Guia de Microbiologia y Toxicologia Agroindustrial 2018 Final
Guia de Microbiologia y Toxicologia Agroindustrial 2018 Final
Guia de Microbiologia y Toxicologia Agroindustrial 2018 Final
UNIVERSIDAD NACIONAL
MICAELA BASTIDAS DE
APURIMAC
GUÍA DE LABORATORIO:
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL
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E.A.P. Ingeniería Agroindustrial UNAMBA 2019-I
Guía de práctica: Microbiología y Toxicología Agroindustrial
INTRODUCCIÓN
Los laboratorios de microbiología constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar
riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo
diario en el laboratorio es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante
las prácticas, así como el entrenamiento que posean en las técnicas requeridas para el manejo de
material contaminado, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la
colectividad en general.
Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las personas involucradas
(estudiantes y profesores) tienen la obligación de conocer cuáles son las normas de seguridad a seguir
en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto
para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente.
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PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD
Conceptos básicos:
Agentes Biopeligrosos: Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son
potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos
podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes, alergenos,
priones, etc.
Riesgo Microbiológico: Se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad práctica
en el Laboratorio, donde se requiera la manipulación de cultivos de microorganismos, los
cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una
infección si no son manipulados adecuadamente. Para que se produzca un accidente por un
agente biológico deben estar presente básicamente 4 elementos: un huésped susceptible, un
agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión adecuada;
siendo este último punto el que mejor se puede controlar en el laboratorio.
Vías de Infección: Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca (al
realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección, o transferencia
indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados como lápices,
bolígrafos, etc.), los pulmones (por la inhalación de microorganismos transportados por el
aire), la piel (intacta o lesionada, por la inoculación accidental con una aguja hipodérmica u
otros instrumentos punzantes o de vidrio, cortes o rasguños), los ojos (por salpicaduras de
materiales infecciosos, transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos
contaminados), etc.
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Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las mochilas, libros y otros objetos personales en el
lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente
cerrada. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.
Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión
práctica.
Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del
laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son
contaminantes.
No comer, beber, fumar, masticar chicle, almacenar comida, objetos personales o utensilios, ni
aplicarse cosméticos en ningún área del laboratorio.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.
Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y
evitando el posible contacto con pelo y ropas. Nunca se debe dejar desatendido.
Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera
ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los
mismos al profesor.
Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por
ejemplo: los tubos y placas de Petri contaminados deben ser etiquetados para su posterior
esterilización y lavado, etc. El grupo encargado de la práctica se responsabiliza del lavado.
Emplear la propipeta al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. De
igual manera las pipetas tendrán tapones de algodón para reducir la contaminación de estos
dispositivos de pipeteo.
Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos
no autorizados. Cualquier estudiante que sufra de alguna deficiencia en sus defensas ante la
infección debe comunicarlo previamente al profesor.
Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado,
heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA
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A continuación, se mencionan los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes
accidentes:
Cortadas menores y heridas por pinchazo: Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón
por varios minutos. Aplicar un antiséptico adecuado. Reportar el incidente al profesor. Buscar
atención médica inmediatamente.
En el caso de derrames: Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame.
Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario. Retirar el material
absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente para residuos contaminados o
bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados. Limpiar y
desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de papel y desinfectante. Lavarse las
manos con abundante agua y jabón.
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CONTENIDO
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PRACTICA Nº 1
I. OBJETIVO
Durante el procesamiento se utiliza un mechero Bunsen que, debido a la fuerza la circulación del aire
en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata
alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen
considerablemente. Durante el proceso de dilución se debe trabajar cerca al mechero. Normalmente se
emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y
después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente. El uso de gorra y mascarillas
durante el procesamiento de las muestras de alimentos debe ser obligatorio.
Todos los homogeneizados generan aerosoles, por lo que se debe tener mucho cuidado para evitar el
riesgo de la formación de los aerosoles, especialmente si se sospecha que el alimento puede contener
gérmenes patógenos. Durante este procedimiento se debe considerar medidas de asepsia.
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naturaleza del alimento se pueden utilizar otros diluyentes, tales como: solución salina peptonada,
solución tween o agua destilada estéril.
Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado
es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo
de alimento y las características del medio de cultivo.
Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las
bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo
apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el
recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los
ácidos nucleicos).
Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de
la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.
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Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones
más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos.
Usando azul de metileno. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto
es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).
Completada la incubación seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contar el
número de colonias, multiplicando por el inverso de la dilución redondeando la cantidad a dos cifras.
Reportar el número de colonias por gramo o mililitro de muestra. Se debe tomar en cuenta las
siguientes consideraciones:
Cuando solo una dilución tiene el rango apropiado, se deberán contar las colonias,
multiplicando por el inverso de la dilución.
Cuando hay dos diluciones cuyo rango es el apropiado, se deben contar las colonias de cada
dilución y luego se promedian las cuentas de dos diluciones.
Cuando la dilución menor tenga menos de 30 colonias contar las colonias y multiplicar por el
inverso de la dilución.
Cuando la dilución máxima tenga más de 300 colonias, se deberá escoger un área de la placa
donde la distribución colonial sea representativa, contando posteriormente las colonias
multiplicando por el factor adecuado para obtener la cuenta de la placa.
Cuando en ninguna de las placas haya desarrollo de colonias, reportar como menor del inverso
de la menor dilución usada.
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PRACTICA Nº 2
I. OBJETIVOS
Los métodos de muestreo y los procedimientos para la toma de muestras deberán basarse en
normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y apropiadas para fines
microbiológicos.
La mayoría de las pruebas de control de calidad se realiza a petición del fabricante interesado
en demostrar al consumidor la calidad de su producto. El muestreo para el control de calidad
debe preestablecerse y programarse de modo que las mínimas variaciones que pueden
apreciarse en los lotes de ciertos productos, se detecten rápidamente para que puedan
introducirse de inmediato modificaciones en el proceso antes de que ocurran cambios
apreciables que alteren las preferencias del consumidor, en las grandes factorías se realiza el
muestreo al comienzo y al final de las operaciones de procesado así como también en la
facturación y durante su almacenamiento. En el caso que se sospeche de una toxiinfección
alimentario el muestreo se dirigirá directo y específicamente al alimento consumido,
sospechoso de haberla causado.
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II.1 DEFINICIONES
Muestra: Una muestra consiste en una o más unidades de producto extraído de un lote. Es
definida como la fracción de un material sobre la que se estudian ciertas
características que posteriormente se generalizan a todo el conjunto.
Contra muestra: Es una porción adicional de la muestra tan parecida a la original como sea
posible, debe tomarse al mismo tiempo y en la misma forma y cantidad que la
muestra original para asegurar que las condiciones sean idénticas.
Muestreo: Acción organizada de extraer una muestra para su análisis. Se muestrea para
obtener una muestra representativa de todas las unidades del lote, es decir una
versión simplificada de la población que reproduzca de algún modo sus rasgos
básicos; con el propósito de aceptar o rechazar dicho lote.
Alimento apto para consumo humano: Alimentos que cumplen con los criterios de calidad
sanitaria e inocuidad establecidos por la norma sanitaria.
Los planes de muestro solo se aplican a lotes o lote de alimentos y bebidas, se sustentan en el
riesgo para la salud y las condiciones normales de manipulación y consumo del alimento. Los
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planes de muestreo se expresan en planes de 2 o 3 clases que dependen del grado de peligro
involucrado.
Un plan de muestreo de 2 clases de usa cuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles
de microorganismo en ninguna de las unidades de muestra. Un plan de muestreo de 3 clases se usa
cuando se puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades de
muestra. Al diseñar un plan de muestreo para un alimento en particular deben establecerse los
valores de n, m, M y c en donde:
Categoría: grado de riesgo que representan los microorganismos en relación a las condiciones
previsibles de manipulación y consumo del alimento.
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Para la verificación del Plan HACCP, el número de unidades de muestra de los planes de
muestreo podrá ser igual a uno (n=1) y deberá ser calificada con los limites más exigentes (m)
indicadas en la presente disposición para este tipo de alimentos o bebidas.
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Esto procederá si una persona natural o jurídica que opera o intervenga en cualquier proceso de
fabricación, elaboración, e industrialización de alimentos y bebidas, demuestre mediante
documentación histórica con un mínimo de de 6 meses, que cuentan con procedimientos
eficaces basados en los principios del sistema HACCP.
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Estas muestras no representan o no reflejan las características del lote. Sería un error escoger de un
lote solo las muestras deteriorada, el inspector también debe escoger muestras buenas.
La toma de muestra representativa puede ser motivada principalmente por razones de carácter
higiénico sanitario o para determinar la calidad del producto. Estas muestras representan las
características del lote.
2.8.1 Toma de muestra de Productos a granel: Para productos ensacados o a granel el plan de
muestreo se aplica de acuerdo a la tabla 3. Cuando el producto es homogéneo es preciso
utilizar una sonda caladora para tomar las muestras del saco seleccionado. Cuando los
productos no son homogéneos es necesario extender el producto en el suelo y mezclar al azar
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para obtener una capa uniforme. La muestra se debe obtener de 5 puntos diferentes como
mínimo. Deben ser tomadas asépticamente, usando contenedores y utensilios estériles y
debidamente protegidos contra las contaminaciones externas, además estas deben ser
mantenidas en condiciones que no permitan la multiplicación o destrucción de la microflora
original presente.
Por ejemplo, si tenemos un lote constituido por 1,200 cajas, que contiene cada uno 12 latas de
1 kg, para calcular el número total de unidades tenemos: 1,200 x 12 = 14,400 unidades, con
este número se busca en la tabla Nº 2 el número de muestras a recolectar, en la tabla se
observa 13 unidades.
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De acuerdo al tipo de estudio que se esté realizando será necesario llenar formularios con datos
del lugar de muestreo, de los manipuladores, entre los datos del alimento se debe considerar los
siguientes datos:
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Con el fin de que los resultados deben comprables y reproducibles, los métodos de ensayo
utilizados en cada una de las determinaciones deben ser métodos internacionales o nacionales
normalizados, reconocidos y acreditados por el organismo nacional de acreditación
Los informes de ensayo, certificados de análisis y otra forma de reporte emitidos por los
laboratorios, deberán indicar los métodos de análisis empleados y la expresión de resultados
acorde con el método debe expresarse en UFC/g, UFC/mL, NMP/g, NMP/mL, NMP/100 mL,
Ausencia o presencia/25 g o mL.
3.1 MATERIALES
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Guantes descartables
Cajas conservadoras con paquete de hielo
3.2 MÉTODOS
Esta actividad debe realizarse con materiales previamente estériles, para ello,
primero desinfectarse las manos con los guantes ya puestos, tomar el alimento con
una pinza y colocarla en una bolsa de primer uso, sellar con el precinto de
seguridad, anotar los datos correspondientes, este procedimiento es para el caso de
alimentos enteros.
Para muestras de alimentos a granel (ensaladas, coberturas, cremas, alimentos
preparados, etc.), coger la muestra con pinzas o el material que fuese necesario
(cucharas, cucharones, tenedor, etc.), y colocarla en taper de primer uso. Colocarlo
en cajas refrigerantes con gelpack, que mantengan una temperatura de refrigeración
(<10 °C). Transportar en el menor tiempo al laboratorio para su análisis.
IV. RESULTADOS
Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliográfico y antecedentes
referidos al ensayo.
VI. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual.
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PRACTICA N° 3
EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES
I. OBJETIVOS
Sea por métodos rápidos o convencionales, los ensayos microbiológicos se realizan utilizando
métodos normalizados por organismos internacionales como la Organización Internacional
para la Estandarización (ISO). Métodos Oficiales de Análisis de la Asociación Internacional de
Químicos Analíticos Oficiales (AOAC), así como la Comisión Internacional de
Especificaciones Microbiológicas para Alimentos (ICMSF), entre otros, utilizando la técnica
de recuento en placa.
El procedimiento para seleccionar muestras debe estar en función de los riesgos sanitarios
relacionados a las diferentes etapas de la cadena alimentaria, sea la de fabricación, la
elaboración y/o expendio. Las evaluaciones microbiológicas de superficies, considera a los
indicadores de higiene como los Coliformes totales y Staphylococcus aureus. También se
considera patógenos como Salmonella sp. Vibrio Cholerae en caso signifiquen un peligro para
el proceso.
a.- Superficies inertes: Se seleccionan aquellas que están o tendrán contacto directo con los
alimentos, que no serán sometidos a un proceso térmico posterior u otro que
disminuye la carga microbiana.
b.- Superficies vivas: Se seleccionarán las manos de los manipuladores, con o sin guantes que
estén en contacto con los alimentos destinados al consumo humano. Se
debe seleccionar el método de muestreo que debe estar en función de las
características de las superficies a muestrear.
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a.- Método del hisopo: Se utiliza en superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla de
picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos, cortadora
de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras, tolvas,
mezcladoras, pisos, paredes y otros.
b.- Método de esponja: Se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor área.
c.- Método del enjuague: Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños o para el
muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plástico, etc.
3.1. MATERIALES
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a. METODOS
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Para superficies vivas, el numero de colonias obtenidas (ufc) se multiplica por el factor de
dilución y por el volumen de la solución diluyente utilizando en el muestreo (100ml). Para
objetos pequeños o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolas de
plástico, entre otros el número de colonias obtenidas se multiplica por el factor de dilución y
por el volumen de solución diluyente y se divide entre las 4 superficies muestreadas.
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o gráficos, reportar la variabilidad
microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los utensilios. Reportar la
numeración de microorganismos indicadores de la mala higiene en manos y superficie inerte.
V. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual
VI. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliográfico y antecedentes
referidos al ensayo.
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PRÁCTICA Nº 4
I. OBJETIVOS
Muestra de alimento
Agua peptonada
Placas estériles.
Pipetor
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Bolsas estériles.
3.2. METODOS
Día 1: Pesar 10g de muestra y añadir 90ml de agua peptonada al 1%, homogenizar por 30
segundos. Sembrar tres diluciones distintas (10-1, 10-2, 10-3). Para ello pipetear 1ml de cada
dilución a placas estériles debidamente codificadas. Verter en la placa el agar fundido y
temperado a 44-46°C. Acto seguido, mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y
girando las placas en diferentes direcciones. Una vez solidificado el agar, invertir las
placas e incubar a 35°C durante 48±2 horas.
Día 3: Calcular el recuento estándar en placa estimado.
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o gráficos, reportar la variabilidad
microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los utensilios. Reportar la
numeración de microorganismos indicadores de la mala higiene en manos y superficie inerte.
V. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual
VI. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliográfico y antecedentes
referidos al ensayo.
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PRACTICA N° 5
I. OBJETIVOS
Bacillus cereus se encuentra en el suelo y vegetación, sus esporas son resistentes a la cocción,
por lo que es importante realizar un tratamiento térmico efectivo. La contaminación de alimentos
por Bacillus cereus, puede ocurrir cuando los alimentos son conservados a medio ambiente por
varias horas antes de ser servidos, es por ello recomendable mantener los alimentos calientes a
mas de 65ºC o enfriarlos a menos de 5ºC. El consumo de alimentos que contienen mas de 10 6
ufc/g de alimentos de este microorganismo, puede ocasionar una infección alimentaría al ingerir
la toxina preformada en el alimento. Los principales alimentos implicados son el arroz hervido o
frito, sopas de pollo, budines, salsa, pastas con huevo, cereales, etc.
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germinan y las células vegetativas producen toxinas durante la fase de crecimiento logarítmico o
durante la esporulación.
La variante diarreica, tiene un periodo de incubación entre 8 a 16 horas y se manifiesta por diarrea
profusa con dolor y cólicos abdominales; la fiebre y el vómito son poco comunes. La enterotoxina
puede preformarse en el alimento o producirse en el intestino, durante 12 a 24 horas. El tipo diarreico
de enfermedad es causado por una proteína de peso molecular grande, mientras que el tipo (emético)
causa el vomito es causado por una proteína de peso molecular bajo viene hacer un péptido
termoestable. (Jawetz, Melnick y Adelberg. 1999)
a.- Protoplasto o núcleo: El citoplasma de la espora está muy deshidratado. Sus componentes están
inmovilizados en una matriz de quelatos de iones Ca ++ y ácido dipicolínico. El citoplasma de la
espora contiene altas concentraciones de ion Ca ++ (1-3% del peso seco de la espora), y de ácido
dipicolínico (DPA) (10% en peso); ambos están formando un quelato, llamado dipicolinato cálcico
(DPC), una sustancia exclusiva de las esporas bacterianas.
b.- Pared de la espora: Se ubica inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora (ver
micrografía a microscopio electrónico, o el esquema de la ultraestructura). Composición a base de
un peptidoglucano (PG) similar al de la célula vegetativa, con sus característicos enlaces entre los
tetrapéptidos. Su función, al germinar la espora, dará lugar a la pared celular de la nueva célula
vegetativa, confiriéndole, mientras tanto, resistencia osmótica.
d.- Cubiertas: La composición depende de las especies, pero en general, a base de una o varias
proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en aminoácidos hidrófobos, y que llegan a
constituir el 60% en peso seco de la espora. Son muy insolubles e impermeables, e impiden la
entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias tóxicas.
e.- Exosporio: En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado,
delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora. Su ccomposición química: mezcla de proteínas,
polisacáridos complejos, y lípidos. Muy resistente a enzimas proteolíticas, lo que sugiere (pero no
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prueba directamente) que el exosporio puede representar algún papel como barrera de defensa
externa de la espora.
3.1 MATERIALES
Medios de cultivo:
Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) ISO:7932;1993
Agar Bacillus cereus
Agua peptonada
Equipos
Estufa
Microscopio
Mechero Bunsen
3.2 MÉTODOS
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3.2.1. Procedimiento
Se prepara el medio de cultivo según las indicaciones del frasco.
Preparar las diluciones con 10 g de muestra en 90 ml de agua peptonada y tubos de 9 ml
cada uno. Diluir el alimento hasta 10-3
Sembrar por duplicado 0.1 ml de volumen del inoculo de cada dilución en el medio
MYP y sembrar por diseminación con una espátula de Drigalsky.
Dejar incubar 48 horas a 30 °C
Seleccionar las colonias sospechosas: grandes, irregulares, rosadas lisas.
Escoger de cada placa 5 colonias y realice la prueba bioquímica
Realizar la confirmación bioquímica, pre cálculo y reporte en ufc/g de alimento
Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es importante que
la muestra no se seque.
IV. RESULTADOS
Describir con tablas, ilustraciones y/o gráficos. Reportar las características de las colonias de
Bacillus cereus y las características de las endosporas. Reportar la numeración de B. cereus en
ufc/g de alimento, comparando con los estándares permisibles
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V. DISCUSIÓN
Interpreta y explica los resultados de la cantidad de bacterias en ufc/g de alimento en forma
amplia con sustento bibliográfico y antecedentes referidos al ensayo. Explica también las
características de las colonias y forma de las endosporas de B. cereus.
PRACTICA N° 6
I. OBJETIVOS
Los estafilococos son destruidos fácilmente por la cocción, pero las toxinas que producen
resistencia a este tratamiento son destruidas de 1 a 3 horas a 100 ºC y de 10 a 40 minutos a 120
ºC. Los alimentos almacenados de forma inapropiada han estado vinculados frecuentemente
con brotes de intoxicación por estafilococos. Los reportes indican que la contaminación del
alimento ocurre después de la cocción, dado que la bacteria se halla en números mayores y
raras veces iguales a la dosis infectante.
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Se han identificado 7 diferentes toxinas que se denominan A, B, C1, C2, C3, D y F. Entre
otros factores presentan adhesinas, coagulasa, lipasa, hialuronidasa, estafiloquinasa,
nucleasa, toxina alpha, toxina beta, toxina delta, toxina gamma, leucocidina, exfoliatina,
exotoxinas pirógenas.
En la actualidad gozan de gran aceptación los medios que contienen yema de huevo junto a
uno de los agentes selectivos antes señalados. En este medio la mayoría de las cepas de S.
aureus utiliza la lipoproteína de la yema de huevo conocida como lipovitelina, dando lugar
a la aparición de áreas de aclaración alrededor de las colonias, también se genera la
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Las colonias Staphylococcus aureus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden aproximadamente
de 1 a 3mm de diámetro a las 24 horas. Las colonias son grandes, estas siguen desarrollando si
se deja en incubación por unos días más. Son de borde entero de superficie lisa, la mayoría de
ellos forman pigmentos que van desde amarillo crema hasta el naranja.
Preparación: Disolver el medio de cultivo según las indicaciones del frasco, esterilizar en
autoclave por 15 minutos/15 libras de presión/121ºC. Enfriar a 45 a 50 ºC y añadir mezclando
50 ml de emulsión de yema de huevo telurito y eventualmente, 50 mg /litro de sulfametacina.
Verter en placas. pH 6.8 ±0.2.
Composición
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Empleo: Agitar el frasco con fuerza para suspender el posible sedimento formado. 50ml de la
emulsión de yema se mezcla con 950 ml de medio de cultivo esterilizado y enfriado a 45 – 50
ºC. Verter en placas. Al tomar la emulsión del frasco, cuidar de que se efectué de forma estéril.
Las placas que se preparan con emulsión de yema de huevo son estables aproximadamente 2
meses almacenadas a 4ºC.
a.- Coloración Gram: Hacer una coloración Gram de las colonias sospechosas y observar al
microscopio. Si se observan cocos gram positivos en racimos, realizar la prueba de la
catalasa.
b.- Acidez del manitol: Sembrar 1 colonia sospechosa a S. aureus, en agar manitol por estrias
y profundidad, incubar por 24 horas a 37ºC, el viraje de rojo a amarillo indica positividad.
Procedimiento:
Con el asa de siembra recoger 1 colonia pura de 18 a 24 horas y colocar sobre un
portaobjeto limpio.
Agregar 1 gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta pasteur.
No es necesario mezclar el cultivo con peróxido de hidrógeno.
Observar inmediatamente la efervescencia (formación de burbujas) lo que indica una
prueba positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
Desechar el portaobjeto colocándolo en un desinfectante.
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humano no puede ser usado al menos que haya sido cuidadosamente probado de no tener
algún agente infeccioso, capacidad de coagulación e inhibidores.
Procedimiento:
Transferir 1 colonia aislada del medio de cultivo (agar sangre) a 0.5 ml de plasma
reconstituido en un tubo de ensayo estéril.
Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar.
Incubar la mezcla a 35 – 37 ºC (baño maría) de preferencia por 4 horas. Observar SI
hay formación de coagulo inclinado lentamente el tubo sin agitar. Cualquier grado de
coagulación es una prueba positiva.
S. aureus forman coágulos dentro de la hora. Considerar que S.aureus produce
fibrinolisina, la cual puede lisar el coáagulo.
Si son Staphylococcus coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la
polimixina B y novobiocina.
3.1 MATERIALES
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Reactivos y colorantes:
Plasma de conejo con EDTA
Reactivo para la catalasa (peróxido de hidrogeno)
Kit para la coloración Gram.
Patrones y Cepas de Referencia
III.2 METODOS
Preparar diluciones hasta 10-3 e inocular 1 ml de cada dilución en placas petri de 140 mm, con agar
Baird Parker por duplicado para cada dilución. Incubar las placas 35° ó 37 ºC / 24 horas. Transferir
paralelamente
DIA 3: Elegir las placas que contengan colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco
rodeadas áreas claras. Para hacer un recuento elegir las placas entre 20 a 200 colonias aisladas y
contar. Seguidamente picar no menos de 5 colonias sospechosas de S. aureus en caldo cerebro
corazón, incubar 35ºC/24 horas. Sembrar en agar manitol, realizar la prueba de la catalasa,
coloración Gram., etc. Realice la prueba de coagulasa transfiriendo 0.3 ml de cultivo a tubos que
contienen 0.3 ml de plasma de conejo, incubar 4 a 6 horas/35ºC. Formación de coagulo da lugar a la
coagulasa +.
IV. RESULTADOS
Reporta los resultados de la numeración de S. aureus en ufc/g y compara con los parámetros
permisibles para este microorganismo. Reporta las características generales de las colonias en
el medio agar Baird Parker
V. DISCUSIONES
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Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliográfico y antecedentes
referidos al ensayo.
VI. CONCLUSIONES
PRACTICA Nº 7
I. OBJETIVOS
Los miembros del género Salmonella son agentes causantes de infección intestinal en seres
humanos y animales. Entre los agentes de enfermedades transmitidas por los alimentos, el género
Salmonella es uno de los principales causantes de casos mortales por las complicaciones surgidas
entre los pacientes afectados. La tasa de mortalidad se sitúa alrededor de 4.1%. Los huevos, carnes
y productos cárnicos derivados son los alimentos que más comúnmente transmiten la Salmonella al
hombre.
El hábitat principal de los microorganismos de este género es el conducto intestinal del ser humano,
de los animales domésticos, de los pájaros y ocasionalmente de los insectos. Debido a que es una
bacteria de origen intestinal, es excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas.
Cuando las aguas contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por el ser humano o
por los animales, el microorganismo vuelve al sistema digestivo donde se multiplica y será
nuevamente eliminado a través de las heces y así continúa el ciclo.
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Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad, siguen siendo portadoras por tiempo
considerable y pasan a ejercer un importante papel en la diseminación del agente especialmente si
participan en la cadena de producción y comercialización de alimentos. El agente etiológico lo
constituye la Salmonella entérica con 7 subespecie divididos en serovariedades.
Son bacilos gram negativos, aerobios, no esporulados, móviles por flagelos perítricos, no
encapsulados y poseen 3 tipos de antígenos: O somático, H ciliar y Vi de superficie.
Los métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella a partir de los alimentos pueden
considerarse 5 etapas sucesivas:
Enriquecimiento no selectivo
Enriquecimiento selectivo
Aislamiento selectivo, siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales
Identificación bioquímica, estudio de las características bioquímicas de las colonias
sospechosas.
Análisis antigénicos en dos fases: a) empleo del antisuero polivalentes O y del antisuero
polivalente H, y b) utilización de los antisueros específicos del grupo O y H.
Tipificación por medio de bacteriófagos.
Los tres primero se refieren al aislamiento y los tres últimos a la identificación.
El primer paso tiene como fin la revitalizaron de las salmoneras dañadas por las diferentes condiciones
de tratamientos o de almacenamiento. El segundo paso es de enriquecimiento selectivo y sirve para
favorecer el crecimiento de las salmoneras en un ambiente que puede contener gran número de
bacterias diferentes. El tercer paso permite la visualización de las colonias sospechosas por su aspecto
característico. El cuarto paso se refiere a la identificación bioquímica.
El quinto paso conduce por medio de pruebas serológicas a la identificación definitiva de las cepas
sospechosas como miembro del genero Salmonella. El sexto paso logra aun más exacta la
identificación de los gérmenes aislados, identificación que es de particular interés para los propósitos
epidemiológicos, ya que los tipos serológicos de un grupo fágico común suelen tener el mismo origen.
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El caldo rico en sustancias nutritivas provoca una alta cuota de sobrevivencia de bacterias
dañadas subletalmente y un crecimiento intenso. El tampón fosfato evita una variación del pH
perjudicial para las bacterias.
Una vez preparado según las indicaciones, distribuir en cantidades de 225 ml en frascos,
esterilizar en autoclave 15min/15 Lb/121ºC.
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella a partir de, alimentos y otros materiales. Para
su composición, este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de la Food and Drug
Administration (1962), de la America Public health Association (1984), de la United Status
Pharmacopoeia XXI (1985), de la Norma DIN 10181 para el análisis de leche y las
Prescripciones analíticas apartado 35 para la investigación de alimentos.
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2.2.4.-AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO
En combinación con un enriquecimiento adecuado, con el agar XLD se puede detectar un numero
notablemente mayor de Salmonella y Shiguella que con otros medios de cultivo selectivos. La
siembra directa por estrías sobre el medio de cultivo para el aislamiento.
Empleo e Interpretación: Sembrar en el medio de cultivo en superficie, por estrías en capa fina.
Incubación 48 horas a 37ºC.
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transparente.
Anaranjadas, ligeramente opacas. Salmonella tiphi (cepas xilosa positivas)
Fuente: Elaboración propia
Empleo e Interpretación: Sembrar por estría en la superficie del medio de cultivo con el material
de muestra o con el procedente de un cultivo de enriquecimiento previo.
Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC. Las colonias de gérmenes lactosa-negativos son incoloras y los
gérmenes lactosa positivos son rosadas hasta rojas. Las colonias formadoras de H 2S presentan un
centro negro.
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Para diferenciar las coliformes de las Salmonellas el medio de cultivo contiene un cromógeno, que
indica la presencia de la separación de B- galactosidasa característico para los coliformes. Los
coliformes crecen en forma de colonias verde azuladas/violeta azuladas, otras enterobacterias y
bacterias Gram negativas, Ej. Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. thyphi, S. parathyphi A, crecen
en forma de colonias incoloras amarillentas.
Disolver en baño de agua a 40 – 50 ºC, agitar regularmente por balanceo el medio de cultivo y
seguida verter las placas. Para evitar que precipite el agar durante el vertido en placas es
recomendable colocar placas durante la fase de solidificación sobre un fondo fresco. Las placas
del medio de cultivo son opalescentes y rosa claro. La estabilidad de las placas en refrigeración sin
protección es 3 semanas, en bolsas plásticos o con cinta adhesiva 3 meses.
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a.-Forma de Acción: La degradación del azúcar con formación de acido se manifiesta por un cambio
de color del indicador rojo de fenol que vira de un anaranjado-rojizo a amarillo, o por un viraje a
rojo intenso en caso de alcalinización. El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a acido
sulfhídrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro.
b.- Empleo de Interpretación: Se siembra el cultivo puro sometido a investigación tanto por estría
en la superficie inclinado como en la columna vertical, mediante estría central. Incubación 48
horas a 37 ºC.
Empleo e Interpretación: El cultivo es sometido a siembra por picadura en la capa superior del
medio de cultivo
Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC. La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del
medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La formación del indol se debe a la coloración
rojo-púrpura de la capa de reactivo.
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Empleo e Interpretación: Los tubos con el medio MIO son inoculados por punción
profunda, después de incubados por 18 a 24 horas a 35ºC. La motilidad y la reacción de
descarboxilación de la ornitina se colorean de rojo después de la adición del indol.
Se basa en la utilización o no del citrato como única fuente de carbono. E. coli no crece en
el medio, mientras que la mayoría de los otros organismos lo hacen. El género Salmonella
utiliza el citrato produciendo la coloración azul característica
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3.1 MATERIALES
Medios de cultivo
Agar SS
Agar triple azúcar hierro (TSI)
Agar citrato de Simmons
Caldo Rappaport – Vassiliadis
Agar hierro lisina (LIA)
Peptona tamponada.
Reactivos y colorantes
Cristales de fosfato de cretina
Solución hidróxido de potasio al 40%
Solución de hidróxido de sodio 1N
Indicador de rojo de metilo
Agua destilada estéril
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3.2 METODOS
Procedimiento Día 1 y 2
Pesar asépticamente 25 g de muestra en un frasco tapa rosca estéril que contengo 225 ml
de agua peptonada tamponada estéril y agitar por 5 minutos.
Pasado este periodo de tiempo transferir asépticamente 0.1 ml de la suspensión a un tubo
de 10 ml del caldo Rappaport – Vassiliadis e incubar a 41.5°C por 24 h ± 3 h junto con los
controles positivo y negativos.
Procedimiento Día 3 y 4
Sembrar de los tubos a los medios selectivos agar SS, por estrías. Incubar a 37 °C por 24 a
48 horas.
Realizar la confirmación bioquímica en los medios de cultivo: agar TSI, agar urea, agar
LIA, Reactivo voges proskauer, indol, detección de B- Descarboxilasa. Reporte los
resultados. Finalmente realice la confirmación serológica
Procedimiento Día 4
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Evaluación bioquímica
Salmonella en agar TSI, produce típicamente en la parte inclinada una reacción alcalina
(roja) y en la columna del medio una reacción acida (amarillo) con o sin producción del
H2S (pigmentación negra).
En el agar LIA, Salmonella produce típicamente una reacción alcalina (color púrpura) en la
columna del medio en el tubo. Considerar una reacción acida negativa cuando la columna
presenta un color amarillo. La mayoría de cultivos de Salmonella produce H2S en agar
LIA.
En agar citrato de Simmons se da una coloración azul para el género Salmonella.
En el agar Sulfuro de hidrogeno-indol –motilidad, se coloca 1 gota de reactivo de indol y
se observa un halo de color púrpura.
Cuando los resultados de la prueba bioquímica concuerdan con el patrón indicado se
confirma que el aislamiento es de Salmonella sp.
Las colonias identificadas bioquímicamentje como Salmonella son enfrentadas a diversos
sueros para su confirmación serológica.
VII. RESULTADOS
Prepare sus resultados mediante cuadros, gráficos sobre las características de las colonias:
forma, aspecto, color y tamaño de las colonias de Salmonella sp. Reporte sus resultados de la
prueba bioquímica para la identificación de SalmoneIla sp.
V. DISCUSIONES
VI. CONCLUSIONES
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PRACTICA Nº 8
I. OBJETIVOS
De acuerdo con los Métodos Normalizados o métodos descritos por organizaciones con
credibilidad internacional tales como la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC), o
Asociación Americana de Salud Pública (APHA) sobre Prueba de Esterilidad Comercial,
considerando la temperatura, tiempo de incubación e indicadores microbiológicos del
mencionado método, los cuales deben especificarse en el informe del ensayo.
Si tras la inspección sanitaria resulta necesario tomar muestras de las unidades defectuosas
para determinar las causas, se procederá por el método de análisis microbiológico para
determinar las causas microbiológicas del deterioro según métodos establecidos en el Codex
alimentarius, Manual de Bacteriología Analítica (BAM) de la Administración de Alimentos y
Drogas (FDA) o Asociación Americana de Salud pública (APHA).
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Manipulación aséptica
Tratamiento térmico
Temperaturas bajas
Deshidratación
Presión osmótica
Productos químicos
Radiaciones
Estos procedimientos de preservación tienen por fundamento algunos de los principios siguientes:
La temperatura elevada es uno de los métodos más seguros y dignos de confianza para la
preservación de alimentos. La acción de calor se aplica para destruir los microorganismos de los
productos alimenticios envasados en cajas o envases de hojalata que impiden la entrada de
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microorganismos después de cerradas. El calor a presión en autoclave es el medio más eficaz para
la destrucción de las formas vegetativas y esporuladas.
La preservación de los alimentos por el calor requiere el conocimiento de la resistencia térmica de
los microorganismos, especialmente las esporas. Axial mismo hay que tener en cuenta la velocidad
de penetración del calor a través de productos de consistencia diferentes, así como el tamaño de los
envases.
El microorganismo más importante que hay que destruir en esta clase de conservas es el anaerobio
Clostridium botulinum, el cual produce una toxina muy activa, muchas veces de acción mortal.
Debido a su resistencia térmica, las bacterias que forman esporas como especies del género
Clostridium y Bacillus, constituyen el grupo de microorganismos más importantes para la industria
conservera.
El microorganismo más importante que hay que destruir en alimento tipo conservas es el anaerobio
Clostridium botulinum. Este microorganismo vive como saprofito en el intestino de los animales
herbívoros, los cuales lo distribuyen extensamente por todo el suelo.
Las esporas de Clostridium botulinum son muy resistentes a la acción del calor y en los productos
alimenticios deficientemente elaborados pueden conservar su vitalidad y germinar mas tarde. La
forma vegetativa crece entonces en condiciones anaerobias en los productos envasados y producen
la toxina que da lugar a una grave toxemia cuando se ingiere con los alimentos. Las conservas de
hortalizas de fabricación casera son las causas más frecuentes de intoxicación, pero también los
encurtidos y las carnes enlatadas constituyen un buen medio para el crecimiento de esta bacteria y
la producción de esta toxina.
El tiempo de incubación es variable, depende de la dosis ingerida, puede ser desde unas cuantas
horas hasta varios días, con promedio de 2 a 36 horas.
50
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3.2 MATERIALES
Licuadora
Balanza de 2000 g de capacidad, sensibilidad 0.1 g
Incubadora de 35ºC
Baño maria de 46ºC
Estufa
Contador de colonias
Mechero Bunsen
Jarras anaeróbicas con sobre generadores de hidrogeno, anhídrido carbónico y catalizadores
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Placas petri
Tubos de prueba
Espátula de extensión
Asa de siembra
Cucharas estériles
Todos los materiales a utilizarse en los análisis microbiológicos deben ser estériles y
manipulados con la debida asepsia.
Medios de cultivo
Agar plate count
Agar tripstosa-sulfito- Cicloserina (TSC)
Emulsión de yema de huevo
Caldo de hígado picado o Medio de carne cocida
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Reactivos y colorantes
Reactivos para tinción Gram
Almidón soluble al 0.1%
Clorhidrato de cisteina
Solución de glicerina
Reactivo para la detección de Nitrito
3.2 METODOS
DIA 1
Tomar nota de las prescripciones externas del envase, numero de lote, dimensiones de la lata, peso,
retirar la etiqueta para pegar en el cuaderno de historial de las muestras. Realizar el examen visual del
recipiente para detectar presencia de defectos mecánicos, integridad de las suturas, perforaciones,
corrosiones, abolladuras u otras anormalidades.
a.- Numero de envases: Se toma una muestra mínima de 10 latas, desinfectar cada uno de los
envases. Colocar las latas sobre papel filtro sobre una placa de petri limpio para observar la pérdida de
líquido durante la incubación.
b.- Incubación preliminar: Incubar algunas latas por 10 días a 55ºC para detectar microorganismos
termófilos y el otro grupo de latas a 35ºC por 21 días para la detección de microorganismos mesófilos.
Durante la pre-incubación se agitan las latas cada 2 días y se separan aquellas que muestren
hinchamiento y pérdida de material, los cuales deben ser examinados para determinar los defectos en la
hermeticidad del cierre.
DIA 10 Y 21
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Para abrir los envases para el control de esterilidad se debe tomar una serie de precauciones
como:
Abrir los envases de preferencia dentro de una cámara de flujo laminar con aire estéril
circulante.
Lavar cuidadosamente con algodón y alcohol de 70º, echar un poco de alcohol sobre la tapa y
dejar actuar por unos minutos, eliminar el alcohol y flamear en forma rápida. No flamear los
envases abombados.
El analista debe asegurarse bien las manos y desinfectar con alcohol si usa guantes
No hablar durante el procesamiento.
Abrir con un abrelatas estéril en una línea alejada de las suturas, evitando tocar la muestra con
las manos.
Examinar visualmente el aspecto del producto, tomando nota de las posibles alteraciones.
Tapar con una placa estéril.
Se debe tener ciertas precauciones para que no se contamine el analista y el ambiente del
laboratorio.
Limpiar y desinfectar el envase, no flamear.
Colocar la lata sobre un desinfectante (tegol al 5%)
Colocar sobre la lata un embudo invertido con un estilete de metal y realizar un orificio en la
lata para eliminar los gases.
Abrir con un abrelatas estéril en una línea alejada de las suturas, evitando tocar con las manos
la muestra. Examinar visualmente el aspecto del producto, tomando en cuenta las posibles
alteraciones.
La medida del pH se realiza después del análisis microbiológico con un pH-metro, directamente
sobre el producto si es homogéneo
Para comprobar la esterilidad del producto es necesario colocar las muestras en medios de
cultivo muy nutritivos que permitan el crecimiento de bacterias revivificables.
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Una vez abierta la lata con un abridor estéril se siembra una serie de 3 tubos para aerobios
y otra serie de 3 tubos para anaerobios.
Según el tipo de muestra utilizar pipetas para líquidos, pinzas, bisturís para sólidos. La
siembra en medios específicos se realiza asépticamente y de distintos lugares.
Transferir con una pipeta estéril 3 ml o g de la muestra en cada uno de los frascos conteniendo
27 ml de caldo cerebro corazón adicionado de almidón.
Transferir con una pipeta estéril 3 ml o g de la muestra en cada uno de los tubos conteniendo
27 ml de caldo cerebro corazón adicionado de cisterna y almidón. Luego se coloca en una jarra
de anaerobiosis. Si no se cuenta con la jarra adicionar a cada tubo o frasco una capa de 12 ml
de parafina estéril.
Se incuba la serie de 3 tubos a 55ºC por 72 horas para detectar microorganismos termófilos y
los otros 3 tubos a 35ºC/72 horas para la detección de microorganismos mesófilos.
a.- Aerobios
b.- Anaerobios
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DIA 24
Lectura de Resultados
III. RESULTADOS
IV. DISCUSIONES
V. CONCLUSIONES
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PRACTICA N° 9
I. OBJETIVOS
Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorganismos
seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un caldo de enriquecimiento a
temperaturas superiores a las normales (45 +/-0,5º C) y son muy indicativos de una posible
contaminación de origen fecal del alimento. Se definen por la producción de ácido y de gas en
caldo EC a 45º C de temperatura.
Los criterios de identificación utilizados son la producción de gas a partir de la glucosa (y otros
azucares) y la fermentación de la lactosa dentro de 48 horas a 45 ºC.
E. coli es causante de la diarrea frecuente en los niños y turistas. Existen varios grupos que pueden
producir cuadros entéricos leves y severos. La presencia de E. coli, indica generalmente una
contaminación fecal. Por ejemplo, la contaminación fecal del agua, moluscos, productos lácteos y
en otros alimentos.
Existen varios grupos que pueden producir cuadros entéricos leves a severos, entre ellos tenemos:
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Cifras sustanciales de E. coli en alimentos, sugiere una falta general de limpieza en el manejo del
mismo y un almacenamiento inadecuado.
El término de coliformes fecales ha sido como un intento de encontrar métodos rápidos y fiables
para establecer la presencia de E. coli.
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para
diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo
tanto, los coliformes totales que comprende la totalidad del grupo los coliformes fecales aquellos
de origen intestinal.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y también en el suelo, las plantas, etc.
No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de contaminación fecal
y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario poco satisfactorio.
Desde el punto de vista de la salud pública esta diferenciación es importante puesto que permite
asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el agua es de origen fecal.
El medio de cultivo contemplado por la ISO es el Caldo Lauril Sulfato Triptosa, aunque se
puede emplear alternativamente otros medios como para esta prueba (Caldo Lauril Sulfato,
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Caldo Lauril Triptosa, caldo lactosado), se puede usar cualquiera de ellos, pero con preferencia
el primero. Incubar 35ºC/3 horas pasar a baño María a 44.5 ºC/24 horas
Debido a su elevada calidad nutritiva y al tampón de fosfatos que contiene este medio de
cultivo se garantiza el crecimiento y la intensa producción de gas. La producción de gas puede
evaluarse con tubitos de fermentación. El contenido de Lauril Sulfato inhibe notablemente el
crecimiento de la flora indeseable de otras bacterias.
A partir de los tubos gas positivo en caldo lauril sulfato en la prueba presuntiva, se inoculará
tubos que contengan caldo EC. Incubar a 44.5 ºC por 24 horas en baño maría con tapa para
mantener una temperatura homogénea y estable.
Cualquier inoculación directa de las diluciones de la muestra en caldo EC, sin previo
enriquecimiento en caldo lauril sulfato o triptosa es inadecuada.
Luego del periodo de incubación, los tubos son retirados del baño maría, se agita subvente y se
observa la producción de gas. La presencia de gas en cualquier cantidad es una prueba positiva.
Se calcula el numero más probable (NMP), basándose en las combinaciones de tubos positivos
y negativos.
El caldo EC, es un medio contemplado por la ISO: 7251; 1993, este medio favorece el
crecimiento de las bacterias lactosa-positivas, especialmente coliformes y E. coli. Los
gérmenes lactosa positivos consumen lactosa con producción de gas, las sales biliares inhiben
notablemente el crecimiento de gérmenes gram positivos o de microorganismos no adaptadas
al medio ambiente intestinal.
Un segundo método es utilizando el caldo lactosado verde brillante bilis con MUG incubado a
37ºC por 24 horas, los tubos que dan fluorescencia azul claro la luz UV corresponden a E. coli.
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A partir de los tubos positivos con un asa de siembra pasar al agar EMB e incubar a 37ºC/24
horas, las colonias típicas son de color rosado oscuras con núcleo central con o sin brillo
metálico.
Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos deben ser examinados, si no se ha producido
gas se vuelve a examinar a las 48 horas.
Para la transferencia se debe utilizar un asa de siembra con alambre de micrón cromo o platino
Nº 22 ó 24 en forma de asa o anillo con 4 mm de diámetro.
Todos los tubos de gas positivo en la prueba presuntiva deben ser sometidos a procedimientos
confirmativos.
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Para esta prueba se utiliza tubos que contienen caldo lactosado verde brillante bilis (caldo
brilla) o también puede ser utilizados palcas de agar eosina azul de metileno (Agar EMB). A
partir de los tubos positivos de caldo Lauril Sulfato inocular de inmediato a tubos que
contienen caldo lactosado verde brillante bilis (caldo brilla), incubar a 37ºC por 24 y 48 horas.
A partir de los tubos positivos de caldo lactosado verde brillante bilis, utilizando un asa de
micrón cromo se siembra en las placas de Agar EMB y llevar a incubar por 24 horas a 35 ºC.
A las 24 horas las colonias positivas son las colonias típicas (colonias rosado oscuras, con un
núcleo central, con o sin brillo metálico) o las colonias atípicas (colonias rosadas mucoides,
opacas sin núcleo), las colonias negativas son transparentes.
El cálculo de la densidad probable de bacterias coliformes fecales en una muestra está basado
en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución. La
densidad de bacterias coliformes se expresa como NMP de coliformes es por 100 ml.
El NMP se obtiene a través de tablas en las que se presentan el límite de confianza de 95% para
cada valor.
Tres diluciones son necesarias para la obtención del código del NMP. Si tenemos sembrados 3
porciones de las diluciones 10-2, 3 de 10-3 y 3 de 10-4 y se tiene como resultado positivo 3 de 10 -
2
, 2 de 10-3 y ninguno de 10-4. El código resultante para la obtención del NMP será de 3 – 2 –
0.
3.1 Materiales
Incubadora a 35ºC±1 ºC
Estufa
Baño maría a 44.5ºC
60
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Autoclave
Balanza con capacidad de 2kg
Contador de colonias
Lámpara UV
Pipetas graduadas a 1ml y 10 ml
Frascos para dilución 500 ml
Placas de petri
Utensilios estériles para manejar muestras (bolsas plásticas, cucharas, cuchillos, tenedores)
Vasos de precipitado
Medios de cultivo
Caldo Lauril Sulfato o Caldo Lauril Triptosa,
Caldo EC
Caldo verde brillante bilis lactosa
Caldo peptonado al 0.1%
Indol
TSI
Medio para movilidad
Agar citrato de Simmons
Reactivos y colorantes
Reactivo rojo de metilo
Reactivo de kovacs
Reactivos para coloración Gram.
3.2 METODO
Procedimiento
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IV. RESULTADOS
Describirlo con tablas, ilustraciones y/o gráficos. Reportar la presencia de Coliformes Totales
y E. coli..
V. DISCUSIONES
VI. CONCLUSIONES
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PRACTICA Nº 10
I. OBJETIVOS
Muchos mohos transmitidos por alimentos y posiblemente levaduras pueden ser peligrosos para
la salud humana y animal debido a su capacidad para producir metabolitos tóxicos conocidos
como micotoxinas. La mayoría de micotoxinas son compuestos estables que no pueden ser
destruidos durante el procesamiento de alimentos o cocción domestica donde la toxina
preformada aun puede estar presente. Ciertos mohos y levaduras transmitidas por alimentos
también pueden producir reacciones alérgicas o pueden producir infecciones principalmente en
grupos de personas vulnerables como ancianos, personas débiles o inmunodeprimidos.
Los mohos son un grupo grande que incluye varios cientos de especies. La capacidad de estos
organismos para atacar a muchos alimentos se debe en gran parte a sus requerimientos
ambientales de relativa versatilidad. A pesar de que todos los mohos y levaduras son aerobios
obligatorios, su requerimiento de acido alcalino para cocer es bastante amplio; fluctuando de pH
2 a 9. Su rango de temperatura varía de 10 ºC a 35ºC.
Los requerimientos de humedad de mohos transmitidos por alimentos son relativamente bajos; la
mayoría de especies crecen en una actividad de agua (aw) de 0.85 o menos, aunque la levadura
requiere una mayor actividad de agua.
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como granos pequeños, nueces, frijoles, tomates y manzanas en el campo antes de la cosecha y
durante el almacenamiento. También crecen en los alimentos procesados y en mezclas
alimenticias.
En los alimentos pueden ser detectados por presentar colores ligeramente manchados, fuertemente
manchados o complemente descompuesto manifestado por la formaron de manchas de diferentes
colores, micelio blanco, negro, rojo, verde, etc. también pueden producir sabores y olores
anormales.
La contaminación del alimento por mohos y levaduras también puede tener como resultados
pérdidas económicas para el productor, procesador y consumidor.
El método de siembra directa en placa es más eficiente que el método de siembra por diluciones en
placa para detectar especies individuales de moho, incluyendo la mayoría de productores de toxina.
Para el cultivo, aislamiento y determinación del número de levaduras y mohos, a partir de alimentos
y otros materiales.
El medio de cultivo Agar papa Glucosa corresponde a las recomendaciones de la American Public
Health Association para el análisis de alimentos y de productos lácteos.
Las características morfológicas típicas de los hongos se desarrollan bien en este medio de cultivo.
Composición g/L
Infusión de patata preparada a partir de 200 g de papa …………..…. 4 ml
D-glucosa …………………………………. 20 g
Agar ……………………………. 15 g
Preparación
Disolver 39g/ litro y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC
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Empleo e Interpretación
3.1 Materiales
Equipos y Materiales
Estomacher u homogenizador
Equipo de filtración
Incubadora de 22 a 25 ºC
Contador de colonias
Placas petri de 100 x 15 mm
Pipetas serológicas de 10 ml
Pipetas serológicas de 1 ml
Pinzas para papel filtro
Medios de cultivo
Agua peptonada al 0.1%
Agar ogy con oxitetraclina
Agar papa dextrosa
Reactivos y colorantes
Oxitetraciclina
Gentamicina
Kit de colorantes para la coloración gram
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Azul de lactofenol
3.2 METODO
DIA 1
DIA 3 y 5
Informe de Resultados
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PRÁCTICA Nº 11
I. OBJETIVOS
Vedder (1986) indica, que el valor nutricional de las setas es notable, ya que constituyen una
magnífica fuente de proteínas por contener hasta 35% en base seca, Este dato es significativo si se
compara con el 13.2% del trigo y 25.2% de la leche. Además, contienen vitaminas: B1, B2, B12,
C, D, Niacina y Ácido pantoténico, así como ácidos grasos insaturados y un bajo contenido
calórico.
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Los Basidiomicetos que descompone la madera proliferan sobre los árboles muertos de castaño,
haya, roble, aliso japonés o morera, entre otras especies de madera dura. En su hábitat natural, se
encuentra en áreas húmedas y boscosas con sombra. Los hongos se producen en el otoño,
temprano invierno y primavera cuando los cambios de temperatura y la humedad inducen el ciclo
reproductivo. Las esporas son blancos y los bordes de las branquias son dentados. Esta especie es
originaria de Japón, China, la península de Corea, y otras regiones en Asia oriental. (Quaicoe, C.,
& Obodai, 2014 p.45).
Como hongo saprófito de la pudrición blanca, el shiitake produce micelio durante su fase de
crecimiento vegetativo vigoroso. El micelio puede absorber pequeñas moléculas de nutrientes en
forma directa. Sin embargo, es necesario previamente romper las moléculas de nutrientes
complejos a través de la secreción de enzimas para descomponer estas sustancias lignocelulósicas
complejas que sirven como la mayor fuente de carbono para el shiitake.
El carbono es el nutriente más importante requerido por el shiitake, es el elemento base para la
construcción de las proteínas, los ácidos nucleicos y los azucares de las células vivientes; también
es el mayor componente para la obtención de la energía usada para la oxidación en el
metabolismo. El carbono normalmente proviene de los compuestos orgánicos como azucares,
ácidos orgánicos, alcoholes, almidones, celulosa, hemicelulosa y lignina. El nitrógeno es un
elemento indispensable para la estructura protoplasmática y los elementos celulares estructurales
del shiitake (Chen, 2005 p.6).
El agua es vital para el crecimiento y la produccion de shiitake, los nutrientes necesitan ser
disueltos en agua para ser absorbidos por el micelio. Es importante proporcionar y mantener el
volumen de humedad optimo en el substrato para el cultivo del shiitake que debe ser de 55% de
humedad. Shiitake es un hongo aerobio, durante el proceso metabolico, dependiendo de la
disponibilidad de oxigeno, los componente organicos se oxidan a traves de la respiracion, de este
modo la energia liberada se almacena en forma de ATP par luego ser utiliza en el crecimiento del
micelio y la fructificacion. Las diferentes fases de produccion del shiitake requiere cantidades
diferentes de oxigeno. Se requiere mas oxigeno durante la fase reproductiva que durante la fase de
crecimiento vegetativo del micelio. (Donoghue, J., 1995 p.239).
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3.2. Métodos
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Modo de preparación:
Este medio de cultivo se prepara hirviendo 100 g de papa cortado en rodajas sin pelar en
1000 ml de agua destilada durante
CUERPO 10 minutos y luego se decanta y filtra, la infusión se
FRUCTIFERO
DEL HONGO SHIITAKE
formula en base a 1 litro, añadiéndose agar 15 g, glucosa 5g. Se esteriliza en autoclave a 15
libras de presión y 121ºC durante 15 minutos. En condiciones de asepsia el medio de
cultivo se deja enfriar hasta aproximadamente 45 °C y proceder a colocar en placas petri
AISLAMIENTO DEL En condiciones asépticas
estériles dejándose solidificar antes
TEJIDO de su empleo.
A PARTIR DEL
CARPOFORO O ESTIPETE
3.2.2. Aislamiento y purificación del micelio
Una vez sembrado los tejidos del hongo en los medios de cultivo a base de cerveza blanca, a base
de cerveza malta y medio a base de infusión
EVALUACIÓN de papa yPara
A LOS descartar se deja en incubación a
sacarosa;
48 Y 72 HORAS contaminación
temperatura ambiente (17 °C), evaluándose a diario el radio de desarrollo del micelio en los medios
de cultivo.
COLONIZACIÓN T= 12 a 14 días
3.2.4. Selección y evaluación del micelio
COMPLETA EN PLACA
En esta etapa se evalúa el radio de desarrollo en cm/día; haciendo uso de una regla
milimetrada se efectúa a medir el crecimiento radial del micelio a diario.
CEPA MADRE DE
SHIITAKE
T= 3 meses
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Figura 1. Flujo de operaciones para el aislamiento de micelio a partir de pseudo tejido del Lentinula
edodes Berk
IV. RESULTADOS
Los resultados deben ser presentados en orden de las etapas planteadas y deben estar
relacionadas con los objetivos planteados, deben ser redactados en forma clara, precisa y
concisa de los hallazgos significativos de las variables estudiadas. Deben ser presentadas en
tablas, ilustraciones y/o gráfico, estos serán citados y comentados dentro del texto y explicados
de acuerdo a los resultados expresados.
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V. DISCUSIONES
Las discusiones que enuncian los resultados deben ser explicados de manera clara, con sustento
bibliográfico, deben ser comparados con resultados de otros autores como antecedentes.
VI. CONCLUSIONES
Las conclusiones serán obtenidas a partir de los resultados y discusiones, se deben presentar en
un párrafo separado, deben ser redactados en forma clara, precisa y concisa. Deben reflejar el
cumplimiento de los objetivos planteados como una respuesta puntual a los objetivos.
PRACTICA Nº 12
I. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual
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BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
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ANEXO 1. DETERMINACION DE AEROBIOS MESOFILOS VIABLES EN ALIMENTOS