PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA PARA CIENCIAS DE LA SALUD - 2021

TINCIÓN DE GRAM Y BACTERIOSCOPÍA

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Dr. Julio Cesar Luna Leyza, Docente de Microbiología – Master en Investigación en Medicina Tropical - 2022

INTRODUCCION

Una de las herramientas más útiles para el estudio de los microorganismos es el microscopio. El microscopio simple fue
inventado en 1609 Galileo en Italia, antecesor de microscopio compuesto inventado por el inglés Roberth Hooke en 1665.
Antonij van Leeuwenhoek, holandés con su afición de tallar lentes para observar objetos con mayor aumento, en 1674
descubre los “animálculos”, en una gota de agua que reconoció como protozoo de vida libre. A partir de este momento y
sobre todo en este siglo este instrumento ha tenido una notable evolución.

Los microscopios utilizan lentes para amplificar las estructuras que se examinan permitiendo así observarlos
detalladamente. Además de la amplificación es el poder de resolución la que permite observar dos puntos adyacentes
como unidades distintas, por lo tanto, el poder de resolución es el que determina los límites de lo que puede ser observado
con un microscopio. Para el microscopio óptico los límites del poder de resolución están en aproximadamente 0.2 µm
(200 nm).

Cuando el microscopio óptico tiene más de un lente se le denomina compuesto, dentro del campo de la microbiología y
parasitología hay diversos tipos de microscopios que se pueden utilizar: de campo claro, campo oscuro, contraste de
fases y de fluorescencia. Actualmente contamos básicamente con dos tipos de microscopios: microscopio óptico y el
microscopio electrónico.

El microscopio de campo claro está integrado por dos tipos de lentes, oculares y objetivos que funcionan conjuntamente
para producir la imagen.

PARTES DEL MICROSCOPIO

OPTICAS

Ocular:
Es la lente a través del cual el observador examinara su preparación, tiene una capacidad de aumento de 10x.

Objetivos:
Son lentes que se encuentran montadas en el revolver y que proporcionan una variedad de aumentos. El revolver
portaobjetivos consta de cuatro objetivos, a saber: el objetivo de más bajo poder de un aumento de 4x (panorámico), el
objetivo de bajo poder de 10x (débil seco), el de alto poder de 40x (fuerte seco), y el objetivo de inmersión de un aumento
de 100x. Multiplicando el aumento del ocular con el del objetivo obtendremos el aumento total, con lo cual podremos
observar microorganismos de aproximadamente 1 µm de diámetro.

DE ILUMINACIÓN

Diafragma:
Permite la entrada de luz a un solo punto del campo microscópico, hay de dos tipos. De Iris que es una serie de aspas
que nos permiten la entrada de luz a un solo punto del campo microscópico. De Disco que cumple la misma función, pero
en este caso está graduada por numeración del 1 al 5, siendo la menor entrada al número 1 y así sucesivamente has la
mayor entrada de luz al número 5.

Condensador:
Se encarga de condensar todos los rayos luminosos en un solo haz.

Fuente de luz:
Es la que proporciona la cantidad total de luz para permitir la observación (antes natural y ahora artificial).

MECÁNICAS

Revolver:
Pieza mecánica móvil sobre la cual se encuentran montados los objetivos.

Platina:
Pieza sobre la cual se colocará el portaobjetos con la preparación a examinar.

Pinzas de sujeción:
Se encuentran montadas en la platina y sirven para aprisionar el portaobjetos y permitir que este permanezca en el punto
deseado.

Carro de movimientos:
Sirve para movilizar la laminilla y ubicarla para su observación adecuada.

Base o pie:
Pieza metálica sobre la cual se encuentran montadas las parte integrantes del microscopio.

Brazo:
Pieza metálica en la cual se encuentran montadas las partes ópticas y que sirve para un adecuado traslado del
microscopio.

Es propiedad intelectual del Dr. Julio Cesar Luna Leyza © - La Paz Bolivia
Se autoriza su reproducción siempre y cuando se solicite por escrito al autor intelectual – juliolunaleyza@gmail.com
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DISPOSITIVOS DE ENFOQUE
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Tornillo macrométrico:
Realiza desplazamientos rápidos de la platina y da un enfoque sin detalle.

Tornillo micrométrico:
Realiza desplazamientos lentos de la platina para un enfoque detallado.

FORMA CORRECTA DE ENFOQUE

Este método requiere usar primero el tornillo macrométrico para descender el objetivo hasta que este tan cerca del
portaobjetos como sea posible, el descenso del objetivo debe observarse lateralmente con cuidado para asegurarse de
que el lente no toque el portaobjetos (sólo en el caso del objetivo de inmersión se permitirá el contacto previa aplicación
de una gota de aceite). Nunca observe por el ocular y haga descender el objetivo al mismo tiempo.

Cuando el lente esté a punto de tocar el portaobjetos, entonces ya puede ver por el ocular y empezar a enfocar moviendo
el objetivo hacia arriba hasta alcanzar el mejor foco posible, ayudándose para un enfoque más detallado del tornillo
micrométrico.

USO Y PRESERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

Si no se utiliza el microscopio, cúbralo con su funda de plástico para resguardarlo del polvo principalmente.

El aceite de inmersión impregnado en el objetivo referente deberá limpiarse inmediatamente después de utilizarlo. Para
ello utilice primero un papel para lentes y posteriormente un paño suave. En su defecto un pedazo de gasa limpia.

Si el aceite se ha secado, aplique cuidadosamente un poco de éter o alcohol isopropílico con un papel para lentes y
seque inmediatamente con otro papel igual, si emplea otros solventes cuide que no disuelvan el pegamento de la lente.

Deberá de limpiarse de inmediato cualquier suciedad o líquido que se derrame sobre el microscopio. Aplicando una capa
de cera o silicona ayuda a la presentación del microscopio.

En caso de que los oculares estén sucios, deben limpiarse primero con una brocha de pelo de camello para quitar el
polvo, después se procede a limpiar con un papel para lentes.

La platina deberá moverse libremente, en la platina las pinzas deberán sujetar con fuerza al portaobjetos; si tiene
dificultad para mover la platina no deberá aplicarse fuerza, ya que modificaría completamente los sistemas de engrane.

Para trasladar el microscopio de un lugar a otro, hágalo siempre sujetándolo del brazo con una mano y apoyando el pie
con la otra. No lo intente por otra parte ya que podría dañarlo.

En cualquier desperfecto del microscopio deberá llamar a su profesor, instructor, facilitador u auxiliar de docencia.

Al acercar la preparación a los objetivos, nunca lo haga a través del ocular, ya que podría chocar con la laminilla y
fracturar el lente del objetivo. Se puede asegurar que no existe ningún aparato o instrumento de laboratorio cuya utilidad
dependa tanto de su uso, así como de su manejo adecuado como el microscopio.

MARCO TEORICO

La tinción de Gram una de las técnicas diferenciales más utilizadas en microbiología, descubierta por Christian Gram en
1883, encontrándola por accidente mientras trataba de teñir especímenes de biopsias para diferenciar los
microorganismos de los tejidos circundantes. En 1886 comprendió que su técnica la podía utilizar se para diferenciar y
clasificar las bacterias. “Esta sencilla técnica es todavía clave en bacteriología diagnóstica debido a que no ha sido
superada por ninguno de los métodos moleculares más modernos”. Las bacterias se dividen en tres grandes grupos:

Cocos: Tienen forma esférica y con diferentes tipos de agrupación como: cadenas (Streptococcus), racimos
(Staphylococcus), pares (Diplococcus), tetradas (Gafkia) o Sarcinas (Sarcina).

Bacilos: Tienen forma cilíndrica o alargada (bacilo significa bastoncito) también con diferentes tipos de agrupación:
empalizada, mal llamadas letras chinas o mejor símbolos asiáticos, banco de peces o cardumen, etc.

Helicoidales: Tienen forma ondulada y se dividen en dos: Espiroqueta si posee varias incurvaciones movibles o Espirilo
si posee una incurvación rígida. A su vez las Espiroquetas se dividen en tres; Treponema con varias incurvaciones
simétricas y ambos extremos terminados en punta, Borrelia con varias incurvaciones asimétricas y ambos extremos
terminados en punta y Leptospira con incurvaciones simétricas, pero uno de sus extremos termina incurvado. Un
representante de los Espirilos es el Helicobacter, con una sola incurvación como arco o alas de gaviota.

FUNDAMENTO

Introducción. Las bacterias son incoloras y se observan con dificultad al microscopio óptico. Los cocos y los bacilos se
pueden identificar por su forma, agrupación y por la afinidad a los colorantes utilizados en la tinción de Gram. Las
bacterias Gram Positivas retienen el color violeta y las bacterias Gram Negativas la coloración rojo pálida. Para teñir
helicoidales se utilizan otras técnicas de tinción ya que son difíciles de observar con Gram. En general la tinción de Gram
no es aplicable a otros microorganismos como protozoos y hongos, exceptuando a las levaduras (Candida) que se tiñen
como Gram Positivas.

Es propiedad intelectual del Dr. Julio Cesar Luna Leyza © - La Paz Bolivia
Se autoriza su reproducción siempre y cuando se solicite por escrito al autor intelectual – juliolunaleyza@gmail.com
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Estructura. La estructura de la pared celular que puede diferenciar a dos grupos de bacterias por el contenido de la
pared celular que está conformada principalmente por el Peptidoglucano, más gruesa en las Gram (+) y más delgada en 3
las Gram (-); por fuera del Peptidoglucano de las Gram (+), se encuentran los ácidos Teicoicos, mientras que las bacterias
Gram (-) tiene por fuera del Peptidoglucano el Lipopolisacárido.

Desde que Cristian Gram obtuvo la tinción diferencial que ahora lleva su apellido, justificaba la coloración violeta de las
bacterias Gram (+) por la formación del Complejo Cristal Violeta Lugol denominado Complejo Violeta Lugol Positivo,
posterior a su muerte se determinó llamarlas a estas bacterias sólo Gram Positivas en honor a su descubridor.

En cuanto a las bacterias Gram (-) que adoptaban la coloración rosada, decía que eran bacterias del Complejo Violeta
Lugol Negativo porque no retenían el colorante violeta y a su muerte fueron denominadas bacterias Gram Negativas.

Se afirmaba que las bacterias Gram (+) se diferenciaban de las bacterias Gram (-) por el contenido (grosor) del
Peptidoglucano, que se mantuvo por muchos años como verdad, pero por las investigaciones de siempre, se toma en
cuenta la estructura con la afinidad de los colorantes. Por fuera de las Gram (+) se encuentran los ácidos Teicoicos que
tienen polímeros de Fosfato de Glicerol o de Ribitol y determinan una carga negativa que atraen a los iones de Mg; los
Gram (-) tiene por fuera a los Lipopolisacáridos que están compuestos por el Lípido A, el Core o Centro y el Antígeno O.

Por lo tanto, el fundamento se relaciona con las estructuras que tienen las Gram (+) que no tienen las Gram (-).

Fundamento (Julio Luna 2021). Así, finalmente, el fundamento de la tinción de Gram, o sea el por qué se tiñen de esos
colores, se basa en la “adquisición del complejo Cristal Violeta Ribonucleato de Magnesio Iodo (Lugol) por las
bacterias Gram Positivas a través del Fosfato de Ribitol de los ácidos Teicoicos que se unen, junto al Mg, con
el colorante Violeta Cristal y el mordiente Lugol (sustancia Iodo Iodurada), formando el Ribonucleto de
Magnesio” visualizando bacterias de color violeta para las Gram Positivas; y por la ausencia del Ribonucleato de Mg en
las Gram(-) que no retienen el colorante primario con el Lugol y la pérdida del LPS, se observan de color rosado.

A partir del trabajo original de Gram y durante muchos años se han expuesto numerosas teorías al mecanismo de la
reacción de Gram, el más aceptable es el fenómeno que se refiere a la estructura y composición de la pared celular Gram
(+) con los reactivos correspondientes, denominándose a esta su fundamento y todavía se confunde por algunos
estudiantes y profesionales.

PASOS PREVIOS DE LA TINCION (LIFROFI)

Limpiar y/o desengrasar la lámina portaobjetos con agua y jabón o alcohol blanco con un pedazo de tela que no
desprenda pelusa.
Identificar en uno de los extremos con lápiz graso (lápiz de ceja) el código o las iniciales del paciente.
Frotis con el asa bacteriológica en forma centrífuga (del centro a la periferia).
Fijación del frotis realizado mediante el sometimiento al calor de la llama, comprobando con el dorso de la mano la
temperatura del mismo (evitando que se quemen las bacterias).

PASOS DE LA TINCION DE GRAM (VILUAAFUC) (CRIVILUAASA)

(1, 1, 10, 1) ó (11101)

Cristal Violeta o Violeta de Genciana: primer colorante por 1 minuto

Lavar con agua corriente
Lugol: mordiente 1 minuto
Lavar con agua corriente
Alcohol acetona: decolorante menos de 10 segundos ó colocar y un enjuague rápido
Lavar con agua corriente
Safranina o Fucsina básica: segundo colorante por 1 minuto
Lavar con agua corriente

PASOS POSTERIORES A LA TINCION DE GRAM (SEOB)

Secar el medio ambiente

Observar al microscopio con objetivo de inmersión

MATERIALES PARA REALIZAR LA PRÁCTICA:

➢ Individual Presencial: Gorro, barbijo, guantes descartables, jabón (recomendado) y toalla, traer neceser
(estuche) para material de limpieza. Un pliego de papel madera, doblados en dos. Regla milimétrica.
➢ Individual Presencial o Virtual: Colores azul y rojo ó violeta y rosado (fucsia). Portaobjetos. Hisopo estéril.

BIBLIOGRAFÍA

• Luna J. Tinción de Gram y Bacterioscopía en: Manual de prácticas de microbiología. 5 Ed. 2021. La Paz
• Mahom C, Lehman D. Diagnóstico Microbiológico. 6 Ed. Amolca. 2020. Medellín.
• Procop G & col. Koneman´s Color Atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 7 Ed. Wolters Kluwer.
2017.Philadelphia.
• Struthers K, Westran R. Bacteriología clínica. 1 Ed. Masson. 2005. Barcelona.
• Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scott Diagnóstico Microbiológico. 11 Ed. Panamericana. 2004. Buenos
Aires.
• Bryan A, Bryan Ch. A., Bryan Ch G. Bacteriología: principios y práctica. 1 Ed. Continental. 1976. México.

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