PRUEBAS BIOQUIMICAS

AGAR SALMONELLA
MEDIO DE CULTIVO: es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento de bacilos entéricos
patógenos, en especial los pertenecientes al género Salmonella, a partir de muestras clínicas.

El agar Salmonella-Shigella es una modificación del agar citrato desoxicolato descrito por Leifson1. Se le
considera un medio moderadamente selectivo según el nivel de inhibición de los microorganismos gram
positivos y Enterobacteriaceae diferentes de Salmonella y Shigella, que inhibe por contenido de sales
biliares, verde brillante y citratos

En los laboratorios de microbiología el medio Salmonella-Shigella es muy utilizado para investigar la

presencia de Salmonella y Shigella en muestras de heces diarreicas, aguas residuales, agua potable y
alimentos.

Cada componente del medio de cultivo Salmonella-Shigella posee una función específica, y el conjunto
de la mezcla le brinda las propiedades que lo caracterizan.

SIM

El medio SIM es un agar semisólido y diferencial, especialmente diseñado para ayudar a la

identificación de algunas bacterias, principalmente de la familia Enterobacteriaceae. Está compuesto por
tripteína, peptona, sulfato de hierro, sulfato de amonio, tiosulfato de sodio y agar.

Este medio permite la ejecución de tres importantes pruebas: la producción de sulfuro de hidrógeno
(H2S), la formación de indol y la motilidad, de allí proviene el acrónimo SIM. Por su gran utilidad no
puede faltar en un laboratorio de bacteriología.

Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes para el desarrollo microbiano. El
triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas y particularmente de la tripteína y
puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto
de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Ehrlich
(Indol Reactivo REF B1550361) o de Kovac´s, para originar un compuesto de color rojo A partir del
tiosulfato de sodio los microorganismos pueden generar ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro
presente formándose un compuesto de color negro. El agar es el agente solidificante y a esta
concentración le otorga al medio la propiedad de ser semisólido, condición necesaria para detectar
movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de
la línea de siembra del microorganismo en estudio.
SEGUNDA DIAPOSITIVA

MANITOL ROJO FENOL

La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos.
El manitol es el carbohidrato fermentable, se manifiesta por un cambio de color del indicador el rojo de
fenol que vira de rojo a amarillo. La detección de gas se observa por la formación de vacío o burbuja en
la campana de Durham

El caldo rojo de fenol es usado para observar la fermentación de algún carbohidrato como puede ser
maltosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trealosa, etc. El caldo rojo de fenol solo lleva un carbohidrato a la
vez.

ROJO DE METILO Y VOGES- PROSKAUER

En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los
microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos
finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil
carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un
indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa
naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y
Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a
los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del
acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

TERCERA DIAPOSITIVA

AGAR SALMONELLA SHIGUELLA

SELECTIVO

Este medio es altamente selectivo debido a que contiene sales biliares, citrato de sodio y verde brillante.
Por ello, inhibe el crecimiento de todas las bacterias Gram positivas y de la mayoría de los bacilos Gram
negativos, incluyendo algunos coliformes.

Principalmente, el género Salmonella es muy resistente a las sales biliares, tanto que son capaces de
vivir en la vesícula biliar de algunos pacientes portadores que expulsan la bacteria constantemente por
las heces.

DIFERENCIAL

La lactosa es el carbohidrato fermentable que ayuda a diferenciar las cepas fermentadoras de lactosa de
las no fermentadoras. Esta propiedad es evidenciada por la presencia del indicador de pH, que en este
medio es el rojo de fenol.

Las cepas fermentadoras de lactosa dan colonias rojas, mientras que las no fermentadoras son
incoloras. Esta característica es importante, ya que Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa.
Por otra parte, este medio contiene tiosulfato sódico como fuente de sulfuro y citrato férrico como
fuente de hierro. Ambos compuestos logran diferenciar a las bacterias capaces de producir sulfuro de
hidrógeno. Estas reaccionan para formar un precipitado negro de sulfuro férrico insoluble y visible.

SIM

A diferencia de otros medios, este debe ser semisólido para que sea detectable la capacidad de
movimiento que poseen algunas bacterias. En este sentido, esta prueba funciona muy bien para
enterobacterias, no así en bacilos Gram negativos no fermentadores, en donde se prefiere usar otros
métodos, como por ejemplo la gota pendiente.

CUARTA DIAPOSITIVA

ROJO DE METILO Y VOGUES

El Medio MR-VP se utiliza en la diferenciación de bacilos Gram-negativos entéricos sobre la base de las
reacciones de rojo de metilo y acetilmetilcarbinol (Voges-Proskauer) del grupo Escherichia-Enterobacter.
La peptona de caseína proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales para el
crecimiento.

MANITOL ROJO FENOL

En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de

carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el
hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se en- cuentra en alta concentración) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el
agar es el agente solidificante.

Se trata de un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a la
capacidad de fermentación del manitol por los microorganismos.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen
ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los
estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pue- den o no fermentar el manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se vi- sualizan como colonias amarillas
rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona
del mismo color o púrpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento de es- tafilococos
patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos y otros
materiales de impor- tancia sanitaria.
QUINTA DIAPOSITIVA

AGAR SS

Este aisla bacilos entéricos patógenos, en especial los pertenecientes al género Salmonella, a partir de
muestras clínicas

PROCEDIMIENTO

Siembra

Sembrar estriando directamente la superficie del medio de cultivo.

Incubación

En aerobiosis a 33-37 °C durante 18-24 horas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadaso rojizas.

Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio, incoloras.

Microorganismos productores de SH2: colonias con centro negro.

SIM
Medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno por
los microorganismos. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

PROCEDIMIENTO

Siembra

Por punción profunda utilizando aguja de inoculación recta. Inocular el centro del tubo, y la punción
debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie.

Incubación

En aerobiosis. a 33-37 °C, durante 18-24 horas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Observar la movilidad y el color del medio de cultivo. Luego realizar la prueba de indol.

Movilidad:

Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de

la línea de siembra.

Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

Producción de SH2:

Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo a lo largo

de la línea de siembra o en todo el medio.

Resultado negativo: el medio permanece sin cambio de color.

Prueba del indol:

Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de Indol Reactivo

Resultado positivo: color rojo.

Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

ROJO DE METILO

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con
producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por
la vía butanodiólica.

PROCEDIMIENTO

Siembra

Por inoculación directa a partir del cultivo en estudio.

Incubación

En aerobiosis, a 33-37°C durante 48 a 72 horas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Examinar los tubos y revelar las pruebas bioquímicas

Prueba del rojo de metilo: añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el
color del medio.

Prueba del Voges Proskauer: añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de
hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura
ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

Interpretación:

Prueba del rojo de metilo:

Resultado positivo: color rojo.

Resultado negativo: color amarillo.

Prueba de Voges Proskauer:

Resultado positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del
tubo.

Resultado negativo: ausencia de color rojo.

MANITOL ROJO FENOL

Base de Caldo Rojo Fenol es un medio sin carbohidratos agregados que se utiliza como base para la
adición de los carbohidratos para determinar las reacciones de fermentación de los microorganismos.
Debe ser capaz de soportar el crecimiento de organismos de prueba.

PROCEDIMIENTO

Siembra

Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra por estría.

Incubación

En aerobiosis, a 33-37 °C durante 18-24 hs. Si a las 24 horas las placas presentan resultado negativo,
incubar otras 24 horas.

La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la in- cubación durante 3 días a 32 °C, en
aerobiosis.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Microorganismos fermentadores de manitol: colonias de color amarillo rodeadas o no de un halo

amarillo.

Microorganismos no fermentadores de manitol: colonias del color del medio, rojas rodeadas o no de
halo rojizo-púrpura.