Northern Blot
Northern Blot
Northern Blot
Northern blot es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una
secuencia de ARN específica en un muestra, permite también determinar el
tamaño de la transcripción de ARN mensajero. El northern blot fue desarrollado en
1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de
Stanford (Boundless, 2013).
Fundamento de la técnica:
(P. Jorge Chedrese., 2009)
El procedimiento involucra electroforesis del ARN total o ARN poli-A junto con
marcadores de pesos moleculares, para separar moléculas por tamaño.
Las muestras de ARN son disueltas en buffers que contienen formamida y la
electroforesis es llevada a cabo en un gel que contiene formaldehido.
El formaldehído y la formamida son fuertes agentes desnaturalizantes que rompen
la estructura secundaria del ARN, las cuales pueden dificultar la migración (Pedro
L. Fernández Ruiz., 2010). Por lo tanto, moléculas de ARN linealizadas pueden
ser separadas y visualizadas por tinción con colorantes fluorescentes como
colorantes de bromuro de etidio y cianina SYBR verde.
Al igual que en el Southern blot, el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se
hibridan con sondas de ADN marcada. Durante la electroforesis se pueden
observan grandes cantidades de ARNm correspondiente a ribosomal (unidades
28S y 18S)
Descripción de la Técnica
(Thanos Athanasiou, 2010)
● Extracción de ARN: Es importante obtener ARN con alto grado de pureza
de las muestra biológica
● Electroforesis en gel: Se utiliza gel de agarosa, los transcriptos de ARN son
separados por tamaño, evitar que se formen estructuras de ARN
secundarias que no migren, se utiliza agentes desnaturalizantes como el
Formaldehido. Usualmente aparece como una mancha en lugar de bandas
definidas porque hay presentes muchas moléculas de ARN diferentes.
● Transferencia del blot a una membrana y su posterior de inmovilización: El
ARN está negativamente cargado, por lo que la membrana de estar
cargada positivamente. Existen varias membranas que poseen compuestos
químicos que pueden ser utilizadas, el más comúnmente utilizado es el
Naylon. Para la inmovilización del RNA se aplican dos procesos. El primero
la membrana es expuesta radiación UV, esto se hace con la finalidad de
generar enlaces covalentes entre las bases de nitrogenadas y los grupos
amino de la membrana. El segundo procedimiento la membrana es
calentada a 80 C, esto se hace con la finalidad de evaporar el agua que
contiene al ARN solubilizado, se crean fuertes interacciones entre las bases
nitrogenadas del ARN que son hidrófobas con los compuestos aromáticos
hidrófobos de la membrana.
● Bloqueo e Hibridación: Un paso antes de la hibridación es el bloqueo, La
secuencia blanco (el blot) se incuba junto con la secuencia de ADN
conocida de una sola hebra (denominada sonda), la cual va a formas pares
de bases con su secuencia de ARN complementario, uniéndose para
formar una molécula de ARN-ADN de doble cadena. La sonda puede ser
marcada con una sustancia radioactiva o puede tener una enzima unida a
ella. Para eliminar la sonda se realizan numerosos baños con soluciones
decrecientes de concentración salina.
● Detección: La naturaleza de la sonda determina el tipo de método de
detección. Una sonda de rayos X es colocada debajo de la membrana e
incubada en la oscuridad. Las manchas resultantes aparecen exactamente
arriba de los lugares donde el ADN radioactivo se ha unido al ARN, estas
manchas se observan negras si se ven de manera directa.
Thanos Athanasiou, H. D. (2010). Key Topics in Surgical Research and Methodology. Springer
Gilbert, Scott F. (2005) Biología del desarrollo. Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
Pedro L. Fernández Ruiz. (2010). Hibridación de los ácidos nucleicos. Fundamento teórico . 2014,
de Hospital Clínico/ IDIBAPS/Universidad de Barcelona Sitio web: http://www.xn--
patologa-i2a.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-bcfb-
d75fd6b2ee9f&groupId=10157