UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE MEDICINA

MICROSCOPÍA
Blga. María Leticia Amésquita
Cárdenas

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA HUMANA

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
 MICROSCOPÍA
Métodos y técnicas
producir imágenes adecuada.

•Técnicas de preparación y •Técnicas de salida,

manejo de los objetos de procesamiento, interpretación
estudio y registro de imágenes.

Elemento central de
microscopia

Mikrós=pequeño
MICROSCOPIO Skopéoo=observar
En siglo XVII, Leeuwenhoek, uso
microscopios simples: dos lupas  1877 Abbe publica la teoría  Calr Zeiss mejora la microscopía
del microscopio donde da de inmersión sustituyendo el
combinadas con 260 aumentos,
mejoras importantes a la agua por aceite de cedro lo que
visualizó: protozoos, bacterias, óptica. permite obtener 2000 X.
espermatozoides y glóbulos
rojos
 óptico
TIPOS DE MICROSCOPIOS
electrónico
simple
óptico
Compuesto
10X y 20X

2X y 4X

útil visualizar como componentes de disección, Luz clara, Campo oscuro, Contraste de
partes de insectos, hongos, estructuras fases, Luz polarizada , Fluorescencia
vegetales
MICROSCOPIO ÓPTICO
 COMPONENTE ÓPTICO
OBJETIVOS
Elementos más importantes formación de
imagen microscópica, porque lentes establecen
calidad de imagen en cuanto: nitidez y
capacidad para captar los detalles de la misma
(poder de resolución).
Caracteriza por:
Lentes convergente y divergente,
Eliminar, aberraciones afecta calidad imágenes.

Lentes disponen dentro soporte o camiseta

metal, en exterior inscritas serie de anotaciones
numéricas que indican:

Imagen que forman los objetivos es:

aumentada de tamaño, invertida y real.
 COMPONENTE ÓPTICO
CLASIFICACIÓN DE OBJETIVOS:
2. Corrección a que se somete las lentes
De acuerdo a:

1. Medio existente entre objeto

examinado y lente frontal del
objetivo.

Secos: entre objeto observado y objetivo solo

existe aire
inmersión: entre preparación y lente frontal
objetivo sustancia líquida: agua,
glicerina o un “aceite de inmersión”,
“aceite de cedro” o aceites artificiales (a) Acromático: corrigen los rayos luminosos azules
y rojos haciéndoles coincidir e un solo plano focal.
(b) Semiapocromático o fluorita, corrigen espectro
secundario dan como resultado imágenes de
bordes nítidos. Corrigen esfericidad verde y azul,
alta capacidad trasmitir royos onda corta son
ideales M. fluorescencia.
(c) Apocromático: hace coincidir solo plano rayos
azules, rojos verdes, obtiene imagen de borde
nítidos.
 Factores que aumentan la capacidad de formar
imágenes a los objetivos
Angulo de apertura:
Capacidad de objetivo de captar los
Índice de refracción: rayos luminosos refractados cuando
éstos atraviesan un medio
transparente. Cuanto mayor sea este
ángulo, la lente frontal del objetivo
aceptará una mayor cantidad de ellos

Apertura numérica (AN):

Cifra a considerar para determinar el rendimiento lente objetivo:
AN = n x sen a
Donde a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.
n = el índice de refracción del medio entre objeto y objetivo.
Velocidad de la luz en el aire
IR= Poder de resolución:
Velocidad de la luz en el medio Calculado mediante la fórmula

IR de: Agua = 1.3300

Aceite de inmersión = 1.5150 Donde: delta= resolución expresada en micrómetros.
Fluorita = 1.4340 lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Vidrio (crown) = 1.5200 Como la ANobj y la ANcond son iguales, resume 2AN.
 Nomenclatura de los objetivos
Gracias a la nomenclatura es posible identificar las propiedades de los objetivos

DIC = Interferencia de contraste diferencial

H = que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage)
 OCULARES
•Forma segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma objetivo.
•La imagen del ocular es de mayor tamaño, virtual y derecha.
•Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces (5X, 8X, 10X,
12X, 15 X) a la imagen formada por el objetivo.
•No añade, más aumentos propios, que los generados por el objetivo.

Clasificación:
Según disposición de lentes y diafragma, dentro del tubo

a) Oculares negativos de Hüygens: dos lentes plano convexos, superficie convexa

dirigida hacia abajo. Entre ambos se sitúa diafragma anular, localizado en el plano
focal de las lentes. Al diafragma se puede adherir puntero que suele ser elaborado
diafragma por pestaña o pelo.

b) Oculares positivos o de Ramsden. Lentes plano convexas dispuestas con

superficies curvas dirigidas hacia adentro. El diafragma situado por debajo de
diafragma
lente de campo o frontal; en el plano donde se forma la imagen formada por
objetivo.
COMPONENTE MECÁNICO:
sistema de soporte
Pinza

Tubo

Platina Brazo

Escala

Píe
COMPONENTE MECÁNICO:
Sistema de ajuste

Anillo de ajuste
de los oculares

Tornillo que
permite mover
el cabezal

Tornillos del
condensador

Tornillos
Palanca de reguladores de
cierre del la platina
diafragma
COMPNENTE MECÁNICO: Sistema de
enfoque

Tornillo
macrométrico
Movimientos
groseros mm /cm
enfoca objeto a
observar

Tornillo
micrométrico
Movimientos
finos, enfoque
exacto.
 COMPONENTE DE
ILUMINACIÓN: Fuente de luz

 Suele ser una lámpara

halógena de intensidad
graduable
 Se enciende y apaga
con un interruptor
 En el exterior puede
Filtro
tener un filtro

Interruptor y graduación
de la luz
Lámpara
COMPONENTE DE ILUMINACIÓN:
Condensador y diafragma

 Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto de
la preparación
 Diafragma o iris (está
dentro del
condensador):si se
cierra mejora el
contraste, pero
empeora la resolución
 TIPOS DE MICROSCOPIA TRAYECTO
DE LA LUZ

b) Campo oscuro: usa condensador

a) Campo claro: Trayecto de la especial con disco opaco que elimina
luz iluminación producida por todo la luz en centro de haz. La única luz
que llega a muestra incide en ángulo, así,
microscopio común.
solo luz reflejada por muestra llega al
La iluminación brillante muestra las objetivo. Con microscopia de campo
estructuras internas y contorno de oscuro los bordes de célula son
cubierta externa brillantes, algunas estructuras internas
brillan y cubierta externa es visible
DIVERSOS TIPOS DE MICROSCOPIO
 MICROSCOPÍA DE LUZ
Haz de luz en todas
direcciones ángulo
POLARIZADA
Ondas tienen el mismo
diferentes
ángulo y plano
Fotones en forma
Fotones igual dirección
aleatorea
Microscopios a los que se les añadido
dos polarizadores. 1 entre
condensador y muestra otro entre
muestra y observador
Polarizador es de cristal de cuarzo y
cristal de nicol entonces luz vibra en
un único plano = luz polarizada
Usa para identificar:
Sustancias cristalinas y fibrosas=
citoesqueleto
Sustancia amiloide, colágeno,
queratina .
 TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN
Y COLORACIÓN
Detener la vida de las células e impedir
FIJACIÓN modificaciones post morten, manteniendo
morfología célula y tejidos sin cambios

CLASIFICACIÓN
DE FIJADORES
MECANISMO DE ACCIÓN PROPIEDADES DE LOS
DE FIJADORES FIJADORES

1. Por coagulación de proteínas, 1. Producen una rápida muerte

alcohol, ácido pícrico, yodo, celular, evitando la autólisis
formol, etc. 2. Preservan la morfología
2. Formando combinaciones celular y tisular
químicas con las sustancias 3. Preservan la composición
orgánicas de las células o química
tejidos, ejemplo Ácido 4. Penetran a los tejidos con
crómico, bicromato de potasio relativa rapidez
de amonio 5. Facilitan la coloración
3. Por reducción al contacto con posterior
las sustancias orgánicas 6. Inhiben el crecimiento
formando un precipitado muy microbiano y por lo tanto la
fino, ejemplo ácido ósmico, putrefacción
bicloruro de mercurio 7. Aumentan la consistencia de
4. Por oxidación, ejemplo los tejidos
bicromato de potasio 8. Algunos de ellos colorean
sustancias de los tejidos
Coloración: TEORÍA DE LA COLORACIÓN
cuerpo toma color bajo la
acción de un colorante

De acuerdo a esta teoría los colorantes se unen a los tejidos por enlaces iónicos, covalentes
o de hidrógeno

Enlace iónico o electrostático ocurre cuando el colorante y la sustancia que va a teñir,

desarrollan diferentes cargas eléctricas y entonces se atraen una a la otra,
Eje. citoplasma se colorea porque la proteínas poseen carga eléctrica (+) y colorante tienen
carga eléctrica (-)
 Colorantes
Sustancias que conferir color a otros cuerpos, ya sea del mismo color que ellas (colorantes
ortocromáticos), o bien teñir de un color distinto (colorantes metacromáticos)

Clasificación de colorantes
COLORANTES NATURALES: derivados del dibenzopireno

El principio colorante producido por la naturaleza pueden ser de:

Origen animal:
Carmín: o cochinilla: insecto coccus cacti, transforma en carmín por acción de alumbre u
otras sales metálicas

Origen vegetal:
Hematoxilina: extraído del árbol del Campeche, no tiene poder colorante por si misma, se
oxida fácilmente a hemateína un colorante débilmente ácido
Orceína: (liquenes), incolora pero al tratamiento con amonio y exposición al aire se torna
azul o violeta conocido como Orcina compuesto fenólico, la fórmula es:

se utiliza para teñir fibras elásticas y cromosomas.

 COLORANTES ARTIFICIALES
modificación anillo bencénico por
reemplazo de 2 C por 1 H u otro átomo con
doble valencia = compuesto coloreado

Básicos:
Acidos: Neutros: C. Indiferentes:
Sales con base coloreada Sales con parte básica
Sales con base incolora, ácida incolora carga Compuestos no iónicos
ácida coloreada carga y ácida incapaces de disociación
positiva
negativa tiñe citoplasma y electrónica son insolubles
colorante catiónico tiñe núcleo en agua peso solubles en
Colorante aniónico, tiñe núcleo
citoplasma wright, giemsa, solventes orgánicos
Azul de metileno, leischman Sudan negro, sudan III,
Eosina, amarillo de hematoxilina, azul de
metilato, fucsina ácida, sudan IV.
toluidina, fucsina básica
naranja G, safranina
 Características de los colorantes
 Penetración: Entrada del colorante a la célula y a través del tejido.
 Inocuo: No debe producir alteraciones en las células ni en los componentes del tejido a colorear.
 Especificidad: Debe colorear ciertas estructuras celulares a través de uniones fuertes.

 Características químicas: deben poseer 2 regiones:

Cromóforos: Grupos que poseen el color, por lo tanto, presentan dobles enlaces alternados con
enlaces simples.

Ej: -C=C- -NO2 -C=O -N=N - -N=O

Auxocromos: Grupos ionizables, los que permiten la unión del colorante a la sustancia a teñir, a través de
uniones con grupos de carga opuesta. Determinan si son colorantes básicos (negativos),
ácidos (positivos) o neutros, son por tanto, determinantes para su unión a los tejidos.
Ej:

Ácidos: -COOH, -OH, -SO3H

Básicos: -NHR, -NR2, -NH2

 Tamaño (PM) molécula colorante y su planalidad (capacidad de rotación) ya que de esto dependerá
cuan fácil y rápido penetrara dentro de un tejido y por lo tanto a cuales componente celulares se unirá.
 Métodos de coloración

o Directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.

o Indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración
tenga lugar.
o Progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
o Regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del
colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina
diferenciación.
o Simple: colorean algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).
oCombinada: tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente,
al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores.
o Panóptica: combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-
Giemsa).
o Pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se
necesiten.
¿ Porque que algunas bacterias se tiñen de azul y otras de rosa o rojo?