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crítica.
BIOLÓGICO Y METROICROBIAL CONTROL
USDAÐARS, Laboratorio de Biocontrol de Insectos y Laboratorio de Productos Químicos que Afectan el Comportamiento de los Insectos,
Beltsville, MD 20705-2350
Los escarabajos del gusano de la raíz del maíz son las principales (Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae
plagas del maíz, aunque ciertas especies de escarabajos (Metschnikoff), para el control de estas plagas
diabroticitas también se alimentan de soja, Glycine max (L.) Merr .; (Krueger y Roberts 1997, Pereira y Roberts 1991, Sosa-
los melonesCucumis spp.), pepinos, Cucumis sativus L., y Gomez y Moscardi 1998). Bacterias, distintas debacilo
cacahuetes, Arachis hypogea L. Además de dañar el cultivo, los turingiensico Cepas de Berliner para el gusano de la
escarabajos adultos transmiten marchitez bacteriana y raíz del maíz (Diabrotica spp.) (Baum et al.
enfermedades virales (York 1992). La chinche verde del sur, 2004), no se utilizan para el control de estos insectos.
Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae), es una plaga Otras bacterias como pigmentadasSerratia marcescens
de los cultivos de solanáceas, pero también tiene gustos más Bizo se ha aislado de insectos muertos e implicado como
generales que se extienden a la soja, otras leguminosas, el agente causal de la enfermedad (Grimont y Grimont
algodón (Gossypium spp.) y diversas hortalizas, incluidos los 1978). Los patógenos se han identificado tradicionalmente
tomates (Lycopersicum spp.) (McKinlay et al. 1992). Estos utilizando los postulados de Koch (según Black 1996) en los que el
insectos se controlan actualmente mediante el uso de primer paso para identificar el agente causal es el aislamiento de
insecticidas, ya sea de manera profiláctica o en un programa los insectos enfermos.
integrado de manejo de plagas. La propensión de los insectos Bacterias pigmentadas violetas como Chromobacterium
a desarrollar resistencia a los insecticidas ha fomentado el violaceum Los Bergonzini se han aislado con poca frecuencia
uso de otros medios de control. de insectos y no se han considerado previamente dañinos
Una alternativa al control químico tradicional es el para los insectos (Bucher 1981). En el barrenador de grano
uso de patógenos. Hongos, comoBeauveria bassiana más grande,Prostephanus truncatus (Horn), estas bacterias
pueden estar involucradas en la digestión de la celulosa
La mención de una marca comercial o producto patentado no constituye (Vazquez-Artista et al. 1997), formando una asociación
una garantía del producto por parte del Departamento de Agricultura de los
simbiótica más que patógena. El genoma de
Estados Unidos y no implica su aprobación con exclusión de otros productos
que también puedan ser adecuados. C. violaceum ha sido secuenciado. Además del pigmento
1 Autor para correspondencia: Laboratorio de control biológico de insectos del USDAÐARS, violeta violaceína, que tiene actividad antimicrobiana
Beltsville, MD 20705-2350 (correo electrónico: phyllis.martin @ .ars.usda.gov ). contra bacterias grampositivas y gramnegativas (Duran
2 Laboratorio de Sustancias Químicas que Afectan el Comportamiento de los Insectos, Beltsville, MD
et al. 1983) yTrypanosoma cruzi Chagas (Duran et al.
20705-2350.
3 Dirección actual: Universidade Federal do Paraná, Departamento de 1994), contiene un gen similar a un gen insecticida que se
Zoologia, Caixa Postal 19020, Curitiba, PR 81531-990, Brasil. encuentra en Photorhabdus luminescens
Junio de 2007 METROARTIN ET AL .: TOXICIDAD DE C. subtsugae PARA PAGest INSECTOS 681
Thomas y Poinar y en Nematophilia de Xenorhabdus Versity. Gusanos de la raíz del maíz occidental,Diabrotica
Poinar y Thomas (Consorcio Nacional Brasileño del virgifera virgifera LeConte, se obtuvieron de C. Neilson
Proyecto Genoma 2003). (USDAÐARSÐNGIRL, Brookings, SD) y se mantuvieron en las
Una nueva especie de Chromobacterium, Chromobacterium mismas condiciones descritas para los gusanos de la raíz del
subtsugae Martin et al., Resultó ser tóxico para el escarabajo de la maíz del sur.
patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata Bioensayos. Las chinches apestosas verdes del sur se
(Diga) Martin et al. 2004). Aquí, describimos la toxicidad de estas incubaron 48 h en jaulas de plástico sin agua. Se utilizaron
bacterias en ensayos de laboratorio para otras plagas de insectos: veinte adultos por tratamiento con cinco chinches por jaula.
dos especies de gusanos de la raíz del maíz y la chinche apestosa Los machos y las hembras se probaron por separado. Las
verde del sur. suspensiones deC. subtsugae se entregaron a los adultos en
1 ml de líquido compuesto por 0,5 ml de agua destilada y 0,5
ml de suspensión bacteriana. Los tubos de microcentrífuga
Materiales y métodos
que contenían el material de prueba o agua como control se
Cepas bacterianas y medios. Las colonias violetas de la cepa taparon con algodón y se reemplazaron cada 3 días. La
bacteriana PRAA4-1 fueron aisladas en el verano de 2000, de suelo mortalidad se registró diariamente durante 6 días. Los
de bosque de Maryland plantado en agar L, por S. Stone (Martin et tiempos de supervivencia se determinaron con el
al. 2004). Las bacterias violetas eran Gramrods, identificadas procedimiento LIFEREG utilizando la distribución de Weibull
preliminarmente comoC. violaceum en comparación con las con intervalos de confianza del 95% (SAS Institute 2004),
descripciones del manual de Bergey (Sneath debido a la limitación del número de insectos (Preisler y
1984) .Cuando se secuenciaron los primeros 500 pb del ADN Robertson 1989).C. subtsugae a las ninfas, pero las ninfas no
ribosómico 16S, la identificación fue solo para el género se alimentaron consistentemente en un sistema de
Cromobacteria (Accugenix, Newark, DE). Esta cepa bacteriana suministro de líquido.
se ha subcultivado semanalmente a temperatura ambiente La toxicidad de C. subtsugTambién se ensayó la ae a los adultos
en agar L (Atlas 1997). Para los recuentos bacterianos, de stickbug verde mediante inyección de cultivos muertos
usamos agar RM (Martin et al. 1998), que contiene la mitad de (esterilizados en autoclave a 121ºC durante 20 min). Se inyectó
los nutrientes del agar L. Debido a que los recuentos de ventralmente un microlitro de cultivo sin diluir en el abdomen de
bacterias viables no se correlacionaron con la toxicidad, 10 machos y 10 hembras. Los controles de 10 machos y 10
usamos la densidad óptica como una medida de la densidad hembras también se inyectaron con agua destilada estéril. La
celular. La correlación entre la densidad óptica y la toxicidad mortalidad se registró diariamente durante 5 días.
para el escarabajo de la patata de Colorado fue de 0,77 Los ensayos del gusano de la raíz del maíz se realizaron con
(PAWM, datos no publicados). escarabajos adultos del gusano de la raíz del maíz del sur o del
Caracterización preliminar de toxinas. Las bacterias se cultivaron gusano de la raíz del maíz occidental de sexos mixtos, como
en placas de agar-L a 25 ° C durante 48 h para probar si las bacterias describen Schroder et al. (2001).C. subtsugae se recogió a las 48 h
podían recuperarse de los insectos muertos, cumpliendo así los en 20 ml de jugo de sandía que contenía glicósido de
postulados de Koch para identificar un patógeno; o durante 120 h para cucurbitacina-E al 0,08% (Matsuo et al. 1999) mezclado con
una mayor estabilidad durante el almacenamiento. Las bacterias se almidón Mirasperse al 3% (AE StaleyManufacturer Co., Decatur, IL).
recogieron en 15 ml de agua destilada estéril. Se esterilizaron en Se añadieron cinco gotitas de 25 l a cada placa de Petri de 100
autoclave volúmenes de diez mililitros a 121 ° C durante 10 min para mm. Se agregaron cinco escarabajos a cada plato y los controles
probar la estabilidad. Las células se retiraron de la suspensión por (sin las bacterias) y los tratamientos se repitieron cinco veces. A las
centrifugación y se filtraron a través de un 48 h, se introdujo humedad adicional mediante una mecha dental
Filtro Millipore de 0,45 m (Millipore Corporation, Billerica, MA) previamente humedecida y se añadió alimento adicional (ya sea la
para producir un sobrenadante libre de células. La fracción de dieta del gusano de la raíz del maíz occidental o la calabaza). La
sedimento se formó resuspendiendo el sedimento hasta el mortalidad se registró 5 días después de iniciado el tratamiento.
volumen original.
Insectos La colonia de chinches apestosas verdes del sur Para los ensayos de larvas del gusano de la raíz del maíz, los
se originó a partir de especímenes recolectados cerca de huevos se incubaron y las larvas se alimentaron en raíces de maíz
Stoneville, MS, y los insectos se criaron en la ducha del sol, germinadas en arena a temperatura ambiente. Las raíces se
Helianthus annuus L., semillas y judías verdes, Phaseolus mantuvieron húmedas mediante riego diario. Las larvas (16) se
vulgaris L., a 28 C, 65% de HR y un fotoperíodo de 16: 8 (L: D) extrajeron después de 3 semanas y se transfirieron a gránulos de
h (Aldrich et al. 1993). dieta liofilizados (Martin 2004a) hechos con una dieta de gusanos
Inicialmente, los gusanos de las raíces del maíz del sur, de la raíz del maíz (BioServ, Frenchtown, NJ), que se habían
Diabrotica undecimpunctata howardi Barber (Coleoptera: rehidratado con agua oC. subtsugae suspensión. Las larvas en
Chrysomelidae), se obtuvieron de French Agricultural Research, bandejas selladas se incubaron a 25 ° C y 50% de HR en la
Inc. (Lamberton, MN). Los adultos se mantuvieron durante 3 oscuridad. La mortalidad se registró cada 24 h. Las larvas
semanas antes de la prueba a 24 C, 30% de HR y un fotoperíodo supervivientes se pesaron después de 4 d. Las diferencias de peso
de 16: 8 (L: D) h. Los escarabajos se alimentaron con una dieta se compararon mediante PROC MIXED (SAS Institute 2004).
artificial (Branson y Jackson 1988). Más tarde, se estableció una Recuperación de C. subtsugae de Insectos Muertos. Porque
colonia de gusanos de la raíz del maíz en el sur a partir de insectos la viabilidad de C. subtsugae declina después de 72 h de
recolectados en el campo de Beltsville, MD, en 2003. La colonia se crecimiento en medio, la recuperación de insectos se realizó
ha mantenido en las raíces del maíz para las larvas y en las cuas y utilizando cultivos que no crecieron en medio sólido durante 48 h.
agua para los adultos. Los insectos recolectados en el campo se Insectos que habían muerto después de ingerirC. subtsugae Las
introducen anualmente para mantener la di- células se trituraron en 0,5 ml de agua estéril utilizando un
682 JNUESTRO DE miCONÓMICO miNTOMOLOGÍA Vol. 100, no. 3
Referencias citadas
Discusión
Aldrich, JE, H. Numata, M. Borges, F. Bin, GKWaite y
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gusano de la raíz del maíz después de consumir C. subtsugae en agua o Nezara spp. y otras chinches apestosas (Heteroptera:
en una formulación de cebo fueron similares a los resultados con el Pentatomidae) A. Naturforsh. C. 48: 73-79.
escarabajo de la papa de Colorado (Martin et al. 2004). La reducción del Atlas, RM 1997. Manual de medios microbiológicos.
peso o la inhibición de la alimentación con las larvas del gusano de la
CRC, Boca Ratón, FL.
Baum, JA, C.-R. Chu, M. Rupar, GR Brown, WP Don-
raíz del maíz fue similar a la observada conLymantria disparL.) (Martín
ovan, JE Huesing, O. Ilagan, TM Malvar, M. Pleau, M.
2004b). Aunque se utilizaron cultivos bacterianos completos en la
Walters y T. Vaughn. 2004.Toxinas binarias de bacilo
mayoría de los experimentos, las bacterias vivas no parecen ser turingiensico son activos contra el gusano de la raíz del
necesarias para la letalidad. Varias líneas de evidencia apoyan esta maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.
hipótesis. Primero, las bacterias productoras de pigmento violeta no se Apl. Reinar. Microbiol. 70: 4889Ð4898.
pudieron aislar de las chinches apestosas ni de los gusanos de la raíz Negro, JG 1996. Microbiología: principios y aplicaciones,
del maíz que habían muerto después de alimentarse deC. subtsugae 3ª ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, Nueva Jersey.
células. Por lo tanto, el primer paso para identificar un patógeno no Branson, TF y JJ Jackson. 1988.Una dieta mejorada para
pudo cumplirse. En segundo lugar, en el caso de las chinches adulto Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera:
Chrysomelidae). J. Kans. Entomol. Soc. 61: 353Ð355.
hediondas, los Þltrados libres de células por sí solos causan la
Consorcio Nacional Brasileño del Proyecto Genoma. 2003.los
mortalidad. En tercer lugar, las células matadas por autoclave también
secuencia completa de Chromobacterium violaceum
mataron a las chinches hediondas de una manera similar a los cultivos
revela una adaptabilidad bacteriana notable y explotable.
completos viables. En cuarto lugar, las células muertas en autoclave Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 11660Ð11665.
mataron al 70% de las chinches hediondas masculinas en 48 h mediante Bucher, GE 1981. Identicación de bacterias encontradas en
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mortalidad. Se sabe que las toxinas insecticidas orales termoestables, Duran, N., RV Antonio, M. Haun y RA Pilli. 1994.
Biosíntesis de un tripanocida por Chromobacterium
como la exotoxina, son producidas por cepas deB. thuringiensis (
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para los escarabajos diabroticita (Schroder et al. 2001) podrían
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