Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Laboratorio de Evaluación de Fármacos y Medicamentos I

Bioensayo de toxicidad en Artemia salina L.

Asesor: Osvaldo Garrido Acosta

Integrantes:
Castillo Alfaro Fernando Arael
Hernandez Hernandez Lucero Beatriz
Hernández Hernández Rocio Guadalupe
Martinez Ballinas Andres
Ortega Jasso Jenifer Karina
Trujillo Iturbide Nallely
 Fecha de entrega: 9-Abril-2019

Introducción:
Se realizó un bioensayo de toxicidad aguda utilizando como organismo el crustáceo Artemia
salina, se realizarón pruebas con siete sustancias diferentes, cada prueba involucra la
exposición de organismos a una serie de diferentes concentraciones de la sustancia y la
determinación de la respuesta del organismo que incluye la supervivencia de este, comparada
con la supervivencia de los organismos en un estándar, en este caso se utilizó el cloruro de
mercurio II, que es, de los reactivos utilizados, el más tóxico para las artemias. Se colocó una
población de 10 artemias en once tubos y se expusieron a la sustancia problema a diferentes
concentraciones y al transcurrir 120 minutos de exposición se realizó un conteo de las
artemias muertas en cada tubo para realizar los cálculos correspondientes y obtener la CL 50
para cada sustancia utilizada.

Marco teórico
En el campo de la toxicología y la ecotoxicología es necesario determinar el efecto que
produce uno o varios compuestos químicos (presuntamente tóxicos) a los individuos de una
determinada especie; así como su capacidad de acumulación en los tejidos vivos y en
general, su comportamiento en el compartimento biótico del ecosistema. Los experimentos
diseñados para este fin son los denominados bioensayos. La FAO define el término bioensayo
como:<<tests en los cuales un tejido vivo, organismo o grupo de organismos, se usan como
reactivos para la determinación de la potencia de alguna sustancia activa fisiológicamente>>.
(Serrano, 2003, p.145)

Este tipo de experimentos se puede utilizar para determinar la toxicidad de contaminantes

para diferentes especies de organismos registrando la mortalidad que producen, u otros
efectos no letales, que ponen en peligro la supervivencia de los individuos o de las
poblaciones en el medio natural, como por ejemplo efectos negativos sobre el
comportamiento, la reproducción o el metabolismo. En un sentido más amplio los bioensayos
incluyen también test de acumulación de los tóxicos en los organismos, diferenciándose entre
las diferentes vías de entrada de los xenobióticos. Mientras que los animales terrestres
acumulan contaminantes principalmente a través del alimento, en el medio acuático se
pueden distinguir tres procesos diferenciados: bioconcentración, bioacumulación y
biomagnificación. (Serrano, 2003, p.145)

La bioconcentración es el proceso por el que un compuesto entra en un organismo acuático

directamente desde el agua a través de las agallas o de los tejidos epiteliales como
consecuencia de un simple equilibrio químico de partición entre los tejidos y el agua. La
bioacumulación incluye tanto la bioconcentración como los procesos de entrada de residuos
químicos a tráves de la comida. Por su parte, la biomagnificación hace referencia a la totalidad
de procesos por los cuales la concentración tisular de un compuesto químico bioacumulado se
incrementa a medida que este material pasa a través de dos o más niveles tróficos. En la
mayoría de los organismos acuáticos predominan los procesos de bioconcentración. (Serrano,
2003, p.146)

Los bioensayos utilizados en ecotoxicología acuática se clasifican, en función de su duración y

del método que se emplea para añadir el tóxico al agua, de la siguiente manera:

● Tests a corto plazo: El periodo de tiempo oscila entre 48 y 96 horas y normalmente no

se suministra comida a los organismos de experimentación, la gran ventaja de estos
tipos de bioensayos es la rapidez de los resultados.
● Tests a largo plazo: Su duración oscila entre 7 días y uno o varios meses; la ventaja
que este presenta es su mayor fiabilidad.
● Tests estático: Son bioensayos generalmente de corta duración en los que los
organismos están durante todo el período de experimentación en el mismo medio.

Cuestionario
1. Indique las diferencias principales entre DL50 y CL50.
DL50
La Dosis letal 50% (DL50) es aquella concentración del insecticida, que al ser administrada
por cualquier vía de ingreso (oral o dermal por ejemplo), en un periodo de tiempo definido
mata el 50% de la población de insectos evaluada. (Díaz Baez, 2004, 312-315)
La DL50 es la dosis de sustancia que produce la muerte del 50% de una muestra de
organismos un plazo de tiempo predeterminado. (Repetto, 1997, p.295)
CL50
La abreviación CL50 significa la concentración que causa la muerte de la mitad de la
población expuesta al tóxico. (Díaz Báez, 2004, 312-315)

2. Indique los organismos utilizados para las pruebas de toxicidad.

Organismos utilizados para la prueba de toxicidad
• Bacterias: Photobacterium.
• Algas: Selenastrum, Chlorella.
 • Plantas: Terrestres y acuáticas.
• Insectos terrestres: cucarachas, moscas, ácaros.
• Acuáticos: Crustáceos, moluscos, larvas de insectos.
• Vertebrados: Terrestre (Mamíferos: rata, conejo, aves: pollo, codorniz, acuáticos:
peces).
3. Describa las características del crustáceo Artemia salina L.
La artemia está ligada a charcas y lagos hiper salinos que albergan comunidades con poca
diversidad de especies y una estructura trófica bastante simple. (Kumar D, 2017, 1617-1627)
La artemia es un crustáceo filtrador. Mediante la actividad filtradora captura bacterias, algas
unicelulares, pequeños protozoos y detritus del medio. (Kumar D, 2017, 1617-1627)
La artemia salina contiene importantes cantidades de proteínas altamente digeribles,
vitaminas y beta- carotenos; sustancia que realza e intensifica los colores en algunos peces y
aves (caso del flamenco). Estas propiedades convierten a la artemia salina en un alimento
clave e insustituible en la cadena trófica. (Kumar D, 2017, 1617-1627)
Es capaz de regular su equilibrio osmótico de tal manera que presenta una concentración de
solutos interno inferior al del medio exterior, sea cual sea la concentración en el exterior.
(Kumar D, 2017, 1617-1627)
La artemia tolera un rango térmico de entre 6 a 35ºC, siendo su óptimo alrededor de 25 a
27ºC. (Kumar D, 2017, 1617-1627)

4. Indique los campos de aplicación de las pruebas de toxicidad.

• Toxicología ambiental.
• Toxicología ocupacional (industrial).
• Toxicología de alimentos.
• Toxicología clínica.
• Toxicología descriptiva.
• Toxicología forense.
• Toxicología analítica.
• Toxicología mecánica.

5. Indique las ventajas de utilizar organismos inferiores en las pruebas farmacológicas.

6. Defina el concepto de pruebas de screening farmacológico.
Estos métodos de screening son análisis simples que se utilizan para la identificación o el
descarte de patologías en pacientes. Se utilizan para obtener una información rápida sobre
esas patologías. Generalmente, si el resultado es positivo, se necesita realizar un análisis más
concluyente para confirmar la enfermedad.
Los métodos de screening pueden ser:
● cualitativos: ofrecen información sobre si una sustancia se encuentra en una muestra
o no.
● cuantitativos: ofrecen información sobre la concentración de una sustancia en una
muestra.
● semicuantitativos: ofrecen una cuantificación de un compuesto de manera no
numérica, por ejemplo: positivo (++), posible positivo (+), posible negativo (-), negativo
(–).

7. Indique los organismos utilizados para las pruebas de screening farmacológico.

Objetivo
Determinar la toxicidad de diferentes sustancias mediante el cálculo de su potencia
en un bioensayo en Artemia salina L.

Hipótesis
Mediante un bioensayo de toxicidad en una población de Artemia salina la cual es
muy sensible a sustancias citotóxicas se podrá determinar el efecto dosis
respuesta de HgCl2 y AgSO4

Material y reactivos:
● 11 Tubos de ensaye. al 1%.
● Pipetas de vidrio. ● Disolución de sulfato de plata al 1%.
● Jeringas de 1 mL. ● Disolución de nicotina al 1%.
● Vasos de precipitados de 100. ● Disolución de acetato de plomo al
● Pipetas Pasteur con bulbo. 1%.
● Gradilla. ● Disolución de tiocianato de potasio al
● Agua de mar artificial. 1%.
● Disolución de etanol al 42%. ● Disolución de dicromato de potasio
● Disolución de cloruro de mercurio (II) al 1%.
Preparación de las muestras
Las muestras se prepararon de acuerdo con la siguiente tabla:

Muestra (mL) Volumen de Volumen de agua Concentración

disolución de de mar artificial (mg/mL)
HgCl2 ó Ag2SO4
1 0 2
2 0.2 1.8
3 0.4 1.6
4 0.6 1.4
5 0.8 1.2
6 1 1
7 1.2 0.8
8 1.4 0.6
9 1.6 0.4
10 1.8 0.2
11 2 0
Tabla 1.Forma de preparación de las muestras.

Realización del bioensayo

1. Coloqué el volumen de disolución de prueba en cada tubo de ensaye previamente

marcado.

2. Se colocarán 10 nauplios de Artemia salina L. por cada uno de los tubos de ensaye,
evitando agregar demasiada agua de mar artificial.

3. Se colocará el volumen de agua de mar artificial necesario para completar a un volumen

total de 2 mL.
4. Se observará el movimiento de los organismos por un periodo de 120 minutos.

5. Al término del periodo de observación se contarán los nauplios de Artemia salina L.

que sobrevivieron de la siguiente manera:
a. Los nauplios que presentan movimiento, aunque sea este mínimo, se consideran vivos.
b. Los nauplios que permanecen inmóviles, se consideran muertos.

Colocar 10 nauplios de
Colocar el volumen de Completar con agua de
Artemia salina L. en cada
disolución de prueba en mar artificial un volumen
tubo, evitando agregar
cada tubo de ensaye total de 2 mL.
demasiada agua

Se observará el Transcurrido el tiempo

movimiento de los se contarán los nauplios
organismos por un de Artemia salina L. que
periodo de 120 minutos sobrevivieron.

Resultados:

HgCl2 AgNO3 Nicotin Pb(Ac)2 KSCN K2Cr2O7 EtOH

a
muestr M T M T M T M T M T M T M T
a
0 1 0 1 0 10 0 10 0 1 0 10 0 1
1
0 0 0 0
6 1 0 1 5 12 6 10 0 1 0 10 1 1
2
0 0 0 0
8 1 0 1 5 10 7 10 0 11 3 10 7 1
3
0 0 0
4 6 1 0 1 7 10 9 10 1 11 4 10 1 1
 0 0 0 0
1 1 0 1 7 12 10 10 0 11 4 10 1 1
5
0 0 0 0 0
9 1 0 1 8 12 10 10 0 11 7 10 1 1
6
0 0 0 0
1 1 0 1 4 11 10 10 0 1 5 10 1 1
7
0 0 0 0 0 0
1 1 4 11 7 10 10 10 4 1 5 10 1 1
8
0 0 2 0 0
1 1 11 11 8 11 9 10 4 1 7 10 1 1
9
0 0 0 0 0
1 1 1 1 6 10 7 10 1 1 9 10 1 1
10
0 0 0 0 0 0 0 0
1 1 2 1 6 12 0 10 11 11 8 10 1 1
11
0 0 0 0 0
Tabla 2. Cantidad de organismos con efecto y totales para cada sustancia utilizada.

Tratamiento de resultados:

HgCl2
mue Vsustanci % Ajust
M T
stra a C(mg) logCo P E U.P e
1 #¡NU 3.3
1 0
0 0 0 M! 0 0 6 0.05
1 0. 5.2
2 6
0 0.2 2 0.30 6 60 5
1 0. 5.8
3 8
0 0.4 4 0.60 8 80 4
1 0. 5.2
4 6
0 0.6 6 0.78 6 60 5
1 10 6.6
5 10
0 0.8 8 0.90 1 0 4 0.95
1 0. 6.2
6 9
0 1 10 1.00 9 90 8
1 10 6.6
7 10
0 1.2 12 1.08 1 0 4 0.95
1 10 6.6
8 10
0 1.4 14 1.15 1 0 4 0.95
1 10 6.6
9 10
0 1.6 16 1.20 1 0 4 0.95
10 10 1 1.8 18 1.26 1 10 6.6 0.95
 0 0 4
1 10 6.6
11 10
0 2 20 1.30 1 0 4 0.95
Método UP
β= 1.55 Μ50= 0.16
1.449
4.75
α= CL50= 7
Tabla 3. Resultados de CL50 para la prueba con una disolución de cloruro de mercurio II al 1%

Gráfica.1 Determinación de CL50 por método gráfico para cloruro de mercurio II.

AgNO3
mues Vsustanci C(m Ajust
M T
tra a g) logCo P %E U.P e
#¡NU 3.3
1 0 10
0 0 M! 0 0 6 0.05
3.3
2 0 10
0.2 2 0.30 0 0 6 0.05
3.3
3 0 10
0.4 4 0.60 0 0 6 0.05
3.3
4 0 10
0.6 6 0.78 0 0 6 0.05
5 0 10 0.8 8 0.90 0 0 3.3 0.05
 6
3.3
6 0 10
1 10 1 0 0 6 0.05
3.3
7 0 10
1.2 12 1.08 0 0 6 0.05
0.3 36.3 4.6
8 4 11
1.4 14 1.15 6 6 4
6.6
9 11 11
1.6 16 1.20 1 100 4 0.95
6.6
10 10 10
1.8 18 1.26 1 100 4 0.95
4.1
11 2 10
2 20 1.30 0.2 20 6
Método UP
Μ5
α
β 0 CL50 Pr
1.2 12.9
1.8
2.52 7 18.61 3
Tabla 4. Resultados de CL50 para la prueba con una solución de nitrato de plata al 1%.

Gráfica 2. Determinación de CL50 por método gráfico para nitrato de plata al 1%.

Nicotina
mues Vsustanci C(m Ajus
M T
tra a g) logCo P %E U.P te
#¡NU 3.3
1 0 10
0 0 M! 0 0 6 0.05
0.4 41.6
2 5 12
0.2 2 0.30 2 7 4.8
0.5
3 5 10
0.4 4 0.60 0 50 5
0.7 5.5
4 7 10
0.6 6 0.78 0 70 2
0.5 58.3
5 7 12
0.8 8 0.90 8 3 5.2
0.6 66.6 5.4
6 8 12
1 10 1.00 7 7 4
0.3 36.3 4.6
7 4 11
1.2 12 1.08 6 6 4
0.7 5.5
8 7 10
1.4 14 1.15 0 70 2
0.7 72.7 5.6
9 8 11
1.6 16 1.20 3 3 1
0.6 5.2
10 6 10
1.8 18 1.26 0 60 5
0.5
11 6 12
2 20 1.30 0 50 5
Método UP
0.3
β= 5 Μ50= 0.43
4.8
α= 5 CL50= 2.68
Pr= 1.86
Tabla 5. Resultados de CL50 para la prueba con solución de nicotina al 1%.
Gráfica 3. Determinación de CL50 por método gráfico para nicotina.

Pb(Ac)2
muestr Vsustanci % Ajust
M T
a a C(mg) logCo P E U.P e
#¡NU 3.3
1 0 10
0 0 M! 0 0 6 0.05
0.6 5.2
2 6 10
0.2 2 0.30 0 60 5
0.7 5.5
3 7 10
0.4 4 0.60 0 70 2
0.9 6.2
4 9 10
0.6 6 0.78 0 90 8
1.0 10 6.6
5 10 10
0.8 8 0.90 0 0 4 0.95
1.0 10 6.6
6 10 10
1 10 1.00 0 0 4 0.95
1.0 10 6.6
7 10 10
1.2 12 1.08 0 0 4 0.95
1.0 10 6.6
8 10 10
1.4 14 1.15 0 0 4 0.95
 0.9 6.2
9 9 10
1.6 16 1.20 0 90 8
0.7 5.5
10 7 10
1.8 18 1.26 0 70 2
3.3
11 0 10
2 20 1.30 0 0 6
Método UP
β= 0.73 Μ50= 0.41
α= 5.30 CL50= 2.57
Pr= 1.78
Tabla 6. Resultados de CL50 para la prueba con solución de acetato de plomo al 1%.

Gráfica 4. Determinación de CL50 por método gráfico para acetato de plomo al 1%.

KSCN
muest Vsustanc C(m logC Ajust
M T
ra ia g) o P %E U.P e
#¡NU
1 0 10
0 0 M! 0.00 0 3.36 0.05
2 0 10 0.2 2 0.30 0.00 0 3.36 0.05
3 0 11 0.4 4 0.60 0.00 0 3.36 0.05
9.0
4 1 11
0.6 6 0.78 0.09 9 3.66
5 0 11 0.8 8 0.90 0.00 0 3.36 0.05
6 0 11 1 10 1.00 0.00 0 3.36 0.05
7 0 10 1.2 12 1.08 0.00 0 3.36 0.05
 33.
8 4 12
1.4 14 1.15 0.33 33 4.56
9 4 10 1.6 16 1.20 0.40 40 4.75
10
10 10 10
1.8 18 1.26 1.00 0 6.64 0.95
10
11 11 11
2 20 1.30 1.00 0 6.64 0.95
Método UP
β= 2.87 Μ50= 1.20
15.9
1.55
α= CL50= 3
Pr= 11.06
Tabla 7. Resultados de CL50 para la prueba con solución de tiocianato de potasio al 1%.

Gráfica 5. Determinación de CL50 por método gráfico para tiocianato de potasio al 1%.

K2Cr2O7
muestr Vsustanci C(m % Aju
M T
a a g) logCo P E U.P ste
1 #¡NU 0.0
1 0
0 0 0 M! 0 0 3.36 5
1 0.0
2 0
0 0.2 2 0.30 0 0 3.36 5
 1 0. 3
3 3
0 0.4 4 0.60 3 0 4.48
1 0. 4
4 4
0 0.6 6 0.78 4 0 4.75
1 0. 4
5 4
0 0.8 8 0.90 4 0 4.75
1 0. 7
6 7
0 1 10 1.00 7 0 5.52
1 0. 5
7 5
0 1.2 12 1.08 5 0 5
1 0. 5
8 5
0 1.4 14 1.15 5 0 5
1 0. 7
9 7
0 1.6 16 1.20 7 0 5.52
1 0. 9
10 9
0 1.8 18 1.26 9 0 6.28
1 0. 8
11 8
0 2 20 1.30 8 0 5.84
Método UP
2.3
β= 5 Μ50= 0.93
2.9
α= 3 CL50= 7.42
Pr= 5.99
Tabla 8. Resultados de CL50 para la prueba con solución de dicromato de potasio al 1%.

Gráfica 6. Determinación de CL50 por método gráfico para dicromato de potasio al 1%.
 EtOH
muestr Vsustanc % Ajust
M T
a ia C(mg) logCo P E U.P e
1 #¡NU 3.3
1 0
0 0 0 M! 0 0 6 0.05
1 0.1 3.7
2 1
0 0.2 84 1.92 0 10 2
1 0.7 5.5
3 7
0 0.4 168 2.23 0 70 2
1 1.0 10 6.6
4 10
0 0.6 252 2.40 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
5 10
0 0.8 336 2.53 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
6 10
0 1 420 2.62 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
7 10
0 1.2 504 2.70 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
8 10
0 1.4 588 2.77 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
9 10
0 1.6 672 2.83 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
10 10
0 1.8 756 2.88 0 0 4 0.95
1 1.0 10 6.6
11 10
0 2 840 2.92 0 0 4 0.95
Método UP
β= 2.31 Μ50= 2.04
- 123.6
α= 0.32 CL50= 4
85.4
Pr= 3
Tabla 9. Resultados de CL50 para la prueba con solución de etanol al 42%.
Gráfica 7. Determinación de CL50 por método gráfico para etanol al 42%.

Análisis de resultados
Para la determinar la concentración letal (CL 50) de cada sustancia se colocó diferente volúmen
de la sustancia en tubos de ensaye, se colocaron 10 Artemias Salina, se agrego el volumen
de agua que le hacía falta para llegar a un volumen de 2 mL y se tomó el tiempo a 120
minutos para observar los organismo si presentaban motilidad y ser reportados como vivos,
aun así tuvieran poco motilidad, mientras los que no presentaban ninguna movimiento fueron
reportados como muertos.
Después se tomó como estándar la solución al 1% de cloruro de mercurio (HgCl 2) el cual
presentó una concentración letal 50 (CL 50=1.44). Las concentración letal de cada sustancia
fue más alta que el estándar, al comparar los resultados obtenidos por las gráficas se observa
que no todos siguen una linealidad y nos lleva a resultados no exactos; por otra parte los
daños en las muestras no fueron en función a la concentración de las sustancias
administradas.

Conclusión
En esta práctica se evaluó la concentración letal para la Artemia Salina, se cumplieron los
objetivos de evaluar el nivel de toxicidad de cada sustancia. La hipótesis no se cumplio por
qué se esperaba un nivel de concentración letal y potencia relativo más alto que las demás
sustancias

Bibliografía:
● Serrano R. (2003). Introducción al análisis de datos experimentale: tratamiento de
datos en bioensayos. Castelió de la Plana: Publicaciones de la Universitat Jaume I.
D.L.
● Repetto M. (1997). Toxicología fundamental. Madrid: Diaz de Santos.
● Kumar D, Roy R, Parashar A, Raichur AM, Chandrasekaran N, Mukherjee A, et al.
Toxicityassessment of zero valent iron nanoparticles on Artemia salina. Environ Toxicol.
2017; 32(5):1617-1627.
● Díaz Báez MC, Bustos López MC, Espinosa Ramírez AJ. Pruebas de toxicidad
acuática: fundamentos y métodos. Primera edición. Bogotá: Universidad Nacional de
Colombia; 2004.