C¡omatosrafia en caoa fina

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

OBJETIVOS

a) Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, (ccf), sus características y los

factores que en ella intervienen.

b) Calcular valores de Rf de varias sustancias y correlacionarlo a la selección

adecuada del eluyente y deducir la relación que existe entre la polaridad de las
sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.

c) Aplicar la técnica de cromatografÍa en capa fina como criterio de pureza e

identificación de sustancias.

ANTECEDENTES

a) Concepto de cromatografía. Tipos de cromatografía. Cromatografía de adsorción

y cromatografía de partición. Ejemplos.

b) Fenómeno de adsorción. La propiedad de retención. Concepto de Rf

c) La cromatografía en capa fina. Sus características y aplicaciones.

d) Eluyentes, soportes y reveladores más comunes para cromatografía en capa

Ttna.

e) Factores que ¡nfluyen en una separación por cromatografía de capa fina.

INFORMACIÓN

Concepto de cromatografia

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos

por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase
móvil. Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las
dos fases involucradas: sólidoJiquido (capa fina, papel o columna), liquidoJiquido y
gases-liquido ( fase vapor ).

Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de

la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que
transporta las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra,
denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la
estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

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Quim. Orgánica t (13ll)

grado otras sustancias sObre su superficie; y, similarmente' todas las sustancias pueden
ier adsorbidas, unas con más facilidad que otras. Este fenómeno de adsorción selectiva
es el principio fundamental de la cromatografía.

Concepto de Rf

Rf es el registro, es una relación de distancias, y se define como:

p1 = (a) distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación

(b) distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente.

Punto de aplicación

(a) (b)

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de

adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de
t
saturación, etc"). Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que es mejor correr
duplicados de la misma Placa.

Cromatografia en caPa fina

En este caso se utiliza una placa recUbierta con fase estacionaria manten¡endo un
pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por
tap¡taridao, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo
"manchas" de los comPonentes.

En la cromatografía en capa fina (ccf), el grado de elución de las sustanc¡as depende

tanto de su profia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado'

El adsorbente se coloca en forma de una capa delgada adherida sobre un soporte rígido,
quá pueoen ser placas de vidrio, aluminio o poliéster. Los tamaños de la placa para ccf
convencional son: 20 x 20; 't0 x20 y 5x2 cm.

Quín. Orgán¡ca I (131l)

 Cromatografía en capa,Ela

Hay adsorbentes que contienen un indicador de fluorescencia para facilitar la

identificación de muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos,
se requerirán otras técnicas de revelado.

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina

oetróleo
- éter de - cloruro de metileno
- n-hexano - acetato de etilo
- ciclohexano - acetona
' tolueno - rso-propanol
- dietil-éter - etanol
- f-butil-éter - metanol
- cloroformo - ácido acético

Reveladores más comunes para cromatografa en capa fina

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden
revelarse mediante:
a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F25a ó F366), el número
que aparece como subíndice nos indica Ia longitud de onda de excitación del
indicador utilizado"
b) La introducción de la placa en vapores de yodo
c) El rocío con una solución de agualH2SOa 1 :1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después
calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero. hasta carbonizar los
comDuestos.

Adsorbentes más comunes para cromatograf¡a en capa fina.

a) Gel de sílice (se utiliza en el 80% de las separaciones)
b) Oxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
Para la selección del adsorbente deber tomar las s¡guientes consideraciones:

a) Polaridad
b) Tamaño de partícula
c) Diámetro
d) Area Superficial
e) Homogeneidad
fl Pureza

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Quin. 0rgánica I (1311)

 Cromatoerafla en caDa fina

Factores que influyen en una separación por cromatografía de capa fina.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase

estacionaria.
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o agentes
plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben
limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar
secar completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

MATERIAL

Pioeta de 5 ml * 'l Espátula 1

Probeta de 25 ml - 1 Frasco p/cromatoqraf ía c/tapa 3

Tubos caoilares ? Portaobietos 6
Aqitador de vidrio 1 Vidrio de reloi I

* graduados

MATERIAL ADICIONAL

Lámoara de luz UV. onda larqa v onda corta 1

Cámara oscura para lámpara de luz UV 1

SUSTANCIAS Y REACTIVOS

Silicagel 60 HFzs¿ Para ccf Acetona

Benzoína Acetato de etilo
Cafeína n-Hexano
Nipagín Metanol
Nipasol Yodo

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Quím. Orgá¡ica I ( 13l l)

 Cromatog¡afía en capa fina

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE CROMATOPLACAS Y CAPILARES

Se pueden util¡zar cromatofolios ya preparados (comerciales), o bien, preparar las

cromatoplacas en el laboratorio.

Para preparar las cromatoplacas, se introducen dos portaobjetos juntos, limpios y

secos, en una suspensión de gel de sílice al 35% en acetato de etilo, se dejan secar
al aire y se separan con cuidado. Se preparan 6 cromatoplacas y se ordenan sobre
una hoja de papel.

Para aplicar las soluciones a las cromatoplacas ulilice capilares, que previamente
deber ser estirados en la flama del mechero (flama pequeña), con el fin de que
tengan el diámetro adecuado (ver Figura l)

Para mayor claridad de los resultados, incluya en su informe los dibujos de las
cromatoplacas a tamaño natural de todos los experimentos de esta sesión.

EXPERIMENTO 1,. APLICACION DE LA MUESTRA Y EFECTO DE LA

CONCENTRACIÓN,

Con la micro pipeta, tome una pequeña cant¡dad de la solución-problema y aplique

una gota sobre la capa de Silicagel, a 1 cm. aprox. del borde inferior de la placa (ver
Figura 2) y trace una marca, con un lápiz fino, en el borde derecho, para no perder el
punto de aplicación.
Para saber cuál es el efecto de la concentración (o el tamaño) de las gotas, se harán
3 aplicaciones de la solución No. 1 en orden creciente de concentración, en una sola
placa, como se ¡ndica en el siguiente ejemplo:

1u aplicación 1 gota
2a aplicación 3 gotas
3a aplicación 9 gotas

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Quím. Orgánica I ( 13l I)

 Cromatosraf'fa en caDa fina

Para desarrollar el cromatoqrama, introduzca la placa en una cámara de elución,

(que puede prepararse con un frasco de tamaño apropiado), a la que previamente se
le coloca por dentro un cuadro de papel filtro para aumentar la saturación de los
vapores del eluyente, coloque unos 4 mL de acetato de etilo y tápela (Figura 3).
Una vez que la placa esté dentro de Ia cámara, no debe moverla. Cuando el frente
del eluyente esté casi en el borde superior de la capa de Silicagel, abra el frasco,
retire la placa y marque el frente del eluyente con un lápiz fino. Coloque la placa en
su hoja de papel, donde anotará sus datos, y déjela secar al aire.

Para visualizar las manchas, revele primero con la lámpara de luz UV (Figura 4),
marcando el contorno de cada una con un lápiz fino y luego introduciendo la placa en
una cámara con cristales de yodo.

Conteste las siguientes preguntas:

a) ¿Cuál es la relación existente entre la intensidad y tamaño de las manchas con la

concentración de la sustancia aplicada en cada caso?
b) ¿Cuál es el Rf de la mancha intermedia?

Experimento No, 2.- Polaridad de las sustancias y polaridad de los

eluyentes.

Para comparar la polaridad de dos sustancias diferentes, se le proporcionarán las

soluciones No. 2 y No. 3. Prepare 3 cromatoplacas y aplique estas dos soluciones
en cada una de ellas, de tal manera que queden como en el siguiente ejemplo:

sólución 3
Solucion2 -------------+
oo
5l

Quím. Orgánica I (1311)

 Cromatograff a en capa-.lEla

Para comparar la polaridad de los eluventes, eluya la primera cromatoplaca con

hexano, la segunda con AcOEt y la tercera con MeOH.

En cada caso, deje evaporar el eluyente y revele con luz UV, observe y anote sus
resultados (calcule el Rf de cada mancha). Luego, revele con yodo y anote sus
observac¡ones.

Con base en los resultados obtenidos, conteste las siguientes pregunta$

a) ¿Cuál es el eluvente adecuado? ¿Por qué?

b) ¿Cuál de las dos sustancias problema es la más polar? ¿Por qué?
c) ¿Cuál es la sustancia problema menos polar? ¿Por qué?

Experimento No. 3.- Pureza de las sustancias.

Se desea saber cuál sustancia es pura y cuál es impura- Para esto se le

proporcionarán las soluciones No.4 y No. 5. Prepare una cromatoplaca y aplique
en ella ambas soluciones, como en el experimento anter¡or.

Eluya con AcOEt y deje secar. Revele con luz UV y luego con yodo. Anote
sus resultados y observaciones.

Solucion4 -------------+ oo Solución 5

Conteste las siguientes preguntas:

a) ¿Cuál es la sustanc¡a pura? ¿Porqué?

b) ¿Cuál es la sustancia impura? ¿Cuántas impurezas se observan?
c) ¿Cuál es el Rf de la sustancia principal?
d) ¿Cuál es el Rf de la impureza?
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Quím. Orgánica I (1311)

 Cromatograffa en caoa fina

Experimento No. 4-B

Se desea identificar dos pastillas de analgésicos d¡ferentes (Prob. 1 y Prob. 2),

utilizando la técnica de ccf, comparando las dos con una muestra patrón.
En este caso, se utilizarán Cafiaspirina (Ac. acetil-salicílico y cafeína) y Sacrdo/ (Ac.
acet¡l-salicílico, paracetamol y cafeína), pero puede usarse otro juego de analgésicos
diferente.

Se le darán las soluciones marcadas como Prob. 1 y Prob.2, (sin que Ud sepa cuál es
cuál). Se usará cafeína como muestra patrón.

Prepare dos cromatopla€s iguales y aplique las soluciones en cada una siguiendo el
siguiente esquema:

Cafeína

Prob.2
Prob. 1

Eluya una de las cromatoplacas en metanol, y la otra en AcOEt. Deje secar, revele las
dos cromatoplacas con luz UV y anote los resultados obtenidos en cada una.

Conteste las siguientes preguntas:

a)¿Cuál eluyente permite una mejor separación de los componentes?

- Tomando en cuenta solamente Ia cromatoplaca eluída en el eluyente que resultó

ser el adecuado, conteste también las siguientes preguntas:

b) ¿A qué analgésico corresponde el Prob. 1? ¿Por qué?

c) ¿A qué analgésico corresponde el Prob. 2? ¿Por qué?
d) ¿Cuál es el Rf del ácido acetil-salicílico?
e) ¿Cuál es el Rf del paracetamol?
f) ¿Cuál es el Rf de la cafeína?

Quím. Orgánica I (l3ll)

 Cromatosraffa en caDa fina

Preparación de las rnicropipetas Aplicación de la muestra en la cromatoplaca

Figura 1 Figura 2

Placa

Papel filtro

Punto de aplicación SolVent

lrrlnl
\
-->
Disolvente
=--\-----
\ \
Frente del eluyerrte ----
Frasco de elución Revelado con luz UV

Figura 3 Figura 4

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Quím. Orgánica I (1311)

 Cromatoqrafía en capa fina

MANEJO DE RESIDUOS
Los residuos generados en este experimento son:

RESIDUOS CANTIDAD
D1. Hexano
D2. Acetona
D3. Metanol
D4. Acetato de etilo
D5. AcOEt-Hexano
D6 Caoilares
D7. Gel de sílice para ccf

D1 a D5: Guardar los disolventes para recuperarlos por destilación

D6: Empacar cuidadosamente para incineración.
D7: Se puede recuperar para su reuso, previo lavado y secado

CUESTIONARIO

a) En el experimento 2, ¿cuál.de las dos sustancias, la más polar o la menos polar,

recorre mayor distancia en la placa a partir del punto de aplicación? ¿por qué?

b) ¿Qué significa que una sustancia tenga:

a) Rf < 0.5?
b) Rf = 0.5?
c) Rf > 0.5?
c) En el experimento 4, ¿cuál de las dos formas de elución permitió mayor
separación de la mezcla?, ¿a qué se debe esto?

d) ¿Por qué se dice que la ccf es un criterio parcial y no total de identificación?

e) ¿Cuál será el resultado de los siguientes errores en cromatografía en capa fina?

a) Aplicación de solución muy concentrada.

b) Utilizar eluyente de alta polaridad.
c) Emplear gran cantidad de eluyente en la cámara de cromatografía.
f) Una serie de colorantes es separada por cromatografía en capa fina. Calcular los
valores de Rf de cada colorante de acuerdo a la siguiente tabla.

Colorantes: Distancia Recorrida (mm)

Eluyente 66.0
Rojo de metilo 56.0
Rodamina B 38.0
Rojo Congo 0.5

g) ¿Qué tratamiento es necesario darle ala gel de sílice para reutilizarla?

Quím. Orgánica I (lJ1l)

 Cromatosrafia en caDa fina

BIBLIOGRAFIA

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Quim" Org{nica I (131 1)