µL) (µL)
1 10 0 200
2 10 0 200
3 10 0 200
4 10 0 200
5 10 0 200
6 10 0 200
7 10 0 200
8 10 0 200
9 0 10 200
3.3.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A CU R V A E S TÁ N D A R
20.
2. Adicionar 200 µL de solución reactiva para lactato e
| 53 |
3.3.4 C ÁLCULOS
La concentración de lactato se determina realizando una curva
patrón utilizando el estándar contenido en el kit comercial,
Linealidad entre 0.003 y 0.4 mg/mL.

𝑨550 nm
𝐋𝐚𝐜𝐭𝐚𝐭𝐨(mg/mL) =
𝟓. 𝟎𝟎𝟐
Figura 20: Curva patrón de lactato. Linealidad entre 0.003 y 0.4 mg/mL
| 54 |
3.4 M E DI CI ÓN DE C OLE S TE ROL E N PL ASM A
El colesterol se determina después de hidrólisis enzimática y
oxidación de los esteres de colesterol mediante la enzima
colesterol esterasa. El indicador es una quinoneimina se forma a
partir de peróxido de hidrógeno y 4-amino-antipirina en presencia
de fenol y peroxidasa

determinación colesterol, la descripción en este manual se refiere
al kit CH200 (CHOL) de RANDOX (método enzimático de punto
final), adaptada para microplaca por Hernández-López (2001)
(Figura 21).

Solución Reactiva: ya viene preparada en el kit y lista para usarse.
Contenido de la solución reactiva: Fenol, 4-aminoantipirina,

peroxidasa, colesterol oxidasa, colesterol esterasa, PIPES.
Figura 21. Formación de producto rojo-violeta para la determinación de

colesterol en hemolinfa de camarón y sangre de pez.
| 55 |
colesterol.
Solución estándar agua Concentración

Tubo de colesterol destilada de colesterol
(µL) (µL) (mg/mL)
1 700 0 2.000
2 300 del tubo 1 300 1.000
3 300 del tubo 2 300 0.500
4 300 del tubo 3 300 0.250
5 300 del tubo 4 300 0.125
6 300 del tubo 5 300 0.063
7 300 del tubo 6 300 0.031
8 300 del tubo 7 300 0.016
9 300 del tubo 8 300 0.008
10 0 400 0.000
de cada dilución.
madre, la cual debe contener 2 mg/mL de colesterol. El
3.4.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A C U R V A E S TÁ N D A R
22.
| 56 |
concentración de colesterol en muestras de hemolinfa.
Dilución de Agua Solución reactiva

Pozo colesterol destilada del kit
(µL) (µL) (µL)
1 10 0 200
2 10 0 200
3 10 0 200
4 10 0 200
5 10 0 200
6 10 0 200
7 10 0 200
8 10 0 200
9 0 10 200
2. Adicionar 200 µL de solución reactiva para colesterol e
3.4.4 C ÁLCULOS
La concentración de colesterol se determina realizando una curva
patrón utilizando el estándar contenido en el kit comercial.
Linealidad entre 0.06 y 1 g/mL.
| 57 |
𝑨540 𝑛𝑚
𝐂𝐨𝐥𝐞𝐬𝐭𝐞𝐫𝐨𝐥 (mg/mL) =
𝟎. 𝟒𝟕𝟒𝟒
Figura 22: Curva patrón de colesterol. Linealidad entre 0.007 y 2 mg/mL
| 58 |
3.5 M E DI CI ÓN DE ACI L GLI C É RI DOS E N PL ASM A
Los acilglicéridos también juegan un papel importante en la
fisiología de los organismos acuáticos como componentes de la
membrana celular por lo que el aporte adecuado de acilglicéridos
es indispensable en el crecimiento y reproducción. Los
acilglicéridos se determinan a partir de la hidrólisis enzimática
con lipasas. El indicador es una quinoneimina se forma a partir de
peróxido de hidrógeno y 4-amino-antipirina en presencia de fenol
y peroxidasa (Figura 23).

determinación acilglicéridos, la descripción en este manual se
refiere al kit TR210 de RANDOX (método GPO-PAP), adaptada para
microplaca por Hernández-López (2001).

Solución Reactiva: Viene en el kit y está lista para usarse.
Figura 23. Formación de producto rojo-violeta para la determinación de

acilglicéridos en hemolinfa de camarón y sangre de pez.
| 59 |
acilglicéridos.
Solución estándar Agua Concentración de

Tubo de acilglicéridos destilada acilglicéridos
(µL) (µL) (mg/mL)
1 400 400 2.000
2 300 del tubo 1 300 1.000
3 300 del tubo 2 300 0.500
4 300 del tubo 3 300 0.250
5 300 del tubo 4 300 0.125
6 300 del tubo 5 300 0.063
7 300 del tubo 6 300 0.031
8 0 400 0.000
de cada dilución.
Buffer (Vial 1): PIPES, 4-clorofenol y magnesio.
Reactivo enzimático (Vial 2): ATP, 4-aminofenazona, lipasas,

glicerol cinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa y peroxidasa.
Preparación de la solución reactiva: Reconstituir el contenido del

vial 2 con 15 ml del vial 1. Esta solución es estable durante 21 días
almacenado a 2-8°C.
madre, la cual debe contener 2 mg/mL de acilglicéridos. El
| 60 |
concentración de acilglicéridos en muestras de hemolinfa.
Dilución de Agua Solución

Pozo acilglicéridos destilada reactiva del kit
(µL) (µL) (µL)
1 10 0 200
2 10 0 200
3 10 0 200
4 10 0 200
5 10 0 200
6 10 0 200
7 10 0 200
8 0 10 200
3.5.2.2 P R E P A R A C I Ó N DE L A CU R V A E S TÁ N D A R
24.
2. Adicionar 200 µL de solución reactiva para acilglicéridos e
| 61 |
3.5.4 C ÁLCULOS
La concentración de acilglicéridos se determina realizando
una curva patrón utilizando el estándar contenido en el kit
comercial, Linealidad entre 0.03 a 2 mg/mL.

𝑨490 𝑛𝑚
𝐀𝐜𝐢𝐥𝐠𝐥𝐢𝐜é𝐫𝐢𝐝𝐨𝐬 (mg/mL) =
𝟎. 𝟐𝟗𝟏𝟗
Figura 24: Curva patrón de acilglicéridos. Linealidad entre 0.03 y 2 mg/mL
| 62 |
4
4 E VALUACIÓN DE L E STADO I NMU NE
El sistema inmune de los vertebrados, incluyendo a los peces,

tiene dos propiedades importantes que le permiten diferenciar lo
propio de lo extraño: 1) la especificidad, la cual se observa tanto
en los anticuerpos, como en los linfocitos, y se basa en la
capacidad de reconocer a una única región del patógeno o del
material extraño, llamada epítope o determinante antigénico. El
sistema inmune puede reconocer miles de millones de antígenos
diferentes, pero para cada determinante se inducirá la
reproducción y/o activación de una población específica de
linfocito. Existen tantos linfocitos estimulados, como
determinantes presentes en el antígeno. 2) La memoria, la cual es
activada cuando el sistema de defensa reconoce por vez primera
un antígeno y se produce una respuesta primaria. A partir de
entonces, quedan células de memoria (linfocito), por cada uno de
los epítopes del antígeno. Cuando ese antígeno vuelva a estar en
contacto con el sistema inmune (respuesta secundaria), el
linfocito memoria se estimulará para producir cuantas réplicas de
linfocitos específicos sean necesarios, (frente a ese determinado
| 63 |
epítope) de una manera más rápida y efectiva que en la respuesta
primaria.
A diferencia de los vertebrados, los crustáceos y moluscos no

tienen inmunoglobulinas ni linfocitos, pero poseen eficientes
mecanismos de defensa que evitan el establecimiento y
proliferación de patógenos. En los últimos 15 años ha habido un
gran interés por estudiar el sistema inmune del camarón con
resultados significativos. Aunque utilizan células y moléculas
distintas, los mecanismos moleculares del sistema inmune de los
invertebrados son tan eficaces como el sistema inmune de
vertebrados. En general, los mecanismos de defensa inmune son
activados como respuesta a la introducción de partículas ajenas,
mediante un sistema de reconocimiento de lo propio y lo extraño.
El sistema inmune de invertebrados, en primera instancia,

reconoce patrones conservados de moléculas que se encuentran
en el patógeno y que no se encuentran en las células del
hospedero. Estas moléculas se denominan Patrón de Moléculas
Asociadas al Patógeno (PMAP). Posteriormente, existen células
inmunitarias que reconocen este patrón como extraño y
responden, desencadenando una respuesta inmune que previene
la replicación del invasor (Hedrick, 2004; Kurtz, 2005). Las células
inmunes responden rápidamente a este compromiso a través de
cascadas de señalización intracelular que conducen a la activación
de las respuestas inmunitarias celular y humoral (Tassanakajon et
al., 2013).
La respuesta humoral está mediada por proteínas de la hemolinfa

que se encargan de reconocer, neutralizar o favorecer la
destrucción del patógeno. Por ejemplo, la lisozima; una proteína
que rompe las paredes celulares de las bacterias (Sotelo-Mundo et
| 64 |
al., 2003; Ye et al., 2009) o péptidos antimicrobianos circulantes
(AMP) como peneidinas (Cuthbertson et al., 2008; Destoumieux et
al., 1997; Woramongkolchai et al., 2011) y crustin (Vargas-Albores
and Martinez-Porchas, 2017; Vargas-Albores et al., 2004). Las
aglutininas séricas (Vargas-Albores et al., 1993a) y la proteína que
se une a beta-glucanos (Vargas-Albores et al., 1997) son
consideradas moléculas de reconocimiento, mientras que
proteasas (Jiménez-Vega et al., 2005; Reyes-Izquierdo and Vargas-
Albores, 2001) e inhibidores de proteasas (Gollas-Galván et al.,
2003; Jimenez-Vega and Vargas-Albores, 2005; Jiménez-Vega and
Vargas-Albores, 2007; Jiménez-Vega et al., 2004) parecen tener un
papel regulador de la misma respuesta inmune.
Por otro lado, existen actividades directas, realizadas por las

células, particularmente las del sistema circulatorio, cuyas
actividades incluyen la apoptosis, la fagocitosis, la formación de
nódulos y la encapsulación del agente extraño (Flegel and
Sritunyalucksana, 2011). Por lo tanto, la mayoría de los
mecanismos de defensa se llevan a cabo en la hemolinfa y las
células involucradas son llamadas hemocitos. En el camarón, se
han descrito tres tipos de hemocitos: Los hialinos o sin gránulos,
los semigranulares o de gránulos pequeños y los granulares o de
gránulos grandes (Lavine and Strand, 2002; Sun et al., 2010). Si
bien, los hemocitos son los efectores de la respuesta inmune
celular, también están implicados en la síntesis de la mayoría de
los efectores humorales.
El sistema de activación de la profenoloxidasa juega un

importante papel en la inmunidad innata de los crustáceos,
particularmente en la cicatrización de las heridas y la defensa
contra los patógenos. La FO está localizada, en la forma inactiva,
| 65 |
dentro de los gránulos de los hemocitos por lo que es llamada
profenoloxidasa (proFO). La transformación de proFO a FO
involucra varias reacciones conocidas como el sistema de
activación de la proFO. Este sistema es activado por -1,3 glucanos
o LPS mediante tres pasos: en el primero, los hemocitos reconocen
los LPS o -1,3 glucanos de bacterias y hongos; el segundo paso es
la degranulación, donde el contenido granular del hemocito es
liberado mediante una exocitosis controlada, sin que se dañe la
membrana de los hemocitos, liberando las formas inactivas de la
FO y la enzima activadora de proFO (EAproFO). El tercer paso
requiere la participación del calcio para la conversión de la
EAproFO inactiva en una proteinasa activa que posteriormente
transforma la proFO en FO activa (Fagutao et al., 2011; Gollas-
Galván et al., 1997; Vargas-Albores et al., 1998a). El sistema
inmune de estos organismos cuenta también con mecanismos de
control. Por ejemplo, cuando ya no existe el estímulo del agente
extraño, la respuesta es controlada al inhibir a la EAproFO,
mediante la acción de un inhibidor de proteinasas conocido como
2-macroglobulina (A2M) que es una proteína que neutraliza la
acción de cualquier proteinasa por mecanismos conformacionales
y este complejo (proteinasa-A2M) es, posteriormente, reconocido
por células fagocíticas y eliminado por endocitosis. Esto remueve
la proteinasa de la circulación por lo que, sus acciones
potencialmente perjudiciales son neutralizadas (Armstrong, 2010;
Enghild et al., 1990; Gollas-Galván et al., 2003; Ponprateep et al.,
2017; Saravanan et al., 2003).
El sistema humoral también involucra la producción de radicales

intermediarios de oxígeno y de nitrógeno con potente acción
microbiocida, donde la participación de enzimas como la
superóxido dismutasa (SOD) y la óxido nítrico sintasa (NOS), entre
| 66 |
otras, son fundamentales, por lo que se consideran componentes
importantes de los mecanismos de defensa de los invertebrados
(Campa-Cordova et al., 2002; Li et al., 2016 ).
| 67 |
4.1 S I GN I FI C ADO DE LO S M A R C ADORE S I NM UNE S
Los organismos acuáticos están sometidos a factores de estrés
que afectan el desempeño inmune. La medición de la actividad del
sistema de defensa ha sido utilizada para intentar determinar el
estado de protección de los organismos ante la presencia de
cualquier agente patógeno o para determinar si dichos
organismos pueden estar predispuestos a enfermarse.
De los factores estudiados que afectan al sistema inmune, la

temperatura, la salinidad y la alimentación deficiente son de los
más analizados. Por ejemplo, los cambios de temperatura afectan
la actividad de la FO, una de las enzimas más representativas del
sistema inmune de crustáceos, mientras que los cambios de
salinidad disminuyen la actividad de fenoloxidasa, superóxido
dismutasa (SOD) y lisozima (Lin et al., 2012). Sin embargo, los
estudios de Vargas-Albores y su grupo (Vargas-Albores et al.,
1998b) observaron un incremento de la actividad de FO al
aumentar la salinidad, mientras que un incremento de
temperatura producía una disminución de dicha actividad. La
temperatura tiene un efecto importante sobre procesos
biológicos, así como sobre las respuestas inmunes y sobre la
función de las actividades enzimáticas en todos los organismos,
por ejemplo, en camarones infectados con el virus de la mancha
blanca (WSSV), el aumento de temperatura por encima de los 32°C
o una disminución a menos de 20°C reduce notoriamente la carga
viral y la agresividad del virus (Moser et al., 2012). Aunque se ha
demostrado que las temperaturas citadas estimulan la expresión
de las proteínas de choque térmico Hsp10, Hsp60 y Hsp90 así
como mayor actividad de lisozima (Cárcamo-Arechiga et al., 2014),
aún no se ha definido si la disminución en la virulencia del WSSV
se debe a un problema del virus en su capacidad de replicación o
| 68 |
bien que a estas temperaturas el sistema inmune puede detener
de manera más eficiente la infección.
Por su parte, el ayuno, generalmente producido por deficiencia en

los protocolos de alimentación o una calidad deficiente del
alimento, provocan disminución de las actividades de los
componentes del sistema inmune en general (Pascual et al., 2006).
Aunque no muy estudiado, las concentraciones de otros

componentes del agua pueden afectar de manera importante la
actividad de defensa de los crustáceos, por ejemplo, la exposición
a altas concentraciones de cobre durante más de 48 h produce
disminución importante en la actividad de FO y en la cantidad de
hemocitos circulantes (Bautista-Covarrubias et al., 2015; Bautista-
Covarrubias et al., 2014). También se ha visto un aumento en la
actividad de SOD en camarones expuestos a concentraciones de
cobre cercanas a las tóxicas (Yeh et al., 2004).
En experimentos relacionados con la calidad del agua, se ha

encontrado que la exposición a bajas concentraciones de oxigeno
producen una disminución en la capacidad de defensa de los
camarones, disminuyendo la actividad de la FO y lisozima,
mientras que hay un aumento en la concentración de alfa-2-
marcroglobulina, proteína involucrada en la regulación del
sistema inmune en crustáceos (Magallón Servín, 2004; Morán
Morales, 2006).
Por otro lado, la exposición a altas concentraciones de amonio

también tiene efecto negativo sobre el sistema inmune de los
crustáceos, disminuyen la actividad de la FO y la concentración de
hemocitos, así como la actividad fagocítica (Le Moullac and
Haffner, 2000).
| 69 |
Es evidente que la medición de los elementos del sistema inmune
puede indicar la capacidad de defensa de los camarones y, de
manera indirecta, deficiencias en el manejo, manifestadas por la
mala calidad del agua o una inadecuada alimentación, con el
consecuente aumento de estrés en los organismos cultivados.
Aunque en la actualidad existen técnicas para la medición de
varios componentes del sistema inmune de camarón, el desarrollo
de estas técnicas en formato de microplaca tiene la gran ventaja
de usar volúmenes pequeños de reactivos y de muestra,
disminuyendo el volumen de residuos generados por los análisis.
Adicionalmente, la posibilidad de medir 96 muestras en 20
minutos reduce significativamente el tiempo de respuesta y
aumenta el número de muestras que pueden ser analizadas. En
este manual se presentan las técnicas en microplaca para medir la
actividad de algunos componentes del sistema inmune de
camarón.
| 70 |
4.2 D E TE RM I NACI ÓN DE AC TI VI DAD F E NOLOXI DAS A
(FO) E N HEM OLI NFA C OM PLE T A
La fenoloxidasa (FO) es una enzima tipo de tirosinasa (EC
1.14.18.1), que contiene cobre. El FO está principalmente
involucrada en la oxidación catalítica de mono- o di-fenoles a la o-
quinona correspondiente. Las quinonas, se entrecruzan para
formar melanina.
La cuantificación de la actividad enzimática de la FO, se basa en

la oxidación de un sustrato incoloro (L-DOPA) produciendo un
complejo de color rosa que tiene una absorbancia máxima a 490 nm.

L-DOPA: Pesar 3 mg de L-DOPA y disolver en 1 mL de agua
inyectable (agitar constantemente porque tarda en disolverse).
Nota: Es una solución incolora, estable durante varios días si se almacena en obscuridad.
No debe usarse si se presenta una coloración.
1. Colocar 10 µL de hemolinfa en una microplaca.
2. Adicionar 250 µL de L-DOPA e incubar a temperatura
ambiente (25-28°C) durante 10 min.
3. Medir la absorbancia a 490 nm en un lector de placas.
| 71 |
4.2.3 C ÁLCULOS
La concentración de actividad fenoloxidasa se determina
realizando una curva patrón utilizando una solución de tirosinasa
como estándar. Linealidad entre 0.1 y 15 Unidades (U)
La concentración se calcula, de acuerdo a la ecuación obtenida en la

curva patrón, de la siguiente forma:
𝑨𝟒𝟗𝟎 𝒏𝒎
𝐅𝐞𝐧𝐨𝐥𝐨𝐱𝐢𝐝𝐚𝐬𝐚 (𝐔) =
𝟎. 𝟎𝟏𝟗
Figura 25: Curva patrón de fenoloxidasa. Linealidad entre 0.1 y 15 U/mL
| 72 |
4.3 D E TE RM I NACI ÓN DE F E NOLOXI DASA T OT AL
( PR O FO+FO) E N HEM OLI NFA C OM PLE T A .
La proFO está localizada dentro de los hemocitos en la forma
inactiva. La transformación de proFO a FO involucra una
proteólisis que realiza la EAproFO. Otras enzimas proteolíticas,
como tripsina y quimotripsina también pueden activar in vitro a
la proFO (Aspán et al., 1990 ; Söderhäll, 1992; Söderhäll and Häll,
1984; Yoshida and Ashida, 1986). Con base en lo anterior, la
cantidad de proFO en una muestra puede ser determinada
hidrolizándola con tripsina comercial como activador y
cuantificando la actividad de FO, por oxidación de L-DOPA como
sustrato. En hemolinfa completa no debería encontrarse de forma
activa; sin embargo, las células pueden degranular y activar la
proPO por una manipulación inadecuada. Por otro lado, las células
pueden son utilizadas para determinar la cantidad de enzima
inactiva.

Tripsina tipo IX de Bovino: Pesar1 mg de tripsina y disolver en 1
mL de agua inyectable.
L-DOPA: Pesar 3 mg de L-DOPA y disolver en 1 mL de agua

inyectable (agitar constantemente porque tarda en disolverse).
Nota: Es una solución incolora, estable durante varios días si se almacena en obscuridad.
No debe usarse si se presenta una coloración.
1. Colocar 10 µL de hemolinfa en una microplaca.
| 73 |
2. Para asegurar la conversión total de la proFO a su forma
activa (FO), adicionar en el pozo de la microplaca,10 µL de
tripsina e incubar a temperatura ambiente (25-28°C)
durante 10 min.
3. Agregar 250 µL de L-DOPA e incubar por 10 min a
temperatura ambiente (25-28°C).
4.3.3 C ÁLCULOS
La actividad de fenoloxidasa total se determina realizando una
curva patrón utilizando una solución de tirosinasa como
estándar. Linealidad entre 0.1 a 15 U/mL (Unidades/mL).
| 74 |
4.4 D E TE RM I NACI ÓN DE PR O -F E NOL OXI DAS A ( PR O FO)
E N HEM OLI NFA C OM PLE T A .
La proFO está localizada dentro de los hemocitos en la forma
inactiva, en las muestras ser hemolinfa completa, no debería
encontrarse de forma activa. Sin embargo, las células generan
activación por manipulación y debe ser determinada para el
cálculo de la concentración de la forma inactiva.
4.4.1 C ÁLCULOS
Para determinar la cantidad de proFO disponible, al valor de
actividad obtenido en la prueba de fenoloxidasa total se le resta
el valor obtenido de actividad en la prueba para FO.
𝐅𝐎𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥 − 𝐅𝐎 = 𝐩𝐫𝐨𝐅𝐎
| 75 |
4.5 D E TE RM I N ACI ÓN DE F E NOLOXI DASA T OT AL
( PR O FO+FO) E N HEM OCI TOS
La proFO está localizada en los gránulos de los hemocitos, en la
forma inactiva. En muestras de hemolinfa completa manipuladas
adecuadamente, no debería encontrarse de forma activa. Para
poder cuantificarla es necesario pasarla a su forma activa (PO),
usando proteólisis con tripsina. La PO es cuantificada por
oxidación de L-DOPA.
1. Colocar 100 µL de hemolinfa en un microtubo de 1.7 mL y
centrifugar a 800g durante 5 min a 4°C.
2. Eliminar el plasma, agregar 100 µL de agua inyectable y
agitar vigorosamente en vortex (alternativamente se puede
agitar utilizado la micropipeta tomando y expulsando el
contenido del tubo varias veces).
3. Centrifugar a 2000g durante 5 min a 4°C.
4. Colocar 10 µL del sobrenadante en un pozo de la
microplaca.
5. Para asegurar la conversión total de la proFO a su forma
activa (FO), adicionar en el pozo de la microplaca, 10 µL de
tripsina e incubar a temperatura ambiente (25-28°C)
durante 10 min.
6. Agregar 250 µL de L-DOPA e incubar por 10 min a
temperatura ambiente (25-28°C).
8. Si se quiere conocer la concentración de FO hacer la
determinación sin agregar tripsina.
| 76 |
4.6 D E TE RM I NACI ÓN DE L A AC TI VI DAD I NHI BI DOR A DE
 2 -M AC R OG LOBULI N A
La α2-macroglobulina es responsable de inhibir a la proteasa
activadora de proFO, por lo que el método utilizado para medir la
actividad se basa en la determinación de la tripsina atrapada en el
inhibidor. Esto es posible porque la molécula de A2M atrapa
físicamente a la molécula de tripsina, sin quitarle su capacidad
proteolítica. Sustratos de bajo peso molecular, como BAPNA, son
capaces de entrar al entramado de la A2M y ser hidrolizados por la
tripsina atrapada, generando un producto colorido. Por lo tanto, la
concentración de tripsina atrapada es directamente proporcional a la
concentración de A2M.

Tripsina tipo IX de Bovino:
Pesar1 mg de tripsina y disolver en 1 mL en agua
desionizada.
Soybean Trypsin Inhibitor (STI):

Pesar 2 mg de STI y disolverlo en 1 mL de agua inyectable.
*BAPNA:
Pesar 1 mg de BAPNA y disolver en 1 mL de agua inyectable.
*Nota: El BAPNA es insoluble en agua por lo que es necesario disolverlo en

dimetilsulfoxido (DMSO) en una proporción de 1 mg de BAPNA en 100 µL de
DMSO y después ajustar a 1 mL con agua inyectable. El DMSO, es un compuesto
muy toxico, se deben seguir las medidas de seguridad al manejarlo.
Tripsina tipo IX de Bovino:

Pesar1 mg de tripsina y disolver en 1 mL en agua inyectable.
| 77 |
1. Colocar, en un pozo de la microplaca, 50 µL de muestra y
agregar 10 µL de solución de tripsina, incubar durante 10
min. a 37°C.
2. Agregar 10 µL de inhibidor de tripsina (STI) e incubar
durante 10 min. a 37°C.
3. Adicionar 100 µL del sustrato BAPNA e incubar durante 1
hora a 37°C.
4. Leer absorbancia a 415 nm.
4.6.3 C ÁLCULOS
La concentración de α2-macroglobulina se determina realizando
una curva patrón utilizando tripsina, Linealidad entre 0.1 a 1
mg/mL.
| 78 |
4.7 A C TI VI DAD DE PR OTE IN AS AS TI PO T RI PSI N A
La EAproFO, una proteinasa tipo tripsina que hidroliza proFO en
FO. Para la determinación de esta enzima, se utiliza la ruptura del
enlace peptídico de la molécula N-benzoil-arginina-p-nitroanilida
(BAPNA) un sustrato sintético de enzimas proteinasas. El
resultado es una reacción de color amarillo, producto de la
liberación de la p-nitroanilina, el cual se puede leer en un
espectrofotómetro a 400 o 415 nm.
4.7.1 P REPARACIÓN DE R EACTIVOS :

*BAPNA:
Pesar 1 mg de BAPNA y disolver en 1 mL de agua inyectable.
Nota: El BAPNA es insoluble en agua por lo que es necesario disolverlo en

dimetilsulfoxido (DMSO) en una proporción de 1 mg de BAPNA en 100 µL de
DMSO y después ajustar a 1 mL con agua inyectable. El DMSO, es un compuesto
muy toxico, se deben seguir las medidas de seguridad al manejarlo.
1. Colocar, en un pozo de la microplaca, 50 µL de muestra.
2. Agregar 100 µL del sustrato BAPNA e Incubar durante 1
hora a 37°C.
| 79 |
4.7.3 C ÁLCULOS
Una curva patrón será necesaria para determinar la concentración
de tripsina, en el rango de 0.1 a 1 mg/mL, que es donde se observa
linealidad.
| 80 |
4.8 M E DI CI ÓN DE ACTI VI DAD DE LI SOZIM A
El método utilizado para medir actividad de lisozima es la lisis de
Micrococcus luteus inmovilizados en agarosa (1.2%). Sin embargo,
existe un método turbidimétrico. La diferencia de esta técnica con
la anterior es que las bacterias (M. luteus) están en un medio
líquido y la actividad de lisozima se observa como una
disminución de turbidez (medida por espectrofotometría) debida
a la lisis de las células bacterianas. Este método tiene la ventaja
de ser una técnica más rápida pues se obtienen resultados en un
tiempo máximo de 1 h.

Suspensión de Micrococcus luteus (SIGMA)
5 mg/mL en solución de Fosfatos 0.05M, pH 7.0 – 7.4
agregar 150 µL de una suspensión de Micrococcus sp. Leer
absorbancia a 415 nm (A0h).
2. Incubar durante 1 hora a 37°C y volver a medir
absorbancia a 415 nm (A1h).
4.8.3 C ÁLCULOS
La lisis bacteriana se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
𝐴𝐿𝑖𝑠𝑖𝑠 = 𝐴1ℎ − 𝐴0ℎ
| 81 |
Para calcular la actividad de lisozima en la muestra se prepara una
curva con concentraciones conocidas de lisozima comercial y se
calcula la ALisis de cada una. Se usa la ecuación de regresión lineal
de la curva para calcular la actividad de lisozima de la muestra.
| 82 |
4.9 M E DI CI ÓN DE ACTI VI DAD ANTI BACTE RI AN A
El método utilizado para medir actividad antibacteriana se basa
en la lisis de bacterias inmovilizadas en agarosa (1.2%). Sin
embargo, existe un método turbidimétrico. La diferencia de esta
técnica con la anterior es que las bacterias están en un medio
líquido y la actividad antibacteriana se observa como una
disminución de turbidez (medida por espectrofotometría) debida
a la inhibición de crecimiento bacteriano. Este método tiene la
ventaja de ser una técnica más sensible pues se obtienen
resultados medidos por absorbancia y no a simple vista.

Caldo Soya Tripticasa (CST): Preparar de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Para bacterias marinas agregar 2% de
NaCl.
Cultivo en fase exponencial de Vibrio sp: Colocar en un pozo de

la microplaca, 200 µL de TSA conteniendo 2% de NaCl y agregar
10 µL de una suspensión de Vibrio sp ajustado a 0.5 de
absorbancia a 415 nm. Después de incubar durante 6-8 horas,
ajustar a 0.5 de absorbancia a 415 nm y tomar 10 µL del cultivo
ajustado para la prueba de actividad antibacteriana.
Cultivo en fase exponencial de Escherichia coli: Colocar en un

pozo de la microplaca, 200 µL de CST (de acuerdo a las
instrucciones del fabricante) y agregar 10 µL de una suspensión
de E. coli ajustado a 0.5 de absorbancia a 415 nm. Después de
incubar durante 6-8 horas, ajustar a 0.5 de absorbancia a 415 nm
y tomar 10 µL del cultivo para la prueba de actividad
antibacteriana.
| 83 |
agregar 150 µL de CST.
2. Agregar 10 µL de un cultivo bacteriano en fase exponencial
(para organismos marinos usar Vibrio sp, para organismos
de agua dulce usar E. coli).
3. Incubar durante 24 horas a 25°C.
4.9.3 C ÁLCULOS
La actividad antibacteriana se calcula leyendo la turbidez a 415
nm. y comparando las lecturas con los controles positivos (100%
de crecimiento: CST + bacterias) y negativos (0% de crecimiento:
CST + solución salina 0.9%).
| 84 |
4.10 M E DI CI ÓN DE ACTI VI DAD DE ÓXI DO NÍ TRI C O
SI N T AS A (NOS)
(kit comercial 23479 de SIGMA)
El óxido nítrico (NO) es un gas que actúa como mensajero en

sistemas biológicos y es producido por oxidación de la L-arginina,
que se transforma en L-citrulina, gracias a la acción de la enzima
Óxido Nítrico Sintasa (NOS). El NO es convertido de manera
inmediata a nitritos (NO2) y nitratos (NO3) los cuales pueden ser
medidos usando el reactivo de Griess. La actividad de la enzima
NOS puede ser medida indirectamente por la formación de NO2 y
NO3 en los tejidos. El kit 23479 de SIGMA life science, denominado
ensayo calorimétrico para NO3 y NO2 mide la concentración de NO2
mediante la reacción de Griess y para medir la concentración de
NO3 primero se reduce el NO3 a NO2 mediante la acción de la
enzima nitrato reductasa.

Buffer:
Listo para usarse, proporcionada en el kit comercial.
Enzima nitrato reductasa

Reconstituir el vial de enzima en 1.2 mL de Buffer. Mantener
en refrigeración (o en hielo) antes del análisis.
Cofactores
Reconstituir el vial de cofactores en 1.2 mL de Buffer.
Mantener en refrigeración (o en hielo) antes del análisis.
Reactivo A:
Solución de sulfanilamida proporcionada en el kit comercial.
| 85 |
Reactivo B:
Solución de N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride)
proporcionada en el kit comercial.
1. Colocar, en un pozo de la microplaca, 10 µL de muestra.
2. Agregar 10 µL de enzima y 10 µL de cofactores.
3. Mezclar e incubar la placa a 25°C durante una hora.
4. Adicionar 50 µL de solución A
5. Después de 5 min de incubación, agregar 50 µL de
solución B e incubar durante 10 min.
4.10.3 C ÁLCULOS
La concentración de nitritos y nitratos se determina realizando
una curva patrón con la solución estándar proporcionada en el kit
comercial. Linealidad entre 10 y 100 µM.
| 86 |
4.11 M E DI CI ÓN DE ACTI VI DAD DE SUPEROXIDO
DISMUTASA (SOD)
La enzima Superóxido Dismutasa (SOD) cataliza la dismutación de
superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Debido a esto es
una de las enzimas antioxidantes más importantes que actúa
como defensa en la mayoría de las células expuestas al oxígeno.
Para la medición de SOD se usa el kit 19160 de Fluka Analytical,
que tiene implementado un método indirecto a través de la
inhibición en la formación de un producto colorido (formazan)
utilizando un sustrato denominado WST-1 (sal monosódica del 2-
(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolium).
Una enzima, la xantinoxidasa es la responsable en convertir el
WST-1 (incoloro) en WST-1 formazan (amarillo), esta reacción
puede ser inhibida por la SOD.

Todos los reactivos vienen listos para usarse.
1. Colocar, en un pozo de la microplaca, 20 µL de muestra o
agua de acuerdo a la tabla 21.
2. Agregar 200 µL del sustrato WST-1.
3. Adicionar 20 µL de solución enzimática o buffer de
acuerdo al cuadro anterior e Incubar durante 20 min a
37°C.
| 87 |
Tabla 21. Preparación de la curva estándar para la determinar la concentración
de SOD en muestras de hemolinfa
Muestra Blanco1 Blanco2 Blanco3
Muestra 20 µL 20 µL
Agua 20 µL 20 µL
Sustrato WST 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Solución enzimática 20 µL 20 µL
Buffer 20 µL 20 µL
4.11.3 C ÁLCULOS
Para calcular la actividad de SOD (% de inhibición) en la muestra
se usa la siguiente ecuación:
(𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜1 − 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜3 ) − (𝐴𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜2 )

SOD (% de inhibición) = 𝑋 100
𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜1 − 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜3
| 88 |
5
5 A NE XOS
5.1 O BTE N CI ÓN DE M U E STR AS DE S AN GRE Y HEM OLNF A
Para la determinación del estado inmune es necesaria la obtención
de muestras de sangre (peces) o hemolinfa (crustáceos y
moluscos).
La hemolinfa en los crustáceos se toma de la región ventral (Figura

26) con una jeringa de 1 mL conteniendo anticoagulante (450 mM
de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 20 mM de EDTA y ajustar
a pH 7.2), de acuerdo a las indicaciones de Vargas-Albores et al.
(1993b).
Figura 26. Obtención de muestra de hemolinfa en camarón
| 90 |
5.2 O BTE N CI ÓN DE S AN GRE DE PE Z .
En el caso de los peces, la sangre se toma de la vena caudal (Figura
27) o directamente del corazón, y se deposita en un tubo
conteniendo EDTA como anticoagulante.
Figura 27. Obtención de una muestra de sangre, de la vena caudal y de corazón

en peces.
| 91 |
5.3 O BTE N CI ÓN DE S AN GRE DE OSTI ÓN .
La hemolinfa en los moluscos se toma del músculo abductor con
una jeringa de 1 mL. No es necesario usar anticoagulante porque
la hemolinfa de moluscos no se coagula.
| 92 |
5.4 E SQU EM A DE L SI STEM A D E DE FENS A DE C AM ARÓN
El sistema de defensa de camarón involucra respuesta celular,
mediada por hemocitos (hialinos y granulares) y humoral,
mediado por moléculas de reconocimiento, sistemas enzimáticos
efectores y sistemas de regulación (α2macroglobulina).
| 93 |
5.5 T I PO DE RE AC CI ON E S E N M I CR OPL AC A .
Ejemplo de coloración que se genera en las reacciones para medir
metabolitos plasmáticos. La intensidad de color se lee en un
espectrofotómetro o un fotocolorímetro para formato de
microplacas.
| 94 |
6
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Técnicas Analíticas

Jorge Hernández López

INSTITUTO DE ACUACULTURA DEL ESTADO DE SONORA, O.P.D.

1.1 Análisis en Microplacas 3

2 Métodos para determinar Calidad Química del Agua ......................... 13

2.1 Cuantificación de Nitritos en agua marina 19

3 Evaluación del Estado Fisiológico y Nutricional .................................. 39

3.1 Medición de proteínas totales en plasma (método del biuret) 43

4 Evaluación del Estado Inmune ........................................................... 63

4.1 Significado de los marcadores inmunes 68

5.1 Obtención de muestras de sangre y hemolnfa 90

La acuicultura en México ha tenido un crecimiento significativo en

Uno de los principales problemas de la producción de organismos

Varias y variadas metodologías han sido descritas para la

El uso de microplacas, para llevar a cabo las reacciones, ha ganado

El formato fue rápidamente aceptado y las dimensiones se

Figura 1. Esquema en una microplaca de hemaglutinación. Las reacciones

A diferencia de las placas para hemaglutinación, las placas para

Todos los análisis colorimétricos se basan en la ley de Beer-

Figura 2. Diferencias en las formas de los pozos de una microplaca. Para

En el sistema de tubo, la distancia (l) se estableció en 1 cm y

Figura 3. Diferencias en la lectura de absorbancia en tubo, donde la luz

En términos generales, es posible determinar la concentración de

Para la detección y cuantificación de sustancias por un método

Un gran avance en las reacciones realizadas en microplacas se

Estas técnicas tienen la ventaja de analizar varias muestras al

Figura 5. Esquema de una reacción ELISA directa. La cantidad de sustrato

Afortunadamente existen técnicas de laboratorio que permiten

Aunque los sistemas de defensa en invertebrados son más

Debido a que el agua es el elemento principal en la acuicultura, la

La calidad del agua es uno de los principales factores limitantes

Uno de los componentes más importantes para la vida de los

Los sistemas acuícolas reciben una gran cantidad de nitrógeno y

Por otra parte, los peces y crustáceos son amoniotélicos, es decir

materia orgánica. El amonio, presente naturalmente en el agua,

La forma no disociada del amonio es el amoniaco (NH 3) que

A pesar de la poca información sobre la toxicidad de los nitratos

Otro compuesto importante presente en el agua es el fósforo, el

La presencia de compuestos azufrados es otro problema

Figura 6. Comportamiento químico del sulfuro de hidrógeno, respecto al pH.

La demanda bioquímica de oxígeno (DBO), que indica la tasa de

La alcalinidad es un factor relevante en los sistemas acuícolas que

La dureza es también un parámetro importante, que tiene cierta

Peces de agua Peces de agua

Oxígeno 5-7 mg/L 5-7 mg/L 4-7 mg/L

Amonio ionizado 0.2 a 2 mg/L <0.04 mg/L <0.04 mg/L

Amonio no ionizado <0.1 mg/L <1.0 mg/L <0.5 mg/L

Nitratos 0.2 a 10 mg/L <150 mg/L

Nitritos <0.23 mg/L <1 mg/L <1 mg/L

Alcalinidad 50-300 mg/L

Dureza 150-300 mg/L 150-300 mg/L 40-400 mg/L

grado de dureza tienen la capacidad de amortiguar el efecto de

Debido al peligro de toxicidad que puede tener el exceso de

2.1.1 P REPARACIÓN DE REACTIVOS

Figura 7. Reacción de Griess para la detección y cuantificación de nitritos

Reactivo Único para NO2:

Solución estándar para NO2:

2.1.2 C URVA ESTÁNDAR

Tubo Volumen de solución madre Agua destilada (µL)