Microbiologia Agricola

EDITOR
Ada S. Albanesi
Microbiología Agrícola.
Un aporte de la Investigación
en Argentina
SEGUNDA EDICIÓN
Prefacio
Microbiología Agrícola. Un aporte de la Investigación en Argentina, se-

gunda edición es un libro que concentra conocimientos y experiencias realizadas
en Argentina y se constituye en material de consulta para la enseñanza de grado y
de posgrado en aquellas áreas que contemplan los procesos biológicos del suelo
y que tienen vinculación con la microbiología agrícola. Tiene 28 capítulos, aporte
de igual número de equipos o personas que investigan en la Argentina y se abordan
aspectos que hacen a la calidad de los suelos, a las rizobacterias que promueven
el crecimiento vegetal, a la fijación simbiótica de nitrógeno, a las micorrizas, al
tratamiento de residuos o a la bioremediación. En todos ellos se ha privilegiado
la calidad académica y el aporte como material de discusión para la enseñanza de
grado y posgrado.
Han pasado 10 años desde aquella primera edición en 2003 y en ambas
oportunidades este libro ha sido editado con un gran esfuerzo y con un fuerte
apoyo de toda la comunidad científica relacionada a la temática. Su edición ha
sido posible gracias al apoyo académico de la Universidad Nacional de Santiago
del Estero y de la Comisión Organizadora Permanente de la Reunión Nacional de
Biología de Suelos y del Congreso Argentino de Biología Molecular de Suelos y
a la colaboración prestada por varias empresas relacionadas con la microbiología
agrícola.
Como comité editor promovemos la concreción de este libro con el con-
vencimiento de que existe un recurso humano insustituible en Argentina que ge-
nera conocimientos importantes y que hay receptores ávidos de esta información:
los estudiantes de grado y posgrado, en primera instancia.
Nuestras Universidades y centros de investigación, a partir de la generación
y difusión de conocimientos se convierten en transformadoras de la realidad social,
económica y política de nuestro país. Este libro es una contribución a ello porque
abre un espacio en donde se genera producción de conocimientos, discusión de
teorías; en definitiva, constituye un aporte al pensamiento crítico.
Ada S. Albanesi
Presentación
Este libro,“Microbiología Agrícola. Un aporte de la Investigación en Ar-

gentina” en su segunda edición, ha sido generado por la convocatoria desde el
seno de nuestra Facultad de Agronomía y Agroindustrias de la Universidad Na-
cional de Santiago del Estero.
Presenta 28 capítulos ordenados en 9 ejes temáticos vinculados a tópicos
como indicadores de calidad de suelos, ciclado de la materia orgánica, diversidad,
interrelaciones sinérgicas, antagónicas, biofertilizantes, biodegradación.
Los autores pertenecen al plantel de Docentes y/o Investigadores de Uni-
versidades Nacionales, Institutos Nacionales de Investigación –como el CONI-
CET- y/o de generación de tecnología –como el INTA, y sus contribuciones son
en función a los aportes científicos producidos por sus investigaciones, general-
mente institucionalizados en el sistema de Ciencia y Técnica de la Nación y, en
algunos casos, con aportes del sector privado.
Esta publicación contribuye generando información para el abordaje de
temas de gran pertinencia para la región y para el país asociados a la producción
agropecuaria y a temas ambientales y de conservación de los recursos, a los efectos
de propender al tan ansiado Desarrollo de nuestros habitantes en general y del sec-
tor agropecuario y agroindustrial en particular.
La Facultad de Agronomía y Agroindustrias de la UNSE reconoce el im-
portante esfuerzo plasmado en este importante compendio, que sin dudas permitirá
contar en nuestras bibliotecas el fruto del esfuerzo de nuestros investigadores ar-
gentinos, como insumo educativo para nuestros estudiantes, y como un aporte
para mejorar la calidad de vida de los habitantes de nuestra patria.
Ing. Agr. José Manuel Salgado

Decano FAyA UNSE
Calidad de suelo. Propiedades biológicas
y evaluación en ecosistemas semiáridos
Soil quality. Biological properties and evaluation in

semiarid ecosystems
Albanesi Adaa*, Analia Anriqueza, José A. Dominguez Nuñezb,

Juan Silbermana, Carlos Kunstb
Resumen
La calidad de suelo, está relacionada con las funciones del mismo en eco-
sistemas naturales y agroecosistemas e incluye los principios de la sustentabilidad,
cuyo objetivo es alcanzar una alta capacidad productiva sin perder sus propiedades
físicas, químicas y biológicas. La misma es dinámica y está en función de las ca-
racterísticas específicas del suelo, de las condiciones ambientales en que se en-
cuentra, del uso y prácticas de manejo. Esto presenta numerosas dificultades al
momento de definir y cuantificar la calidad, en particular al considerar las pro-
piedades biológicas y bioquímicas usadas como indicadores, las cuales aún no
presentan un consenso en cuanto a su determinación y niveles de referencia. Esto
dificulta la interpretación de los indicadores analizados individualmente, en índi-
ces simples, o en índices multiparamétricos. El objetivo es discutir la necesidad
de una mirada integradora en la evaluación de los suelos, resaltar los indicadores
biológicos y bioquímicos en la construcción de índices y evaluar la calidad en sis-
temas de producción en ambientes semiáridos. En la región chaqueña el efecto de
los sistemas de habilitación de tierras evaluados, esta en función del manejo pos-
terior del sitio, y los indicadores, en general, presentan una fuerte dependencia
del sitio ecológico y la cobertura vegetal presente.
Palabras clave: Región chaqueña, silvopastoril, indicadores microbiológicos
a
FAyA–Univ. Nac. Sgo. del Estero; Av. Belgrano 1912, (4200) Sgo. del Estero.
*Mail: albanesi@unse.edu.ar
b
INTA-Santiago del Estero;
c
ETSI-UPM España
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Microbiologia Agrícola. Un aporte de la Investigacion en Argentina. Segunda Edición
Calidad de suelos
A partir de la década de los 90 los estudios sobre la calidad del suelo fueron
en aumento, sin embargo, contrariamente a otros conceptos como calidad del aire
y agua, aún no existe reglamentación para establecer la calidad del suelo, ni un
consenso sobre su concepto. Han surgido varias significaciones de calidad de sue-
los, en su mayoría relacionados con las funciones del mismo en ecosistemas na-
turales y agrícolas (Araújo et al., 2012). Las funciones específicas del suelo
incluyen: i) captar, mantener y liberar agua y nutrientes y otros compuestos quí-
micos. ii) recargar las napas subterráneas. iii) mantener un hábitat edáfico ade-
cuado para la actividad biológica del suelo.
La calidad de suelos, establecida por el comité de la Sociedad Americana
de la Ciencia del suelo, es la capacidad funcional de un tipo específico de suelo,
para sustentar la productividad animal o vegetal, mantener o mejorar la calidad
del agua y el aire, y sostener el asentamiento y salud humanos, con límites eco-
sistémicos naturales o determinados por el manejo (SAG, 2005). Incluye los prin-
cipios de la sustentabilidad, cuyo objetivo es alcanzar una alta capacidad
productiva (habilidad del suelo para promover la productividad del ecosistema o
agroecosistema, sin deteriorar sus propiedades físicas, químicas y biológicas) y
la conservación o mejoramiento de la capacidad del mismo para atenuar los con-
taminantes ambientales, los patógenos, y cualquier posible daño hacia el exterior
del sistema, incluyendo también los servicios ecosistémicos que ofrece (Cuevas
et al., 2004), con el fin de lograr un rendimiento sostenido de manera constante a
lo largo del tiempo (López Zamora, 2005).
La calidad del suelo es dinámica y puede cambiar en el corto plazo de
acuerdo con las características específicas del suelo, con las condiciones ambien-
tales, con el uso y con las prácticas de manejo; es por ello que para conservarla es
necesario implementar prácticas sustentables en el tiempo con sistemas de manejo
diferentes según cada situación particular (Navarrete Segueda et al., 2011). Inter-
pretar y predecir los efectos del manejo sobre la calidad del suelo a través de in-
dicadores confiables y sensibles constituye una de las principales finalidades de
la ciencia del suelo moderna (Campitelli et al., 2010).
Evaluación de la calidad de suelos

Si bien la determinación de la calidad del suelo resulta esencial para poder
evaluar la sustentabilidad de los sistemas de manejo de la tierra (López Zamora,
2005), aún existen dificultades en su determinación ya que la búsqueda de índices
cuantitativos es difícil, y que muchos de los cambios se producen a largo plazo, y
por lo tanto un cambio en la calidad sólo puede ser percibido cuando todos los
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Calidad de suelo. Propiedades biológicas y evaluación en ecosistemas semiáridos
efectos son combinados durante un período de tiempo (Gil –Sotres et al., 2005;
Li et al., 2013).
En la evaluación de la sustentabilidad y considerando que la calidad del
suelo es un aspecto fundamental de la misma, existen dos posibilidades: una es la
evaluación per se y la otra es la evaluación comparativa. La primera exige una
definición de valor absoluto de sustentabilidad donde el factor tiempo es esencial
ya que se compara un sistema consigo mismo en el tiempo. En la evaluación com-
parativa (retrospectiva o prospectiva) no importa el valor absoluto ya que se com-
paran sistemas o tecnologías. En la comparación retrospectiva es muy importante
conocer el estado inicial o de referencia y que los cambios que se evalúen sean
debidos al efecto del sistema que se está evaluando y no estén enmascarados por
otros factores. En la evaluación prospectiva se puede realizar un monitoreo de in-
dicadores en el tiempo, por lo cual se necesitan varios años para lograr resultados
confiables. Otra forma es realizar una proyección a futuro con una serie histórica
de datos ajustando a alguna función matemática para conocer la tendencia (Sa-
randón, 2002).
Independientemente del método, la evaluación de la sustentabilidad está
basada, fundamentalmente, en la elección correcta de los indicadores y en el des-
arrollo de su aplicación dentro de un sistema de monitoreo (SAG, 2005). Es así
que la calidad del suelo, no puede ser medida directamente ya que se necesitan un
gran número de variables, puede ser estimada a partir de indicadores selecciona-
dos.
Para evaluar la calidad del suelo es conveniente determinar la escala de es-
tudio, dividir la región o área de estudio en diferentes ecorregiones, seleccionar
zonas ecológicas con suelos similares, definir el objetivo de estudio sobre la cali-
dad del suelo (producción agrícola, protección ambiental o cualquier otro uso), se
deben elegir un conjunto de indicadores para el área de estudio, seleccionar un
punto de referencia (línea base) para cada indicador y especificar los límites crí-
ticos para los indicadores seleccionados que varían en función de cada indicador
y transformarlos en índices de calidad de suelo/sustentabilidad (Araújo et al.,
2012).
Niveles de percepción
En el ajuste de las metodologías de evaluación es muy importante, el espa-
cio elegido como nivel de resolución, el cual depende de la escala de estudio, ya
que los paisajes son por naturaleza heterogéneos en su composición y dependientes
de la escala. Es así que con una misma resolución temática, un paisaje puede ser
homogéneo en la escala local, pero heterogéneo en otra escala incluida o inclusiva
de la anterior (Riesco Chueca et al., 2008), siendo por ello importante definir pre-
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viamente el nivel de análisis y caracterizar el sistema a evaluar, en particular el

ecosistema suelo ya que la heterogeneidad y dinámica del mismo, proporcionan
un carácter dinámico de su calidad, la cual puede cambiar en el corto o largo plazo
de acuerdo al uso y a las prácticas de manejo (SAG, 2005).
El tipo de indicadores elegido está influenciado fuertemente por el nivel de
análisis, existiendo indicadores de calidad de suelo de escala local y de nivel re-
gional, estos últimos requieren la agregación y regionalización de los datos que
alimentan a los indicadores. Estos indicadores de calidad del suelo son importantes
ya que facilitan el establecimiento de estrategias para la planificación y formula-
ción de políticas y acciones de aprovechamiento y conservación del recurso suelo
(Navarrete Segueda et al., 2011).
Niveles de referencia
Los indicadores de calidad de suelos seleccionados, deben ser propiedades
edáficas que mejor reflejen el cambio en la calidad, aún cuando la misma es afec-
tada por un gran número de propiedades. No existen procedimientos de evaluación
adecuados y acordados por el cual estas propiedades se miden adecuadamente.
Además existen diferentes enfoques para establecer los niveles de referencia de
calidad de un suelo, uno de ellos considera que un suelo de máxima calidad es
aquel que está en equilibrio con todos los componentes del ambiente, es decir, un
suelo climax desarrollado bajo vegetación climax. El otro enfoque considera que
un suelo de referencia de máxima calidad es aquel capaz de mantener una alta
productividad y de provocar el mínimo disturbio al ambiente (Gil –Sotres et al.,
2005; Li et al., 2013).
El nivel umbral de cada indicador puede ser obtenido de diferentes maneras:
i) de los ecosistemas no disturbados o con impactos antropogénicos mínimos
(cuando se comparan suelos dentro de una región ecológica o de un mismo tipo
de suelo), ii) el uso de suelos de referencia capaces de mantener un alto nivel de
productividad y funciones medioambientales en estrecha relación con el nicho
ecológico de los cultivos que se realicen en los agroecosistemas a evaluar, esto
es, en relación con los requerimientos óptimos de las especies que habitualmente
se cultivan en la región, área o sitio; iii) determinando los valores medios resul-
tantes de estudios realizados con anterioridad o a partir de datos históricos, de los
mismos suelos de los agroecosistemas que se desea evaluar; iii) fijando como lí-
mite crítico una proporción por encima de los valores medios del indicador y fijar
este exceso como nivel de sostenibilidad de ese indicador; iv) monitorear las di-
námicas de los cambios de los indicadores para determinar la calidad del suelo
(Albanesi et al., 2003).
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Índices de calidad de suelos

Un índice de calidad del suelo es el conjunto mínimo de parámetros (pro-
piedades físicas, químicas, microbiológicas y bioquímicas) que, cuando relacio-
nados entre sí, proporciona datos numéricos sobre la capacidad de un suelo para
llevar a cabo una o más funciones (Bastida et al., 2008), brindando información
para la toma de decisiones. La búsqueda de un índice único y factible es inalcan-
zable.
Los índices se calculan a partir de fórmulas que introducen una o múltiples
propiedades del suelo (indicadores de la calidad del suelo) convenientemente nor-
malizadas y ponderadas. Para la construcción de los mismos existen diferentes
metodologías, que dependen del objetivo de manejo de los ecosistemas, y gene-
ralmente involucran tres etapas: (i) la selección de las propiedades del suelo / in-
dicadores que constituyen el conjunto mínimo de datos; (ii) la transformación de
los resultados de los indicadores a una escala de medición común que permita la
cuantificación de todos los indicadores y (iii) combinar el resultado del indicador
en un índice que puede ser aditivo o aditivo ponderado (Laishram et al., 2012).
Los índices pueden ser simples o multiparamétricos según la cantidad de
indicadores utilizados. La ventaja de los primeros es que al usar dos parámetros
son fáciles de aplicar, sin embargo su limitación es la falta de información. Es
por ello que se deben obtener índices multiparamétricos para los agrosistemas y
ecosistemas naturales, que integren y proporcionen más información sobre la ca-
lidad de un suelo.
Uno de los procesos utilizados cuando se trata de índices simples es deter-
minar relaciones entre dos parámetros por ejemplo: respiración edáfica: biomasa
microbiana (qCO2); C de la biomasa microbiana: C orgánico total; cantidad de
un componente celular: C de la biomasa microbiana (Bastida et al., 2008).
En la construcción de índices multiparamétricos uno de los procesos utili-
zados es la selección de un set mínimo de indicadores usando una metodología
integradora y con base en regresiones lineales entre las variables medidas y la fun-
ción del suelo que se esté evaluando. Por lo general se utilizan métodos estadísti-
cos multivariados para describir las principales correlaciones entre variables y
sitios de muestreo y se introduce cada indicador seleccionado para construir el ín-
dice matemático, que puede ser de tipo aditivo (Delgado et al., 2010).
Otros de los procedimientos utilizados es la selección mínima de indicado-
res , los cuales pueden ser previamente normalizados utilizando una escala en
dónde se representen las condiciones más y menos deseables desde el punto de
vista de la calidad del suelo, independientemente de los valores absolutos medidos
para cada indicador. El índice de calidad de suelos también se puede generar pro-
mediando los valores de todos los indicadores. Para la valoración del índice se
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puede utilizar una escala de transformación en diferentes clases establecidas de

calidad de suelo (Cantú et al., 2007).
Indicadores de calidad de suelos

En el correcto funcionamiento de un suelo están involucradas una gran can-
tidad de propiedades físicas, químicas y biológicas que interaccionan entre si (Gil
–Sotres et al., 2005), las cuáles, son susceptibles de ser empleadas como indica-
dores de calidad, siempre que puedan ser medidas cualitativa o cuantitativamente
y den idea sobre que tan adecuadamente funciona el suelo. Esta manera indirecta
de medir la calidad de los suelos es muy útil para el monitoreo de cambios en el
ambiente. Es decir que éstos indicadores permiten: a) analizar la situación actual
e identificar los puntos críticos con respecto a su sostenibilidad como medio pro-
ductivo o recurso natural importante para la calidad de vida o el mantenimiento
de la biodiversidad; b) analizar los posibles impactos antes de una intervención;
c) evaluar el impacto de las intervenciones; y d) ayudar a determinar si el uso del
recurso es sostenible (Pajares et al., 2010).
Generalmente se clasifican a los indicadores en físicos, químicos y bioló-
gicos y para la elección de los mismos se sugieren algunos criterios: i) estar co-
rrelacionados con procesos naturales del ecosistema (aspecto funcional), ii) ser
de fácil utilización en el campo (aspecto de practicidad), iii) ser susceptibles a las
variaciones climáticas y de manejo (carácter dinámico) iv) ser componentes de
una base de datos (Bautista et al., 2004). Los indicadores tendrán mayor relevancia
si se los estudia en forma integrada y se los interpreta con relación a funciones
del mismo, como por ejemplo la producción de biomasa vegetal (Frioni et al.,
2003).
Las características físicas del suelo son una parte necesaria en la evaluación
de la calidad de este recurso, ya que no se pueden mejorar fácilmente. Se asocian
con el uso eficiente del agua y nutrientes. Algunas de las propuestas como indi-
cadores se encuentran: la estructura, la densidad aparente, la estabilidad de los
agregados, la infiltración, la profundidad del suelo superficial (García et al., 2012).
Entre las propiedades químicas propuestas como indicadores, se señalan
aquellas que inciden en la relación suelo-planta como: la calidad del agua, la ca-
pacidad amortiguadora del suelo y la disponibilidad de nutrientes para las plantas
y los microorganismos, la capacidad de intercambio catiónico, pH, disponibilidad
de nutrientes en el suelo, contenido de materia orgánica, C y N orgánico (de la
fracción total de materia orgánica y de la fracción particulada siendo ésta última
la más fácilmente disponible para los microorganismos del suelo) (Navarrete Se-
gueda et al., 2011).
Los componentes biológicos del suelo pueden actuar como indicadores sen-
sibles ya que participan en innumerables procesos y funciones que ocurren en el
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suelo, como en la descomposición de residuos orgánicos, el ciclado de nutrientes,

en la síntesis de sustancias húmicas, en la agregación y en la liberación de energía
entre otros (González et al., 2007), siendo importantes en la estimación de la ca-
pacidad del suelo para el crecimiento vegetal (Araújo et al., 2012). Entre los indi-
cadores biológicos, son importantes la biomasa microbiana de suelo, nitrógeno
mineralizable, respiración microbiana del suelo, actividad enzimática, cociente
metabólico, tasas de mineralización.
Las variables que estiman la calidad del suelo, al ser ésta dinámica, pueden
cambiar en períodos relativamente cortos. En general, los parámetros físicos y fí-
sico-químicos son de poca utilidad ya que se alteran solo cuando el suelo se somete
a un cambio muy drástico y pueden variar dentro de largos períodos de años
(Fließbach, 2007); mientras que los parámetros biológicos y bioquímicos son sen-
sibles a las ligeras modificaciones que el suelo puede sufrir en presencia de cual-
quier disturbio. Por lo tanto, cuando se quiere evaluar la sostenibilidad de las
funciones naturales del suelo y sus diferentes usos, se deben incluir indicadores
clave como los biológicos y bioquímicos.
Indicadores biológicos y bioquímicos

Las subsecuentes propuestas para un uso sostenible de tierras ha mostrado
la ausencia de parámetros para establecer la calidad de suelos desde un punto de
vista microbiológico, siendo que los microorganismos juegan un rol importante
en el desarrollo y conservación del suelo (Anderson, 2003) ya que los atributos
microbianos del suelo presentan la dificultad en la interpretación de sus valores
individuales. A diferencia de los indicadores químicos para los cuales los niveles
de referencia están relativamente bien definidos para cada elemento y tipo de sue-
los (teniendo en cuenta características tales como la textura, materia orgánica y
sistemas de manejo) existe dificultad para mediciones simples y para interpretar
una serie de indicadores microbianos independiente de un control comparativo o
tratamiento. Se han sugerido usar criterios de referencia (estableciendo compara-
ciones) debido a que los valores ideales para los bioindicadores pueden variar con
el clima, tipo de suelo, mineralogía, manejo y uso del suelo (Castro Lopes et al.,
2012).
Las propiedades biológicas se pueden estudiar a nivel de población (diná-
mica de los organismos específicos), a nivel de comunidad biótica (propiedades
relacionadas a la estructura de la población microbiana, composición y distribu-
ción de grupos funcionales de microorganismos de suelo), a nivel de ecosistema
(propiedades relacionadas con los ciclos de biogeoquímicos de los elementos tales
como C, N, P y S; y propiedades relacionadas con el tamaño, diversidad y activi-
dad de la biomasa microbiana, así como a la actividad de las enzimas hidrolíticas
del suelo) (Gil –Sotres et al., 2005).
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Estructura y función de las comunidades microbianas del suelo

Las comunidades microbianas catalizan un amplio rango de procesos que
son importantes para la productividad y sostenibilidad del ecosistema suelo. Es
por ello que entre los indicadores biológicos se pueden mencionar aquellos que
permiten determinar la estructura de la comunidad microbiana presente en el suelo
(tamaño, composición, etc.) y aquellos que determinan su función (actividad bio-
lógica en general o involucrada en procesos específicos) (Alvear et al., 2008). Las
relaciones directas que existen entre estructura y función de las comunidades mi-
crobianas son difíciles de dilucidar, es por ello que ambos parámetros caracterizan
la respuesta de los microorganismos a una perturbación y por lo tanto al cambio
de uso del suelo (Bissett et al., 2013).
Indicadores relacionados a la estructura

Uno de los indicadores más sensibles de las alteraciones introducidas en
los suelos es la biomasa microbiana, componente biótico de la materia orgánica
del suelo, que regula la descomposición de materiales orgánicos y el reciclaje de
nutrientes, contribuye a la formación de los suelos, a la regulación de los ciclos
de los elementos y a la emisión de gases con efecto invernadero. Este parámetro
revela modificaciones dentro de períodos de 1-5 años luego de realizados los cam-
bios en el manejo, clima y polución debido a su más alta tasa de recambio en re-
lación a la materia orgánica total del suelo. Existen distintos métodos de
determinación, por ejemplo la cuantificación del C, N, P etc. de la biomasa mi-
crobiana; determinación de ATP (Frioni et al., 2003); cuantificación por PCR cuan-
titativa de la abundancia de genes presentes en determinados grupos taxonómicos
o relacionados con alguna función (por ej. fijación biológica de nitrógeno, deni-
trificación, etc.) (Smith y Osborn 2009).
Otros indicadores son los grupos fisiológicos (ej. celulolíticos, fijadores de
N2, solubilizadores de P), grupos tróficos (ej. bacterias heterótrofas, algas, proto-
zoos, hongos) y las interacciones entre microorganismos y entre organismos y ve-
getales. La metodología comprende determinaciones de la composición,
densidades microbianas y diversidad de la comunidad. Los métodos tradicionales
de determinación identifican organismos cultivables usando diferencias taxonó-
micas ó basadas en atributos de funcionamiento o procesos, como la utilización
de sustratos, también han sido usados análisis de componentes estructurales, como
el análisis de ácidos grasos.
Las principales limitaciones metodológicas son la dificultad en aislar y cul-
tivar a la mayoría de los microorganismos y la heterogeneidad espacial y temporal
de la microflora en el perfil del suelo (Frioni et al., 2003). Es por ello que en los
últimos años se ha incrementado el empleo de métodos moleculares para la iden-
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tificación a nivel de género y especie. Estas técnicas se basan en el análisis de

marcadores moleculares como ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA) y ácidos nu-
cleicos (DNA y RNA). Ambos tipos de marcadores se encuentran presentes en
todas las células, se pueden extraer directamente de muestras de suelo sin necesi-
dad de realizar cultivos previos y además permiten diferenciar distintos grupos de
microorganismos. Utilizando estos marcadores se puede determinar la composi-
ción de las comunidades microbianas y cuantificar la abundancia de microorga-
nismos específicos (Nogales, 2005). Además, el surgimiento de la metagenómica
junto al desarrollo de las nuevas tecnologías de secuenciación (Next generation
sequencing) han permitido describir y comparar los atributos funcionales de las
comunidad de microorganismos del suelo en diferentes ecosistemas (Fierer et al.
2012a; Delmont et al. 2012; Fierer et al. 2012b).
Indicadores relacionados a la función

La diversidad funcional es importante en el mantenimiento de la sustenta-
bilidad del recurso suelo. La función del suelo puede ser evaluada por monitoreo
de las transformaciones biogeoquímicas específicas (por ej. nitrificación, desni-
trificación, amonificación, actividad fijadora de N2 aerobia, etc.) por métodos tra-
dicionales o utilizando marcadores moleculares (mediante el análisis de genes
funcionales); ó más generalmente, por monitoreo del uso de perfiles fisiológicos
de la comunidad por utilización de sustratos y actividades enzimáticas (Bissett et
al., 2013).
En la cuantificación de los procesos degradativos del suelo se utiliza como
indicador la respiración del suelo la cual indica la magnitud de la actividad mi-
crobiana. La metodología utilizada es la determinación del flujo de C-CO2 en
muestras de suelo (emitido por la microflora heterotrófica aeróbica), se realiza en
condiciones naturales o en laboratorio.
Por otro lado las enzimas presentes en el suelo son mediadores y cataliza-
dores de importantes funciones del mismo, su estudio suministra un índice poten-
cial del nivel de actividad biológica del suelo. Entre las que comúnmente se
cuantifican en el suelo se encuentran: i) oxidoreductasas (ej. deshidrogenasas, glu-
cosa oxidasa, catalasa, peroxidasa; ii) hidrolasas (ej. fosfatasas; celulasas, gluco-
sidasas, galactosidasa, peptidasas, amidasa, ureasa, las transferasas; iii) de amplio
espectro que hidrolizan el diacetato de fluoresceína y constituyen un indicador
general de la actividad hidrolítica del suelo realizada por proteasas, lipasas y en-
terasas. La determinación esta basada en el agregado de una solución de sustrato
de concentración conocida a una determinada cantidad de suelo y su incubación
en condiciones adecuadas de temperatura, pH y potencial iónico. Por colorimetría
se determina la conversión del sustrato en producto final (Frioni et al., 2003).
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Calidad de suelos en la Región Chaqueña
Actividades en la Región Chaqueña

En los últimos años, con el proceso de agriculturización, aumentó la super-
ficie dedicada a actividades agrícolas y ganaderas en las regiones extrapampeanas.
Esto profundizó la deforestación con síntomas evidentes de insustentabilidad am-
biental, socio-cultural y productiva.
En Santiago del Estero, región Chaqueña, el total deforestado entre 1998 y
2006 ascendió a 2.295.567 ha, y como consecuencia se generaron áreas de vege-
tación secundaria en diversos estadios de la sucesión y de extensos parches de
bosques intervenidos con distintos grados de deterioro (“fachinales”) (Figura 1).
Esto generó degradación del suelo (Morello y Matteucci, 2000), ya que por sus
características, que son propias de las regiones semiáridas, no tienen capacidad
para amortiguar los efectos del inapropiado uso y manejo que se les da, disminu-
yendo por lo tanto su calidad, no pudiendo mantener una producción sustentable
(Sanzano et al., 2005).
Figura 1. Fisonomía de vegetación de “fachinales.
En la actualidad se están habilitando los fachinales mediante: i) tratamiento

mecánico, ii) siembra de especies introducidas y iii) terminación y mantenimiento
de la habilitación con fuego y/o retratamiento mecánico. Los métodos de desmonte
para habilitación de tierras que se utilizan en la Región chaqueña son: desmonte
total (topado, acordonado y posterior quema) para agricultura y ganadería. Des-
monte parcial o desbarejado que se utiliza como alternativa de manejo productivo
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y sustentable. Implica una intervención inicial con eliminación del estrato arbus-
tivo que aumenta la productividad primaria neta en los primeros años de evalua-
ción (Figura 2).
Figura 2. Sistemas Silvopastoriles habilitados mediante tratamientos mecánicos (rolado de baja

intensidad).
Esta eliminación del estrato arbustivo puede ser manual o mecánica (ro-
lado). Las prácticas que acompañan estas transformaciones del ecosistema son
generalmente el fuego y la siembra de pasturas, con el fin de mejorar la cantidad
y calidad del forraje.
Evaluaciones de calidad de suelos en la Región Chaqueña. Actualización al

estudio de casos
El indicador de calidad de suelos más comúnmente usado en la región cha-
queña es la materia orgánica total, y el principal elemento que aporta la misma
para el crecimiento de las plantas es el nitrógeno, el cual constituye en zonas áridas
y semiáridas, después del agua, el nutriente más limitante para la productividad
de las plantas (Celaya Michel y Castellanos Villegas, 2011).
La calidad del suelo está en función del ecosistema de partida, de la inter-
vención y del manejo posterior y su evaluación se dificulta por la falta de valores
de referencia de los distintos indicadores en la región chaqueña. Por ello general-
mente se emplean los valores de los ecosistemas naturales (fachinales=testigos)
como referencia.
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Calidad de suelos en sistemas silvopastoriles de la región chaqueña en secano
Habilitados mediante desmonte parcial manual con pasturas naturales

En estudios prospectivos, en ecosistemas boscosos (pluviometría de 570
mm con suelo Torriorthent típico), con desmonte parcial manual y habilitado como
sistema silvopastoril, las condiciones físicas/físico-químicas (pH, densidad apa-
rente) y el carbono orgánico total (COT) no se modificaron en comparación con
un ecosistema natural durante tres años evaluados.
La mineralización es el proceso estimulado en este sistema ya que la elimi-
nación del estrato arbustivo produce una mayor entrada de luz y agua en el suelo,
lo que provoca un aumento de la temperatura del mismo y una mayor disponibi-
lidad de agua para la biota, aumentando la tasa de mineralización de N y los pulsos
de mineralización - inmovilización. Esta mineralización compromete más materia
orgánica nativa en función de la profundidad y de la falta de protección de la co-
bertura de las especies del estrato arbóreo (Albanesi et al., 2001, 2004).
Existe un efecto protector del dosel arbóreo ya que aumenta el COT por el
mayor aporte de biomasa. Las especies arbóreas afectan de manera diferente la
actividad microbiana. Bajo el dosel de las especies de Schinopsis lorentzii y As-
pidosperma quebracho blanco hay una intensa actividad microbiana y sus patro-
nes de mineralización-inmovilización varían de acuerdo al sistema (silvopastoril
o monte natural), con lo cual se evidencia que no existe uniformidad en la calidad
de la materia orgánica ni en el capital enzimático microbiano. En los suelos bajo
la especie Prosopis nigra, no se evidencia variación de su actividad sin embargo
cambian los patrones de mineralización-inmovilización cuando se realiza el des-
arbustado, indicando cierta independencia a la nutrición nitrogenada y una cierta
adaptación de los microorganismos a asimilar fracciones lábiles en estos sistemas
(Anriquez et al., 2000).
El N volatilizado aumenta notablemente en el suelo sin cobertura arbórea,
lo que puede incidir notablemente en el sistema silvopastoril donde se eliminan
los árboles indeseables y aquellos que tienen un aprovechamiento inmediato. Sin
embargo, existe mayor demanda de N por parte de las plantas del monte natural
pese a que el estrato herbáceo graminoso aumentó casi un 900 % en materia seca
cuando se implementó el sistema silvopastoril. Se destaca que el N tomado por
las plantas es absorbido hasta los 50 cm de profundidad del perfil del suelo, con
las mismas cantidades que en los primeros cm del suelo, aún cuando la materia
orgánica disminuye significativamente con la profundidad (Albanesi et al., 2001).
-12-
Habilitados mediante desmonte parcial mecánico (rolado) con pasturas natu-

rales y/o cultivadas y prácticas asociadas
a)Ambiente con pluviometría de 570 mm
a.1) En un estudio prospectivo con muestreos periódicos durante más de
tres años consecutivos, se evaluó el efecto del rolado y prácticas acompañantes
(fuego y siembra de Panicum maximum cv Trichloglume cv green panic) en suelos
de los sitios ecológicos Alto, Media Loma (Haplustoles énticos), y Bajo (Haplus-
toles típicos y Haplustoles páchico) característicos de la región chaqueña. Las
mismas no modificaron la calidad del suelo, evaluada mediante los indicadores
densidad aparente del suelo, carbono orgánico total (COT), respiración edáfica
(RE), C orgánico particulado (COP), C de la biomasa microbiana (C-BM) y acti-
vidad dehidrogenasa (Dh-asa).
Las reservas de materia orgánica del suelo, expresadas mediante el conte-
nido de COT, no fueron modificadas debido a que la incorporación de residuos
vegetales compensaron las pérdidas generadas por el movimiento del suelo, por
el pasaje del rolo y las demandas nutricionales de la sucesión secundaria posterior
(Anriquez et al., 2005).
El rolado no modificó el COT. Este indicador presentó una fuerte depen-
dencia espacial, siendo el sitio Alto el que presentó mayor magnitud. Asimismo,
COT no fue afectado por las prácticas complementarias: sólo hubo una leve pero
significativa disminución en el sitio Alto rolado y sembrado con Green panic por
la alta demanda nutricional de la pastura cultivada, satisfecha a expensas de la
materia orgánica del suelo. En este sitio de pastizal donde el balance de carbono
puede afectarse por la diferencia entre la biomasa subterránea de las especies, es-
pecialmente en Green panic, especie muy agresiva y con gran crecimiento radi-
cular comparado con especies nativas.
RE en el sitio Bajo rolado y quemado, aumenta por efecto del fuego, ya que
éste liberó nutrientes inmovilizados, aumentó la disponibilidad de luz solar por
eliminación de cobertura, favoreciendo así la actividad respiratoria de los micro-
organismos (Anriquez et al., 2005).
La alta proporción de COP en los tres sitios ecológicos, que indica menor
carbono protegido de la degradación microbiana, no varió con los tratamientos.
En Dh-asa el efecto del tratamiento varía por sitio ecológico presentando
mayor actividad en el Bajo, por el mayor contenido de agua en el suelo de este
sitio. El C-BM tiene gran variabilidad y el efecto de los tratamientos varía de
acuerdo al sitio de pastizal. El disturbio, causado por el rolado y prácticas com-
plementarias no posee gran efecto desestabilizador en el contenido de C-BM del
suelo.
a.2) En estudios realizados con el objetivo de evaluar la calidad de suelos
Haplustoles énticos, en sitios habilitados con rolado selectivo, siembra de Panicum
-13-
maximum cv.Gatton panic y pastoreo controlado, a los 5 años de implantado, se

demostró que en estos sistemas silvopastoriles, se mantienen los niveles de los in-
dicadores evaluados, tales como la RE, C-BM, carbono potencialmente minerali-
zable (C0), tasa de mineralización del carbono potencialmente mineralizable (Kc),
nitrógeno total (NT) indicando que los sustratos fácilmente disponibles para los
microorganimos no se modifican (Tablas 1,2).
Tabla 1. Valores medios de respiración edáfica (RE) en ug C g suelo-1 día-1, carbono de la biomasa
microbiana (CBM) en ug C g suelo-1, carbono potencialmente mineralizable (C0) en mg C kg-1, tasa
de mineralización del carbono potencialmente mineralizable (Kc) en mg de C-CO2 kg-1 suelo dia-1,
carbono orgánico total (COT) en g C kg-1 suelo, carbono orgánico particulado (COP) en g kg-1 suelo,
nitrógeno total (NT) en g kg-1 suelo, en Testigo (T), Rolado 4 años sin pastoreo (Rs/p) y Rolado 4
años con pastoreo. Letras diferentes evidencian diferencias significativas (p=0,05).
Tratamiento RE CBM C0 Kc COT COP Nt

T 34ab 182ab 326a 0,16a 29,0b 24,1c 2,1a
Rs/p 36b 153ab 279a 0,1a 28,1b 22,2bc 2,7b
Rp 32ab 98a 309a 0,17a 20,5a 16,5a 2,2a
Tabla 2. Valores medios de las relaciones CBM: COT en %, cociente metabólico microbiano (qCO2),
RE: COT en %, C: N y COP: COT en Testigo (T), Rolado 4 años sin pastoreo (Rs/p) y Rolado 4
años con pastoreo. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05).
Tratamiento CBM: COT qCO2 RE:COT C:N COP:COT

T 0,63a 0,32ab 0,13a 13,5ab 0,8b
R s/p 0,54a 0,28 ab 0,15ab 10,6a 0,76ab
Rp 0,48a 0,39b 0,17c 10,3a 0,8b
Los menores valores de COT y COP en el tratamiento rolado y pastoreado

(Rp), común a todas las habilitaciones utilizadas en la región, se atribuye al pas-
toreo y no al rolado, el cual mantiene los residuos en el sistema. En estos sistemas
silvopastoriles las relaciones C-BM: COT, el cociente metabólico microbiano
(qCO2), C: N y COP: COT, se mantienen. El qCO2 en Rp tiende a aumentar, a
expensas de una disminución en la biomasa microbiana poniendo en evidencia
una demanda energética mayor y una eficiencia metabólica reducida para mante-
ner la integridad de las células bajo condiciones de estrés. Esto también se evi-
dencia por la mayor relación RE: COT. En el tratamiento rolado sin pastoreo
(Rs/p) los valores de qCO2 son similares al testigo (T), sugiriendo que el rolado
y la implantación de pasturas no modifican las demandas energéticas de las co-
munidades microbianas, favoreciendo la capacidad del suelo de sostener el creci-
miento de la biota (Albanesi et al., 2012).
-14-
Estudios llevados a cabo en los mismos sitios, mediante técnicas de micro-

biología molecular demuestran que a los cinco años de la implementación del sis-
temas silvopastoril se genera un cambio en la composición de las comunidades
bacterianas del suelo, aumentando su diversidad (Indice de Shannon en sistemas
silvopastoriles =3 y en Testigo=2,7). La composición de las comunidades bacte-
rianas en el sistema silvopastoril se distinguen claramente de las del fachinal y
dependen claramente de la especie arbórea. Por el contrario esta dependencia no
se detecta en los testigos probablemente debido a la mayor heterogeneidad natural.
Cinco años de tratamiento de rolado es suficiente para generar cambios en la es-
tructura de las comunidades bacterianas del suelo, debido a los cambios en la es-
tructura de la vegetación.
Las coberturas arbóreas mejoran las condiciones biológicas del suelo, ya
que se determinó que en los suelos sin cobertura vegetal se exaltan los procesos
de mineralización y de pérdida de materia orgánica al observarse disminuciones
en RE, C0, COT, COP, NT (Tablas 3,4). Es por ello que el rolado de baja intensi-
dad, que deja árboles y arbustos en el sistema, es una alternativa relevante para el
manejo de los ambientes naturales de la región chaqueña (Albanesi et al., 2012).
Tabla 3. Valores medios de respiración edáfica (RE) en ug C g suelo-1 día-1, carbono de la biomasa
microbiana (CBM) en ug C g suelo-1, carbono potencialmente mineralizable (C0) en mg C kg-1, tasa
de mineralización del carbono potencialmente mineralizable (Kc) en mg de C-CO2 kg-1 suelo dia-1,
carbono orgánico total (COT) en g C kg-1 suelo, carbono orgánico particulado (COP) en g kg-1 suelo,
nitrógeno total (NT) en g kg-1 suelo, debajo de distintas coberturas: Schinopsis lorentzii (Qc), Aspi-
dosperma quebracho blanco (Qb), Zizyphus mistol (M) y sin cobertura vegetal (D). Letras distintas
indican diferencias significativas (p≤0,05).
Cobertura RE CBM C0 Kc COT COP Nt

D 19a 99a 205a 0,16a 9,01 a 6,25 a 1,03 a
Qc 36b 160a 394b 0,24a 27,49 c 22,53 c 2,29 b
Qb 37b 186a 331b 0,1a 24,74 b 19,89 b 2,48 b
M 40b 186a 334b 0,17a 37,67 d 30,95 d 3,02 c
Tabla 4. Valores medios de las relaciones CBM: COT en %, cociente metabólico microbiano (qCO2),
RE: COT en %, C: N y COP: COT, debajo de distintas coberturas: Schinopsis lorentzii (Qc), Aspi-
dosperma quebracho blanco (Qb), Zizyphus mistol (M) y sin cobertura vegetal (D). Letras distintas
indican diferencias significativas (p≤0,05).
Cobertura CBM: COT qCO2 RE:COT C:N COP:COT

D 1,1b 0,26a 0,22c 9,51a 0,67a
Qc 0,6a 0,28a 0,14b 12,42a 0,81b
Qb 0,8ab 0,39a 0,15b 11,13ab 0,79b
M 0,5a 0,38a 0,11a 15,96b 0,81b
-15-
b)Ambientes con pluviometría de 650 mm

b.1) En un estudio retrospectivo en ambientes del centro este de la provincia
de Santiago del Estero, con suelo Haplustol éntico, se evaluaron indicadores en
la habilitación de tierras por rolado y posterior siembra de Panicum máximum cv.
Gatton panic, con pasturas de 1, 2, 3 y 5 años de edad desde la implantación. Los
sitios estuvieron sometidos a pastoreo continuo, con distinta pero siempre alta
carga animal (superior a 1 E.V. ha-1).
La densidad aparente aumentó desde el primer al quinto año de implanta-
ción de la pastura, por efecto del sobrepastoreo. El NT y el COT disminuyeron
notablemente por estimulación de los procesos de mineralización; el primero desde
el primer año de implantación por la alta demanda nutricional de Gatton panic; el
segundo desde el quinto año de implantación por el manejo y por la lentitud en
detectar sus variaciones dada la gran variabilidad espacial. Las tasas de minerali-
zación aumentaron a partir del tercer año de la pastura y el N potencialmente mi-
neralizable disminuye desde la implantación (Albanesi et al., 2001, 2012, 2013).
b.2.) En ensayos para evaluar la calidad de suelos, en sitios habilitados con
rolado selectivo, siembra de Panicum maximum cv.Gatton panic y la introducción
de ganado, se demostró que al año y a cuatro años de la implementación de estos
sistemas silvopastoriles, se mantienen los niveles de los indicadores evaluados
tales como COT, NT, nitrógeno de la fracción particulada de la materia orgánica
(NOP), el C y N de la fracción asociada (COA, NOA respectivamente), la hidró-
lisis del diacetato de fluoresceína (FAD) y los índices COT:NT, COP:NOP bajo
las coberturas de Aspidosperma quebracho blanco (Qb) y la pastura implantada
Panicum maximum cv. gatton panic (G) (Tablas 5,6). Además estas prácticas au-
mentan los contenidos del nitrógeno potencialmente mineralizable (Nan) en los
suelos debajo de cobertura de Qb mientras que lo reducen debajo de cobertura de
G. Determinando que en estos sistemas, el suelo mantiene sus propiedades quí-
micas y biológicas originales por ser este manejo conservacionista del recurso
suelo (Albanesi et al., 2013; Savino, 2012).
Tabla 5. Carbono orgánico total (COT), particulado (COP), asociado (COA) (g C kg-1 suelo), Nitró-
geno total (NT), particulado (NOP) y asociado (NOA) (g N kg-1 suelo); nitrógeno potencialmente
mineralizable (Nan) (mgN kg-1 suelo día-1) y actividad hidrolítica de FDA (ug fluoresceína g-1 h-1)
en los tratamientos testigo (T0), rolado de un año (R1) y rolado de 4 años (R4), bajo cobertura de
quebracho blanco. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05).
Tratamientos COT NT COP COA NOA Nan FDA

T0 20,6a 1,7 a 15,6a 5,0a 0,4 a 6,3 a 30,18 a
R1 24,8a 1,3 a 18,5a 6,4a 0,5 a 9,2 a 32,3 a
R4 25,7a 1,6 a 19,3a 6,4a 0,5 a 15 b 36,9 a
-16-
Tabla 6. Relaciones COP: COT (%), NOP:NT (%), COT:NT, COP:NOP; en los tratamientos testigo
(T0), rolado de un año (R1) y rolado de 4 años (R4), bajo cobertura de Aspidosperma quebracho
blanco. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05).
Tratamientos COP:COT NOP:NT COT:NT COP:NOP

T0 75,3a 73,3 b 12,7 a 13,3 a
R1 74,2a 64,7 a 19,7 b 22,7 b
R4 74,9a 69,6 ab 16,2 ab 17,5 ab
La cobertura influye en el efecto del rolado sobre la calidad del suelo, de-
mostrando que el aporte de residuos al suelo por el G disminuyen el COP al año
de efectuada la práctica, por el aporte de biomasa vegetal desde las pasturas que
presentan menor relación C:N, aumentando la tasa de mineralización a expensas
de la fracción más lábil de materia orgánica del suelo (Tablas 7,8).
Tabla 7. Carbono orgánico total (COT), particulado (COP), asociado (COA) (g C kg-1 suelo), Nitró-
geno total (NT), particulado (NOP) y asociado (NOA) (g N kg-1 suelo); nitrógeno potencialmente
mineralizable (Nan) (mgN kg-1 suelo día-1) y Actividad hidrolítica de FDA (ug fluoresceína g-1 h-
1
), en los tratamientos rolado de un año (R1) y rolado de 4 años (R4), bajo cobertura de Aspidosperma
quebracho blanco (Qb) y Panicum maximum cv. gatton panic (G). Letras distintas indican diferen-
cias significativas (p≤0,05).
COT COP COA NT NOA NOP Nan FDA

Qb G Qb G Qb G Qb G Qb G Qb G Qb G Qb G
25 21 18 12 6 9 1,2 1,4 0,5 0,5 0,8 0,9 9,2 12,2 32,3 32,5
R1
ab a b a a a a a a a a a ab bc a a
26 23 19 17 6 7 1,6 1,31 0,48 0,3 1 1 15 7,6 36,9 31
R4
b ab b b a a a a a a a a c a a a
Tabla 8. Relaciones COP: COT (%), NOP:NT (%), COT:NT, COP:NOP en los tratamientos rolado
de un año (R1) y rolado de 4 años (R4), bajo cobertura de Aspidosperma quebracho blanco (Qb) y
Panicum maximum cv. gatton panic (G). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05).
COP:COT NOP:NT COT:NT COP:NOP

Qb G Qb G Qb G Qb G
RT1 74b 58a 65a 62a 20a 15a 23b 14a
RT4 75b 71a 70a 77a 16a 18a 17a 17a
Además el aumento de la actividad microbiana resultado de las altas tem-

peraturas del suelo en estos sectores más abiertos, generan un mayor consumo de
la fracción más lábil (Abril y Bucher, 2001). Sin embargo a los 4 años de aplicado
el rolo los valores se restituyen, ya que la contribución de materia orgánica al
suelo se incrementa a medida que el sistema silvopastoril es más antiguo por fa-
vorecerse el desprendimiento de material senescente en todos los estratos, este se
-17-
acumula de manera lenta y continua sobre la superficie del suelo incorporándose

a la materia orgánica del mismo. Además la pastura aumenta la producción de
biomasa, alcanzando el máximo crecimiento al quinto año de implantada en fun-
ción de las condiciones edafoclimáticas. El material que no es consumido por el
ganado, dado que la eficiencia de pastoreo de los animales a campo varía entre el
50 y el 70%, constituye un aporte de materia seca, que compensaría así, las dis-
minuciones de COT generadas por la mayor mineralización.
Al cuarto año del rolado, bajo cobertura de Panicum maximum cv. gatton
panic, el Nan disminuye, correspondiéndose esta disminución con una baja acti-
vidad FDA, éste indicador está muy influenciado por la relación C:N y la actividad
microbiológica, de este modo aquellos factores que los modifiquen, también po-
drían afectar el comportamiento del mismo (Savino, 2012).
Calidad de suelos en las áreas agrícolas bajo riego de la región chaqueña

En ensayos para evaluar la calidad de suelos bajo riego, en dos sitios con
cultivo de soja (Glycine max) (Figura 3), con diferentes tratamientos de inocula-
ción, se trabajó con el método estadístico multivariado de análisis de componentes
principales (ACP). De esta manera, se comprende más claramente las relaciones
entre el cultivo, las cepas de inoculantes y la calidad del suelo.
Figura 3. Agroecosistemas sojeros bajo riego en dos sitios de diferente calidad de suelo.
Las variables pH, NT, COT y conductividad eléctrica (CE) se muestran

como posibles indicadores para ser incorporados a un índice polinómico en un
-18-
sistema de cultivo con incorporación de inoculantes cuando el sitio es de menor

contenido de NT y COT.
Las variables vegetativas (materia seca aérea y de grano) evidenciaron una
relación directa con los indicadores de calidad de ambiente NT y COT (Figura 4).
Figura 4. Análisis biplot de los tratamientos y variables de suelo y biomasa vegetal., en estadio ve-
getativo en sitio I. Referencias: Tratamientos: 1, 2, 3, 4 y 5. Los indicadores físico-químicos de
suelos pH; CE; NT; COT; COL; COP; COPe. Las variables vegetativas fueron: MS nod 1°; MS nod
2°; MS raíz; M S aérea.
De acuerdo con el análisis se obtuvieron rendimientos mayores en trata-

mientos que estuvieron en sitios con mayores contenidos de NT y COT. Con el
fin de encontrar la relación funcional entre la variable de suelo y las variables de
biomasa, se ajustaron los datos a diferentes combinaciones lineales resultando con
mejor ajuste el siguiente modelo para la variable biomasa total: = a +b*NT, resul-
tando ser NT la variable de mayor contribución a la aptitud del suelo para el cultivo
de soja. Los tratamientos inoculados en general favorecen la producción de materia
seca generando residuos que ingresan al suelo y aportan al NT (Figura 5). La cepa
de Bradyrhizobium japonicum que mejor comportamiento tuvo en sitios con
mayor contenido de NT fue Salta, mientras que en sitios con menor contenido de
NT fue E109. Esto permite definir un manejo adecuado para lograr sustentabilidad
(Werenitzky et al., 2013).
-19-
Figura 5. Análisis biplot de los tratamientos y variables de suelo y biomasa vegetal, en cosecha en
dos sitios (I y II). Referencias: Tratamientos: 1, 2, 3, 4 y 5. Los indicadores físico-químicos de suelos
pH; NT; COT. Las variables vegetativas: MS nod 1°; MS nod 2°; MS raíz; MS aérea, IC s/raíz e IC
c/raíz.
Calidad de suelos en las áreas agrícolas de secano de la región chaqueña

En ecosistemas boscosos o de pastizales en suelos Haplustoles énticos, Ha-
plustoles típicos, Argiustoles típicos o aún Argiustoles údicos, en ambientes con
pluviometría cercana a los 650 mm, el carbono orgánico total, no cambia hasta
los 20 años de habilitado el sistema productivo. La variabilidad espacial de algunas
propiedades disminuye, lo que supone la merma de nichos ecológicos y/o micro-
hábitats que garanticen la biodiversidad (Albanesi et al., 2001, 2013).
Además del COT, los hidratos de carbono solubles no presentan sensibilidad
para evaluar la habilitación y posterior laboreo cuando se los analiza en forma
univariada, ya que debe darse un lapso suficiente para que los cambios en los mis-
mos sean más grandes que la variabilidad analítica y espacial. El C soluble, C-
BM, C0, RE, qCO2, la eficiencia metabólica, la Dh-asa, NT, N potencialmente
mineralizable (N0), N soluble, N de la biomasa microbiana y la actividad ureásica
(U-asa) se muestran como indicadores más sensibles al análisis univariado (Al-
banesi et al., 2001, 2013).
El análisis multivariado de correlaciones canónicas permite detectar, que
un suelo con bajo contenido de COT tendrá mayor COP y menor cantidad de NT
(Albanesi, 2001), y los que tienen qCO2 y tasas de mineralización de C bajos, au-
-20-
mentarán las tasas de mineralización de N, U-asa y la actividad nitrificante a ex-

pensas de NT. El análisis de componentes principales y de conglomerados distin-
gue tres grupos de sitios agrícolas. Los sitios de las laderas con 20 años de
agricultura o de las planicies que con pocos o muchos años de actividades agrícola
se caracterizan por disminuir el NT, el C0, N0, Dh-asa y el porcentaje de infección
de micorrizas arbusculares, Los sitios de las laderas con pocos años de actividad
agrícola se caracterizan por tener más NT y C0 y N0. Las áreas bajas con actividad
agrícola se caracterizan por el más elevado porcentaje de infección micorrícico y
los valores más bajos de NT y de C0 y N0. Esta tipificación pone en evidencia
que las consecuencias ante el cambio de uso de la tierra en el área son diferentes,
dependiendo de la posición topográfica y del manejo, y que influyen en la calidad
del suelo. En la Planicie, se observan cambios drásticos desde los primeros años
de actividad agrícola, en la Ladera estos cambios se observan a los 20 años de
agricultura y, en términos generales, las áreas bajas no fueron demasiado afectadas
por el uso de la tierra. Por la pérdida de calidad biológica de los sitios, se distin-
guen la Planicie y Ladera por su alta probabilidad de degradación y las áreas bajas
constituyeron zonas de menor riesgo (Albanesi, 2001).
Conclusiones
La calidad de los suelos involucra las propiedades físicas, químicas y bio-

lógicas que determinan la capacidad del mismo (funcionando dentro de los límites
de los ecosistemas naturales o manejados) para aumentar la productividad vegetal
y animal, para ser amortiguador medioambiental y relacionarse con la salud hu-
mana, animal y vegetal, siempre incluyendo los principios de la sustentabilidad.
La calidad del suelo es dinámica y puede cambiar en el corto plazo de acuerdo
con las características específicas del suelo, con las condiciones ambientales, con
el uso y con las prácticas de manejo.
De los indicadores de la calidad del suelo son relevantes los indicadores
biológicos y la obtención de índices que describan la cantidad y calidad de la ma-
teria orgánica por su asociación a un gran número de funciones de importancia en
el suelo. La calidad de suelos cobra relevancia en ambientes semiáridos por las
características peculiares de los ecosistemas. La evaluación de calidad de suelo
en sistemas agrícolas o pastoriles se dificulta en la región chaqueña por la falta de
valores de referencia.
Se analizan casos en la región chaqueña y se demuestra que, aún en los sis-
temas conservadores de habilitación de tierras, el manejo posterior puede mini-
mizar esas ventajas o incluso ser contraproducente. Los indicadores evaluados en
general presentan una fuerte dependencia del sitio ecológico y la cobertura vegetal
presente.
-21-
El análisis estadístico es utilizado como herramienta para detectar la sensi-

bilidad de los indicadores, las variaciones espaciales y temporales, las relaciones
entre los indicadores físico-químicos, biológicos y bioquímicos de los sitios; se-
leccionando un conjunto de ellos que explican los procesos que se suceden en el
suelo y, en algunos casos, permite estudiar las correspondencias entre los indica-
dores (variables) y los sitios.
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Indicadores de calidad de suelo: Una perspectiva biológica
Soil quality indicators: a biological perspective
Toresani, Silvia a *, Laura Ferreras b, Beatriz Bonelc, Gustavo Magrab, María

Valeria Romagnolia, Marta Bortolato a, María Eugenia Schiavóna
Resumen
El uso de las tierras para fines agrícolas es una de las principales causas de
degradación del suelo. Implementar prácticas de manejo conservacionistas con-
tribuye a la sustentabilidad de los agroecosistemas. Los parámetros físicos, quí-
micos y biológicos son potenciales indicadores de calidad de suelo, que permiten
monitorear en forma temprana y de manera eficaz los cambios que se puedan pro-
ducir como consecuencia del manejo. Se evaluaron indicadores edáficos en dife-
rentes ensayos en siembra directa, rotación de cultivos, rotaciones
agrícolo-ganaderas y cultivos de cobertura en INTA Oliveros, Marcos Juárez y
Rafaela en el período 2006-2008. Los parámetros microbiológicos evaluados tales
como carbono de la biomasa microbiana y actividad de las enzimas fosfatasa
ácida, deshidrogenasa y ureasa resultaron indicadores sensibles y tempranos para
manifestar cambios producidos por el uso del suelo. La construcción de Índices
simples de calidad de suelo como el cociente metabólico y la relación entre enzi-
mas y carbono orgánico, así como generar nuevas variables a través del uso de
técnicas como Análisis de Componentes Principales permitió relacionar paráme-
tros físicos, químicos y biológicos de utilidad para el monitoreo de las situaciones
de manejo. El desafío inmediato es la construcción de Índices complejos de calidad
de suelo que permitan integrar las variables físicas, químicas y biológicas con va-
riables ambientales y de producción.
Palabras clave: bioindicadores, práticas de manejo, índices de calidad de suelo
a
Microbiología Agrícola, bEdafología, cManejo de Tierras
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, Parque J. Villarino s/n, Zavalla,
Santa Fe. Mail: storesan@gmail.com
-27-
Introducción
La implementación de sistemas de labranza agresivos e inapropiados y la

agricultura continua (fundamentalmente la monocultura) han provocado a lo largo
de los años el deterioro de las propiedades físicas, químicas y biológicas de los
suelos, con un incremento en la superficie afectada por procesos de degradación
y erosivos en vastas zonas de la Región Pampeana. Paralelamente, la población
demanda en forma incesante generar productos para satisfacer sus necesidades,
intensificando y aumentando las áreas en producción, situación que exige hallar
un adecuado equilibrio entre el incremento de la producción agrícola y la preser-
vación de los recursos naturales. García (2007) afirma que los conceptos actuales
de fertilidad exceden la “fertilidad química” de un suelo, e incluyen la “fertilidad
física” y la “fertilidad biológica”. En este marco, la relación de la biología del
suelo con la fertilidad es de gran importancia para definir sistemas de intensifi-
cación agrícola sustentables. La mayor parte de los enfoques relacionados a la fer-
tilidad edáfica convergen en la importancia de la materia orgánica del suelo y su
rol fundamental en el funcionamiento y sustentabilidad de los agroecosistemas,
impactando significativamente sobre las propiedades físicas, químicas y biológicas
del suelo (Rotenberg et al., 2007). Cuando estos atributos son alterados, la calidad
del suelo se afecta negativamente con una consecuente disminución de su capaci-
dad productiva para un mismo nivel de ingreso de insumos al sistema, por lo tanto
para lograr la recuperación de la capacidad productiva del suelo se debe aumentar
el uso de insumos e implementar prácticas de manejo adecuadas. En determinadas
situaciones los procesos de degradación pueden ser tan intensos que aún aumen-
tando el agregado de insumos al sistema no se logra recuperar la capacidad pro-
ductiva por pérdida irreversible de la calidad edáfica, produciéndose un desbalance
económico y/o ambiental (Figura 1).
Figura 1. Modelo conceptual para mostrar la relación entre el nivel de insumos y la productividad
según diferentes calidades de suelo (Cassman, 1999).
-28-
La respuesta a esta problemática es implementar una agricultura sustentable,

que permita satisfacer los requerimientos de la población, hacer un uso eficiente
de los recursos y mantener un equilibrio con el medio que sea favorable tanto para
los seres humanos como para la mayoría de las otras especies (Doran y Zeiss,
2000). El uso sustentable de los agroecosistemas involucra prácticas de manejo
conservacionistas tales como labranza reducida o siembra directa, la rotación con
cultivos que aporten grandes volúmenes de rastrojo, los cultivos de cobertura y la
alternancia de ciclos agrícolas con pasturas. Estos sistemas de manejo, estimulan
la actividad microbiana debido al incremento en el contenido de carbono orgánico
y nitrógeno total como consecuencia de los mayores aportes a través de la biomasa
aérea y de los diferentes sistemas radiculares, incrementando también la produc-
ción y liberación de exudados (Acosta-Martínez et al., 2007).
Para evaluar la calidad del suelo, es necesario la búsqueda e identificación
de indicadores sensibles asociados a las propiedades físicas, químicas y biológicas
que permitan monitorear en forma temprana y de manera eficaz los cambios que
se puedan producir. Los indicadores cuantitativos de sustentabilidad son un ins-
trumento utilizado para simplificar el análisis de un sistema con el fin de facilitar
el diagnóstico y la capacidad de decisión de los usuarios que los administran. Los
parámetros físicos y químicos de suelo han sido ampliamente evaluados como in-
dicadores de calidad, mostrando sensibilidad a los cambios; sin embargo, las mo-
dificaciones como resultado de los disturbios suelen ser detectadas por estos
indicadores, en el mediano o largo plazo. Algunos autores consideran que los pa-
rámetros biológicos y bioquímicos son los más adecuados para estimar la calidad
del suelo puesto que están relacionados con los ciclos de los elementos y con la
transformación de la materia orgánica del suelo (Carvalho Mendes et al., 2010;
Trasar-Cepeda et al., 2008) y tienden a reaccionar más rápidamente a los cambios
en el medio, con lo cual podrían convertirse en sensores tempranos de calidad de
suelo. La tasa de descomposición de la materia orgánica, la biomasa microbiana
y la actividad de las enzimas del suelo son variables directamente relacionadas a
la actividad microbiana, puesto que reflejan la actividad oxidativa total con lo cual
podrían estar representando el tamaño y la actividad de la comunidad microbiana
viable y convertirse en variables de gran utilidad en un programa de monitoreo
de la calidad de un suelo (Doran y Parkin 1996). No obstante, ningún indicador
por sí solo puede predecir, describir o cuantificar la totalidad de los aspectos re-
lacionados a la calidad de un suelo. La construcción de índices simples o comple-
jos que resultan de la combinación de diversos parámetros si bien es un gran
desafío, podría permitir el avance en la evaluación de la calidad del suelo.
Este capítulo tiene como objetivo presentar algunos resultados obtenidos
por el grupo de trabajo de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Na-
-29-
cional de Rosario, integrado por docentes-investigadores y becarios de las cátedras

de Microbiología Agrícola, Edafología y Manejo de Tierras. Los sitios experimen-
tales corresponden a diferentes ensayos de rotaciones, labranzas y fertilización
ubicados en las Estaciones Experimentales INTA Oliveros, Rafaela y Marcos Juá-
rez. La conducción de los ensayos, selección de tratamientos y la extracción de
las muestras de suelo fue llevada a cabo por investigadores y técnicos de cada una
de la Estaciones Experimentales.
Comportamiento de algunos indicadores de calidad de suelo

en diferentes ensayos de rotaciones
Muestreos y análisis de suelo

Se evaluaron sistemas de manejo que incluyeron labranzas, rotaciones agrí-
colas y agrícolo-ganaderas, fertilización química y cultivos de cobertura, según
las características particulares de cada ensayo. Se extrajeron muestras compuestas
de suelo en los diferentes tratamientos a evaluar y en todos los casos se relevó
para cada tipo de suelo una situación de máxima conservación como referencia.
Debido a la influencia que presenta el clima edáfico sobre la microflora del suelo,
para el análisis de los parámetros microbiológicos, se realizaron dos muestreos al
año tratando de abarcar el período otoño/invernal y primavero/estival; en este se-
gundo período se determinaron además los parámetros físicos y químicos. Los
muestreos de suelo se realizaron siempre sobre la misma sub-parcela. Las muestras
fueron tamizadas por 2 mm y conservadas a 4 °C hasta su análisis, dentro de los
15 días de recolección. El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante
un ANOVA utilizando el test de Tukey para las comparaciones de medias (SAS
System, 2001). Las diferencias estadísticamente significativas para todas las va-
riables entre los tratamientos fueron establecidas a un nivel de p < 0,05.
Los parámetros edáficos evaluados fueron carbono orgánico (CO) por Wal-
kley-Black (Nelson y Sommers, 1982), carbono de la biomasa microbiana (CBM)
por fumigación-incubación (Jenkinson y Powlson, 1976); actividad respiratoria
microbiana (ARM) al cabo de 10 días (Frioni, 1999), actividad enzimática fosfa-
tasa ácida (Ff), deshidrogenasa (Dh) y ureasa (Ur) fueron determinadas según Ta-
batabai (1982).
Sitios y parámetros edáficos

Sitio Estación Experimental INTA Oliveros (32º 32’ S; 60º 51’ O)
El ensayo fue iniciado en el año 2006 sobre un Argiudol Típico serie Maciel
(Soil Survey Staff, 2006) con la siguiente composición mineral en el horizonte
Ap: arcilla 215 g kg-1 y limo 745 g kg-1. La historia agrícola previa consistió en 30
-30-
años de agricultura en forma continua y siembra directa en los últimos 8 años.

Previo al inicio del ensayo se realizó una labor de descompactación con un esca-
rificador hasta los 0,25 m de profundidad. Se utilizó un diseño experimental en
bloques completos al azar con tres repeticiones. El tamaño de cada unidad expe-
rimental fue de 13m x 50m. A partir del invierno de 2007 se incluyó al trigo como
cultivo de cobertura. Los tratamientos fueron: Soja-Soja (S-S); Soja- Cultivo de
cobertura – Soja (S-CC-S); Maíz-Soja-Trigo/Soja (M-S-T/S) y Maíz-Cultivo de
cobertura-Soja-Trigo/Soja (M-CC-S-T/S). Todos los tratamientos se dispusieron
en la situación con y sin uso de escarificador y se realizaron bajo siembra directa.
La Figura 2 presenta los resultados obtenidos en Carbono de la biomasa
microbiana para los distintos tratamientos durante los muestreos realizados en
2006, 2007 y 2008. En el muestreo correspondiente al año 2006, la secuencia S-
S presentó valores mayores de CBM con respecto a M-S-T/S. Durante 2007 y
2008, el CBM fue mayor cuando se incluyó el cultivo de cobertura en S-S, mien-
tras que para los tratamientos M-S-T/S y M-CC-S-T/S las diferencias fueron no
significativas.
Figura 2. Carbono de la biomasa microbiana en las parcelas bajo cultivo y en el suelo de referen-
cia. Letras distintas en el mismo año de muestreo indican diferencias estadísticamente significati-
vas entre tratamientos (p < 0,05).
El cociente metabólico (qCO2), expresado a través de la relación entre res-

piración microbiana y CBM se observa en la Figura 3. Los resultados muestran
que durante el primer muestreo, año de inicio del ensayo, la secuencia M-S-T/S
presentó los valores más elevados de qCO2. Luego, en los muestreos realizados
-31-
en 2007 y 2008, el suelo de referencia presentó un cociente metabólico menor con

respecto a los demás tratamientos, mientras que los valores más elevados corres-
pondieron a la secuencia S-S sin CC.
Figura 3. Cociente metabólico en las parcelas bajo cultivo y en el suelo de referencia. Letras dis-
tintas en el mismo año de muestreo indican diferencias estadísticamente significativas entre trata-
mientos (p < 0,05).
En esta experiencia, el suelo de referencia expresó los valores más bajos

de qCO2, manifestando una mayor biomasa microbiana que resultó ser más efi-
ciente en el uso de sustratos carbonados, empleando más carbono para crecimiento
celular en lugar de utilizarlo como fuente de energía para mantenimiento. Con-
trariamente, durante los muestreos realizados en 2007 y 2008, la secuencia S-S
presentó valores mayores de qCO2 en comparación con los demás tratamientos,
reflejando una menor eficiencia metabólica.
La Figura 4 (A, B, C) muestra los resultados obtenidos en actividad de las
enzimas Ff, Dh y Ur, respectivamente. Al igual que CBM, el suelo de referencia
presentó los valores más elevados de actividad enzimática con respecto a las par-
celas cultivadas, a excepción de la actividad Dh en el muestreo del año 2006 donde
no hubo diferencias significativas entre tratamientos. En el primer año de muestreo
(2006) la secuencia M-S-T/S presentó mayor actividad Ff con respecto a S-S,
siendo no significativas las diferencias para Dh y Ur.
-32-
Figura 4. Actividad fosfatasa (A), deshidrogenasa (B) y ureasa (C) en las parcelas bajo cultivo y
en el suelo de referencia. Letras distintas en el mismo año de muestreo indican diferencias esta-
dísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05).
-33-
A partir del año 2007 la actividad de las enzimas Ff y Dh detectaron cam-

bios debidos a la implantación del cultivo de cobertura, manifestando mayor ac-
tividad con respecto a la misma secuencia donde no se incluyó el trigo. En general,
los resultados demostraron que la inclusión del cultivo de cobertura provocó un
incremento en la biomasa microbiana evaluada a través del CBM y en la actividad
enzimática del suelo, resultando la fosfatasa el parámetro de mayor sensibilidad,
cuya actividad manifiesta un estímulo inmediato a la incorporación del cultivo de
cobertura. Ninguno de los parámetros microbiológicos evaluados permitió detectar
cambios entre la situación descompactada y no descompactada (datos no mostra-
dos).
Sitio Estación Experimental INTA Marcos Juárez (39º 41´S; 62º 09Ó)
El suelo es un Argiudol Típico serie Marcos Juárez (Soil Survey Staff, 2006)
con una composición mineral en horizonte Ap de arcilla 215 g kg-1 y limo 689 g
kg-1. El ensayo fue iniciado en 1993/94 con la rotación Maíz-Trigo/Soja-Soja en
un diseño con bloques completos con un arreglo factorial con parcelas subdividi-
das con tres repeticiones. En la parcela principal (36m x 50 m) se dispuso la fer-
tilización y en la subparcela (9m x 50m) se encuentran los siguientes sistemas de
manejo: labranza combinada (LC) que consistió en realizar labranza mínima en
trigo, labranza vertical en maíz y soja de primera, y siembra directa en soja de se-
gunda; siembra directa en todos los cultivos (SD); siembra directa con dosis doble
de fertilización respecto al uso actual medio de los productores (SD- DF) y siem-
bra directa con cultivo de cobertura antes de los cultivos de verano (SD-CC). Se
muestreó además un sector que no ha recibido laboreo desde 1993 (terreno de
clausura) considerado como referencia. Los muestreos se realizaron siempre sobre
la misma parcela, correspondiendo los siguientes cultivos de la rotación: 2006/07
Soja, 2007/08 Maíz y 2008 Trigo/Soja. La aplicación de fertilizantes nitrogenados
y fosfatados se realizó según el uso actual medio de los productores.
Dentro de los sistemas de manejo, la LC presentó los valores más bajos de
CBM, manifestando diferencias importantes con respecto a SD-CC en las cinco
fechas de muestreo. (Figura 5).
Figura 5. Carbono de la biomasa microbiana (CBM) en las parcelas bajo cultivo y en el suelo de
referencia, para cada fecha de muestreo.
-34-
Los resultados obtenidos en la actividad de las enzimas Ff, Dh y Ur en los

distintos tratamientos a lo largo del tiempo se presentan en la Figura 6 (A, B, C).
Figura 6. Actividad fosfatasa (A), deshidrogenasa (B) y ureasa (C) en las parcelas bajo cultivo y
en el suelo de referencia, para cada fecha de muestreo. Las barras indican el error estándar de las
medias
-35-
En todos los muestreos el suelo de referencia mostró diferencias significa-

tivas con respecto a las parcelas bajo cultivo para las tres enzimas estudiadas. Las
enzimas Ff y Dh en SD-CC presentaron los mayores valores respecto a LC. La
actividad Ur, resultó menos sensible para mostrar diferencias entre tratamientos.
En conclusión, parámetros biológicos como el CBM y la actividad de las enzimas
permitieron diferenciar el efecto de los distintos manejos, y resultaron menos sen-
sibles para establecer diferencias atribuibles a la fertilización. El sistema de SD-
CC se identificó como el más adecuado para la conservación biológica del suelo
según los indicadores empleados.
Sitio Estación Experimental INTA Rafaela (31º11’S; 61º33’O)

El ensayo se inició en la campaña 1999/00 con cuatro rotaciones agrícolo-
ganaderas, sobre un Argiudol Ácuico serie Lhemann (Soil Survey Staff, 2006),
con la siguiente composición mineral del horizonte Ap: arcilla 270 g kg-1 y limo
700 g kg-1. El diseño experimental fue en bloques con tres repeticiones (parcela
44m x 20m) y los cultivos se realizaron bajo siembra directa. Se detallan las ro-
taciones agrícolas seguidas de un período de 4 años con pasturas perennes (se en-
cuentra subrayado el cultivo sobre el cual se realizó el primer muestreo siendo los
subsiguientes sobre pasturas de 1º y 2º año):
Trigo/Soja - Trigo/Soja - Trigo/Soja - Soja - Pastura 4 años: (T/S)3 - S - pp4

Trigo/Soja – Soja - Trigo/Soja – Soja – Pastura 4 años: (T/S - S)2 - pp4
Trigo/Soja - Soja –Maíz – Soja – Pastura 4 años: T/S - S - M - S - pp4
Trigo/Soja - Soja –Soja – Soja – Pastura 4 años: T/S - S - S - S - pp4
En este sitio, además del CBM y actividad enzimática, se evaluó el porcen-

taje de agregados estables al agua (Ea) y etanol (Ee) según Hénin (1972). El mé-
todo consiste en realizar el pre-tratamiento de la muestra con agua o etanol y luego
pesar la fracción de agregados que permanece en el tamiz de 0,25 mm luego de
sumergir las muestras en agua con el aparato de Feódoroff. Se realizó un análisis
multivariado, para luego proceder al ANOVA utilizando el test de Tukey para las
comparaciones de medias y se aplicó un modelo de medidas repetidas en el tiempo
utilizando el procedimiento MIXED de SAS para analizar las variables en el
tiempo. Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) sobre la matriz
de correlaciones de las variables. Se buscó una función que condense información
pertinente a la calidad del suelo en una sola variable. Para evaluar esta nueva va-
riable a través de los muestreos se aplicó un modelo de medidas repetidas en el
tiempo (SAS System, 2001).
-36-
El análisis de medidas repetidas mostró un incremento significativo

(p<0,05) para el CO, Ff y Ea cuando se pasó del ciclo agrícola (2006) al pastoril
evaluado en 2007, siendo las diferencias no significativas entre 2007 y 2008 (datos
no mostrados). El ACP se realizó con las seis variables en estudio considerando
las cuatro rotaciones y el suelo no perturbado (T). Se graficaron las dos primeras
componentes (que explican el 85% de la variancia total de los datos), etiquetando
los distintos muestreos (Figura 7).
Figura 7. Análisis de componentes principales sobre las variables Carbono orgánico total (COT),
Fosfatasa ácida (Ff), Deshidrogenasa (Dh), Ureasa (Ur) y Agregados Estables al agua (Ea) y eta-
nol (Ee) para los diferentes tratamientos en los muestreos de 2006, 2007 y 2008.
Los coeficientes de la primer componente principal (CP1) indican que a

esta nueva variable le corresponderán valores positivos cuando las variables tomen
valores altos. Para la segunda componente (CP2), los coeficientes indican que esta
variable tomará valores positivos cuando los valores de CO, Ff y Dh tengan va-
lores elevados y las restantes variables tengan valores bajos. Los datos correspon-
dientes al muestreo de 2008 se encuentran por encima del cero en el eje vertical,
indicando una situación de valores elevados de CO, Ff y Dh y valores bajos de
Ur, Ea y Ee. Los demás muestreos presentan los puntos bajo la línea del cero, lo
que indica la situación contraria. El Biplot muestra que las variables CO, Ff y Dh
están asociadas en forma positiva con la CP2, mientras que Ur, Ea y Ee se corre-
lacionan negativamente con la CP2. Todas las variables presentan asociación po-
sitiva con la CP1. La Figura 8 refleja los promedios de la CP1 según las rotaciones
y los tres muestreos realizados, en relación al suelo considerado como referencia.
La CP1 explica el 59% de la variabilidad total de los datos. Esta variable se asocia
positivamente con todas las variables incluidas en el análisis (coeficientes positi-
vos para todas ellas), por lo tanto podría interpretarse como un índice simple de
calidad del suelo.
-37-
Figura 8. Promedio de la CP1 teniendo en cuenta todas las variables estudiadas para las rotaciones
(T/S)3 - S pp4, (T/S - S)2 pp4, T/S - S - M - S pp4, T/S - S -S -S - pp4 y el suelo testigo en los
muestreos realizados en 2006, 2007 y 2008.
Se observó un incremento de las variables evaluadas con el cambio del ciclo

agrícola al pastoril, y se destacó marcadamente la diferencia entre las parcelas
bajo cultivo y T. Variables como CO, Ff, Dh y Ea manifestaron un incremento
cuando se inicia el ciclo bajo pastura. La Ur y Ee mostraron un comportamiento
más variable. En suelos bajo pasturas o no perturbados se incrementa el contenido
de CO, que contribuye a mejorar la calidad bioquímica y física del estrato super-
ficial.
El CO es el principal elemento que forma parte de la materia orgánica, por
lo tanto toda práctica de manejo de suelo que contribuya a incrementar el aporte
de CO, redundará en un aumento de la MOS.
En los tres sitios estudiados los diferentes sistemas de manejo convergen
en la importancia del aporte de la MOS como un indicador global de calidad de
suelos. La MOS contribuye a aumentar la productividad de los cultivos, no obs-
tante sólo en algunos casos se ha observado una relación cuantitativa directa entre
MO y productividad, dado que en muchos casos el efecto es indirecto y en inter-
acción con otras propiedades del suelo. La biomasa microbiana representa del 1
al 5% de la MOS y es la fracción más activa relacionada con la fertilidad y pro-
ductividad. Las prácticas de manejo planteadas en los ensayos evaluados son es-
trategias de manejo agronómico adecuado para la conservación o restablecimiento
de la MOS. Las labranzas modifican la localización de la MO tanto a lo largo del
perfil como a nivel de agregados, aumentando su exposición física para una más
rápida degradación microbiana. La SD evita la rápida pérdida de los residuos su-
perficiales y los que se encuentran en el suelo, permitiendo un flujo de nutrientes
de la MO hacia los cultivos sostenido en el tiempo.
La rotación de cultivos es una práctica de manejo que permite, además del
control de plagas y enfermedades, favorecer el ciclado de los nutrientes, la con-
-38-
servación de la biodiversidad microbiana y la reposición de nutrientes, produ-

ciendo cambios significativos en el CO del suelo a largo plazo. La inclusión de
pasturas dentro de las rotaciones favorece la acumulación de CO y la disponibili-
dad de nitrógeno para los cultivos siguientes (Galantini y Landriscini, 2007). Los
cultivos de cobertura actúan equilibrando el balance de carbono en el suelo por el
aporte de la biomasa aérea, como así también de las raíces; incrementan la capa-
cidad de almacenaje de agua, debido a que disminuyen la amplitud térmica en su-
perficie evitando pérdidas de agua por evaporación. También provocan un
incremento en la infiltración como consecuencia de la cobertura y del incremento
en la proporción de macroporos, aportando una mejora significativa a las propie-
dades físicas y la fertilidad del suelo.
En conclusión, el incremento en el carbono orgánico estimula la actividad
de los microorganismos, provocando una mayor síntesis de enzimas relacionadas
con las transformaciones de la materia orgánica. Nuestros resultados son coinci-
dentes con lo informado por diversos autores que hallaron una mayor proporción
de CBM y actividades enzimáticas en suelos con manejos conservacionistas.
Indices de Calidad de suelo (ICS)
Está ampliamente aceptado que las modificaciones que ocurren en la acti-

vidad enzimática del suelo no siempre son en el mismo sentido ya que pueden
responder a diferentes ciclos o estados de degradación. Asimismo se han hallado
distintas respuestas frente a similares prácticas agrícolas (Trasar-Cepeda, 2008).
Por ello no se puede usar una sola propiedad bioquímica como indicador universal.
Cada sitio o situación de manejo presentará respuestas diferenciales a los indica-
dores evaluados según condiciones edafoclimáticas y de manejo tecnológico, por
lo que se hace necesario evaluar un conjunto de parámetros físicos, químicos y
biológicos, establecer sus relaciones y seleccionar los de mayor sensibilidad para
cada situación con la finalidad de poder construir Índices Simples o Complejos
de Calidad de Suelo.
La importancia de la construcción de ICS radica en la posibilidad de decidir
acciones en relación a: 1) Prevención: detectar signos de degradación de suelos a
tiempo para poner en práctica manejos sustentables; 2) Monitoreo: seguimiento
de restauración de áreas degradadas o con prácticas mejoradoras de la calidad del
suelo; 3) Servicios ambientales: valor agregado a los productos agropecuarios.
Demostrar que provienen de sitios con buenas prácticas de manejo que mejoran o
mantienen la calidad del suelos; 4) Valoración de tierras.
Para la construcción de un ICS se emplean modelos o funciones que inte-
gran parámetros físicos, químicos y biológicos que participan en funciones espe-
-39-
cíficas del suelo que consideren: la capacidad del suelo de recibir, almacenar y
ceder el agua; aspectos relacionados al ciclado y almacenamiento de nutrientes;
el ambiente físico para promover crecimiento de raíces y desarrollo microbiano y
la capacidad de resiliencia del mismo. Se determinan valores mínimos, máximos
y óptimos para realizar curvas-función teniendo en cuenta como referencia suelos
vírgenes o suelos de máxima producción. Los indicadores pueden seleccionarse a
través de:
Análisis de Componentes Principales: Se seleccionan los indicadores con
elevada incidencia en las CP y se incorporan a los modelos
Regresiones múltiples: permiten relacionar e identificar las variables que
explican de mejor manera las funciones del suelo
Agrupamientos Clusters: mide la similitud entre entidades a agrupar. Per-
mite agrupar a los tratamientos a través de los valores de las variables estudiadas
Índices simples
Como índices simples de calidad de suelo podemos utilizar entre otros:
1.a.Cociente metabólico microbiano (qCO2): es la relación entre el CO2
producido por ARM y el CBM. Mayor respiración en relación al CBM indica
menor eficiencia. Una ARM más elevada en relación al tamaño de la BM puede
estar manifestando una menor eficiencia metabólica, reflejada por una mayor ener-
gía de mantenimiento como respuesta a la baja disponibilidad de nutrientes o sus-
tratos como el carbono orgánico. El C se usa para Energía, en lugar de convertirlo
en biomasa.
2. Relación entre actividad enzimas y CO o fracciones: permite observar
la dinámica de la MOS y sus fracciones en relación al comportamiento enzimá-
tico.
3. Relación entre diferentes indicadores biológicos y bioquímicos
4. Cociente microbiano (q MIC): relación entre CBM y CO: en la medida
que exista mayor disponibilidad de carbono para los microorganismos, menor será
el qMIC. Si existe una menor disponibilidad de carbono orgánico, la comunidad
microbiana respirará a una tasa mayor, manifestando una menor eficiencia meta-
bólica como respuesta a la baja disponibilidad de nutrientes o sustratos carbona-
dos.
5. Componentes principales: el ACP es un análisis exploratorio que permite
reducción de la dimensión de datos. Generar una nueva variable (CP1 o CP2) que
condense la información de “n” variables, permite interpretar y relacionar la in-
formación.
A continuación se presentan algunos ejemplos de Índices simples de calidad
de suelo obtenidos a partir de los resultados presentados en la evaluación de los
-40-
parámetros físicos, químicos y biológicos de los tres ensayos de rotaciones y la-

branzas durante el período 2006-2008
Actividad enzimática, el carbono orgánico y el qCO2 de los tratamientos

en relación con el suelo de referencia
La bibliografía propone dos criterios para la elección de sitios o áreas de
referencia para la elaboración de los ICS, condiciones de suelo nativas con vege-
tación natural o sitios de máxima conservación.
La Figura 9 muestra los valores de actividad enzimática de los tratamientos
evaluados en cada sitio, en promedio de tres años, y en relación al valor tomado
como referencia para cada caso. Las muestras de suelos no disturbados presentaron
variaciones en la actividad enzimática entre ambientes edafoclimáticos y según
enzima considerada. La curva de relación 1:1 refleja el valor correspondiente a la
máxima calidad, mientras que las 1:0,75 y 1:0,50 representan disminuciones en
los valores de actividad enzimática del 25 y 50 % respectivamente.
Figura 9. Actividades enzimáticas en suelos cultivados en relación a los de referencia de Oliveros

(Oli), Marcos Juárez (MJ) y Rafaela (Ra)
-41-
En Rafaela la disminución de la actividad enzimática en muestras de suelo

provenientes de rotaciones mixtas fue de aproximadamente un 25 % para CO, Ff
y Dh, mientras que para Ur los valores hallados representaron una pérdida cercana
al 50 %. Entre las distintas rotaciones mixtas no se halló diferencias para ninguna
de las tres enzimas. En Marcos Juárez los lotes de larga duración de rotaciones
agrícolas presentaron mayor dispersión en los valores hallados. La actividad de
la Ff fue entre un 25 y 50 % menor que la de referencia, mientras que la actividad
de Dh en algunos casos estuvo próxima a la situación sin disturbar y en otros se
hallaron pérdidas cercanas al 50 %. La actividad de la Ur disminuyó entre un 25
y hasta valores por debajo del 50 %. Entre los tratamientos de manejo agrícola se
hallaron diferencias para Ff, Dh y Ur. El CO en algunos tratamientos manifestó
pérdidas cercanas al 50 % respecto de los valores de referencia. En Oliveros la
actividad de Ff y Ur correspondiente a muestras de suelo de ensayos de rotaciones
de corta duración disminuyeron entre un 25 y 50 % respecto al suelo no distur-
bado. En este sitio se hallaron tratamientos con valores de actividad de Dh próxi-
mos al de referencia, y otros con pérdidas cercanas al 50 %. Se hallaron diferencias
significativas entre tratamientos en promedio de los tres años evaluados en la ac-
tividad de las enzimas Dh y Ur. Los valores de CO mostraron una pérdida de al-
rededor de 25 % (Tabla 1).
Tabla 1. Diferencias entre tratamientos dentro de cada sitio para parámetos biológicos. Los aste-
riscos indican diferencias significativas: ANVA (p < 0,05)
Actividad enzimática Actividad por unidad de CO

CBM ARM qCO2
Ff Dh Ur Ff Dh Ur
µg de producto h-1 g-1 de suelo en base seca µg de C-CO2 g-1
Oliveros ns *1 * ns * ns * * *
Marcos Juárez * * * * * * * * *
Rafaela ns ns ns ns ns ns ns * ns
Los valores de CO hallados en suelos no disturbados fueron de 1,86 % para

Oliveros, 2,01 para Rafaela y de 2,67 para Marcos Juárez.. En general los valores
de actividad de las tres enzimas evaluadas y de CO estuvieron por debajo del nivel
de referencia en los tres sitios pero con diferentes tendencias. La menor actividad
se relaciona con la pérdida de materia orgánica. Gonzalez et al. (2007) encontraron
en suelos franco arcillosos de Buenos Aires, comparando suelos nativos y culti-
-42-
vados una disminución en la actividad de las mismas enzimas que las evaluadas
en este trabajo, mostrando mayor caída la Ff y la Ur. Estos hallazgos dan cuenta
del disturbio provocado por las prácticas de manejo en diferentes condiciones eda-
foclimáticas, no obstante ello, el impacto del uso del suelo sobre las propiedades
biológicas y bioquímicas son diferentes según parámetro y situación que estemos
evaluando. Los factores que influyen sobre la actividad de una enzima pueden ser
diferentes a los de otra enzima, por lo que la sensibilidad de cada una de ellas di-
fiere frente a distintas condiciones de manejo. Por otra parte la actividad por uni-
dad de CO pone en evidencia tendencias diferentes a la actividad enzimática
absoluta. Aparentemente el deterioro respecto a la situación óptima es menor, in-
clusive se pueden hallar valores superiores al de referencia. Algunos autores atri-
buyen esto a la degradación del CO del suelo, lo que provocaría un stress
aumentando la actividad de la enzimas, otros autores apoyan la idea de que esta
situación se debe a una necesidad de mantener cierto equilibrio ecológico (Tra-
sar-Cepeda et al., 2008).
El qCO2 hallado en la mayor parte de las parcelas cultivadas de Oliveros y
Marcos Juárez fue mayor respecto al suelo de referencia. Los valores de qCO2
hallados en muestras de suelos cultivados en Rafaela estuvieron por debajo de los
suelos no disturbados, no existiendo diferencias entre tratamientos (Tabla 1).
Según Anderson y Domsch (1993) coeficientes metabólicos comparativamente
bajos constituyen una característica típica de comunidades microbianas diversas
y muy relacionadas entre sí. El qCO2 provee una medida específica de la actividad
metabólica que varía en función de la composición y estado fisiológico de la co-
munidad microbiana, de la disponibilidad de sustratos y de diferentes factores
abióticos (Melero et al., 2006). Este índice establece que, en la medida que la flora
microbiana sea más eficiente en el uso de los recursos disponibles, la pérdida de car-
bono en forma de CO2 a través de la respiración será menor. Un aumento en el CBM,
con una consecuente disminución del qCO2 sugiere que el ecosistema se encuentra
estabilizado. En esta experiencia, el suelo de referencia expresó los valores más
bajos de qCO2, manifestando una mayor biomasa microbiana que resultó ser más
eficiente en el empleo de sustratos carbonados, empleando más carbono para cre-
cimiento celular en lugar de utilizarlo como fuente de energía para mantenimiento.
Coeficiente de correlación entre parámetros físicos, químicos y biológicos

En la Tabla 2 se muestran los coeficientes de correlación entre las variables
biológicas, físicas y químicas en el ensayo de rotaciones y fertilización de INTA
Marcos Juárez, en dos fechas de muestreo. La correlación entre variables mostró
diferencias entre épocas de muestreo y entre enzimas para una misma fecha. Con
respecto al carbono, la actividad enzimática se relacionó con el COT y las re-
-43-
laciones fueron variables, mejorando en el muestreo de mayo, para fosfatasa y

deshidrogenada. La misma tendencia se registró para estabilidad estructural. En
el ensayo de rotaciones INTA Oliveros, la enzima fosfatasa y el COT presentaron
una correlación superior al 70% , confirmando la importancia de la sensibilidad
de las enzimas como indicadores tempranos de recuperación de un suelo degra-
dado y su correlación con el COT aportado por prácticas restauradoras como las
rotaciones con gramíneas y los cultivos de cobertura.
Tabla 2. Coeficientes de correlación entre las variables biológicas, físicas y químicas en el ensayo
de rotaciones y fertilización de INTA Marcos Juárez
Noviembre 2006 Mayo 2007

Ff Dh Ur Ff Dh Ur
COT 0,19 0,40 0,70 0,68 0,86 0,55
Ea 0,11 0,27 0,59 0,61 0,88 0,51
Ee 0,08 0,29 0,48 0,54 0,76 0,44
Índices complejos de calidad de suelos

Los modelos utilizados para el cálculo de índices de calidad de suelos deben
representar de la manera más próxima posible la realidad de los agroecosistemas
y deben ser posibles de utilizar en diferentes situaciones, regiones o con diferentes
objetivos de estudio de la sustentabilidad. Por tal motivo la construcción de índices
simples de calidad de suelos es una importante herramienta para evaluar las prác-
ticas de manejo en el corto plazo. Se torna interesante establecer la interacción de
los indicadores biológicos y su correlación con el CO con los factores ambientales
y de producción con el fin de determinar un índice complejo de la calidad del
suelo (Gil-Sotres et al., 2005). Para ello, se presenta como desafío establecer cuáles
y cuántos atributos químicos, físicos y biológicos constituyen el mínimo conjunto
de datos para cada situación a estudiar; estandarizar la recolección y almacena-
miento de muestras de suelo y métodos de análisis y ajustar modelos incluyendo
variables ambientales y del cultivo. Esto permitirá agregar valor a la producción
agrícola procedente de unidades productivas que implementen prácticas de ma-
nejo que permitan mejorar la calidad del suelo.
Consideraciones finales
Si se acepta que la calidad del suelo se refiere a un correcto funcionamiento,

la degradación o restauración se puede evaluar mediante el análisis de las princi-
pales propiedades que sustentan las funciones del suelo, en particular aquellas que
son sensibles a los cambios de uso. Los indicadores microbiológicos explican pro-
-44-
cesos microbianos que ocurren en el suelo en forma global o a través de reacciones

específicas, lo cual permite evaluar la actividad metabólica y de esta forma en-
tender la funcionalidad del suelo. Las variables biológicas evaluadas presentaron
un interesante potencial como atributos de alta sensibilidad a los cambios provo-
cados por el uso del suelo y como señal temprana de mejora atribuidas a la imple-
mentación de cultivo de cobertura o inicio de ciclo de pastura. La identificación
y el conocimiento de indicadores microbiológicos en diferentes sistemas de ma-
nejo en regiones agroecológicas diversas, y su integración en Índices simples y
complejos de calidad de suelo permitirá definir estrategias de manejo que permitan
optimizar la potencialidad de los microorganismos del suelo y su aporte a la fer-
tilidad y la productividad en un marco de sustentabilidad.
Nuestro grupo de trabajo ha avanzado en el uso de la β-glucosidasa y la hi-
drólisis del diacetato de fluoresceína (FDA) como otros indicadores biológicos y
se encuentra abocado a la construcción de un Indice complejo de calidad de suelo
para el ensayo en INTA Oliveros.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los responsables de los ensayos: Ings. Agrs. Silvina
Bacigaluppo, Marcelo Bodrero y Fernando Salvagiotti de INTA Oliveros; Jorge
Villar de INTA Rafaela y Carlos Galarza de INTA Marcos Juárez, por su perma-
nente colaboración y por permitir llevar a cabo la experiencia en sus ensayos de
larga duración.
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-47-
Parámetros biológicos y bioquímicos de suelo
en sistemas bovinos pastoriles de la Llanura
Deprimida Salina de Tucumán
Biological and biochemical soil parameters in cattle

grazing system of Depressed Saline Plain of Tucuman
Banegas, Natalia R.a, Ada S. Albanesib, Raúl O. Pedrazac
Resumen
La sustentabilidad de los sistemas ganaderos plantea la necesidad de cuan-

tificar y comprender las relaciones entre las variables químicas, físicas y biológicas
del suelo. El trabajo se desarrolló en el Instituto de Investigación Animal del Chaco
semiárido (IIACS) INTA, localizado en Dpto. Leales, Tucumán. Se trabajó en un
sistema ganadero pastoril con Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes
manejos: P-NF, parcelas destinadas al pastoreo directo sin fertilización nitroge-
nada; PF: ídem P-NF con fertilización nitrogenada (100 kg de urea ha-1); R-NF:
parcelas destinadas a la confección de rollos sin fertilización nitrogenada; RF:
ídem R-NF pero con fertilización nitrogenada (100 kg de urea ha-1). La situación
de referencia fue el Monte. Profundidades: 0-5; 6-20; 21-40; 41-60 y 61-100 cm.
Las variables evaluadas fueron carbono orgánico, carbono orgánico ligero, hidra-
tos de carbono solubles, carbono soluble, respiración edáfica y carbono de biomasa
microbiana. Todos los sistemas evaluados presentaron una estrecha relación entre
las variables biológicas y las bioquímicas. En el sistema natural (Monte), las va-
riables se mantuvieron estables en el tiempo, mientras que los sistemas pastoriles
variaron en función del manejo. Los sistemas que presentaron mayor aporte de
sustrato estimularon a la biomasa microbiana y su actividad, y por lo tanto favo-
recieron los procesos de transformación y ciclaje de carbono.
Palabras clave: biomasa microbiana, actividad microbiana, sistemas pastoriles.
a
Instituto de Investigación Animal del Chaco Semiárido- INTA. E-mail:
nbanegas@correo.inta.gov.ar.
b
Facultad de Agronomía y Aroindustrias-Universidad Nacional de Santiago del Estero.
c
Facultad de Agronomía y Zootecnia-Universidad Nacional de Tucumán.
-49-
Introducción
El suelo es considerado un espacio heterogéneo, definido por sus propie-

dades físicas, químicas y biológicas, que bajo condiciones naturales tiende a des-
arrollar un equilibrio dinámico entre sus diferentes atributos, lo que genera las
condiciones adecuadas para una diversidad de organismos transformadores y des-
componedores de sustratos. En general, se considera que la microbiota del suelo,
aunque es una pequeña fracción del total de la materia orgánica del suelo, es un
agente que condiciona las transformaciones de ésta, y es fuente y destino crítico
de los nutrientes mediados biológicamente Los microrganismos desempeñan una
función central en la fertilidad, reciclaje, evolución, estructura y conservación del
suelo. Por ende, conocer la estructura y el funcionamiento de la comunidad mi-
crobiana es fundamental en el mantenimiento de la resiliencia del sistema suelo,
dado que las prácticas de manejo que se realizan durante varios años en los siste-
mas agropecuarios influyen en la biota (Babujia et al., 2012).
En los sistemas de pasturas perennes, la productividad de la pradera puede
estar influenciada por el manejo, debido a su impacto sobre los microorganismos
del suelo y el reciclaje de nutrientes. En general, estos suelos se caracterizan por
una extensa biomasa radicular, alta concentración de compuestos carbonados so-
lubles, una cobertura permanente, y una vegetación activa durante un gran período
del año (cuando las condiciones son las adecuadas), asegurando un flujo continuo
de nutrientes al suelo y estimulando a la biota (Maková et al., 2011).
Cuantificar la biomasa microbiana del suelo y su actividad, contribuye al
conocimiento de los procesos de inmovilización y mineralización de la materia
orgánica del mismo y su incidencia directa en la nutrición de las plantas. Permite
comparar los cambios temporales y espaciales producidos en los contenidos de
materia orgánica entre ecosistemas naturales y modificados, ya que es un sensible
indicador de diferencias en la sustentabilidad de los ecosistemas (Maková et al.,
2011). Da Siva et al. (2012) expresan que los sistemas de manejo que tienden a
conservar el recurso suelo, son aquellos que promueven el crecimiento y desarrollo
de la biomasa microbiana y su actividad.
La biota del suelo y su actividad tienen un gran potencial para ser utilizados
como indicadores biológicos, debido a que los organismos responden al manejo
del suelo en una escala temporal apropiada. Sin embargo, la biomasa microbiana
del suelo no puede ser evaluada aisladamente, sino en relación con otros paráme-
tros del suelo que condicionan su desarrollo, tal es el caso de C, N, y compuestos
solubles. Sólo profundizando en el conocimiento de las interrelaciones entre los
componentes del suelo se podrá explicar y alertar sobre el impacto ambiental a
largo plazo que tendrá el manejo de los suelos (Doran y Zeiss, 2000).
-50-
Parámetros biológicos y bioquímicos de suelo en sistemas bovinos pastoriles ...
Por lo tanto, la evaluación de la sustentabilidad en los sistemas de produc-

ción ganadera plantea la necesidad de cuantificar y comprender las relaciones e
interrelaciones entre las variables químicas, físicas y biológicas, así como también
disponer de indicadores que permitan determinar la calidad/salud del suelo.
El objetivo del trabajo fue evaluar la biomasa microbiana, su actividad, y
su relación con parámetros bioquímicos del suelo, en sistemas ganaderos pastoriles
de la Llanura Deprimida Salina de Tucumán.
El sistema silvopastoril
En el Dpto. Leales, provincia de Tucumán (27°11’ L.S y 65°17’ L.O), a una

altitud de 335 msnm se trabajó en un sistema ganadero pastoril. La precipitación
media anual es de 880 mm, concentrados de octubre a marzo. La temperatura
media anual es de 19°C, siendo la media del mes más cálido 25°C y la del mes
más frío 13°C. El clima es de tipo subtropical subhúmedo con estación seca, según
clasificación de Thornthwaite.
El sistema ganadero pastoril de 12 hectáreas fue implantado con Chloris
gayana cv Finecut en el año 2000 en el Instituto de Investigación Animal del
Chaco semiárido (IIACS) INTA, localizado en Dpto. Leales, Tucumán, y la situa-
ción de referencia con vegetación nativa a la que se denominó Monte. El suelo en
ambos sitios se clasifica como Haplustol fluvacuéntico (USDA).
En un diseño de parcelas divididas, se establecieron parcelas de 100 m2 (10
m x 10 m). Se destinó parte de ellas a pastoreo directo (P) y las restantes a con-
fección de rollos (R), no pudiendo ingresar los animales a estas últimas. En los
meses de octubre y noviembre se procedió a fertilizar de manera fraccionada las
parcelas, seleccionadas al azar, con 100 kg de urea.ha-1 luego de cada pastoreo o
corte.
De esta manera, las parcelas de trabajo quedaron establecidas de la siguiente forma:
P-NF (n=4): parcelas destinadas al pastoreo directo sin fertilización nitro-
genada, con pastoreo rotativo racional, controlando tiempos de ocupación (in-
vierno 39±11 días, y verano 11±3 días) y descanso de la pastura (verano 34±11
días). Se trabajó con novillitos biotipo Braford adaptados al ambiente de la Llanura
Chaqueña subhúmeda-semiárida, de 6 a 8 meses de edad y 140 a 170 kg de peso
vivo inicial. La duración de la invernada no superó los 12 meses. La suplementa-
ción energético-proteica se suministró en un nivel equivalente al 1,4% de peso
vivo (PV) durante el invierno, y al 0,8% del PV durante el verano. Entre los meses
de julio a octubre se incorporó heno de Chloris gayana cv Finecut a razón de 1,5
Kg animal-1.día-1. Se trabajó con un sistema de carga fija de 3 animales ha-1.año-1.
PF (n=4): idem P NF pero con fertilización nitrogenada.
-51-
R-NF (n=4): parcelas destinadas a la confección de rollos sin fertilización

nitrogenada. Los animales no tuvieron ingreso a estos sitios. El corte de la pastura
se realizó en principio de floración. Se realizaron entre 3 a 4 cortes por año, obte-
niéndose rollos de 120 kg de MS.ha-1. El periodo de descanso de la pastura fue de
42±12.
RF (n=4): idem R NF pero con fertilización nitrogenada.
Monte (n=4): caracterizado por la presencia de un estrato arbóreo poco
denso, y un estrato herbáceo casi nulo. La vegetación nativa arbórea está consti-
tuida por especies como Geoffroea decorticans, Zizyphus mistol, Sideroxylon ob-
tusifolium, Celtis tala y Ruprechtia laxiflora, entre otras. El estrato arbustivo se
encuentra prácticamente ausente, representado por Braccharis juncea y legumi-
nosas del género Acacia. El estrato herbáceo es escaso, generalmente constituido
por especies rastreras.
El muestreo de suelo se realizó a distintas profundidades de suelo 0-5 cm,
6-20 cm, 21-40 cm, 41-60 cm y 61-100 cm en marzo del 2007 (año 1) y 2010 (año
4). Se tomaron 3 muestras simples, por cada profundidad y para cada tratamiento.
En cada punto de muestreo se removió todo el material vegetal superficial para
obtener solamente la muestra del suelo mineral. Las muestras simples fueron lle-
vadas a laboratorio en doble bolsa identificada, secadas al aire libre, y tamizadas
por malla de 2 mm. Sobre cada una de las muestras se determinó carbono orgánico
(CO): se determinó por oxidación con ácido crómico (Nelson y Sommers 1982),
carbono orgánico ligero (COL): se obtuvo por dispersión en agua y tamizado
entre 2000 y 250 μm (Anderson e Ingram 1989), carbono de la biomasa micro-
biana (CBM) por fumigación-extracción (Weaver et al. 1994), respiración edáfica
(RE) en un período de incubación de diez días (Anderson 1982), carbono soluble
(CS) por dicromatometría, lectura a 590 nm (Weaver et al. 1994), hidratos de car-
bono solubles (HCS) que forman hidroximetilfurfural, lectura a 620 nm (Brink et
al. 1960). Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente con el programa
INFOSTAT (2008). Se realizó análisis de variancia (ANOVA) y la prueba Tukey
(p≤ 0,05) para detectar diferencias entre medias. También se realizó el análisis de
correlaciones empleando el coeficiente de correlación de Spearman.
Las variables biológicas y bioquímicas
En los años 1 y 4, los valores medios de CO fueron mayores en los primeros

5 cm de profundidad del suelo (Tablas 1 y 2). En esta profundidad el CO repre-
sentó 53 % en Monte y 46,1 - 46,9 % en los sistemas pastoriles, del total del car-
bono orgánico contenido en el perfil del suelo (100 cm de profundidad del suelo).
-52-
Tabla 1. Carbono Orgánico (CO), en g kg-1 de suelo, a diferentes profundidades de suelo en

Monte y pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes sistemas de manejo (Año 1).
Profundidad Monte PF P-NF RF R-NF

0-5 cm 27,88 bE 22,07 aE 22,28 aE 22, 12 aE 22,21 aE
6-20 cm 10,36 aD 9,99 aD 10,21 aD 10,24 aD 10,15 aD
21-40 cm 6,69 aC 6,93 aC 6,81 aC 7,12 aC 7,02 aC
41-60 cm 3,91 aB 4,71 bB 5,05 bB 4,88 bB 4,82 bB
60-100 cm 3,06 aA 3,33 aA 3,10 aA 3,22 aA 3,27 aA
Letras minúsculas distintas en filas indican diferencias significativas (p<0,05).
Letras mayúsculas distintas en columnas indican diferencias significativas (p<0,05).
Referencias: PF, parcelas pastoreadas con fertilización nitrogenada; P-NF, parcelas pastoreadas
sin fertilización; RF, parcelas de confección de rollo con fertilización nitrogenada; R-NF, parcelas
de confección de rollo sin fertilización.
Tabla 2. Carbono Orgánico (CO), en g.kg de suelo-1, a diferentes profundidades de suelo en


0-5 cm 28,06cE 24,01cE 23,16bE 22,87abE 22,12aE
6-20 cm 10,39abD 10,50bD 10,23abD 10,14aD 10,11aD
21-40 cm 6,64aC 8,25bC 7,99bC 8,00bC 6,98aC
41-60 cm 4,09aB 5,18bB 4,91abB 5,01bB 4,80abB
60-100 cm 3,08aA 3,72aA 3,74aA 3,60aA 3,52aA
Referencias ídem tabla 1
En los 20 cm de profundidad de suelo se registró 73 % del CO en Monte,

mientras que en Chloris gayana sometida a diferentes manejos fue 66,5 - 68,1 %.
Resultados semejantes fueron informados por Babujia et al. (2010) en sistemas
con pasturas y sin remoción de suelo. Es decir, que un 27 % del CO en Monte se
encuentra por debajo de la superficie de suelo, mientras que en pasturas este por-
centaje es mayor (34-32 %).
Los valores de CO en Monte y R-NF en diferentes profundidades fueron
estables entre los distintos años evaluados (Tabla 1 y 2). Por el contrario, en los
restantes sistemas pastoriles (PF, P-NF y RF), se observó un incremento en los
contenidos de CO, encontrándose las diferencias significativas en las profundida-
des 0-5; 6-20 y 21-40 cm. Ello indica que en estos sistemas, si bien existe una
contribución en profundidad de CO, los principales ingresos están relacionados
con los 40 cm de profundidad del suelo, donde existe una contribución significa-
tiva de material aéreo y subterráneo, y una actividad microbiana que estimula los
procesos de transformación.
-53-
El COL es considerado como la fracción más dinámica del CO, por ser sus-
ceptible a la actividad microbiana y al manejo del suelo. Se encuentra estrecha-
mente vinculada con la formación de agregados de suelo, principalmente de
macroagregados pequeños (250-2.000µm). En general, los incrementos de COL
están asociados al aporte de residuos e incrementos en los niveles de MO (Chen
et al, 2010).
En este estudio, los valores medios de COL mostraron diferencias signifi-
cativas por profundidad (p<0,0001), presentado un distribución estratificada (Ta-
blas 3 y 4).
Tabla 3. Carbono orgánico ligero (COL), en g.kg de suelo-1, a diferentes profundidades de suelo en

0-5 cm 11,60 aC 11,85 aD 11,19 aD 11,44 aD 11,67 aD
6-20 cm 1,80 aB 2,74 bC 2,55 bC 2,81 bC 2,61 bC
21-40 cm 0,98 aB 0,98 aB 1,04 aB 0,95 aB 0,97 aB
41-60 cm 0,19 aA 0,36 bA 0,38 bA 0,34 bA 0,35 bA
61-100 cm 0,11 aA 0,23 bA 0,25 bA 0,26 bA 0,23 bA
Tabla 4. Carbono orgánico ligero (COL), en g.kg de suelo-1, a diferentes profundidades de suelo en

0-5 cm 12,09 aC 12,42 aD 12,10 aD 13,42 bD 13,10 bD
6-20 cm 2,05 aB 3,02 abC 3,07 abC 3,35 bC 3,23 bC
21-40 cm 0,96 aB 1,04 aB 0,90 aB 0,94 aB 1,15 aB
41-60 cm 0,23 aA 0,38 bA 0,30 abA 0,39 bA 0,36 bA
61-100 cm 0,12 aA 0,28 bA 0,27 bA 0,27 bA 0,25 bA
Los valores medios de COL fueron significativamente mayores en los pri-

meros 5 cm de profundidad con respecto a las restantes profundidades (Tablas 3
y 4). Este descenso estuvo vinculado con el origen de la fracción ligera y con el
aporte de residuos.
El Monte no mostró diferencias significativas en los primeros 40 cm de
profundidad durante los años presentados, en comparación con los sistemas pas-
toriles (Tablas 3 y 4). En sistemas pastoriles se observaron incrementos significa-
-54-
tivos en los valores de COL en los primeros 20 cm (Tablas 3 y 4). Los altos con-
tenidos de COL en los tratamientos pastoriles estuvieron asociados al significativo
aporte que realizan las raíces y a una alta actividad microbiana (ver datos respira-
ción edáfica).
Chen et al. (2010) señalan que la fracción ligera de C tiende a disminuir
con el agregado de fertilizante inorgánico, como consecuencia de la ruptura de
los macroagregados del suelo en microagregados, a los cuales se asocia el C, y
posteriormente a las arcillas y limo. Los mismos autores expresan que el agregado
del fertilizante tiende a ocasionar degradación de C en esta fracción del suelo. Sin
embargo, en este estudio los tratamientos fertilizados no presentaron diferencias
significativas con respecto a los correspondientes no fertilizados (PF vs P-NF; RF
vs R-NF) (Tabla 4). Esto estuvo asociado al mantenimiento de una cobertura de
suelo permanente, lo cual generó un aporte continuo de material a la fracción
ligera de C.
La fracción soluble del CO cobra relevancia como sustrato de la microflora.
El carbono soluble (CS), está constituido por azúcares, ácidos orgánicos y prote-
ínas simples, es decir compuestos que pueden ser rápidamente mineralizados por
los microorganismos. Collins et al. (1992) sostienen que el carbono mineralizado
deriva de los compuestos activos de la MOS e indica acumulaciones variables de
C lábil, resultantes de diferentes prácticas de manejo y de la masa microbiana
muerta.
Para todos los tratamientos evaluados, se registró una estraficación del CS
(Tablas 5 y 6), encontrándose los mayores valores en los primeros 40 cm de suelo.
Una particularidad a destacar en la distribución del CS, es la profundidad 21-40
cm en la cual los contenidos de CS son significativamente mayores con respecto
a 6-20cm en ambos años.
Tabla 5. Carbono Soluble (CS), en mg.kg de suelo-1, a diferentes profundidades de suelo en Monte y
pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes sistemas de manejo (Año 1).

0-5 cm 29,8 bE 26,0 aE 25,0 aE 24,8 aE 25,4 aE
6-20 cm 22,6 bC 18,2 aC 17,9 aC 17,3 aC 17,5 aC
21-40 cm 26,5 bD 21,3 aD 22 aD 21,0 aD 21,7 aD
41-60 cm 14,9 bB 12,5 bB 13,5 bB 13,2 bB 12,9 bB
60-100 cm 7,0 aA 5,8 aA 5,4 aA 6,4 aA 5,8 aA
-55-
Tabla 6. Carbono Soluble (CS), en mg. kg de suelo-1, a diferentes profundidades de suelo en Monte y
pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes sistemas de manejo (Año 4).

0-5 cm 30,3bD 34,3cD 31,1bD 29,8abD 27,7aD
6-20 cm 25,4bcC 27,5cC 25,8bC 23,4bC 20,5aC
21-40 cm 28,3bcD 30,2cD 27,3bD 28,0bD 25,9aD
41-60 cm 15,2aB 14,9aB 14,8aB 13,5aB 14,3abB
60-100 cm 7,0aA 7,0aA 6,6aA 6,2aA 6,7aA
Amelung et al. (1997) sostienen que, en suelos minerales, los sacáridos pue-
den difundirse dentro de los poros o ser adsorbidos por las arcillas. De esta manera,
estos compuestos resultan protegidos del ataque microbiano. Teniendo en cuenta
la textura del suelo en estudio, los compuestos solubles podrían haber sido adsor-
bidos por las fracciones de menor tamaño y estar protegidos de la acción micro-
biana. A su vez, el muestreo se realizó en marzo de ambos años, cuando el perfil
del suelo se encuentra húmedo, producto de las lluvias estivales que habrían pro-
vocado la lixiviación a los compuestos solubles hacia zonas más profundas del
perfil.
Las diferencias significativas entre tratamientos para ambos años se regis-
traron en los primeros cm de profundidad. En el año 1, Monte presentó los mayo-
res valores de CS hasta los 40 cm con respecto a Chloris gayana cv Finecut. Luego
de cuatro años (año 6) se observa que el manejo influyó sobre el contenido de esta
variable. Mientras que en Monte, los valores medios de CS se mantuvieron esta-
bles, en los tratamientos con pastura, los mismos se incrementaron.
En los sistemas pastoriles, PF presentó los mayores valores de CS con res-
pecto a los restantes tratamientos. Los menores valores se observaron en R-NF.
En las tablas 7 y 8 se observa que los mayores valores medios de HCS para
todos los tratamientos se encontraron en superficie (0-5 cm), posiblemente en re-
Tabla 7. Hidratos de carbono soluble (HCS), en mg.kg de suelo-1, a diferentes profundidades de

suelo en Monte y pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes sistemas de manejo
(Año 1).

0-5 cm 10,5bE 4,06aE 4,11aE 4,14aE 3,97aE
6-20 cm 8,21bD 3,55aD 3,62aD 3,58aD 3,49aD
21-40 cm 6,34bC 2,50aC 2,41aC 2,46aC 2,37aC
41-60 cm 3,25bB 2,05bB 2,06bB 2,08bB 2,12bB
60-100 cm 2,41aA 1,74aA 1,71aA 1,66aA 1,63aA
-56-
lación con la cantidad de material depositado superficialmente, el cual está some-

tido a procesos de transformación microbiana.
Tabla 8. Hidratos de carbono soluble (HCS), en mg. kg de suelo-1, a diferentes profundidades de

suelo en Monte y pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes sistemas de manejo
(Año 4).

0-5 cm 10,46cE 9,89cE 8,63bE 8,41bE 7,25aE
6-20 cm 8,20cD 7,86cD 6,75bD 6,87bD 5,95aD
21-40 cm 6,50C 5,40cC 4,00bC 4,17bC 3,49aC
41-60 cm 3,27aB 2,82aB 2,61aB 2,34aB 2,23abB
60-100 cm 2,55aA 2,17aA 2,00A 2,09aA 1,70aA
Renella et al. (2007) encontraron que los compuestos orgánicos de bajo

peso molecular, como la celulosa, constituyen sustratos importantes que estimulan
el crecimiento microbiano. Los mismos autores sostienen que estas fuentes de car-
bono, en general, son utilizadas por los microorganismos para biosíntesis y creci-
miento, pero ello depende de la disponibilidad de nitrógeno y de otros nutrientes
en la rizosfera.
Las diferencias significativas entre tratamientos se presentaron en los pri-
meros 40 cm de suelo. En mencionada profundidad, Monte presentó los mayores
contenidos de HCS al inicio de la evaluación. Hacia el año 4, se observa que los
tratamientos sometidos a pastoreo y a corte incrementaron su contenido de HCS
pero el mismo estuvo condicionado por el manejo utilizado.
De igual manera que CS, los HCS fueron significativamente mayores en
los tratamientos pastoreados con respecto a los correspondientes de henificación
(PF vs RF; P-NF vs R-NF), y a su vez los tratamientos fertilizados presentaron
un contenido mayor de ambas variables con respecto a los correspondiente no fer-
tilizados (PF vs P-NF; RF vs R-NF). Ello podría estar en relación con un aporte
diferencial de sustrato al suelo en los distintos manejos planteados. Mencionado
aporte podría ser mayor en sistemas con pastoreo, a través de las excretas, el man-
tillo, su descomposición, las raíces y los exudados radiculares. En concordancia,
Franzluebbers y Stuedemann (2009) asocian mayores contenidos de compuestos
carbonados en aquellos sistemas con mayor ingreso de nutrientes que favorecerían
al ciclaje de los mismos, mayor estimulo en el crecimiento vegetal y deposición
de residuos vegetales, aumento en la translocación de C a las raíces, incremento
en la producción de rizodeposición e incrementos en la tasa de descomposición
de mantillo. Por el contrario, en los sistemas extractivos, sin reposición de nu-
trientes (vía excretas, mantillo, fertilizantes orgánico e inorgánicos) una gran can-
-57-
tidad de los mismos son exportados (como biomasa vegetal), sin ser repuestos.
CS y HDCS son consideradas como las fracciones más activas de la MO.
Aún cuando, esta fracción representa solo una pequeña parte del CO, actúa como
un agente buffer en mecanismos como la descomposición de los residuos y la exu-
dación radicular, y son especialmente importantes en el incremento de la estabi-
lidad estructural. Escaso aporte de residuos vegetales y/o animales, y prácticas
agropecuarias que disminuyan su concentración, causan reducciones en la cantidad
de nutrientes totales y en la biomasa microbiana. La disminución de los mismos
provocan la degradación de las funciones biológicas del suelo.
Carbono de biomasa microbiana y Respiración Edáfica.

En el análisis del contenido de carbono en la biomasa microbiana realizado
en este estudio, se observó que los mayores contenidos de CBM se presentaron
en los primeros cm del suelo y luego descendieron en profundidad (Tablas 9 y
10). Esta estraficación del CBM se encuentra en relación con el depósito de ma-
terial sobre la superficie del suelo en estos sistemas sin remoción del mismo, pro-
duciendo una acumulación de materia orgánica (MOS) en diferente cantidad y
calidad en la superficie de suelo, disponible para los microrganismos. En concor-
dancia, Enwall et al. (2007), por su parte, encontraron que los valores de CBM
son mayores en los primeros cm del suelo, producto de la actividad radicular y el
efecto rizosférico.
Tabla 9. Carbono de biomasa microbiana (CBM), en mg.kg suelo-1, a diferentes profundidades en
Monte y pradera de Chloris gayana cv Finecut (Año 1).

0-5 cm 683,67 bE 488,01 aE 486,71 aE 490,13 aE 487,98 aE
6-20 cm 188,59 bD 160,06 aD 162,04 aD 161,22 aD 162,83 aD
21-40 cm 72,12 aC 66,12 aC 67,22 aC 65,37 aC 66,67 aC
41-60 cm 34,73 aB 29,98 aB 32,44 aB 29,79 aB 30,18 aB
60-100 cm 21,68 aA 17,52 aA 19,21 aA 17,44 aA 18,23 aA
Tabla 10. Carbono de biomasa microbiana (CBM), en mg.kg suelo-1, a diferentes profundidades en
Monte y pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes manejos (Año 4).

0-5 cm 660,35 bcE 699,47 cE 640,94 bE 629,28 bE 578,15 aE
6-20 cm 185,01 bD 185,56 bD 178,53 abD 180,53 bD 170,09 aD
21-40 cm 74,67 aC 75,52 aC 70,96 aC 72,13 aC 71,80 aC
41-60 cm 35,57 aB 34,32 aB 32,98 aB 31,98 aB 29,17 aB
60-100 cm 21,14 aA 21,99 aA 20,70 aA 19,70 aA 18,11 aA
-58-
En Monte se observó que los contenidos de CBM se mantuvieron estables

mientras que, en los sistemas pastoriles los valores de CBM se incrementaron
con respecto al año 1 por efecto del tratamiento, pero sólo en los primeros cm del
suelo (Tabla 9 y 10).
Entre tratamientos las diferencias se presentaron en los 20 cm de profundi-
dad del suelo (Tablas 9 y 10). Este hecho se puede relacionar con diferencias en
las entradas de C y nutrientes al sistema, que afecta principalmente a la capa su-
perficial de suelo, como así también con el efecto rizosférico inducido por las ra-
íces, especialmente importante en pasturas. Según Moore et al. (2000), la rizósfera
ejerce una influencia positiva sobre las comunidades microbianas, existiendo va-
riaciones en la concentración y tipo de compuestos orgánicos liberados por las ra-
íces, de acuerdo a la especie vegetal, edad y manejo.
Los mayores valores de CBM en PF estuvieron asociados a una acumula-
ción de compuestos orgánicos carbonados que favorecen el crecimiento micro-
biano. Esto se observó no sólo en los contenidos de CO, sino también en los
mayores contenidos de COL, CS e HCS que se obtuvieron en este tratamiento,
con respecto a los restantes. El CBM presentó una importante correlación con
estos parámetros (r2=0,98; r2=0,96; r2=0,94; r2=0,95 para CO, COL, CS e HCS,
respectivamente).
A su vez, los sistemas pastoreados presentaron mayores valores de CBM
con respecto a los correspondientes no pastoreados (Tablas 9 y 10). Las diferen-
cias estuvieron en parte relacionadas con un mayor aporte continuo de sustrato.
Estos ingresos diferenciales se traducen en un cambio en las tasas de energía que
se mueve a través de los sistemas y que afectan a la biomasa del suelo. En los sis-
temas en los cuales existe una mayor provisión constante de material en suelo,
asociada principalmente a los contenidos de MOS, se asegura una cantidad de sus-
trato disponible para el metabolismo de los microorganismos.
Los sistemas pastoreados pueden presentar valores de CBM mayores, con
respecto a sistemas no pastoreados, en función de la intensidad y frecuencia de
pastoreo, ya que éste modifica las entradas y salidas del sistema. Bardgett et al.
(2001) observaron que entre tratamientos pastoreados y no pastoreados puede
existir una diferencia en la cantidad, calidad y descomposición de mantillo que
afecta a la biomasa microbiana.
En cuanto a la pastura y el efecto del fertilizante nitrogenado sobre la bio-
masa microbiana, se observó en los primeros 20 cm de profundidad del suelo, que
los tratamientos fertilizados incrementaron su biomasa con respecto a los corres-
pondientes no fertilizados (Tablas 9 y 10). De manera similar, Enwall et al. (2007)
también observaron que la fertilización afectó a la biomasa microbiana debido a
un incremento en la producción vegetal, y por ende, en los niveles de rizodeposi-
-59-
ción. El agregado de nutrientes (abonos, material vegetal, excretas y fertilización)

puede incremetar la producción de C metabolizable y N, junto con un incremento
en la producción de biomasa radicular y sus exudados, lo que contribuye a au-
mentar los valores de CBM.
La respiración edáfica (RE) es la producción y liberación de dióxido de car-
bono (CO2) como resultado de la actividad biológica en el suelo. Los sistemas de
manejo pueden ocasionar alteraciones en la tasa de liberación de CO2, ya que
pueden modificar las entradas de agua y MOS, y a la biomasa microbiana y su
actividad (Babujia et al., 2010).
En este estudio la RE estuvo positivamente correlacionada con los valores
de CBM (r2=0,97), CO (r2=0,94), COL (r2=0,90), CS (r2=0,90) e HCS (r2=0,91).
Los valores de RE fueron significativamente mayores en los primeros 5 cm
de profundidad del suelo en todos los tratamientos. A partir de los 41 cm de pro-
fundidad no se registraron diferencias significativas en todos los tratamientos (Ta-
blas 11 y 12).
Tabla 11. Respiración edáfica (RE), en mg.kg suelo-1, a diferentes profundidades del suelo en Monte
y pradera de Chloris gayana cv Finecut (Año 1).

0-5 cm 365,52 bD 260,30 aD 262,44 aD 259,47 aD 259,59 aD
6-20 cm 147,70 bC 109,95 aC 107,66 aC 111,36 aC 110,33 aC
21-40 cm 80,60 bB 69,55 aB 71,35 aB 68,11 aB 68,34 aB
41-60 cm 44,54 bA 24,30 aA 24,41 aA 23,66 aA 24,12 aA
60-100 cm 38,80 bA 21,85 aA 20,75 aA 20,25 aA 21,22 aA
Tabla 12. Respiración edáfica (RE), en mg.kg suelo-1, a diferentes profundidades del suelo en Monte
y pradera de Chloris gayana cv Finecut sometida a diferentes manejos (Año 4).

0-5 cm 375b,50cD 368,70bcD 352,50bD 359,00bD 344,54aD
6-20 cm 152,21cbC 143,50bcC 136,43abC 139,11abC 132,43aC
21-40 cm 85,27aB 85,01aB 81,09aB 81,38aB 80,76aB
41-60 cm 46,14aA 27,77aA 26,13aA 26,74aA 24,71aA
60-100 cm 39,40aA 22,54A 24,61A 25,51A 23,22A
Esta distribución responde a lo que Carrillo (2003) llama “curva decreciente

de distribución de la actividad microbiana”, y señala que la misma es producto de
-60-
la incidencia de luz solar, la desecación y el efecto rizosférico. La estratificación

de la RE se relaciona con la disminución de la actividad microbiana, con una dis-
minución de la cantidad de material de fácil descomposición, de materia orgánica
y de biomasa microbiana en profundidad. Se sabe que la actividad microbiana se
encuentra fuertemente condicionada por el suministro de nutrientes, especialmente
carbonados (Babujia et al. 2010), por lo tanto, al encontrarse éstos menos dispo-
nibles en profundidad, su actividad se ve restringida.
Los valores de RE variaron en función del tratamiento, aunque las diferen-
cias fueron significativas en los primeros cm de profundidad del suelo. En Monte,
los valores de RE se mantuvieron establesm mientras que en los sistemas pastoriles
se observó un aumento de los mismos. Caquet et al. (2012), quiénes trabajaron en
un pradera de pasturas C4 dominada por Loudetia simplex (Nees) Hubb en el
Congo, expresan que los incrementos de RE están asociados con la productividad
primaria aérea y subterránea. Particularmente, las raíces desempeñan una función
muy importante, dada la acción de la rizósfera, pero también debido a una mayor
transferencia de C a las raíces, lo cual estimula el crecimiento y producción de las
mismas, como así también su actividad, y con ella la de los microrganismos edá-
ficos (Caquet et al., 2012).
En los primeros cm del suelo los valores de RE fueron significativamente
mayores en Monte con respecto a los restantes tratamientos pastoriles (Tablas 11
y 12). Existe bibliografía que indica que en condiciones naturales hay una mayor
diversidad vegetal, que promueve el crecimiento de la biomasa y su actividad (da
Silva et al., 2012).
En los primeros cm del suelo, la actividad microbiana fue mayor en los tra-
tamientos fertilizados con respecto a los correspondientes no fertilizados (Tablas
11 y 12), lo que se encontraría asociado a que el N incrementa el crecimiento ve-
getal, la productividad del ecosistema y la tasa de descomposición del mantillo, y
como consecuencia, el suministro de sustrato carbonado hacia las raíces y el suelo.
Los sistemas pastoreados, con respecto a los correspondientes de confección
de rollo se diferenciaron estadísticamente en los primeros cm de profundidad del
suelo (Tablas 11 y 12). En este estudio ya se observó que los tratamientos pasto-
reados, con respecto a los correspondientes de confección de rollo, presentaron
diferencias significativas en los contenidos de CO, COL, CS e HDCS, es decir,
todas constituyen variables muy relacionadas con la actividad microbiana. De
igual manera, estudios realizados por Bardgett et al. (1998) encontraron la biomasa
y su actividad son mayores en sistemas con efecto animal debido, en parte, a la
cantidad y calidad de los residuos incorporados al suelo, al incremento de las exu-
daciones radiculares en pastoreo y al mayor ingreso de nutrientes vía excretas.
-61-
Conclusiones
Todos los sistemas evaluados (Monte, PF, P-NF, RF, R-NF) presentaron
una estrecha relación entre las variables biológicas (carbono de biomasa micro-
biana y respiración edáfica) y las bioquímicas (carbono orgánico, carbono orgá-
nico ligero, carbono soluble e hidratos de carbono soluble).
En el sistema natural (Monte), las variables se mantuvieron estables en el
tiempo, mientras que los sistemas pastoriles variaron en función del manejo. Los
sistemas pastoreados presentaron los mayores valores de todos los parámetros con
respecto a los correspondientes de henificación (PF vs RF; P-NF vs R-NF) en re-
lación con un aporte de sustrato mayor que estimula a la biomasa microbiana y su
actividad, y por lo tanto favoreciendo los procesos de transformación y ciclaje de
nutrientes en suelo.
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-63-
Microorganismos del suelo y su participación
en la formación de la materia orgánica:
degradación de lignocelulosa
Soil microorganisms and their participation in the formation

of organic matter: degradation of lignocellulose
Saparrat, Mario C. N.a,b,c,*, Alejandra Bárcenaa, Pedro A. Balattia,c,d
Resumen
En el suelo coexisten diferentes procesos de transformación de la materia

orgánica, los que incluyen reacciones de despolimerización, mineralización y sín-
tesis de sustancias húmicas. Los polímeros estructurales de los residuos agrícolas
y la hojarasca del mantillo forestal, como la celulosa y la lignina, son los aportes
de carbono orgánico más importantes que llegan al suelo, que constituye un re-
servorio clave en el ciclo biogeoquímico del carbono. La transformación micro-
biana de celulosa y lignina en el suelo condiciona las características estructurales
y químicas del mismo, lo que es crítico para la productividad del ecosistema, que
se desarrolla a partir del subsistema suelo. Diferentes bacterias y hongos son los
principales actores del proceso, en el que participan a través de diferentes estrate-
gias de transformación y mecanismos. Asimismo, factores ambientales como la
disponibilidad de oxígeno, pH y temperatura así como las características de los
materiales lignocelulósicos son también parámetros claves de la transformación
microbiana de estos polímeros. En este capítulo se analizará el rol de los micro-
organismos en la transformación de celulosa y lignina y como un caso de estudio
se describe la participación de los hongos en la degradación de la hojarasca de
Celtis ehrenbergiana y Scutia buxifolia, material que está asociado a un suelo fo-
a
Instituto de Fisiología Vegetal (INFIVE), Universidad Nacional de La Plata (UNLP)- CCT-La
Plata- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Diag. 113 y 61,
CC 327, 1900-La Plata, Argentina
b
Instituto de Botánica Spegazzini, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, UNLP, 53 # 477,
1900-La Plata, Argentina
c
Cátedra de Microbiología Agrícola, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP, 60 y 119,
1900-La Plata, Argentina
d
Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Foresta-
les, UNLP, 60 y 119, 1900-La Plata, Argentina
*E-mail: ;Tel.: +54 0221 4236618; fax: +54 0221 4233698.
Mail: masaparrat@yahoo.com.ar
-65-
restal condicionado por el pH y su relación con la actividad enzimática lignoce-

lulolítica. Además, se incluye información sobre las sustancias húmicas, precur-
sores y su relación con la lignocelulosa en el contexto actualizado de los modelos
de las sustancias húmicas y los procesos de transformación de la materia orgá-
nica.
Palabras clave: microorganismos, suelo, materia orgánica.
Introducción
El carbono (C) y el oxígeno (O) son los componentes mayoritarios de la

biomasa generada a través de los procesos de fotosíntesis (oxigénica y anoxigé-
nica) y quimiolitotrofía que reducen el CO2 a carbono orgánico. En el marco del
ciclo biogeoquímico del C (Figura 1), la transformación microbiológica del pool
orgánico en el suelo involucra reacciones de mineralización y/o humificación.
Guggenberger (2005) puntualizó a modo de recapitulación los procesos claves
asociados con el ciclo de la materia orgánica en los suelos, distinguiendo los si-
guientes: deposición de hojarasca, transformación, descomposición, mineraliza-
ción, partición -distribución-, asimilación y estabilización.
Figura 1. Ciclo del Carbono y su relación con el oxígeno adaptado de Madigan et al. (2004). Ob-
sérvese la diferencia entre los procesos autotróficos (CO2 → Compuestos orgánicos) y heterotró-
ficos. QUI, quimiolitotrofía; FO, fotosíntesis oxigénica; FAO, fotosíntesis anoxigénica; REA,
respiración aeróbica; REAN, respiración anaeróbica; FER, fermentación; MEG, metanógenos;
MET, metanótrofos; HOA, homoacetógenos.
-66-
Microorganismos del suelo y su participación en la formación de la materia orgánica...
Mientras que la mineralización es definida como la conversión microbiana

de la materia orgánica en constituyentes inorgánicos, la humificación es el proceso
en el que el carbono de los residuos orgánicos es transformado y convertido en
sustancias húmicas a través de reacciones bioquímicas y abióticas (Guggenberger,
2005). La mineralización de la materia orgánica en el suelo es el resultado de di-
versos procesos que ocurren simultáneamente y que provocan la degradación entre
otros de sustancias poliméricas, y la posterior fermentación (etanólica o alcohólica,
ácido-mixta, butanodiólica, entre otras) y/o respiración (aeróbica y/o anaeróbica)
de los monómeros liberados. Esto está en función de la presencia de microorga-
nismos específicos que son responsables de cada proceso, lo que debe ser acom-
pañado de condiciones predisponentes, como por ejemplo la disponibilidad de
oxígeno, es decir que tanto los microorganismos como las condiciones están di-
rectamente relacionados con los ciclos de C y O. La humificación es el proceso
de formación del humus, principal reservorio de C en el suelo; este convierte y
acumula diferentes materiales orgánicos como humus. El humus se define como
una estructura polifenólica, compleja, amorfa y recalcitrante que caracteriza el
status nutricional de los suelos. El proceso y los mecanismos de síntesis así como
la naturaleza de sus principales precursores se encuentra actualmente en análisis
y discusión.
A nivel cuantitativo la fracción más importante de carbono orgánico que
ingresa al suelo son los residuos vegetales, ya sean en forma de rastrojos u hoja-
rasca de sistemas forestales, material constituido por celulosa y lignina (Paul y
Clark, 1996). Este es el material estructural de las paredes celulares de las plantas,
esta matriz compleja corresponde a los siguientes polímeros: celulosa que forma
parte de la estructura de la pared celular vegetal, hemicelulosa y un polímero de
naturaleza aromática, la lignina (Figura 2).
Figura 2. Esquema representativo de un grupo de elementos celulares (fibras) de madera y su aso-

ciación (A), la estructura simplificada de una de ellas (B), diferenciando las capas y ultra-estruc-
tura de la pared celular, y la distribución de los polímeros en la pared secundaria (C), adaptado de
Segura et al. (2007). LM, laminilla media; P, pared primaria; S1-S3, capas de la pared celular se-
cundaria. Diámetro de cada célula aproximadamente 25 μm.
-67-
Este último cumple un rol clave en la rigidez de las paredes de las células
vegetales xilemáticas y es lo que da sostén y contribuye a la defensa frente ataques
microbianos (Martínez et al., 2005). La transformación de estos polímeros en el
suelo es un proceso clave del ciclo biogeoquímico de carbono lo que tiene impacto
en las características estructurales y químicas del suelo. Los microorganismos he-
terótrofos de la microbiota del suelo utilizan la lignocelulosa como sustrato de
crecimiento y/o simplemente la degradan en reacciones cometabólicas, y de esta
manera actúan sobre el flujo de energía en el sistema, lo que afecta a otros niveles
tróficos y conduce además a la liberación de CO2 a la atmósfera. A causa del sig-
nificado funcional que tiene la celulosa y la lignina como material de partida en
los procesos de transformación de residuos vegetales en el suelo y en la formación
de sustancias húmicas así como la estabilización de los suelos (Paul, 2007), en
este capítulo se analizará el rol de los microorganismos en la transformación de
ambos polímeros y como un caso de estudio se describe la participación de los
hongos en la degradación de la hojarasca de Celtis ehrenbergiana y Scutia buxi-
folia, material que está asociado a un suelo forestal condicionado por el pH y su
relación con la actividad enzimática lignocelulolítica. Además, se incluye infor-
mación sobre las sustancias húmicas, precursores y su relación con la lignocelulosa
en el contexto actualizado de los modelos de las sustancias húmicas y los procesos
de transformación de la materia orgánica.
Lignocelulosa y su degradación en el suelo
La lignocelulosa es el componente clave de la matriz estructural de las pa-

redes celulares de las plantas. La celulosa, que habitualmente representa entre el
35 y el 50 % de la masa seca de la biomasa vegetal, es un polímero linear de ce-
lobiosa (D-glucopiranosil-β-1,4-D-glucopiranosa; Figura 3). La celulosa forma
en la pared agregados de cadenas, que están estabilizadas por puentes de hidrógeno
intra- e intermoleculares; a estos se los conoce como microfibrillas que tienen
unos pocos nanómetros de diámetro. La celulosa en la pared presenta un estado
semicristalino en el que se identifican sectores ordenados y amorfos, estos últimos
más susceptibles a lo hidrólisis enzimática (Lynd et al., 2002; Thomas et al.,
2012). Las microfibrillas suelen agregarse en estructuras mayores definidas como
macrofibrillas y estas últimas en paquetes que se asocian con los otros polímeros
de la pared.
-68-
Figura 3. Estructura de la celulosa, mostrando tipo de enlace involucrado, adaptado de Rencoret

(2008).
La hemicelulosa corresponde a otros polisacáridos que forman la pared, y

si bien estos están formados principalmente por xilanos y mananos, pueden con-
tener otros constituyentes. La hemicelulosa está estrechamente asociada con las
microfibrillas de celulosa y conforma un complejo con la lignina a través de en-
laces covalentes y puentes de hidrógeno (Núñez, 2004). Uno de los principales
componentes de la hemicelulosa en las células xilemáticas de maderas duras es el
xilano, que representa entre el 15 y el 30% de la masa seca. Este es un polisacárido
de unidades de D-xilosa unidas por enlaces de tipo -1,4, pudiendo incluso estar
sustituidos con otros monosacáridos. La hemicelulosa de maderas blandas con-
tiene principalmente galactoglucomananos, en cantidades que van del 15-20% de
la masa seca. Este es un polisacárido compuesto de D-glucosa y D-galactosa uni-
das también por enlaces tipo -1,4 (Bugg et al., 2011).
La lignina representa entre el 20 y el 30 % de la masa seca y es un polímero
tridimensional de hasta 3 unidades fenilpropanoides, no metoxiladas (p-hidroxi-
fenílica, H), mono- (guaiacílica, G) o di-metoxiladas (siringílica, S), derivadas de
alcoholes p-hidroxicinamílicos, que dan origen a una variedad de subunidades in-
cluyendo diferentes enlaces C-C y éter (Martínez et al., 2005). La estructura de la
lignina no se conoce con exactitud y hasta el momento tan sólo se han descripto
modelos estructurales que se han ido mejorando gracias al avance de las técnicas
analíticas. Entre estas, la Resonancia Magnética Nuclear Bidimensional (2D-
NMR), ha permitido el reciente descubrimiento de nuevas subestructuras (Ren-
coret, 2008; Figura 4).
-69-
Figura 4. Estructura modelo de la lignina de una conífera (Picea sp.; A) y de una angiosperma
(Populus sp.; B), adaptado de Rencoret (2008). Las diferentes tonalidades denotan subestructuras
características del polímero.
-70-
La composición de la lignina en términos de la relación entre las unidades

H:G:S varía entre los diferentes grupos de plantas vasculares. Las gimnospermas
leñosas (coníferas) tienen el contenido más alto de lignina, la cual se compone
principalmente de unidades G. En el otro extremo, la lignina de las angiospermas
leñosas (caracterizadas por sus maderas duras) consiste en mayor medida de uni-
dades G y S, y la lignina de angiospermas herbáceas contiene también unidades
H. También la composición de la lignina varía según los diferentes tejidos de la
madera y las capas de la pared celular (por ejemplo, la lignina de la laminilla
media generalmente tiene una menor relación S/G que aquella de la pared secun-
daria; Martínez et al., 2005). La lignina es un constituyente clave de la pared ce-
lular que le da rigidez a la planta, aportándole además resistencia a la degradación
microbiana. La lignina y los compuestos de baja masa molecular de la fracción
extraíble determinan el color pardo amarillento de los restos lignocelulósicos. Este
color es el resultado de un efecto óptico de la serie de dobles enlaces del anillo
bencénico presentes en su estructura. Los enlaces éter y C-C de la lignina no son
susceptibles al ataque hidrolítico, por ello la lignina es altamente resistente a la
despolimerización. Incluso, las microfibrillas de celulosa se revisten con la lignina
de manera de generar una barrera física a la degradación de polisacáridos.
A diferencia de las hemicelulosas, las pectinas y otros polímeros menores
mixtos de azúcares, que son altamente susceptibles como fuente de carbono y
energía por un amplio espectro de microorganismos no específicos considerados
como R-estrategas, la celulosa y la lignina son recalcitrantes a la degradación, es
decir que son degradados más lentamente, lo que se debe en parte a la acción de
microorganismos específicos considerados K-estrategas (Sylvia et al., 2005).
La descomposición microbiológica de celulosa en el suelo no solo contri-
buye al flujo de energía en los suelos y al reciclado de C, sino que además afecta
la movilización de otros nutrientes como N, P y S.
La celulólisis consiste en una serie de procesos mediados por enzimas de
microorganismos que utilizan la celulosa como fuente de carbono y energía (asi-
milación) que incluye:
1. un evento inicial de acondicionamiento que consiste en la desorganiza-
ción de sectores cristalinos;
2. otro de despolimerización extracelular que genera pooles de oligosacá-
ridos hasta celobiosa o incluso glucosa; y
3. un último evento en el que se produce la hidrólisis de la glucosa. La des-
organización de la estructura lignocelulósica es clave para exponer la celulosa al
ataque enzimático y aumentar el área susceptible a la despolimerización. No obs-
tante, algunos microorganismos, como los hongos causantes de pudrición parda
de la madera, degradan en células (vegetales) intactas la celulosa de la capa S2 de
-71-
la pared celular a través de un sistema no enzimático involucrando especies reac-

tivas de oxígeno (Steenkjær Hastrup et al., 2011).
En la despolimerización enzimática de la celulosa actúan tres grupos de enzimas:
1. endoglucanasas, endo 1,4--D-glucano-4-glucanohidrolasas, que catalizan
en forma aleatoria la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la cadena de celu-
losa;
2. exoglucanasas, celobiohidrolasas (exo 1,4--D-glucano-4-celobiohidrolasas),
que liberan celobiosa o glucosa desde el extremo no-reductor de la celulosa; y
3. β-glucosidasas, también conocidas como celobiasas que hidrolizan ce-
lobiosa y otras celodextrinas solubles a glucosa (Singh y Hayashi, 1995).
Estas enzimas pueden ser secretadas fuera de las células microbianas o pue-
den permanecer inmovilizadas en estructuras globulares sobre la superficie mi-
crobiana constituyendo el celulosoma. Este sistema se encuentra principalmente
en organismos anaeróbicos en los que de esta manera se incrementa la eficiencia
de la celulólisis (Lynd et al., 2002). La mayor actividad celulolítica se observó en
reacciones conteniendo mezclas de enzimas del sistema celulolítico que actúan
sinérgicamente (Wood et al., 1989), lo que es probable que ocurra en el suelo
(Zhou y Ingram, 2000). Existe una diversidad de microorganismos de suelo y aso-
ciados al material vegetal como rastrojos agrícolas y hojarasca del mantillo del
suelo forestal, que incluyen bacterias aeróbicas y anaeróbicas y hongos, que par-
ticipan en la degradación de la celulosa. Estos microorganismos sintetizan dife-
rentes enzimas que componen sistemas enzimáticos especificos según de cada
microorganismo. Estas enzimas difieren en las propiedades catalíticas, ya que mu-
chas son isoenzimas en su respuesta al pH, fuerza iónica y tipo de sustrato ligno-
celulósico, incluyendo la relación C/N y tenor de lignina (Lynd et al., 2002). La
mayor actividad celulolítica se da en ambientes aeróbicos, y solo un 5-10 % de la
degradación se lleva a cabo bajo condiciones anaeróbicas (Coughlan y Mayer,
1992). Mientras que bacterias celulolíticas aeróbicas incluyen a representantes de
los géneros Cellulomonas, Cellovibrio, Cytophaga y Thermomonospora así como
del género Streptomyces (phylum Actinobacteria), entre las anaeróbicas están las
representadas por Acetovibrio, Bacteroides, Clostridium (phylum Firmicutes) y
Ruminococcus. Entre los hongos celulolíticos, se incluyen unos de los phyla As-
comycota (los géneros Chaetomiun y Trichoderma se encuentran entre los más
estudiados, a tal punto que se han caracterizado sus enzimas celulolíticas a nivel
transcripcional y proteómico), Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota
(sólo ciertos miembros del género Mucor presentan significativa actividad celu-
lolítica; Cooke y Whipps, 1993). Se han descripto también hongos anaeróbicos
celulolíticos, incluidos en el phylum Neocallimastigomycota, que están asociados
a la microflora del sistema digestivo de animales rumiantes. Diferentes microor-
-72-
ganismos eucariotas pertenecientes al phylum Oomycota (Reino Straminipila)

también degradan la celulosa. A pesar de los numerosos estudios sobre la degra-
dación microbiana de lignocelulosa, existen escasos datos sobre Archaea capaces
de atacar celulosa cristalina, destacándose unas hipertermófilas afines a Ignis-
phaera aggregans, Pyrobaculum islandicum y Thermofilum pendues (Gram et al.,
2011). No obstante, es difícil imaginar el rol de estos microorganismos conside-
rando que las condiciones extremas en las que desarrollan probablemente no tenga
relación estrecha con el crecimiento de plantas vasculares y el aporte al suelo de
lignocelulosa.
La degradación de la lignina ha sido estudiada con mayor énfasis en repre-
sentantes del phylum Basidiomycota que son los que más frecuentemente están
asociados a maderas, en los que se han descripto un número de enzimas oxidativas
(lacasa, LiP, MnP , VP) y mecanismos de ataque de la lignina (Martínez et al.,
2005; Jurado et al., 2011). Los hongos causantes de pudrición blanca de la madera
son degradadores agresivos debido a su capacidad para degradar lignina, hemice-
lulosa y celulosa, a menudo generando un material blanco enriquecido en celulosa.
Otros hongos asociados al ataque de la madera son los causantes de la pudrición
parda que desarrollan sobre maderas blandas y representan sólo el 7 % de los ba-
sidiomycetes degradadores de madera. Aunque ellos también pueden degradar po-
lisacáridos de la madera, solo modifican parcialmente la lignina, la cual torna a
un color pardo (lignina oxidada), que es una fuente potencial de compuestos aro-
máticos para la fracción estable de la materia orgánica de los suelos forestales
(sustancias húmicas). Un tercer grupo de hongos que atacan madera son los hon-
gos causantes de pudriciones blandas, son representantes del phylum Ascomycota
que hidrolizan sólo los polisacaridos accesibles pero no poseen sistemas enzimá-
ticos que alteren la estructura de la madera atacada. Este último tipo de pudrición
con frecuencia ocurre bajo un ambiente de elevada humedad relativa.
Muchos trabajos reportan los mecanismos involucrados en la degradación
de lignina por hongos causantes de pudrición blanca de la madera, las enzimas
que intervienen, y las condiciones que favorecen el proceso (Martínez et al., 2005).
Aunque las reacciones de las enzimas ligninolíticas con compuestos modelos de
lignina están bien caracterizadas, no está claro si estas enzimas puedan oxidar la
lignina polimérica nativa. Esto sugiere que otras reacciones podrían estar también
involucradas en el estado inicial de la despolimerización de lignina. En contraste
con los hongos causantes de pudrición blanca, que sintetizan un arsenal de enzimas
oxidativas extracelulares que despolimerizan lignina, los hongos causantes de la
pudrición parda solo hidrolizan la celulosa. La descomposición de lignina se ha
estudiado principalmente en hongos del phylum Basidiomycota causantes de pu-
driciones blancas sobre madera de árboles en pie, pero existen estudios que de-
-73-
muestran el potencial de otros hongos y bacterias de suelo y que viven en la ho-

jarasca o mantillo del bosque que metabolizan la lignina (Perestelo et al., 1999;
Saparrat et al., 2002: Tabla 1).
Tabla 1. Algunos microorganismos del suelo y hojarasca asociada involucrados en la transforma-

ción de lignina.
Taxa Estatus taxonómico Sustrato de aislamiento Referencias

Dominio Eucarya
Hojarasca en un
Agrocybe praecox Reino Fungi Steffen (2003)
espacio forestal
Phylum Basidiomycota
Dominio Bacteria
Taylor et al.
Bacteria T1 Phylum α-Proteobacteria Suelo forestal
(2012)
Orden Rhizobiales
Dominio Eucarya
Cylindrocarpon didy- Sedimento del fondo de un
Reino Fungi Bi et al. (2012)
mum curso de agua
Phylum Ascomycota
Dominio Eucarya
Material vegetal (Glycine Lozovaya et al.
Fusarium solani Reino Fungi
max) (2006)
Phylum Ascomycota
Dominio Eucarya
Hypocrea pachybasioi- Suelo de un bosque dominado
Reino Fungi Bi et al. (2012)
des con Picea abies
Phylum Ascomycota
Microbacterium Dominio Bacteria Taylor et al.
Suelo forestal
phyllosphaerae Phylum Actinobacteria (2012)
Ochrobactrum pseudo- Dominio Bacteria Taylor et al.
Suelo forestal
grignonense Phylum α-Proteobacteria (2012)
Dominio Eucarya
Suelo de un bosque dominado
Penicillium canescens Reino Fungi Bi et al. (2012)
con Populus tremula
Phylum Ascomycota
Dominio Eucarya
Penicillium daleae Reino Fungi Bi et al. (2012)
con Populus tremula
Phylum Ascomycota
Dominio Eucarya
Penicillium thomii Reino Fungi Bi et al. (2012)
con Picea abies
Phylum Ascomycota
Dominio Eucarya
Phoma herbarum Reino Fungi Bi et al. (2012)
con Populus tremula
Phylum Ascomycota
Dominio Bacteria Taylor et al.
Sphingobacterium T2 Suelo forestal
Phylum Bacteroidetes (2012)
Dominio Eucarya Restos vegetales superficiales
Stropharia rugosoan-
Reino Fungi asociados a un suelo de pra- Steffen (2003)
nulata
Phylum Basidiomycota dera
-74-
En suelos de bosques en el horizonte superficial A, la hojarasca se encuentra

en contacto directo y asociada a hongos saprótrofos del Phylum Basidiomycota
productores de enzimas oxidativas, como los hongos causantes de pudrición
blanca, que contribuyen con la degradación de lignina en el suelo forestal (Bal-
drian, 2008). No obstante, la actividad ligninolítica de estos hongos de Basidiomy-
cota descomponedores de hojarasca es moderada comparada con la eficiencia
ligninolítica de los hongos causantes de pudrición blanca sobre madera (Steffen,
2003). Asimismo, se ha comprobado que hongos del phylum Ascomycota y sus
anamorfos también poseen la habilidad para degradar lignina, aunque en menor
grado que los hongos de la pudrición blanca, ya sea como fuente de C (asimila-
ción) como bajo condiciones de cometabolismo (Rodríguez et al., 1994; Bi et al.,
2012). La asimilación de carbono consiste en incorporarlo a la biomasa microbiana
(Guggenberger, 2005), el cometabolismo es definido como la transformación de
un compuesto llamado co-sustrato en presencia de un sustrato asimilable (García
Rivero y Peralta-Pérez, 2008). Mientras que la celulosa es una fuente de carbono
y energía asimilada por los microorganismos, la degradación de lignina provocada
por hongos de la pudrición blanca es considerada un proceso cometabólico. Sin
embargo, en numerosos estudios se ha demostrado la habilidad de diferentes bac-
terias y hongos (no basidiomicetaceos) de utilizar lignina como fuente de carbono
y energía, si bien la ineficiencia del proceso hace que el incremento de biomasa
de estos microorganismos sea reducido (Saparrat et al., 2002). Basado en el mo-
delo de Berg y Staaf (1980), la degradación de lignina en la hojarasca sólo es im-
portante en un estado avanzado de descomposición (cuando no hay disponibilidad
de sustratos carbonados fácilmente asimilables) comparado a la etapa inicial de
degradación de la hojarasca en el suelo donde la pérdida de masa es controlada
por compuestos solubles y celulosa expuesta. No obstante, Klotzbucher et al.
(2011) recientemente reportaron que la degradación de lignina de diferentes ho-
jarascas en los suelos depende fuertemente del aporte continuo de fuentes de car-
bono y energía fácilmente disponibles, los cuales son clave en la ligninólisis. Por
lo tanto, adicionales estudios son necesarios para concluir bajo qué situaciones
los microorganismos del suelo utilizan lignina y si esto tiene significancia en el
porcentaje de materia orgánica mineralizada. Aunque la degradación de lignina
por bacterias y hongos anamorfos es limitada, su contribución podría ser impor-
tante debido a la abundancia que estos microorganismos tienen en los suelos y la
hojarasca asociada (Kirk y Farrell, 1987), probablemente a través de la actividad
de consorcios microbianos (Steffen, 2003). Se ha descripto la existencia de bac-
terias del suelo que metabolizan lignina; la mayoría correspondientes al grupo de
Actinobacteria, α-Proteobacteria y γ-Proteobacteria (Bugg et al., 2011; Taylor et
al., 2012). Estos grupos bacterianos suelen estar presentes en los sistemas diges-
-75-
tivos de termites e insectos que infectan (atacan) madera. Estas bacterias despoli-
merizan lignina Kraft de alta y baja masa molecular, y producen a partir de ligno-
celulosa de trigo metabolitos de la ruta catabólica de compuestos aromáticos como
el ácido oxálico y el ácido protocatéquico. La actividad ligninolítica de algunas
bacterias fue mayor en presencia de peróxido de hidrógeno, por lo que se ha aso-
ciado a las peroxidasas extracelulares con el proceso, si bien otras bacterias atacan
lignina sin agregar peróxido de hidrógeno, lo que sugiere la produccion de peró-
xido de hidrógeno in-situ y/o la presencia de sistemas enzimáticos tipo lacasa
(Taylor et al., 2012). Las evidencias que sustentan la habilidad bacteriana para
metabolizar lignina son:
1. el crecimiento de los aislamientos sobre medios minimos conteniendo
lignina Kraft fraccionada por tamaño como única fuente de carbono;
2. la despolimerizacion de lignina Kraft de alta masa molecular y la gene-
ración consecuente de productos de baja masa molecular;
3. la detección de metabolitos específicos de baja masa molecular, cuyas
estructuras son consistentes con rutas de degradacion de fragmentos modelos de
lignina; y
4. la actividad de degradacion usando diferentes preparaciones de lignina,
tal como la lignina nitratada y lignina Kraft.
Si bien ciertas enzimas de bacterias que degradan lignina han sido identifi-
cadas y caracterizadas con sustratos modelos, resta conocer cuales son los proce-
sos/mecanismos de la degradación bacteriana de la lignina y sus fragmentos
oxidados. Además se deben identificar con precisión los pasos de las vías catabó-
licas involucradas, ya que el conocimiento actual sólo es inferido a partir de los
datos obtenidos en experimentos con compuestos modelo de la lignina que son
simples (no poliméricos) y que presentan unicamente un enlace representativo
(Taylor et al., 2012).
Degradación in-vitro de hojarasca de Celtis ehrenbergiana y Scutia

buxifolia por anamorfos de Ascomycota: rol de los sistemas
enzimáticos lignocelulolíticos
La hojarasca de los bosques es muchas veces considerada un componente

del estrato F en suelos forestales y es uno de los principales aportes de lignocelu-
losa y C microbiano al suelo de esos ambientes (Kandeler et al., 2005). Entre los
microorganismos del suelo, los hongos cumplen un rol clave en la descomposición
y mineralización de la materia orgánica animal y vegetal, y por ello son respon-
sables de la fertilidad del suelo (Pfenning y Magalhães de Abreu, 2008). Ellos
constituyen el 75 % a 95 % del total de la biomasa microbiana y transforman la
-76-
hojarasca, rol que es más relevante que el de las bacterias, probablemente debido
a que el desarrollo miceliar permite explorar una mayor superficie (Kjoller y
Struve, 1982; Gaspar et al., 2001; Busso et al., 2008). Además, los hongos inter-
actúan en forma directa o indirecta con otros organismos, favoreciendo el des-
arrollo, la estabilidad y el control de los ecosistemas, incluido el suelo y sus
comunidades vegetales asociadas (Trape y Luoma, 1992).
Los “talares” son bosques nativos dominados por Celtis ehrenbergiana
(Klotzsch) Liebm. (Celtidaceae) y Scutia buxifolia Reissek (Rhamnaceae) del
Noreste de la Provincia de Buenos Aires (Argentina, Arturi, 1997). Estos repre-
sentan la principal comunidad boscosa nativa de la Región, cuya fisonomía res-
ponde a las propiedades de sus suelos tipo Rendol (alcalino-calcáreos, Arturi,
1997). Entre estas, en esta comunidad el pH del suelo puede alcanzar valores cer-
canos a 9, y por ello es un regulador de la actividad microbiana (Elíades et al.,
2010, 2011a,b; Saparrat et al., 2007, 2008, 2010). La hojarasca de C. ehrenber-
giana y S. buxifolia en estos bosques es el reservorio de nutrientes, incluyendo al
C, así como también de un amplio espectro de hongos saprótrofos (Allegrucci et
al., 2005, 2007). Numerosos trabajos han reportado recientemente sobre el estado
del arte de las comunidades de hongos asociados a los suelos y su hojarasca de
los talares de Magdalena, así como su contribución a la transformación de la ma-
teria organica (Allegrucci et al., 2003, 2009; Cabello y Arambarri, 2002; Crous et
al., 2005; Elíades et al., 2004, 2006, 2011a,b). Por ello, se ha estudiado la degra-
dación in-vitro de la hojarasca de ambas especies vegetales por hongos anamorfos
de Ascomycota y el rol de sus sistemas enzimáticos lignocelulolíticos. Entre los
resultados obtenidos, se identificaron propiedades fisico-químicas de la hojarasca
y actividades enzimáticas como herramientas diagnósticas de la degradación fun-
gica (Saparrat et al., 2008). Mientras que el pH, los azúcares reductores y los cro-
móforos revelaron ser parámetros indicadores confiables de la descomposición
de la hojarasca de C. ehrenbergiana y S. buxifolia, la degradación de la hojarasca
de S. buxifolia sólo se relacionó con los componentes enzimáticos celulolíticos:
celobiohidrolasa y β-1,4 endoglucanasa (Figura 5a,b). Sólo la actividad β-gluco-
sidasa, tercer componente del sistema celulolítico fúngico, estuvo asociada a la
degradación de la hojarasca de C. ehrenbergiana (Figura 5c; Saparrat et al., 2008).
Con respecto al componente ligninolítico, la actividad enzimática oxidativa no se
relacionó con el proceso de degradación (Figura 5d). Se caracterizó también el
potencial celulolítico de Ulocladium botrytis LPSC 813, un hongo aislado a partir
de la hojarasca de S. buxifolia, que produjo enzimas con actividad β-1,4 endoglu-
canasa que están involucradas con el proceso de degradación (Saparrat et al.,
2007).
-77-
Figura 5. Análisis de regresión entre la degradación fúngica de la hojarasca de C. ehrenbergiana y

S. buxifolia (expresada como reducción % de la masa del sustrato) y la actividad enzimática lig-
nocelulolítica: (a) celobiohidrolasa, (b) β-1,4-endoglucanasa, (c) β-glucosidasa, y (d) peroxidasa.
Se incluyen las significancias de la prueba F (p) y los coeficientes de determinación (R2). Se utili-
zaron triplicados de cultivos para cada aislamiento fúngico. Se definió una unidad de actividad
enzimática (U) como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de producto de reacción por minuto
bajo las condiciones de ensayo (Adaptado de Saparrat et al., 2008).
Ciliochorella buxifolia (anamorfo de Ascomycota, Allegrucci et al., 2011),

es un hongo frecuente en la hojarasca de S. buxifolia (Allegrucci et al., 2005). El
crecimiento de este hongo redujo la masa de la hojarasca en un 4,7 % a los 60
días de incubación, lo que fue acompañado de una disminución relativa en la in-
tensidad de las bandas espectrales FTIR (espectroscopía infrarroja con transfor-
mación de Fourier) asociadas a polímeros de la pared celular del sustrato como
polisacáridos, lignina y proteínas. Paralelamente en las fracciones solubles aso-
ciadas a la hojarasca transformada por el hongo se observaron variaciones en los
niveles de amonio, azúcares reductores y pH respecto a aquellas correspondientes
a las muestras control sin inocular. Además se observaron incrementos en los ni-
veles de β-1,4 endoglucanasa acorde con la extensión de la degradación del sus-
trato, si bien no se detectó actividad oxidativa extracelular en el sustrato
-78-
transformado por el hongo. Los resultados sugieren una estrecha relación entre la
capacidad del hongo para metabolizar estos sustratos y su posible rol como colo-
nizador primario en la hojarasca de S. buxifolia (resultados inéditos y parciales en
Troncozo et al., 2008 y Saparrat et al., 2010). Adicionalmente, y en base a que C.
buxifolia aislamiento LPSC # 847 reveló actividad oxidativa extracelular sobre
cultivos agarizados suplementados con guaiacol y otros compuestos fenólicos, se
observaron incrementos significativos en los niveles de la actividad lacasa (resul-
tados inéditos y parciales en Troncozo et al., 2011). Además se analizó la capaci-
dad de hongos aislados de los suelos alcalino-calcáreos y neutros de los bosques
de C. ehrenbergiana y S. buxifolia así como de hongos asociados a los suelos al-
calino-sódicos cubiertos de Distichlis spicata en el este de la provincia de Buenos
Aires (Reserva Biosfera ‘‘Parque Costero del Sur’’, Argentina) para crecer y pro-
ducir actividades del complejo celulolítico (actividad endo-glucanasa y β-gluco-
sidasa) sobre cultivos a pH 6,0 y 9,0 (Elíades et al., 2010, 2011a,b). Se observó
que la actividad de estos hongos y el pH del medio donde desarrollan están estre-
chamente relacionados. Estos resultados sugieren que estos hongos tienen meca-
nismos (aún desconocidos) que les permiten tolerar pH alcalinos. Puesto que las
enzimas sintetizadas por estos hongos tienen potencial de aplicación en diferentes
desarrollos tecnológicos (Elíades et al., 2011a,b; Jurado et al., 2011), futuros es-
tudios revelarán información sobre sus propiedades catalíticas y su factibilidad
como herramientas biotecnológicas.
Sustancias húmicas: precursores, su relación con la lignocelulosa y

procesos de estabilización de la materia orgánica
La materia orgánica del suelo representa un continuum que abarca desde

residuos alterados amorfos de la biota, en proceso de descomposición, exudados
radiculares, biomasa microbiana, biomoléculas como sustancias no húmicas y sus-
tancias húmicas. Convencionalmente, acorde al concepto clásico de la teoría del
polímero, se acepta que la materia orgánica del suelo consiste predominantemente
de sustancias húmicas (humus, 60-70 % de la materia orgánica del suelo), las que
son sintetizadas en un proceso llamado “humificación” del material orgánico.
Las sustancias no húmicas son compuestos orgánicos de estructura definida
como proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, y pequeñas moléculas tales como
azúcares y aminoácidos, siendo la mayoría de ellos fácilmente degradables y pue-
den ser utilizados como sustrato por microorganismos del suelo, de tal forma que
su existencia es transitoria.
Las sustancias húmicas son los constituyentes más activos de la materia or-
gánica del suelo en términos de sus funciones ambientales y agroecológicas (Al-
-79-
mendros, 2008a,b). Las sustancias húmicas afectan las propiedades físicas y quí-
micas del suelo y aumentan la fertilidad del mismo, porque intervienen en varios
ciclos biogeoquímicos que ocurren en el suelo. El efecto indirecto de las sustancias
húmicas sobre el crecimiento de las plantas consiste en el acomplejamiento de ca-
tiones y en el aumento de la biodisponibilidad a las plantas. Las sustancias húmicas
forman complejos sistemas húmico-metal que alteran la absorción de nutrientes
por la planta (García-Mina, 2000). Por otro lado, las sustancias húmicas interac-
túan con procesos metabólicos relacionados con el crecimiento de la planta como
la respiración y la síntesis proteica; así como por su actividad hormonal a través
de la inhibición de la actividad de la enzima ácido indol-acético (AIA)-oxidasa,
por lo que contribuirían a elevar los contenidos de ácido indol-acético en los teji-
dos y por lo tanto, estimular el crecimiento vegetal (Sánchez, 1999; Pizzeghello
et al., 2002). Otro elemento distintivo de las sustancias húmicas es su actividad
catalítica en las reacciones de hidrólisis y condensación (Klavins et al., 2001).
Las sustancias húmicas representan una clase de polímeros de alta masa molecular
de color amarillo a pardo oscuro o negro. Tienen un núcleo de tipo aromático y
un grupo de componentes alifáticos enriquecidos con nitrógeno heterocíclico, que
es estable bajo condiciones naturales. Estos componentes del humus, son quími-
camente indefinidos, siendo refractarios, complejos, heterogéneos, amorfos y po-
lidispersos, Estos se caracterizan por presentar variada masa molecular, multitud
de grupos funcionales, presencia de grupos oxigenados (carboxílicos, OH fenóli-
cos y enólicos, OH alcohólicos, y C=O de quinonas), alto contenido de grupos
ácidos (carboxílicos y fenólicos, principalmente) que le otorgan propiedades re-
guladoras del pH. Las sustancias húmicas tienen un mayor contenido de C y menor
de O que la mayoría de sus precursores. Su composición elemental se puede sin-
tetizar en: C, 45-55 %; H, 3-6 %; N, 1-5 %; O, 30-45 %; S, 0-1%. Además las
sustancias húmicas están estrechamente asociados con los constituyentes inorgá-
nicos de los suelos, a menudo formando agregados, lo cual explica su lenta mo-
dificación y/o mineralización. Todas estas características explican su resistencia
a la degradación y al ataque químico. No obstante, las sustancias húmicas son de-
finidas convencionalmente en tres categorías: ácidos húmicos (AH, fracción so-
luble en medio alcalino e insoluble en medio ácido), ácidos fúlvicos (AF, fracción
soluble tanto en medio alcalino como en medio ácido), y humina (material orgá-
nica insoluble en los residuos alcalinos).
La humificación es entendida como la serie de procesos por los cuales el
carbono de las sustancias orgánicas precursoras son transformadas y convertidas
en sustancias húmicas a través de procesos bioquímicos y abióticos (Figura 6).
-80-
Figura 6. Potenciales precursores de las sustancias húmicas y posibles mecanismos de síntesis.

Obsérvese que compuestos aminados de origen microbiano son considerados reaccionar con ligni-
nas modificadas (vía 4), quinonas (vías 2 y 3) y azúcares reductores (vía 1) para formar polímeros
complejos tipo-humus, adaptado de Sylvia et al. (2005).
La lignina y sus productos de transformación así como también polisacári-

dos, melanina, cutina, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, partículas finas de car-
bón, entre otros, son componentes importantes que participan del proceso. Se han
propuesto dos principales mecanismos del proceso de humificación, que pueden
estar interrelacionados, no ser exclusivos, e incluso ser convergentes (Almendros,
2008b): 1. uno que implica la alteración del material macromolecular preexistente
sin previa degradación; y 2. otro que consiste en la condensación de precursores
de baja masa molecular provenientes de la degradación de biomacromoléculas o
de la síntesis biológica. Dentro de los mecanismos de estabilización se pueden in-
cluso distinguir dos subtipos:
1.1. Alteración estructural progresiva de biomacromoléculas recalcitrantes
como lignina y biopoliésteres como cutinas y suberinas, o de origen microbiano
como los botriococanos, seguido de una reorganización estructural que es inducida
por los microorganismos, a lo que se conoce como reutilización microbiana, con
la posterior incorporación de productos conteniendo N y estructuras álcalis de ori-
-81-
gen microbiano. Estas alteraciones prevalecen en suelos con una actividad bioló-
gica baja y media y están relacionadas a los niveles de oxígeno molecular en el
ambiente.
1.2. Alteración de formas biosintéticas microbianas análogas a sustancias
húmicas como son las melaninas fúngicas que actúan como fuente de materia or-
gánica, las que además son también resistentes a la biodegradación.
Diferentes reacciones pueden también incluso diferenciarse en los procesos
de condensación:
2.1. Reacciones bioorgánicas a través de la biodegradación y condensación
en estructuras macromoleculares, como es el caso de la condensación enzimática
de compuestos generados durante la degradación de lignina y otros biopolímeros,
que incluye también la condensación de lixiviados y/o exudados de estructuras
vegetales (hojas y raíces) que además son favorecidos por la matriz de las enzimas
del suelo.
2.2. Reacciones de síntesis abióticas a partir de precursores aromáticos (fe-
noles) o alifáticos simples, que condensan con aminoácidos, formando productos
de alta masa molecular de color marrón del tipo catecol-glicina.
2.3. Síntesis de análogos de productos de Maillard vía la condensación de
aminoácidos y carbohidratos, como resultado de lo cual se forman macromolécu-
las heterogéneas. Este proceso ocurre en suelos y/o sedimentos en donde la materia
orgánica no se biodegrada rápidamente debido a bajas temperaturas, anegaciones
(falta de oxígeno molecular), oligotrofia o presencia de productos antimicrobianos.
También se forman abióticamente a través de la deshidratación de carbohidratos
en medios pobres en nitrógeno (pseudomelanoidinas). Además en situaciones ex-
tremas, como son los suelos afectados por incendios, procesos abióticos conducen
a una serie de partículas orgánicas carbonizadas progresivas que finalmente for-
man el llamado “carbón negro” (Guggenberger, 2005).
2.4. Otras reacciones consisten en la condensación abiótica de lípidos (áci-
dos grasos) insaturados que forman productos de alta masa molecular. Estas reac-
ciones involucran unas de foto-oxidación, donde la presencia de óxidos, arcillas
y otros catalizadores inorgánicos puede incrementar el envejecimiento fotoquí-
mico y la resinificación de lípidos y su asociación a sustancias húmicas preexis-
tentes, pudiendo incluso desarrollarse en suelos donde la actividad biológica está
limitada por la falta de agua (Almendros, 2008b).
Todo esto sugiere que las sustancias húmicas tienen un origen complejo y
una estructura macromolecular heterogénea que además es una función de los ma-
teriales de origen y las condiciones ambientales de los distintos suelos (Stevenson,
1982), siendo de importancia capital en la comprensión de la composición, carac-
terísticas, actividad y calidad del suelo y su fertilidad así como en el estudio de
los mecanismos de secuestro de C en el suelo.
-82-
Diferentes metodologías rigurosas y estandarizadas se han utilizado para la

caracterización de la humificación y las sustancias húmicas en el marco de la teoría
del polímero o modelo polimérico de estas sustancias. Entre éstas se pueden in-
cluir: ultracentrifugación, extracción en solución alcalina, identificación de es-
tructuras químicas y su relación con posibles precursores del C y O del humus en
base a mediciones del 13C y del 18O a través de estudios de espectroscopía de re-
sonancia magnética nuclear (RMN) y pirólisis-cromatografía gaseosa (Paul y
Clark, 1996). No obstante la aplicación y el desarrollo de nuevos procedimientos
y técnicas no resultan del todo consistentes con este modelo (Orsetti, 2010). Todo
esto condujo a un nuevo concepto de las sustancias húmicas como una asociación
supramolecular de un grupo relativamente pequeño de moléculas heterogéneas
que se ensamblan en si mismas por fuerzas débiles a valores de pH neutros (Pic-
colo, 2000). Entre las técnicas empleadas que evidencian este segundo modelo se
pueden mencionar: algunas de tipo no destructivas tales como unas técnicas es-
pectroscópicas transformadas, unas destructivas como de pirólisis, de ionización
suave, y también cromatográficas como la cromatografía de permeación en gel y
cromatografía de exclusión por tamaño de alta presión, cuya sigla en inglés es
HPSEC, así como electroforesis de capilar de alta resolución (HPCE). Entre los
aportes logrados, la HPSEC reveló que el tamaño aparente de fragmentos húmicos
cambia drásticamente con la adición de ácidos orgánicos simples comparado con
lo observado cuando se adiciona HCl como referencia. Además la HPCE separó
algunos tipos de compuestos suficientemente solubles en soluciones buffer acuo-
sas, ofreciendo la posibilidad de distinguir en las sustancias húmicas entre com-
puestos de alta y baja masa molar. En resumen, este segundo modelo considera a
las sustancias húmicas como una supermolécula, correspondiendo a un próximo
nivel de complejidad de la materia después de las partículas elementales, el núcleo,
el átomo y la molécula (Valdés Carmenate y Balbín Arias, 2002). Sobre la base
de esta teoría, las sustancias húmicas son agregados (asociaciones) supramolecu-
lares compuestos de diferentes números de monómeros (moléculas relativamente
pequeñas y químicamente diversas) individuales de origen microbiano y vegetal
con relativamente baja masa molecular, los cuales están asociados y forman un
agregado (cluster) unido por interacciones no covalentes tipo hidrofóbicas (aro-
máticas), de van der Waals, electrostáticas y puentes de hidrógeno. La organiza-
ción supramolecular de los sustancias húmicas explica más fielmente sus
parámetros tales como polidispersión, heterogeneidad, anfifilicidad, dinamicidad
y su habilidad de renovación. La similitud de las sustancias húmicas está princi-
palmente relacionada a los grupos similares de precursores en todos los ambientes,
y sus distinciones son debido a las diferencias de los componentes y sus combi-
naciones aleatorias. Por analogía con otros sistemas macromoleculares, tres nive-
-83-
les estructurales pueden ser diferenciados en sistemas húmicos (García-Mina,

2000): 1. Estructura primaria: correspondiente al orden lineal de los átomos y gru-
pos funcionales diferentes en las moléculas; 2. Estructura secundaria: correspon-
diente a la configuración molecular resultante de interacciones intramoleculares;
y 3. Estructura terciaria: correspondiente a la configuración molecular asociada
con interacciones intermoleculares. Bajo ciertas condiciones experimentales, es
también posible hablar de una estructura cuaternaria correspondiente a los agre-
gados macromoleculares. La habilidad para formar complejos, es decir, la forma-
ción de centros formadores de complejos con funcionalidad viable, está
directamente relacionada con las estructuras 2ria y 3ria del sistema húmico, lo
que está también influenciado por los cambios conformacionales asociados con
las variaciones en ciertas condiciones experimentales tales como pH, fuerza iónica,
temperatura y concentración. Sin embargo, adicional información utilizando di-
ferentes técnicas de avanzada (Semenov et al., 2013) sugiere que tanto el modelo
polimérico y el de la asociación supramolecular explican complementariamente
la naturaleza y características de las sustancias húmicas y sus propiedades en el
suelo (y en otros ambientes naturales). En este sentido, las sustancias húmicas se
definen como formas de polímeros macromoleculares y monómeros organizados
supramolecularmente, que presentan algunas propiedades de supraestructuras y
que están asociados en agregados, los que a la vez pueden unirse a través de en-
laces covalentes entre monómeros de supramoléculas (Semenov et al., 2013). Por
lo tanto, y en base a este concepto dual, todas los biomoléculas, incluyendo aque-
llas consideradas previamente como sustancias no húmicas, que no pueden ser se-
paradas sin significantes cambios en la estructura de la supramolécula y en las
propiedades químicas de su fracción húmica, formarían parte de las sustancias hú-
micas (Semenov et al., 2013). Esto sugiere la utilización del término de estabili-
zación de la materia orgánica en reemplazo al término de humificación, siendo
definido como un proceso de tres etapas, el cual incluye la degradación de la ma-
teria orgánica original, la agregación de los productos de degradación y la des-
composición de los productos de agregación. Además la estabilización de la
materia orgánica, que implica procesos que incrementan su resistencia en el suelo,
es controlada por un rango más amplio de mecanismos físicos, químicos y bioló-
gicos comparados con la humificación. Futuros estudios contribuirán al avance
del conocimiento de la génesis de la materia orgánica estabilizada en el suelo, los
mecanismos involucrados y sus principales precursores, lo que acorde al constante
desarrollo de técnicas y la optimización de procedimientos analíticos, definirá con
mayor precisión la naturaleza de las “sustancias húmicas” y sus propiedades.
-84-
Perspectivas futuras
La lignocelulosa es uno de los componentes clave del carbono en el suelo

y es una fuente de energía para un amplio espectro de microorganismos que la de-
gradan y que de esta manera generan también estructuras precursoras de las sus-
tancia húmicas a través de reacciones que estabilizan la materia orgánica.
Muchos trabajos asocian a la microbiota lignocelulolítica a diferentes tipos
de sustratos orgánicos en diversos ecosistemas, las enzimas que intervienen y las
condiciones que favorecen la degradación de celulosa y lignina. Los trabajos con
la micobiota asociada a los hojarasca de los bosques de Celtis ehrenbergiana y
Scutia buxifolia del Noreste de la Provincia de Buenos Aires (Argentina) mostra-
ron que hay una relación estrecha entre los componentes enzimáticos del sistema
celulolítico y además que la degradación depende del pH del suelo y del tipo de
sustrato carbonado. No obstante, aún resta identificar los mecanismos de los hon-
gos que toleran pHs alcalinos como los de los suelos donde se acumula la hoja-
rasca. Además es importante conocer si las características catalíticas de las
enzimas son compatibles con el ambiente donde se liberan y actuán. Estos estudios
son particularmente importantes debido a que estas enzimas actúan a pH alcalino,
lo que sugiere que estos organismos podrían cumplir roles en la transformación
de la materia orgánica pero además ser herramientas tecnológicas clave.
Si bien la degradación de la lignina llevada a cabo por bacterias y hongos
no basidiomicetaceos en el suelo es de baja intensidad, nuevos estudios brindarán
información clave sobre los aspectos básicos del proceso, que aún hoy están en
discusión. Por otro lado, esto revelará cuál es el rol de estos microorganismos en
el suelo y de que manera se relacionan con la génesis de fragmentos aromáticos
de bajo peso molecular que además suministran como precursores la síntesis de
sustancias húmicas.
Acorde con la tendencia a un nuevo concepto sobre el origen de la materia
orgánica del suelo, y su estabilidad, la identificación de parámetros estructurales
y funcionales de las sustancias húmicas y la aplicación de modelos de consenso
para explicarlo dependen de las metodologías y las técnicas de estudio. El escla-
recimiento de los mecanismos y vías de síntesis de las sustancias húmicas estará
en función del conocimiento de las características de estas sustancias, lo que está
limitado a su vez por la complejidad y heterogeneidad de las sustancias húmicas.
La falta de una técnica experimental que genere por si sola una imagen clara de
la estructura de las sustancias húmicas, el uso de métodos complementarios pro-
porcionará un conocimiento más preciso. La identificación de los principales pro-
cesos de la síntesis de las sustancias húmicas y de las condiciones de génesis,
incluyendo el rol de los microorganismos y los productos que se generan como
-85-
resultado de la transformación de la lignocelulosa, dará un papel diagnóstico del

funcionamiento del suelo y su impacto en la producción vegetal asociada, lo que
es fundamental al estudiar los sistemas afectados por la actividad humana.
Agradecimientos
M. C. N. Saparrat es investigador del CONICET. A. Bárcena es becaria de

la CICBA. P. A. Balatti es investigador de la CICBA. Este trabajo se realizó con
fondos del CONICET (PIP 112-200801-01422, PIP 112 201101 00391), CICBA,
UNLP, Argentina.
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Mineralización de Nitrógeno del suelo: potencial
de mineralización. Factores relacionados
con el potencial de mineralización
Soil Nitrogen Mineralization: Potential Nitrogen Mineralizaton –

Factors Related to Potential Nitrogen Mineralization
Benintende, María C.a*, Silvia M. Benintendeb
Resumen
Las variables de manejo como el sistema de labranza, y las rotaciones de

pasturas con diferentes cultivos afectan, de acuerdo a lo esperado, el potencial de
mineralización de N del suelo. Esto es, una técnica que produzca un efecto menos
destructivo o rehabilitador en el suelo, se refleja en la capacidad de mineralización
de N. Pero la magnitud del efecto no es siempre la que cabría suponer. Así por
ejemplo los años de pastura o el sistema de labranza utilizado son afectados a su
vez por múltiples variables (estado y productividad de la pastura, forma de im-
plementación del sistema de labranza, etc) que inciden en el resultado obtenido.
A partir de los datos de N potencialemente mineralizable es posible estimar la can-
tidad de N que se mineraliza a campo, realizando ajustes por temperatura y hu-
medad del suelo.La mayor proporción del total de N mineralizado en el perfil (casi
el 50%). se encuentra en el horizonte superficial, donde generalmente se desarro-
llan gran parte de las raíces de los cultivos. Pero el aporte de los horizontes sub-
superficiales debería ser considerado, especialmente en casos que éstos
permanecen durante periodos importantes con mayor contenido de humedad.
Palabras clave: N mineralizable, potencial de mineralización,
Introducción
Para la determinación de la dosis de fertilizante nitrogenado necesario para

satisfacer los requerimientos de un cultivo en general no se tienen en cuenta las
diferencias en la tasa de mineralización del N orgánico que existen entre sitios.
Tecnología de Tierras, bMicrobiología Agrícola. Fac. Cs. Agropecuarias UNER. CC 24 CP 3100

a
Paraná Entre Ríos (Argentina). Mail: crisben@fca.uner.edu.ar
-93-
En consecuencia, se pueden aplicar dosis excesivas en algunas situaciones y dosis

muy bajas que no proveen el N requerido por el cultivo en otras. Por esto, es ne-
cesario ajustar la dosis de fertilización nitrogenada de acuerdo al aporte por mi-
neralización de compuestos orgánicos del suelo para lograr un uso eficiente del N
y a la vez evitar contaminaciones (Aldrich 1984, Cabrera et al. 1994).
Se han desarrollado diversos métodos para estimar la cantidad de N que se
mineralizará durante el ciclo de los cultivos y las tasas a las que este proceso ocu-
rre, o sea, la capacidad de aporte de N de un suelo determinado (Stanford, Smith
1972; Oyanedel, Rodríguez 1977; Stanford 1982 ).
El método propuesto por Stanford y Smith (1972) permite estimar el po-
tencial de mineralización de N del suelo (N0) que se deriva del N mineralizado
acumulado en 4, 8, 12, 16 y 20 semanas de incubación. La cantidad acumulada
de N mineralizado en estas incubaciones se utiliza para ajustar un modelo de la
forma
Nmin = N0 (1- e –kt)
En el que Nmin es la cantidad de N mineralizada en el tiempo t, N0 es el

N potencialmente mineralizable, y k es la tasa de mineralización. Stanford y Smith
(1972) así como Oyanedel y Rodríguez (1977) concluyeron que es posible usar
un valor constante para la tasa de mineralización (k) en distintos suelos. De
acuerdo con esto, sólo sería necesario estimar el valor de N0 a fin de poder pre-
decir la cantidad de N mineralizado bajo condiciones de campo.
Numerosos trabajos de investigación han demostrado que hay varios fac-
tores que pueden afectar el N0 del suelo, la cantidad total de N orgánico del suelo
que es susceptible de ser mineralizado.
La mineralización del N está relacionada con una fracción activa de este
elemento y no con el N total (Campbell et al. 1981). Representa una proporción
importante de la cantidad requerida por un cultivo. (Cabrera et al. 1994).
Lo que hace que la técnica de Stanford sea adecuada para medir la fracción
de No, es que se basa en la utilización de los conceptos biológicos básicos que
hacen que la misma sea la mejor y la menos empírica para estimar el suministro
de N de los suelos (Campbell et al., 1981).
Una vez estimado el No, el valor se afecta por factores de temperatura y
humedad a campo durante el ciclo de desarrollo de un cultivo, a fin de estimar el
N que efectivamente se mineralizaría en ese período, valor que hemos denominado
Nm.
-94-
Mineralización de Nitrógeno del suelo ...
Variaciones de la capacidad de mineralización de

nitrógeno en relación al tipo y manejo de suelos
El N orgánico del suelo está formado por un pool húmico o pasivo que cons-
tituye entre un 80 a un 90 % del N orgánico, un pool orgánico estabilizado y un
pool orgánico lábil que constituyen del 10 al 20 % (Rodríguez 1993). La minera-
lización a partir de la fracción húmica es pequeña por lo que se la considera un
pool pasivo. La mineralización que aumenta los contenidos de N mineral durante
el ciclo de un cultivo está vinculada al N orgánico lábil y en menor medida al N
orgánico estabilizado (Rodríguez 1993, Frioni 1999).
Efecto del tipo de suelos

El equipo de trabajo del Proyecto de Investigación sobre N de la FCA -
UNER ha realizado determinaciones de N0 en muestras superficiales compuestas
de suelos correspondientes a dos órdenes diferentes Molisoles y Vertisoles. En
Molisoles se trabajó con suelos pertenecientes a los subgrupos Argiudoles ácuicos
y Argiudoles vérticos. Los primeros se desarrollan sobre un manto de loess de
mayor espesor que en los últimos. Por otra parte, el paisaje en que se encuentran
los Argiudoles ácuicos es un paisaje de pendientes más pronunciadas y cortas que
los segundos. Esto les confiere características diferentes, pese a pertenecer al
mismo orden, en especial las relacionadas a la susceptibilidad a la erosión hídrica.
Como resultado de ello, es común encontrar diferentes grados de erosión en rela-
ción al uso y manejo al que han sido sometidos.
Tabla 1. C orgánico, N total y N potencialmente mineralizable en suelos de la Provincia de Entre
Ríos
Suelo Carbono orgánico (%) Nitrógeno total (%) N0 (mg.kg-1)
Vertisol (Peluderte árgico) 2,60 0,161 195
Molisol (Argiudol ácuico) 1,89 0,164 136
Molisol. (Argiudol vértico) 1,87 0,170 104
Para este grupo de suelos el N0 representó entre el 6,3 y el 12 % del N total,

sin diferencias entre órdenes.
-95-
Efecto de las labranzas

Los factores que alteran las condiciones de equilibrio de los ecosistemas tien-
den a provocar modificaciones en las propiedades de los suelos, entre las cuales
merecen especial atención las que se producen sobre las condiciones biológicas. Las
alteraciones de los procesos en los cuales la población microbiana está involucrada,
principalmente la descomposición de residuos orgánicos y la dinámica de los nu-
trientes del suelo, inciden en su productividad agrícola (García, Morón 1992).
Una de las alteraciones que provoca consecuencias más drásticas sobre el
suelo, es la aplicación de diversos sistemas de labranzas, los que tienen efectos
ecológicos fundamentalmente relacionados a la aireación, régimen térmico, eco-
nomía hídrica, distribución, calidad de residuos, etc., cuya sumatoria afecta la fer-
tilidad del suelo y particularmente la fertilidad nitrogenada. Pilatti y colaboradores
(1988) en un trabajo en el que analizaron comparaciones entre sistemas de laboreo,
concluyeron que el que incluía arado de rejas y vertederas fue el que provocaba
mayor deterioro físico, químico y biológico del suelo. Las labores primarias y se-
cundarias incrementaron la disponibilidad de nutrientes para las plantas como con-
secuencia de una mayor exposición de la materia orgánica a la acción de
mineralización.
Los niveles de materia orgánica del suelo son altamente dependientes de
los sistemas de manejo, especialmente de aquellos que involucran la utilización
de los residuos, la rotación y el laboreo. La descomposición de los residuos vege-
tales depende de su incorporación o no al suelo lo que se vincula fuertemente al
sistema de laboreo del suelo; cuando quedan en superficie, la fracción de C que
se descompone rápidamente representa solo un 60 % de la fracción que se des-
compone cuando éstos son mezclados con el suelo, para las condiciones de estu-
dio de Cordone y colaboradores (1996).
Benintende y colaboradores (1995) trabajando sobre un ensayo de labranza
de la EEA Paraná INTA de 10 años en un suelo Argiudol ácuico encontraron di-
ferencias por efecto de las labranzas en dos secuencias de cultivo.
Tabla 2. C orgánico, N total, y N mineralizado acumulado, bajo distintos sistemas de labores o en

monocultivo de maíz y en secuencia trigo/soja – maíz
N min. ac.
Tratamientos C org (%) N tot. (%)
(mg.kg-1)
Reja 1,84 a 0,147 b 76 a
Monocultivo de maíz Cincel 2,24 a 0,157 b 103 a
S directa 2,44 a 0,197 a 121 a
Reja 1,75 b 0,141 c 49 b
Secuencia Tr/S. - Maíz Cincel 2,00 ab 0,154 b 101 a
S directa 2,13 a 0,177 a 104 a
Nota: N min ac = N acumulado resultado de las incubaciones aeróbicas de largo plazo.

-96-
Los valores que se presentan en la tabla 2 corroboran lo expresado por Hein

(1981) acerca de que los sistemas de labranza conservacionista producen una
menor caída de los niveles de materia orgánica. Independientemente de la secuen-
cia evaluada, los sistemas conservacionistas permiten al suelo sustentar una masa
mayor de microorganismos y tienen una capacidad de mineralizar mayor conte-
nido de N y así suministrar más nutrientes a los cultivos. Crespo y colaboradores
(2001), en un ensayo de labranzas de la Unidad Integrada INTA- Fac. de Ciencias
Agrarias UNMdelP (Balcarce provincia de Buenos Aires), que contaba con 5 años
de aplicación, encontraron resultados similares. En siembra directa el N minera-
lizable fue superior en un 52 % al del sistema de labranza convencional.
En otro trabajo realizado sobre un suelo Argiudol vértico de Entre Ríos,
Benintende y colaboradores (2000) compararon sistemas: labranza convencional
y siembra directa con solo 2 años de aplicación, con una situación de equilibrio:
campo natural. Los resultados de N min ac fueron de 170 (b); 220 (a) y 233 (a)
mg N kg-1 de suelo respectivamente. Las letras representan diferencias significa-
tivas p≤ 0.05. En la Figura 1 se presenta la evolución del N mineralizado en el
tiempo de incubaciones para las tres situaciones evaluadas. Se presenta además
el ajuste de cada una de las curvas a un modelo polinómico.
Figura 1. N mineralizado acumulado en incubaciones aeróbicas de largo plazo en sistemas de ma-

nejo.
Las tres situaciones presentaron una cantidad de N inicial similar, pero a

las dos semanas de incubación comenzaron a diferenciarse. Esta diferenciación
se hizo más importante al cabo de cuatro meses. En este lapso, el N mineralizado
en la muestra proveniente de labranza convencional representó un 75 % de campo
natural, en tanto que en siembra directa la proporción fue de 94 %. El N minera-
lizado acumulado en 4 meses representó alrededor de un 10 % del contenido de
N total de las muestras.
-97-
Efecto de las rotaciones

Durante el período agrícola de la rotación se producen variaciones en el ré-
gimen hídrico, en el tenor de oxigenación de la atmosfera edáfica y en la tempe-
ratura del suelo más importantes que en el período de desarrollo de las pasturas,
generando una aceleración de la mineralización de la materia orgánica, especial-
mente si se utilizan sistemas de laboreo que provocan perturbaciones del horizonte
superficial. En cambio la población de microorganismos del suelo, mayoritaria-
mente heterótrofos, se ve beneficiada durante el período de producción de las pas-
turas por un aporte continuo de exudados radicales, raicillas muertas, y restos de
parte aérea. Por lo tanto es de esperar que también la capacidad de mineralización
de un suelo se vaya incrementando con los años de pastura en la rotación. Estos
efectos recuperadores de las condiciones el suelo dependen de variables propias
de la pastura, asociadas al aporte de restos vegetales que provocan un incremento
de la materia orgánica. La aplicación de fertilizantes también ejerce un efecto po-
sitivo ya que aumenta la productividad de las pasturas y por lo tanto es mayor la
cantidad de material vegetal incorporado (Benintende, Benintende 1995). Rizzali
y colaboradores (1984) encontraron que tanto la masa de microorganismos del
suelo como la capacidad de mineralización era mayor cuando se trataba de una
pastura que en caso de un barbecho prolongado. Los valores de N0 encontrados
por estos autores fueron de 308 en la pastura y de 192 en el barbecho. Hein (1981)
observó que tanto los parámetros físicos y químicos como los biológicos reflejaban
el mejoramiento que se produce en los suelos con pasturas y el deterioro ocasio-
nado por la agricultura continua. Esta autora, trabajando con suelos Argiudoles
de la provincia de Córdoba, encontró una producción máxima de nitratos en con-
diciones de incubación para suelos con alfalfa, siguiendo en orden decreciente los
de agricultura y finalmente los de cultivo de achicoria.
Benintende y colaboradores (2000) evaluaron el efecto de las pasturas, entre
otras variables, sobre la capacidad de mineralización de N del suelo.
Figura 2. N mineralizado acumulado en incubaciones aeróbicas de largo plazo en campo natural,

agricultura y praderas de 2 y 4 años.
-98-
Para una pradera de 2 años, el N mineralizado acumulado no difirió del re-

gistrado en el uso agrícola (aproximadamente el 65% del valor de N mineralizado
acumulado en 18 semanas). La pradera de 4 años presentó un resultado algo mayor
y alcanzó el 86% del campo natural.
Marzoratti y otros (1999) evaluaron el efecto de los años de praderas en 3
establecimientos ubicados sobre suelos Vertisoles de la provincia de Entre Ríos.
En la tabla 3 se presentan valores de N0.
Tabla 3. Nitrógeno potencialmente mineralizable en pasturas y campo natural
Situación N0 (mg.kg-1)
Prad 1 año 142

Prad 2 años 155
Establecimiento 1
Prad 3 años 130
Campo Natural 220
Prad 1 año 151
Prad 2 años 154
Establecimiento 2 Prad 3 años 177
Prad 4 años 180
Campo Natural 223
Prad 2 años 168
Prad 3 años 171
Establecimiento 3 Prad 4 años 176
Prad 5 años 180
Campo Natural 185
En los datos presentados se destaca el efecto recuperador de las pasturas en

los establecimientos 2 y 3. Este efecto no se observa en el establecimiento 1 en el
que la pradera se caracterizaba por presentar malezas y una baja población de es-
pecies forrajeras que permitieran la recuperación del suelo. Benintende y colabo-
radores (2000) evaluaron la aplicación de dos sistemas de uso de la tierra
habituales de la Provincia de Entre Ríos en un suelo Peluderte árgico. Estos suelos
se caracterizan por tener altos contenidos de arcilla desde el horizonte superficial.
Esta característica favorece la formación de complejos arcillo – húmicos que le
confieren alta estabilidad a la materia orgánica. Una de las situaciones muestreadas
es un sistema de 2 años de cultivo de arroz y 2 de descanso, otra es de 2 años de
arroz seguido de pastura y la tercera un campo natural.
El N min acumulado fue de 320 mg N kg suelo-1 en el campo natural, de
240 en arroz - descanso y 250 mg N kg suelo-1 en la rotación arroz con pasturas.
-99-
Del análisis de los resultados, se puede deducir que los dos sistemas de uso
tuvieron efecto similar sobre el N mineralizado acumulado, tal como puede verse
en la figura 3 alcanzando valores de N mineralizado acumulado del orden del
70% del que se alcanza en el campo natural.
Figura 3. N mineralizado acumulado en incubaciones aeróbicas de largo plazo en campo natural,

y sistemas de uso arroz pastura y arroz – descanso.
Resulta evidente que un período de 2 años de pastura no resulta suficiente

para recomponer las condiciones biológicas en un sistema que incluye el cultivo
de arroz.
Estimación del nitrógeno mineralizado en condiciones

de campo a partir del N0
Ajuste por Temperatura y Humedad
En condiciones de campo la mineralización del N va a estar controlada por
2 factores, fundamentalmente la temperatura y humedad del suelo, que varían
según el clima, tipo de suelo y el ciclo de desarrollo de los cultivos. (Oyanedel,
Rodríguez 1977).
La tasa de mineralización del N está influenciada por la temperatura del
suelo dentro del rango encontrado bajo condiciones de campo. La mineralización
prácticamente cesa a 0 °C y por encima de 45 °C, aunque continúa la amonifica-
ción, la nitrificación se detiene. Por lo que se considera el rango de 0 °C a 35 °C
como el de mayor interés biológico. (Stanford et al. 1973).
Según Stanford y colaboradores (1973), la temperatura del suelo actuaría
sobre la intensidad de mineralización (k), y la relación entre ambas variables es-
taría dada por la siguiente ecuación:
-100-
k = exp 2,3 (7,71 – 2758 / T)
Donde:
k = intensidad de mineralización
T = temperatura absoluta (°K)
Por otro lado, el N mineralizado en condiciones de campo varía de acuerdo

al contenido de humedad relativo (q / q0).
Según Cavalli y Rodríguez (1975), la mineralización del N es lineal en el
rango comprendido entre el punto de marchitez permanente y la humedad óptima
para la mineralización, definida por la ecuación:
Nt = - 13,8 + 1,11 q / q0
Donde:
Nt = mineralización relativa de N (%)
q / q0 = contenido relativo de humedad (%)
Este hecho se explica por el aumento en el contenido y la disponibilidad de

agua, lo que permite una mayor actividad microbiana. A su vez, contenidos de
agua superiores al óptimo disminuyen la mineralización, posiblemente debido a
desnitrificación y a una disminución de la actividad microbiana aeróbica (Cavalli,
Rodríguez 1975).
La obtención de un modelo de mineralización aplicable a condiciones de
campo que se base en la utilización de la estimación en condiciones potenciales
debe incluir factores de corrección tales como temperatura y disponibilidad de
agua, debido a que en condiciones de laboratorio se determinan tasas de minera-
lización próximas al óptimo, a diferencia de las imperantes a campo.
Por lo tanto, el N mineralizado en condiciones de campo (Nm) como fun-
ción de la temperatura del suelo, humedad y potencial de mineralización sería, de
acuerdo a Oyanedel y Rodríguez (1977):
Nm = N0 exp. 2,3 (7,71 – 2758/T) * (1,11 q/q0 – 0,138)
Donde:
Nm = N mineralizado.
N0 = N potencialmente mineralizable.
T = temperatura edáfica en grados Kelvin. (°K)
q = contenido volumétrico de agua.
q0 = contenido volumétrico de agua óptimo para la mineralización. (0,7 atm.)
-101-
De esta manera, la cuantificación del No, a través de la metodología pro-

puesta por Stanford y Smith (1972), permite estimar el N mineralizado en condi-
ciones de campo, corrigiendo los valores obtenidos por factores de temperatura y
humedad y, en consecuencia, el N que se mineralizó durante el período de des-
arrollo de un determinado cultivo. Se puede establecer el suministro de N del suelo
y estimar el déficit que se produce en los requerimientos de N durante el ciclo del
cultivo. Esto proporciona una información útil para la práctica de fertilización ni-
trogenada, tanto en los aspectos de las dosis de N a aplicar como en la época de
aplicación del mismo.
N mineralizado en condiciones de campo

La cantidad de N que se mineraliza durante el ciclo de diferentes cultivos
depende del N0 y de las condiciones ambientales, fundamentalmente temperatura
y humedad edáfica.
Estimaciones de cantidades de N mineralizado durante el ciclo de un cultivo
de maíz variaron entre 13 y 131 kg. N.ha-1 en Nebraska (Saint-Fort et al., 1990,
citado por Cabrera 2000) y entre 50 y 123 kg. N.ha-1 en Japón (Saito, Ishii, 1987,
citado por Cabrera 2000).
El equipo de trabajo en investigaciones sobre el N de la FCA- UNER (in-
édito) trabajando en un suelo Argiudol ácuico con un N0 de 182 mg kg-1 suelo,
durante el ciclo de un cultivo de maíz en el que las temperaturas del suelo en el
horizonte superficial oscilaron entre 16 y 28ºC y la humedad entre el 72 y el 99%
de la óptima para el proceso de mineralización, estimó que el N mineralizado a
campo en ese período fue de 112 kg. N.ha-1.
Otras estimaciones realizadas por el mismo equipo durante el ciclo de un
cultivo de lino en un suelo Argiudol vértico fue de 63 kg. N.ha-1 en el horizonte
superficial. En este caso el N0 fue de 153 mg kg-1 suelo, las temperaturas del suelo
a esa profundidad oscilaron entre 12 y 24 ºC y la humedad entre el 80 y el 99%
de la óptima para el proceso de mineralización.
Para el período de desarrollo de un cultivo de trigo en un suelo Argiudol
vértico se estimó una mineralización de 54 kg. N.ha-1 en el horizonte superficial.
El N0 fue de 104 mg kg-1 suelo, las temperaturas del suelo a esa profundidad os-
cilaron entre 14 y 22 ºC y la humedad entre el 70 y el 88% de la óptima para el
proceso de mineralización. Para el mismo cultivo, en un suelo Peluderte argiudó-
lico con No de 151 mg kg-1 suelo, con temperaturas del suelo que oscilaron entre
11 y 24 ºC y la humedad entre el 25% y la óptima para el proceso de mineraliza-
ción, estimaron una mineralización de 55 kg. N.ha-1
En un Argiudol vértico con No de 201,4 mg kg-1 se corrió el modelo de
Oyanedel y Rodríguez (1977) para dos niveles de humedad probables durante el
ciclo del cultivo de trigo con medias históricas de temperatura del suelo. En el
-102-
primer caso se supuso una humedad de suelo relativa del 50% de la óptima para
el proceso de mineralización y se estimó una mineralización de 97 kg. N.ha-1. Para
una humedad del 80% de la óptima, se mineralizarían 174 kg. N.ha-1 en el mismo
período.
Cabrera (2000) cita estimaciones de N mineralizado realizadas por Camp-
bell en suelos de Canadá que van de 52 kg. N.ha-1 en cultivo de secano a 81 kg.
N.ha-1 en cultivos bajo riego.
El equipo de trabajo en investigaciones sobre el N de la FCA- UNER (in-
édito) trabajando en un suelo Argiudol ácuico encontró que la diferencia de tem-
peratura del suelo en el horizonte superficial por efecto de las labranzas,
comparado con siembra directa durante un período de barbecho de 5 meses, se
mantuvo en 2ºC. Esta diferencia de temperatura a favor de la situación laboreada,
produjo una diferencia de 22 kg. N.ha-1
Estos resultados muestran una amplia variación en las estimaciones y que
en muchos casos el N mineralizado a partir de la materia orgánica representa una
proporción importante de la cantidad requerida por los cultivos.(Cabrera 2000).
Aporte de nitrógeno de los horizontes subsuperficiales.

La capacidad de mineralización de los distintos horizontes en un perfil de
suelo presenta diferencias importantes. El N orgánico del suelo disminuye con la
profundidad (Darwich 1990) por lo que es esperable que ocurra lo mismo con el
N mineralizable.
Borgetto y otros (1994), realizaron incubaciones aeróbicas de muestras de
los horizontes de dos perfiles de suelo. En el primer caso se trató de un Molisol
(Argiudol ácuico) similar a la serie Tezanos Pinto. (Plan mapa de suelos, 1991) y
en el otro de un Vertisol (Cromuderte árgico) similar a la serie Febre (Plan mapa
de suelos, 1991).
Los resultados encontrados junto a las principales características de cada
horizonte se presentan en las tablas 4 y 5.
Tabla 4.Tezanos Pinto: No y k por horizonte.
Horizontes Espesor (cm) Arcilla (%) MO (%) N tot.(%) N0(mg.kg-1) k
Ap 17 28 2,65 0,154 187 0,0596
B21 17 42 1,53 0,111 76 0,1060
B22 29 35 1,03 0,075 60 0,0945
B3 41 31 0,69 0,057 37 0,3340
-103-
Tabla 4.Tezanos Pinto: No y k por horizonte.
Horizontes Espesor (cm) Arcilla (%) MO (%) N tot.(%) N0 (mg.kg-1) k

Ap 18 40 4,29 0,249 164 0,0505
B21 37 55 3,19 0,185 102 0,0459
B22ca 29 60 1,38 0,089 57 0,0658
B3ca 31 ND 0,60 0,044 47 0,4330
La dinámica de la mineralización durante el período de incubaciones de

este trabajo para los dos perfiles se presenta en las figuras 4 y 5.
Figura 4. N mineralizado acumulado en incubaciones de largo plazo Serie Tezanos Pinto.
Figura 5. N mineralizado acumulado en incubaciones de largo plazo Serie Febre.
Se encontró que el N potencialmente mineralizable disminuyó con la pro-

fundidad, en tanto que la intensidad de mineralización tendió a elevarse.
Es evidente la presencia de una mayor cantidad de compuestos orgánicos
nitrogenados en superficie lo que concuerda con los tenores de C orgánico y N
total en profundidad. Se observa alto grado de asociación entre estas variables:
No y C orgánico r = .983 en la serie Tezanos Pinto y r = .970 en la serie Febré. En
tanto que entre No y N total r = .947 para Tezanos Pinto y r = .972 para Febré.
-104-
La comparación entre los gráficos permite apreciar las diferencias en el pa-

trón de distribución de N mineralizado en los perfiles.
En el horizonte superficial el N0 representó el 12 % del N total en Tezanos
Pinto y el 6,6% en Febre. En los horizontes inferiores la proporción fue menor
excepto en el horizonte B3 de la serie Febré.
Los valores de la intensidad de mineralización (k) fueron similares para
ambos tipos de suelo, lo que probablemente indica una fuente de N mineralizable
similar e independiente del manejo y del origen de los suelos.
El valor promedio de intensidad de mineralización del horizonte superficial
fue de 0,0596 para la serie Tezanos Pinto, lo que indica que a 35 ºC el No se mi-
neraliza a una tasa de 5,9% por semana.
Stanford y Smith (1972) para una amplia gama de suelos de USA encon-
traron una tasa de 0,054 +/- 0,009, y Oyanedel y Rodríguez (1977) encontraron
una intensidad de mineralización promedio de 0,058 +/- 0,01 en suelos de Chile.
Hadas y otros (1986) encontraron que el No diminuía en profundidad y nin-
gún efecto consistente del la profundidad sobre la tasa de mineralización.
Echeverría y colaboradores (1994) trabajando en suelos del sudeste de la
provincia de Buenos Aires encontraron que el N0 de horizontes subsuperficiales
fue inferior al de horizontes superficiales. Encontraron valores mas elevados de
la constante de mineralización (k) en los horizontes subsuperficiales, lo que su-
geriría una composición diferente dentro de la fracción susceptible de ser mine-
ralizada en los diferentes horizontes. Otra posible explicación a las diferencias de
k entre horizontes la constituyen las condiciones de incubación de las muestras
de suelo que alteran las condiciones de degradabilidad del N0 .
En cuanto al aporte de los horizontes subsuperficales se considera que la
sobreestimación por las condiciones de incubación de las muestras es más impor-
tante aún que la que se produce en el horizonte superficial, y que se debe princi-
palmente al manipuleo (secado, molido y tamizado) y finalmente mezclados con
proporciones de arena que resultan en condiciones óptimas de aireación y hume-
dad, que no ocurren en condiciones de campo. De todos modos parece valioso el
valor comparativo de los resultados por lo que aquí se presentan.
Verdejo y Esquivel (2001) realizaron un análisis sobre muestras provenien-
tes de un perfil de suelo Argiudol vértico similar al de la serie La Jaula (Plan mapa
de suelos 1991). Determinaron el N mineralizado acumulado durante un tiempo
de incubación de 183 días. Los resultados encontrados junto a las principales ca-
racterísticas de cada horizonte se presentan en la tabla 6.
-105-
Tabla 6. La Jaula: No y k por horizonte.
Horizontes Espesor (cm) Arcilla (%) MO (%) N tot. (%) N0 (mg.kg-1) k

A1 17 27,9 2,99 0.158 104 0,0284
B21t 22 42,3 1,48 0.078 54 0,1841
B22t 43 45,2 0,86 0.062 40 0,5276
B3ca 38 37 0,45 0.043 22 1,7291
El N0 representó en este caso el 6,6% del N total en el horizonte superficial,

proporción idéntica a la encontrada por Borgetto y otros (1994) para la serie Febre.
El valor de la proporción de No/N total del horizonte superficial fue similar
a los citados por Oyanedel y Rodríguez (1977), cuyo rango para una amplia gama
de suelos Vertisoles y Molisoles varió entre 4 y 12,6 % de N total, también con
los valores citados por Stanford y Smith (1972) para un gran número de diferentes
suelos en USA, que presentan valores que varían entre 4,6 y 40,6 % de N total, y
con los señalados por Prado y Rodríguez (1978), que encontraron valores de N0
que representaban entre 6,4 y 20,8 % de N total.
La tasa de mineralización del N en el horizonte superficial fue marcada-
mente inferior a las citadas por otros autores, pero como en otros estudios aumentó
en profundidad. Cassman y Munns (1980) y Hadas y colaboradores (1986) en-
contraron valores de k diferentes para diferentes horizontes.
La dinámica del proceso de mineralización en las incubaciones se presenta
en la figura 6 donde se observa que al igual que los resultados correspondientes a
la serie Tezanos Pinto, en el trabajo de Borgetto y otros (1994), el N mineralizado
acumulado disminuyó con la profundidad de suelo, hallándose una marcada dife-
rencia entre el horizonte superficial y el resto del perfil.
Figura 6. N mineralizado acumulado en incubaciones de largo plazo Serie La Jaula
-106-
La importancia relativa del aporte de N por mineralización en las capas

subsuperficiales del perfil, puede ser de mayor magnitud cuando la humedad del
horizonte superficial es limitante y no lo es en los horizontes subsuperficiales.
(Cabrera et al. 1994) Esta situación es relativamente frecuente en los suelos Ver-
tisoles y Molisoles de la provincia de Entre Ríos en los que los horizontes subsu-
perficiales densos permanecen húmedos por períodos relativamente prolongados.
En estudios realizados por el equipo de investigación en el cultivo de arroz, parte
de la demanda de N del cultivo en los momentos de mayor absorción parece ser
satisfecha a partir del aporte de N acumulado en los horizontes inferiores.
Hadas et al (1986) estimaron que la contribución relativa de los 20 cm. su-
perficiales a la mineralización de los primeros 60 cm varió entre 45 y 74 %.
Cabrera (1986), citado en Cabrera y colaboradores (1994) estimó que los
15 cm. superficiales contribuirían con 45 a 56% del N mineralizable en 120 cm.
de perfil y con el 90% de los primeros 45 cm.
Cassman y Munns (1980) en incubaciones de 13 semanas encontraron que
el N mineralizado en los 18 cm. superficiales constituyó el 42% del N minerali-
zado hasta 108 cm de profundidad.
A partir de estos resultados se podría concluir que el aporte por mineraliza-
ción de las capas subsuperficiales podría contribuir significativamente en algunos
casos al N mineralizado en el suelo y que deberían ser consideradas en su estima-
ción.
Equipo de Trabajo: El equipo de investigación de la FCA UNER en el tema ,

que se cita en este capítulo está integrado por los Ings. Agrs. María C.
Benintende, Silvia M. Benintende, Juan J. De Batista, Mariano F. Saluzzio,
Cecilia I. Sánchez, María A. Sterren y Cristian Muller.
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-109-
Incubaciones anaeróbicas para la determinación de
N mineralizable: su aplicación para establecer
necesidades de fertilización
Mineralizable N by anaerobic incubation used to

establish fertilization needs
Benintende, Silvia M.a*, María C. Benintendeb
Resumen
El N del suelo está mayoritariamente unido a la fracción orgánica parte de

la que por mineralización puede pasar a formar parte de la fracción inorgánica.
Este aporte de formas disponibles a los cultivos durante la estación de crecimiento,
es de importancia ya que puede contribuir en gran parte a la nutrición de los mis-
mos. El N potencialmente mineralizable hace referencia a la fracción del N orgá-
nico del suelo que es susceptible de ser transformada a formas minerales, su
estimación por métodos rápidos que puedan emplearse en diagnóstico de fertili-
dad, es el objetivo de este capítulo.
Las incubaciones anaeróbicas de siete días es una metodología considerada
de gran utilidad por diversos grupos de investigación que trabajan en el tema. En
el Laboratorio de Microbiología Agrícola de la FCA –UNER proponemos un pro-
cedimiento para su utilización en diagnóstico de necesidades de fertilización por
el método del balance.
Palabras clave: Mineralización de N, Potencial de mineralización de N, Incuba-

ciones anaeróbicas.
Introducción
En el suelo, el N se encuentra formando parte de la fracción orgánica y en

formas inorgánicas. Las formas inorgánicas – principalmente nitratos y amonio
– constituyen las formas fácil y rápidamente aprovechables por los cultivos. En
tanto que las formas orgánicas, mediante el proceso conocido como mineralización
del N orgánico del suelo, pasan a constituir parte de estas formas disponibles.
El aporte de esta fracción durante la estación de crecimiento de los cultivos,
Microbiología Agrícola, bTecnología de Tierras. Fac. Cs. Agropecuarias UNER. CC 24 CP 3100

a
Paraná Entre Ríos (Argentina). ¨Mail: silviab@fca.uner.edu.ar
-111-
es de importancia ya que puede contribuir en gran parte a la nutrición de los mis-

mos. En el total de N presente en el suelo se reconoce una fracción inorgánica –
disponible – y una fracción orgánica que más o menos lentamente pasa a constituir
las formas disponibles (Rodríguez, 1993). La velocidad y la magnitud con que la
fracción orgánica pasa a formar parte de la fracción disponible de N del suelo,
depende de múltiples factores, no sólo de la cantidad de N total.
El concepto de N0 o Nitrógeno potencialmente mineralizable que proponen
Stanford y Smith (1972) hace referencia a la fracción del N orgánico del suelo
que es susceptible de ser transformada a formas minerales y a la velocidad a la
cual dicha fracción de N es transformada. El N0 es una fracción definida y medible
que representa la fracción del N orgánico susceptible de ser mineralizado. Estos
autores proponen que su medición se realice a través de incubaciones aeróbicas
de largo plazo (de 5 a 6 meses). La técnica consiste en incubar en condiciones op-
timas de temperatura y humedad 10 g de suelo mezclados con arena estéril durante
150 días en columnas de suelo y arena que son percoladas con una solución de
CaCl2, en tiempos sucesivos: al comienzo de la incubación y a los 7, 14, 28, 56,
94, 122 , 150 y 180 días. Luego, por destilación por arrastre de vapor, se deter-
minan el N mineral (amonio y nitrato) en los percolados.
Si se grafica el N que se mineraliza (N mineral a partir de los percolados,
acumulando los valores determinados en cada uno de los momentos (Figura 1), la
curva que se podría ajustar a estos puntos crece a tasa decreciente. Esto ocurre
porque inicialmente se mineralizan rápidamente las formas orgánicas más suscep-
tibles y fáciles de ser degradadas y, a medida que se van agotando, se va lentifi-
cando el proceso. Las incubaciones de largo plazo son necesarias para que se
obtenga el quiebre de la curva.
Figura 1. M nineralizado acumulado en incubaciones aeróbicas de largo plazo (6 meses) por la

técnica de Stanford y Smith.
La estimación del N potencialmente mineralizable se hace a partir de una

regresión lineal entre la inversa del N mineralizado acumulado y la inversa del
tiempo medido en semanas. En la figura 2 se ha graficado esta relación y al con-
junto de puntos se le aplicó una regresión lineal.
-112-
Incubaciones anaeróbicas para la determinación de N mineralizable...
Figura 2. Regresión entre la inversa de M nineralizado acumulado y la inversa del tiempo.
La estimación del N0 se hace calculando la inversa de la ordenada al ori-

gen.
1/Nac = 1/N0 + b/t
Donde:
N0 = N potencialmente mineralizable (ppm) calculado por regresión de la
inversa del N mineralizado y el tiempo medido en semanas.
Nac = N mineralizado acumulado (ppm) en el tiempo de las incubaciones
aeróbicas.
b = pendiente (ppm/semanas)
t = tiempo de incubación, expresado en semanas.
Entonces:
Estimación de N0 para este caso particular 1/0.0096 =104 ppm
Como fue señalado, el N0 no depende solo de la cantidad de N orgánico

presente, sino que, entre otros factores, influyen la complejidad de los compuestos
orgánicos presentes y la actividad de los microorganismos que los descomponen.
Por lo que es razonable entender que esta fracción no es una porción fija del N
total del suelo. En trabajos realizados en el Laboratorio de Microbiología Agrícola
de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Entre
Ríos, se observa que el N0 representa entre el 6 y el 15 % de los suelos analizados,
y que la proporción no está asociada al subgrupo de suelo del que se haya tomado
la muestra. Como se observa en la tabla 1, estos extremos fueron evaluados en
Ariudoles verticos.
-113-
Tabla 1. Valores de N0 y N total, encontrados en distintos suelos de Entre Ríos (Laboratorio de

Microbiología FCA UNER).
En condiciones de campo, raramente se dan las condiciones para que ocurra

una óptima mineralización. Los factores que influyen sobre el proceso son prin-
cipalmente la humedad del suelo y temperatura. Además mejoran el proceso la al-
ternancia de condiciones de secado y humedecimiento y la reacción del suelo,
entre otras.
Para la determinación de N0 se utilizan, en laboratorio, condiciones óptimas
de temperatura y humedad para la mineralización (35 °C y 70 % de capacidad de
campo).
Para estimar el N que se puede mineralizar en condiciones de campo, re-
sulta necesario ajustar el valor de N0 por las condiciones ecológicas que afectan
en mayor medida al proceso de mineralización (temperatura y humedad) durante
el período de crecimiento del cultivo.
Por esta razón, para utilizar este concepto en diagnósticos de fertilidad, es
necesario transformar el N0 en la cantidad que puede mineralizarse en condicio-
nes de campo ajustándolo por estas variables.
Se han propuesto funciones para adaptar lo que se mineraliza, de acuerdo

a la temperatura (Stanford, et al. 1973) y por el contenido de humedad Cavalli y
Rodriguez (1975)
Estos efectos se han sintetizado en la ecuación de ajuste de Oyanedel y Ro-
driguez (1977)
Donde:
Nm = nitrógeno mineralizado semanal.
N0 = nitrógeno potencialmente mineralizable.
-114-
T = temperatura edáfica (°C)

H como (q/q0 = contenido volumétrico actual de agua en relación al con-
tenido volumétrico de agua óptimo para la mineralización (0,7 atm.))
Según se observa, la temperatura afecta la mineralización de manera expo-

nencial mientras que la humedad lo hace de forma lineal.
A partir de esta ecuación se puede calcular la cantidad de N que se minera-
liza semanalmente utilizando el dato de N0 del suelo y tomando en cuenta la tem-
peratura media para esa semana y la humedad del suelo. De esta manera se obtiene
la cantidad de N mineralizado por semana según condiciones de campo el cual
está expresado en partes por millón.
Figura 3. Isolíneas para valores de humedad entre 0,2 y 1 θ/θ0 cada 0,2
En la figura 3 se representan las isolíneas o curvas de nivel para la ecuación

propuesta por Oyanedel y Rodriguez (1977). En ella se ha graficado el N minera-
lizado por semana en función de las temperaturas del suelo (tomando un valor de
N0 de 104 ppm ). Cada línea representa la relación gráfica que se obtiene a con-
tenidos hídricos de 0,2 (representado por la línea punteada), 0,4 (línea con mar-
cadores de triángulos) 0,6 (línea gris), 0,8 (línea con marcadores de rombos) y 1
(línea negra).
La línea punteada representa un suelo muy seco y la negra, un suelo con el
óptimo contenido de humedad. Analizando la figura 3 se puede ver que cuando el
suelo está muy seco, los incrementos de temperatura no generan mayores modi-
ficaciones en N que se mineraliza. En cambio a humedad óptima, los cambios de
la temperatura generan fuertes incrementos en el N mineralizado.
Métodos rápidos para estimación de No
Las incubaciones aeróbicas de largo plazo (5 a 6 meses) es el método reco-

nocido por muchos autores, como la mejor forma de estimación del N que puede
-115-
mineralizarse en el corto plazo. Sin embargo, presenta inconvenientes por los lar-
gos períodos de incubación necesarios para estimar el N mineralizable, por lo cual
no puede ser utilizada como técnica de rutina en laboratorio de diagnóstico de
fertilidad nitrogenada.
Por esta razón se han buscado métodos de laboratorio más simples y rápidos
que permitan estimar el N0 (Gianello y Bremner, 1986; Echeverría et al. 2000;
Benintende et al. 2007; Garcia Lamothe et al. 2010; Reussi Calvo et al. 2013).
El Laboratorio de Microbiología Agrícola FCA - UNER ha encarado un tra-
bajo de comparación de distintas técnicas para la estimación de N0 (Sterren et al.
2001). Entre las metodologías analizadas la técnica de incubaciones anaeróbicas
de siete días es la que mejores resultados ha tenido para suelos de Entre Ríos.
El método consiste en realizar una incubación de suelo por siete días en
anaerobiosis a 40 º C. Finalmente se determina el N inorgánico por destilación
por arrastre de vapor.
En esta línea de investigaciones, Benintende et al. (2007) han trabajado con
treinta y dos muestras sobre las que se midió N0 de incubaciones aeróbicas y N
de incubaciones anaeróbicas, se ajustó una ecuación lineal y se obtuvo un coefi-
ciente de regresión de 0.73. Esta ecuación permite estimar el valor de N0 haciendo
uso de una medición de N mineralizado en incubaciones anaeróbicas, que, como
se ha visto, es una técnica sencilla que puede incorporarse en análisis de rutina
para diagnóstico de fertilidad nitrogenada.
El N0 se calcula multiplicando el contenido de N obtenido por incubacio-
nes Anaeróbicas, por un coeficiente de 1,1305 y se suma 55,275 (Figura 4).
Cabe destacar que esta estimación tiene validez para valores de N de incu-
baciones anaeróbicas de 20 a 137 ppm, que estiman valores de N0 de 78 a 210
ppm.
Figura 4. Ajuste lineal entre las mediciones de N0 de incubaciones aeróbicas y el N de incubacio-

nes anaeróbicas (N-IA)
-116-
El grupo de investigación de INTA Balcarce, en un trabajo sobre métodos

rápidos para estimación de N0, encontró ó un buen ajuste con el N que se mine-
raliza en 7 días de incubaciones anaeróbicas. Además estudiaron la longitud del
período de incubación anaeróbico y encontraron una elevada y estrecha relación
positiva entre el N mineralizado en una y dos semanas de incubación, lo que su-
giere que es posible reducir el tiempo de incubación de las muestras a una semana
(Echeverría et al. 2000)
La utilización de la metodología de IA tiene ventajas ya que no se necesiten
realizar ajustes a condiciones de humedad para la incubación debido porque en el
procedimiento se coloca el suelo totalmente sumergido en agua. Además, la me-
todología requiere de instrumental de bajo costo.
Aplicación de N de incubaciones anaeróbicas para

estimar el N a campo
En la tabla 2 se ha estimado el N que se mineralizó en un suelo Argiudol

acuico con cultivo de maíz. Se midió tanto N0 de incubaciones aeróbicas, como
el N de incubaciones anaeróbicas de 7 días y con este se estimó el N0. Finalmente
se calculó el N que se mineralizaría a campo a partir de los dos valores de N0 uti-
lizando datos reales de temperatura y contenido de humedad.
Tabla 2. N mineralizado estimado durante el ciclo de un cultivo de maíz a partir de N0 incuba-

ciones aeróbicas y de los N0 estimados a partir de los PMN-IA.
N min
N0 PMN-IA N min (N0)
Suelo Cultivo (PMN IA)
(ppm) (ppm) (kg/ha)
(kg/ha)
Argiudol 66,5 132 136
Maíz 127
acuico (N0 = 130) (66 ppm) (68 ppm)
N0: Nitrógeno potencialmente mineralizable calculado a partir de la ecuación propuesta por Stan-
ford y Smith.
PMN-IA: Nitrógeno mineralizado en anaerobiosis (Waring & Bremner, 1964).
N min (N0): N mineralizado durante el ciclo de un cultivo, corregido por humedad y temperatura
de campo (Oyanedel y Rodriguez, 1977) a partir del N0 .
N min (PMN– IA): N mineralizado durante el ciclo de un cultivo, corregido por humedad y tem-
peratura de campo (Oyanedel y Rodriguez, 1977) a partir del N0 estimado con el modelo que re-
laciona PMN-IA y N0.
A partir del trabajo que se viene realizando en el Laboratorio de Microbio-

logía Agrícola de la FCA – UNER, para utilizar el N0 para estimar lo que un suelo
puede aportar por mineralización en el ciclo de los cultivos, se debería recurrir a
la medición del N de incubaciones anaeróbicas del suelo. Con este dato estimar
el No aplicando el modelo lineal. Luego, utilizar la ecuación de Oyanedel y Ro-
driguez para afectarlo por las condiciones de temperatura y humedad que se pro-
yectan para el año. Para esto se propone utilizar las temperaturas promedio
-117-
semanal para el ciclo del cultivo en cuestión y estimar lo que se aportaría en años
secos usando un contenido de humedad volumétrica (q/q0 ) de 0,5 y para años hú-
medos de 0,8. Una vez calculado el Nm acumulado durante el periodo de creci-
miento del cultivo (en ppm), se calcula el peso por hectárea que representa el Nm
para una profundidad de 20 cm.
Aplicando el procedimiento de cálculo propuesto para un suelo cuyo N0
estimado es de 100 ppm, y considerando una humedad óptima de suelo, en el pe-
ríodo correspondiente a un cultivo invernal (trigo) el N mineralizado ajustado por
T y H es de 51 kg por hectárea, mientras que para un cultivo estival (maíz), es
de 91 kg.
Para facilitar la aplicación del procedimiento de estimación del N que se
mineraliza durante la estación de crecimiento de los cultivos, se han calculado al-
gunos coeficientes por los cuales se pueden afectar el valor estimado de N0 y así
obtener rápidamente el N que se mineraliza a campo. Estos coeficientes han sido
generados para cultivos que se desarrollan en Entre Ríos, ya que se han conside-
rado para su cálculo las temperaturas promedio para una profundidad de suelo de
5 cm para los ciclos de los cultivos en cuestión.
Los coeficientes calculados se presentan en la tabla 3.
Tabla 3: Coeficientes para la conversión de No en N mineralizado a campo para cultivo de maíz y

de trigo en la provincia de Entre Ríos
Maíz
Fechas de siembra Humedad (Ɵ/Ɵ0) coeficiente
1 de septiembre 0,8 0,36
1 de diciembre 0,8 0,46
1 de septiembre 0,5 0,219
1 de diciembre 0,5 0,274
Trigo
Fechas de siembra Humedad (Ɵ/Ɵ0) coeficiente
1 de junio 0,8 0,205
1 de julio 0,8 0,240
1 de junio 0,5 0,122
1 de julio 0,5 0,144
1 de junio variable 0,162
1 de julio variable 0,188
Los coeficientes corresponden a cultivo de maíz considerando dos fechas
de siembra, 1 de septiembre y 1 de diciembre, y dos condiciones extremas de hu-
medad (óptima para la mineralización (q/q0 de 0,8 y humedad correspondiente
a un años seco q/q0 de 0,5).
Los coeficientes correspondientes a cultivo de trigo se presentan conside-
rando dos fechas de siembra, 1 de junio y 1 de julio y tres condiciones de humedad.
Las dos condiciones extremas de humedad (óptima para la mineralización q/q0
de 0,8 y humedad correspondiente a un años seco q/q0 de 0,5) y una humedad de
un suelo que se va secando a medida que avanza el cultivo.
-118-
Tabla 4. N mineralizado durante el ciclo de un cultivo de trigo y uno de maíz en suelos molisoles
y vertisoles de Entre Ríos.
En la tabla 4 se presentan resultados de cálculos de N mineralizado ajustado

por condiciones de T y H en base a un valor hipotético de N0 de 200 ppm. En
la cuarta columna se detallan los valores calculados de N mineralizado para cul-
tivos de trigo con dos fechas de siembra (1 de junio y 1 de julio) considerando las
temperaturas promedios semanales de suelo para la época de desarrollo del cultivo
y humedad óptima, correspondiente a un año seco y un tercer caso de un suelo
que va perdiendo humedad con el desarrollo del cultivo. En las últimas dos co-
lumnas se presenta el N mineralizado expresado en kg por hectárea en 20 cm de
profundidad para suelos Molisoles y Vertisoles, suelos predominantes en el área
de producción de estos cultivos en Entre Ríos.
Aplicación de la estimación de N mineralizado durante el

ciclo del cultivo a estimaciones de necesidades de fertilización
El cálculo de la dosis de fertilización con N para un determinado cultivo

se basa em contrastar la demanda (que es la extracción del nutriente por el cultivo
para un rendimiento dado en kg/ha) con la oferta (disponibilidad del nutriente en
el suelo en kg/ha) tomando en consideración la eficiencia de aprovechamiento
(proporción del nutriente absorbido por cada kg aplicado).
A partir de la ecuación de balance, para determinar la necesidad de fertili-
zación nitrogenada (NF) , el cálculo de cada término de la misma se realiza como
se detalla a continuación en este ejemplo práctico.
-119-
El término N pl representa el requerimiento de N del cultivo expresado en

kg de N por hectárea para el rendimiento objetivo.
El cultivo de maíz requiere unos 22 kg de N/ha por tonelada de grano, si el
rendimiento objetivo fuera de 10.000 kg de grano por hectárea Npl será de 220
kg de N por hectárea.
Nd representa la cantidad de N disponible al momento de realizar el análisis
de suelo expresado en kg de N por hectárea en 60 cm de profundidad.
Partiendo del resultado en partes por millón (ppm) de N-NO3- del análisis
de suelo de una muestra obtenida a 20 cm de profundidad realizamos el cálculo
de los kg de N por hectárea que representa.
Para el cálculo suponemos un resultado de 20 ppm de N-NO3- y conside-
ramos la masa de una hectárea 20 cm de profundidad (2000 m 3) si la densidad
aparente fuera de 1,3 gr cm-3 (en caso de tratarse de un suelo Molisol) es de 2600
toneladas, por lo que 20 ppm de N-NO3- representan 52 Kg de N por hectárea.
Para estimar la cantidad de N en 60 cm se duplica esta cifra por lo que te-
nemos 104 Kg de N por hectárea. La eficiencia con la que el cultivo recupera esta
cantidad de N es estimada en 50% por lo que Nd será entonces de 52 kg de N por
hectárea.
Nm representa la cantidad de N que se mineralizará durante el ciclo del cul-
tivo de maíz que se siembre en setiembre. Este término es el que estimamos
usando los conceptos que se han desarrollado en este capítulo. A partir del resul-
tado de N-IA del análisis de suelo de una muestra obtenida a 20 cm de profundidad
realizamos el cálculo de los Kg de N por hectárea que representa.
Para el cálculo consideraremos una temperatura media del suelo para cul-
tivo de maíz es de 23ªC. y realizaremos el cálculo para una buena condición de
humedad (humedad del suelo Θ/Θ0 = 0.8).
Para el cálculo suponemos un resultado de análisis de laboratorio de 39,4
ppm de N-IA.
Aplicando la ecuación
N0 = 1,1305 N-IA + 55,275
Resulta un N0 de aproximadamente 100 ppm.
Valor que utilizamos para estimar la cantidad de N que podría mineralizarse
a campo en las condiciones de temperatura y humedad enunciadas (Nm).
Ecuación que resumimos en coeficientes que permitieran calcular fácil-

mente el Nm.
Para las condiciones enunciadas este coeficiente es de 0.360 por lo que el
-120-
N0 acumulado en 18 semanas (que es el tiempo en que se estima el cultivo absor-

berá N) será de 36 ppm de N /ha.
Para aplicar a la ecuación de balance transformamos este valor a Kg de N
/hectárea en iguales condiciones que las calculadas para el Nd, esto es con una
densidad aparente de 1,3 gr/cm3.
Esto resulta en unos 94 Kg de N /hectárea acumulados en 18 semanas.
La eficiencia de absorción de este N que se mineraliza durante el ciclo del
cultivo es mayor a la del N disponible al inicio del mismo y se estima en un 75%.
Por lo que el Nm para nuestro cálculo será de 70,5 Kg de N /hectárea.
La eficiencia de absorción del fertilizante que se aplique dependerá de la
fuente, momento, dosis etc., pero si utilizamos un valor de 50% encontraremos
que la dosis a aplicar para la situación enunciada y en las condiciones analizadas
será de 195 Kg de N /hectárea.
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-122-
Procedimientos microbiológicos modernos aplicados al es-
tudio de comunidades microbianas de suelo
Modern microbiological techniques applied to the study

of soil microbial communities
Silberman, Juanab*; Analía Anriquezb; Ada S. Albanesib; Daniel H. Grassoa
Resumen
Los microorganismos del suelo son los responsables de llevar a cabo fun-
ciones ecosistémicas claves. Por ello, junto con el análisis físico y químico, el mo-
nitoreo de la biota del suelo es de suma importancia en los sistemas agrícolas y
pecuarios para asegurar que las prácticas de manejo se desarrollan dentro los lí-
mites de la sustentabilidad. Desde los comienzos del estudio del suelo se han des-
arrollado diversos métodos para realizar este monitoreo, algunos de ellos por su
simplicidad y accesibilidad perduran en el tiempo. Sin embargo el análisis pro-
fundo y en detalle de los microorganismos requiere de metodologías que permitan
acceder a la diversidad genética de las poblaciones cultivables y no cultivables.
En este capítulo se pretende describir los procedimientos microbiológicos moder-
nos para estudiar los microorganismos a nivel de comunidad, analizar las ventajas
y desventajas de cada una de ellas, así como el manejo y análisis de la información
obtenida con cada procedimiento.
Palabras clave: Metagenómica suelo, Diversidad microbiana, Oxitop
Introducción
El incremento en la demanda global de alimentos está llevando a la inten-

sificación de las prácticas agrícolas y al incremento en presión sobre los recursos
naturales, entre ellos el suelo. Esta situación plantea un desafío de producir dentro
de los límites de la sustentabilidad. El cambio del uso del suelo, y el creciente re-
a
Instituto de Suelos. CNIA. INTA Castelar. De los Reseros y Nicolás Repetto s/n. Hurlingham,
Pcia Buenos Aires. CP 1686.
b
Fac. Agronomía y Agroindustrias. Univ. Nac. de Santiago del Estero. Av. Belgrano (s) 1912,
Santiago del Estero. CP 4200.
*
jsilberman@cnia.inta.gov.ar
-123-
conocimiento de la necesidad de mejorar la sostenibilidad de las prácticas agro-

pecuarias, ha llevado a la adopción generalizada de los procesos de mínimo im-
pacto (Bisset et al., 2013). Por lo tanto, para garantizar que los disturbios
antrópicos son compatibles con la conservación del suelo se requiere del estudio
de sus efectos para detectar la magnitud de su impacto. En este sentido reviste
vital importancia el componente microbiano, ya que los microorganismos cumplen
diversos roles en el funcionamiento de los ecosistemas, por ello es deseable in-
crementar la biodiversidad de la biota del suelo responsable de las funciones eco-
sistémicas claves. Las comunidades microbianas, catalizan un amplio rango de
procesos que son importantes para la productividad y sostenibilidad del ecosistema
suelo. Las relaciones directas entre estructura y función de las comunidades mi-
crobianas son difíciles de dilucidar, es por ello que tanto la estructura como la
función son parámetros que caracterizan la respuesta de los microorganismos a la
perturbación y al cambio de uso del suelo (Bissett et al., 2013).
Técnicas basadas en análisis de ADN

Aun cuando es sabido que los microorganismos desempeñan un rol clave
en el funcionamiento del ecosistema, nuestro conocimiento de la diversidad mi-
crobiana del suelo estuvo limitado en parte por nuestra inhabilidad para el estudio
de los microorganismos del suelo. Torsvik et al. (1990) estimaron que en 1 g de
suelo hay 4.000 bacterias diferentes “unidades genómicas” basado en análisis de
reasociación ADN-ADN. Solo el 1% de la población de bacterias del suelo pueden
ser cultivadas en condiciones estándares de laboratorio (Torsvik et al., 1998). Exis-
ten cerca de 1,5 millones de especies de hongos en el mundo (Giller et al., 1997),
pero al igual que las bacterias, menos del 1% pueden ser cultivados en laboratorio
(Thorn, 1997; van Elsas et al., 2000).
Avances en las tecnologías basadas en ADN permiten que la estructura de
las comunidades microbianas y sus cambios puedan ser inferidos mediante una
variedad de métodos, de los cuales las técnicas de fingerprint permiten una repli-
cación ecológica adecuada. Fingerprints pueden ser derivados de lo que se con-
sidera comunidad total, vía ADN, o de la comunidad activa, vía ARN (Mengoni
et al., 2005).
Las técnicas moleculares permitieron acceder a la diversidad total de mi-
croorganismos del suelo. Estas técnicas que utilizan ácidos nucleicos extraídos
directamente de muestras ambientales permiten el análisis de la comunidad
(Amann, 1995; Woese, 1987) y su uso caracteriza el momento de nuestra investi-
gación en el siglo XXI, por lo cual este período podría ser denominado “Segunda
Edad de Oro de la Microbiología de Suelo” (Nannipieri y Eldor, 2009). Para ac-
-124-
Procedimientos microbiológicos modernos aplicados al estudio de comunidades microbianas ...
ceder a la diversidad total de microorganismos del suelo, es decir, cultivables y

no cultivables, es necesario focalizarnos en la extracción de ADN microbiano de
modo tal que la calidad del mismo garantice una exitosa amplificación por PCR
para cebadores específicos, y que represente lo mejor posible el ADN en la muestra
original. Hay una variedad de métodos publicados para la extracción de ADN de
muestras de suelo. También hay en disponibilidad kits comerciales para extracción
y purificación de ADN, que son fáciles de usar y considerablemente reproducibles.
La mayoría de los autores reportaron las ventajas de sus respectivos métodos com-
parado con los reportados previamente. Sin embargo, ninguno de los métodos pu-
blicados hasta el momento, es universalmente aplicable, por lo que se requiere la
optimización de la extracción y purificación de ADN (Rajendhran y Gunasekaran,
2008)
Métodos moleculares para describir la estructura y funcionalidad

de las comunidades de microorganismos del suelo
Una comunidad es un ensamblaje de diferentes especies que ocurren juntas

en un espacio y tiempo (Begon et al., 1996). Los parámetros que caracterizan a
una comunidad son la estructura y el funcionamiento. Los atributos de la estructura
está relacionados con la composición (miembros de la comunidad), riqueza, do-
minancia y diversidad.
Para describir la diversidad de microorganismos en un ambiente heterogé-
neo como es el suelo requiere de procedimientos que revelen la totalidad de mi-
croorganismos. Dado que el 99% microorganismos presentes en suelo no se
pueden cultivar en laboratorio, se utilizan herramientas que estudien el genoma
de todos los miembros de la comunidad (Metagenoma). La región más estudiada
es la correspondiente a los genes codificantes de los ARN ribosomales (denomi-
nada ADNr).
El análisis del gen ADNr 16S ha sido usado extensivamente para estudiar
la diversidad de procariotas como así también para identificar y establecer rela-
ciones filogenéticas. El ADNr 18S y el espaciador transcrito interno (ITS) son re-
giones ampliamente usadas para estudiar comunidades de hongos (Kirk et al.,
2004).
Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al ARNr, hasta el mo-
mento ninguno ha conseguido desplazarlo. De hecho, esta macromolécula presenta
una serie de características, en base a las cuales fue considerado por Woese como
el cronómetro molecular definitivo (Rodicio y Mendoza, 2004):
- Es una molécula antigua, presente en todas las células bacterianas actuales.
Constituye por lo tanto una diana universal para su identificación.
-125-
- Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo

muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan pro-
bablemente cambios aleatorios
- Presenta regiones altamente conservadas y regiones hipervariables, lo que
permite diferenciar organismos próximos
- El tamaño relativamente largo (1500pb) minimiza las fluctuaciones esta-
dísticas
- La conservación de la estructura secundaria puede servir de ayuda en las
comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.
- Existe una gran base de datos electrónica (y en constante crecimiento)
de secuencias de ARNr 16S (procariotas) y 18S (eucariotas).
Muchos de los procedimientos moleculares que se desarrollaron para

analizar la estructura de las comunidades microbianas en muestras ambien-
tales hacen uso de una primera etapa en la que a partir de la totalidad de
los genomas (ADN ambiental) se obtiene mediante amplificación por PCR,
los fragmentos correspondientes al ADNr. En una segunda etapa se estudia
la diversidad de estos fragmentos mediante diferentes metodologías: bi-
bliotecas de ADNr, DGGE, tRFLP, RFLP, SSCP, RISA, ARISA.
En la actualidad se emplea cada vez más la secuenciación directa,
como la pirosecuenciación, dado que el costo de este análisis se ha visto
reducido debido al avance de los procedimientos de secuenciación de nueva
generación (Next generation sequencing).
Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)

DGGE es una técnica ampliamente usada en ecología microbiana. Este pro-
cedimiento permite resolver fragmentos de ADN que poseen igual tamaño mole-
cular en función de la composición de bases. Es decir que, dentro de la capacidad
resolutiva del método, es posible poner de manifiesto la diversidad de secuencias
de ADN presentes en la muestra. Se asume generalmente que la diversidad de ban-
das puesta de manifiesto guarda relación directa con la diversidad de organismos
presentes en la muestra original, sin embargo es necesario hacer incapié que al
igual que todos los procedimientos que requieren de la amplificación por PCR
presenta bias inherentes a esta metodología tales como el hecho de no ser cuanti-
tativamente representativa. La gran utilidad de esta metodología radica determinar
directamente la riqueza y equitatividad de las especies dominantes usando ampli-
cones del gen ARNr 16S (o su homólogo 18S) y perfilar las poblaciones micro-
-126-
bianas correspondientes, tanto en forma cualitativa y cuantitativa. La diversidad

puede determinarse por el número e intensidad de las bandas. Se asume que cada
banda representa una unidad taxonómica operacional, que por simplicidad es lla-
mada especie (Tao et al., 2012).
Con DGGE los productos de PCR son separados en base al contenido de la
secuencia mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida. Los productos de
PCR atraviesan a través de un gradiente de desnaturalizantes químicos incorpo-
rados en la matriz del gel. Específicamente, la separación de los fragmentos en el
gel DGGE es dependiente del contenido de GC, tales que los fragmentos con alto
contenido GC son más difíciles de desnaturalizar. La diferencia es debido a los
tres puentes hidrógeno en las uniones G-C y a los dos puentes hidrógeno en las
uniones A-T. Así los productos de PCR con alto contenido GC migrarán más lejos
en el gel. La desnaturalización de los fragmentos retrasa el movimiento resultando
en la formación de una banda. Por separación de productos de PCR de una muestra
ambiental, se genera un fingerprint. El número de bandas, sus posiciones y la in-
tensidad relativa pueden ser utilizados para el análisis de diversidad. Cuando se
requiere información más específica, se cortan las bandas del gel y se identifican
por secuenciación (Drenovsky et al., 2008).
Una revisión en PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) del número
de publicaciones de microbiología de suelo que usaron la técnica DGGE (Figura
1) reveló que desde el año 1997 al 2012 las publicaciones continúan creciendo, lo
que pone de manifiesto que es una herramienta de elección dada su simpleza y
utilidad.
Figura 1.Número de publicaciones que utilizaron la técnica DGGE para estudio de suelo en los úl-
timos 15 años.
-127-
Análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

Este método se basa en la digestión de los productos de PCR (del gen de
interés) con enzimas de restricción. Éstas cortar el ADN en sitios con secuencias
específicas de 100 pb a 10 kb de longitud. Las diferencias en la longitud de los
fragmentos, como resultado de la acción de diferentes enzimas son detectados me-
diante un electroforesis en gel (Stefanis et al., 2013;Wang, 2008; Obsorn et al.,
2000). Al igual que DGGE este método sirve para comparar comunidades.
Análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos terminales de restric-

ción (tRFLP)
RFLP es otro método basado en PCR, que es comúnmente utilizado para
análisis comparativos de comunidades microbianas. Los genes de interés son am-
plificados con primers marcados con fluorescencia seguidos de la digestión con
enzimas de restricción y separación y detección de los fragmentos en un secuen-
ciador automático. Solo los fragmentos terminales de restricción (TRFs) son de-
tectados y la heterogeneidad en su longitud indica la complejidad de la comunidad
visualizado por un electroferograma. TRFLP es típicamente llevado a cabo en un
gel de secuenciación, que provee alta resolución, sensibilidad, cuantificación, alto
rendimiento, tamaño exacto de fragmentos por uso de marcadores de tamaño es-
tándares. El uso de marcadores de tamaño estándar con un fluoróforo diferente,
permite una asignacion de tamaño precisa con resolución de un par de base (Ste-
fanis et al., 2013; Juste et al., 2008). Actualmente se usan, en una misma reacción
de PCR, primers con diferentes fluróforos de modo tal de poder obtener en una
sola corrida los perfiles de comunidad de bacterias, hongos y archaea (cada grupo
marcado con un fluoróforo diferente) para cada muestra de suelo. Este procedi-
miento es conocido con el nombre de TRFLP multiplex.
Polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP)

Es un método adaptable para un perfilado rápido de comunidades de mi-
croorganismos del suelo sin requerir la formación de un gradiente en gel. Este mé-
todo involucra la electroforesis de amplicones de PCR de cadena simple. Se
supone que las secuencias desnaturalizadas asumen una única conformación de
cadena simple, que influye en su movilidad electroforética (Stefanis et al., 2013;
Deldes et al., 2000; MacGregor y Amann, 2006).
Análisis del espacio intergénico ribosomal (RISA)/ análisis del espacio in-
tergénico ribosomal automatizado (ARISA)
RISA separa los productos de PCR que se encuentran entre el extremo 5´
del gen ARNr 16S, a través del espaciador, y en el extremo 3´ del gen ARNr 23S.
-128-
La región espaciadora no es tan conservada evolucionariamente como los genes

ribosomales, RISA ofrece mayor resolución que el análisis del gen ARNr 16S. La
mayoría de los estudios dirigidos al espacio intergénico ribosomal incorporan fluo-
róforos para uso automatizado de secuenciador de ADN. ARISA provee un incre-
mento en la resolución, que permite comparaciones rápidas y reproducibles de
comunidades de bacterias de múltiples muestras (Stefanis et al., 2013; Ranjard et
al., 2001; Nocker et al., 2007).
PCR cuantitativa o en tiempo real

Actualmente, la PCR cuantitativa (Q PCR o PCR en tiempo real) está
siendo ampliamente aplicada en ecología microbiana para cuantificar la abundan-
cia de genes involucrados en los ciclos biogeoquímicos, tales como nifH (Mao et
al., 2011; Orr et al., 2010); nir (Rasche et al., 2011); nosZ y amoA (Mao et al.,
2011; Rasche et al., 2011) como así también en otros genes de interés taxonómico
y funcional (Smith y Osborn, 2009).
Los análisis basados en Q-PCR combina la “tradicional” PCR de punto final
con la tecnología de detección fluorescente para el registro de la acumulación de
amplicones en “tiempo real” durante cada ciclo de la amplificación por PCR. Esto
permite la cuantificación de genes cuando estos son proporcional a la concentra-
ción de templado en el comienzo (Smith y Osborn, 2009).
La PCR cuantitativa en tiempo real trabaja de manera similar a la PCR de
punto final: múltiples ciclo de amplificación en el que el ADN es inicialmente
desnaturalizado, seguido del annealing de primers específicos y la subsecuente
extensión de la cadena mediada por la ADN polimerasa, resultando en un incre-
mento exponencial del números de amplicones durante la PCR. Sin embargo, en
contraste con la PCR punto final, en la Q-PCR el incremento de amplicones es
registrado a través de un reportador fluorescente que indica la acumulación de
amplicones durante cada ciclo. Dos sistemas reportadores son comúnmente usa-
dos, el SYBR green (Wittwer et al., 1997) y el sistema TaqMan (Holland et al.,
1991; Livak et al., 1995).
SYBR green se une a la doble cadena de ADN a través de la intercalación
entre dos pares de bases adyacentes. Cuando se une al ADN, se emite una señal
fluorescente (Figura 2a). Como el número de amplicones se acumula después de
cada ciclo de PCR, hay un correspondiente incremento en la fluorescencia. Debido
a que SYBR green se une a la doble cadena de ADN, es esencial usar un par de
primers que sean altamente específicos para la secuencia target y de esta manera
evitar la generación de amplificaciones no específicas que contribuirán a la señal
fluorescente, resultando en una sobre estimación (Smith y Osborn, 2009).
El método de la sonda TaqMan utiliza una sonda marcada con fluorescencia
-129-
que se hibridiza con una región adicional conservada que se encuentra dentro del
amplicon de la secuencia target. La sonda TaqMan está marcada con fluorescencia
en el extremo 5´ y contiene una molécula quencher en el extremo 3´( Livak et
al.,1995). La proximidad de la sonda de la molécula quencher al fluoróforo impide
la fluorescencia debido a la transferencia de energía de resonancia fluorescente.
Durante la etapa de annealing de cada ciclo de PCR, los primers y la sonda intacta
se unen a la secuencia target. Durante la subsecuente extensión de la cadena, la
actividad exonucleasa 5´de la enzima Taq polimerasa libera el fluoróforo de la
sonda TaqMan y se detecta una señal fluorescente, ya que el fluoróforo ya no está
en proximidad cercana al quencher (Figura 2b). La amplificación del templado
es medida por la liberación y acumulación del fluoróforo durante la etapa de ex-
tensión en cada ciclo de PCR. La especificidad adicional proporcionada por la
presencia de la sonda TaqMan asegura que la señal fluorescente generada durante
la Q-PCR deriva solo de la amplificación de la secuencia target (Smith y Osborn,
2009).
Figura 2. Esquema de los sistemas reportadores. Fuente: Smith y Osborn 2009
Pirosecuenciación
La pirosecuenciación fue desarrollada para dar respuesta a la necesidad de
un método de secuenciación robusto, de bajo costo y a la vez de alto rendimiento.
Este método fue desarrollado por Pål Nyrén en la década de 1990s y se basa en la
detección del pirofosfato liberado (PPi) durante la síntesis de ADN. En una reac-
-130-
ción enzimática en cadena, se genera una luz visible que es proporcional al número
de nucleótidos incorporados. La cascada comienza con la polimerización de un
ácido nucleico en el que el PPi es liberado como resultado de la adición de un nu-
cleótido por la polimerasa. Este PPi liberado es convertido a ATP por la ATP sul-
furilasa, que provee energía a la luciferasa para oxidar la luciferina y generar luz
(Figura 3). Debido a que se conoce el nucleótido agregado, se puede determinar
la secuencia del templado (Novoais y Thorstenson, 2011)
Figura 3. Esquema de la pirosecuenciación. Fuente: Novoais y Thorstenson (2011)
La pirosecuenciación está siendo ampliamente usada como indicador para

describir la diversidad y distribución de los microorganismos del suelo (Figuerola
et al., 2012; Fierer et al., 2012; Ramirez et al., 2012; Suleiman et al., 2013) y es
el único método de secuenciación que fue desarrollado como una alternativa a la
clásica secuenciación de ADN de fragmentos cortos a medianos. Comparado a
otros métodos de secuenciación, es altamente cuantitativa, rápida y económica.
Una ventaja adicional incluye la alta precisión, flexibilidad y habilidad para la
preparación de muestras automatizada (Novoais y Thorstenson, 2011). Sin em-
bargo se requiere de dominio en los conocimientos de bioinformática para el pro-
cesamiento y análisis del gran volumen de información obtenida.
-131-
Metagenómica shotgun
Uno de los eventos más trascendentales en el campo de la ecología micro-
biana en la década pasada fue el surgimiento y desarrollo de la metagenómica. Se
entiende por metagenómica al análisis genético directo de los genomas contenidos
en una muestra ambiental. El campo inicialmente comenzó con la clonación de
ADN ambiental, seguido del screening de expresión funcional, y luego comple-
mentado rápidamente con la secuenciación shotgun directa al azar del ADN am-
biental. Estos proyectos iniciales no solo mostraron pruebas del principio del
enfoque de la metagenómica, sino que también descubrieron una enorme diversi-
dad genética funcional en el mundo microbiano. La metagenómica Shotgun con-
siste en la secuenciación directa al azar del ADN ambiental y permite acceder a la
composición de genes funcionales de las comunidades microbianas y por lo tanto
da una descripción mucho más amplia que los estudios filogenéticos, que a me-
nudo se basan sólo en la diversidad de un gen, por ejemplo, el ARNr 16S.
Por su parte, la metagenómica brinda información genética acerca de nue-
vos potenciales biocatalizadores o enzimas, uniones genómicas entre la función y
la filogenia de los organismos no cultivados y los perfiles evolutivos de la función
de la comunidad y la estructura. Esto también puede ser complementado con me-
tatranscriptómica o metaproteómica para describir expresión de actividades (Tho-
mas et al., 2012).
La rápida y sustancial reducción del costo en las nuevas tecnologías de se-
cuenciación (Next generation sequencing) ha acelerado el desarrollo de la meta-
genómica basada en secuencias (Thomas et al., 2012). Este procedimiento está
siendo ampliamente usado en el campo de la ecología microbiana para estudiar la
variación producida por la fertilización N Fierer et al (2012a); para describir co-
munidades microbianas en pastizales Delmont et al (2012) y para comparar atri-
butos funcionales de la microbiota de suelos de desiertos fríos, desiertos cálidos,
bosques, pastizales y tundra Fierer et al (2012b).
Aún cuando está herramienta permitió acceder a información nunca antes
lograda, considerables retos permanecen en el análisis de estos datos, particular-
mente con respecto al análisis de velocidad. No obstante ello, el set de datos de
secuencias de metagenomas shotgun creció enormemente en pocos años.
En el futuro se utilizará la metagenómica de la misma manera que hoy se
utilizan los métodos fingerprinting basados en el ARNr 16S para describir la di-
versidad microbiana (Thomas et al., 2012). Por ello es esperable que esta técnica
se convierta en una herramienta estándar en los laboratorios de microbiología de
suelos.
-132-
Tabla 1. Cuadro comparativo de las ventajas, desventajas y costo de cada metodología molecular
Método Ventajas Desventajas Costo relativo Referencia

- Alto consumo de
- Alto nivel de resolución
tiempo
(especie) en conjunción
- Se requiere un - Drenovsky et
con secuenciación.
software especial al., 2008
DGGE - La recuperación de la se- *
para analisis de - Kirk et al.,
cuencia es sencilla ya que
geles 2004
las bandas se cortar física-
- Solo detecta espe-
mente del gel
cies dominantes
- Altamente reproducible - Resolución a

- Puede ser automatizado nivel de género Drenovsky et
TRFLP **
- Analisis de datos me- - Se requiere estan- al., 2008
diante software libre darizar los datos
Perfiles de comunidad al- Requiere gran can- Kirk et al.,

RISA/ARISA **
tamente reproducibles tidad de ADN 2004
- Algunos ADNss
- No requiere GC clamp
pueden formar mas Kirk et al.,
SSCP - No requiere gradiente *
de una conforma- 2004
desnaturante
ción estable
- Rápido, robusto y pre-

- Alto coto
ciso
- Requiere dominio
- Puede ser automatizado
de bioinformática
Pirosecuenciación - Es el método que mayor ******
para manejo de la
información proporciona
gran cantidad de
respecto de la estructura
datos obtenidos
de la comunidades
- Provee información pre-

PCR cuantitativa Alto costo ***
cisa de abundancia
- Alto coto
- Es el método que mayor - Requiere dominio
Metagenómica información proporciona de bioinformática
******
shotgun respecto de la función de para manejo de la
las comunidades gran cantidad de
datos obtenidos
Nota: *(bajo costo); ****** (alto costo)
-133-
Técnicas bioquímicas
Otro enfoque que permite describir la funcionalidad de los microorganismos

del suelo es el empleo de técnicas bioquímicas. A continuación describiremos dos
metodologías ampliamente difundidas en el ámbito de la microbiología de suelo:
Biolog y Respiración múltiple sustrato inducido. El primero mide la actividad me-
diante una reacción de reducción de tetrazolio (Garland y Mills, 1991) mientras
que el segundo se basa en una medición directa del CO2 producido (Degens y Ha-
rris, 1997; Campbell et al., 2003) o consumo de O2 (Garland et al., 2003).
Biolog
Un método CLPP (community level physiological profiling) requiere la ex-
tracción de las células de la muestra de suelo, que es inoculado directamente en
microplacas, con diferentes fuentes de carbono, disponibles comercialmente como
Biolog Eco Plate. Un set de datos de absorbancia o densidad óptica, uno por sus-
trato, es obtenido de las mediciones colorimétricas de la reducción de un colorante
de tetrazolio. Aunque es una técnica basada en cultivo, se encontró que células no
cultivables responden a este método (Garland y Lehman, 1999). Este método no
sería tan sesgado como las técnicas de cultivo tradicionales (Preston-Mafham et
al.2002). Sin embargo, el metabolismo de un sustrato particular durante un ensayo
CLPP no indica necesariamente lo que ocurre en el campo (Garland y Lehman,
1999). En sentido inverso, la falta de metabolismo de un sustrato no refleja la fun-
cionalidad de la comunidad in situ.
Smalla et al. (1999) notó que CLPP refleja solo las características funcio-
nales de aquellos microorganismos capaces de crecer o estar activos en condicio-
nes de ensayo, dando una imagen incompleta de la funcionalidad de la comunidad
(Preston-Mafham et al., 2002).
Por otra parte, la diversidad metabólica no necesariamente indica la diver-
sidad de especies, como en el caso de una comunidad compuesta de pocos gene-
ralistas y un gran número de especialistas (Garland, 1997; Konopka et al., 1998).
Aun con las limitaciones que presenta este método, CLPP usando Biolog,
provee resultados rápidos y reproducibles que permite discriminar comunidades
de bacterias en muestras ambientales (San Miguel et al.,2007). Por tal motivo,
está siendo ampliamente empleado en estudios de ecología microbiana (Weber et
al., 2007; San Miguel et al., 2007; Weber y Legge, 2009; Tiquia, 2010; Bang
Zhang et al., 2011).
Respiración múltiple sustrato inducido. Sistema Oxitop.

La respiración múltiple sustrato inducido es un método para caracterizar y
-134-
evaluar la diversidad funcional de la microbiota y es una de las varias técnicas

para generar perfiles fisiológicos a nivel de comunidad. Usualmente un set sus-
tratos carbonados de diferente naturaleza química (amino ácido, ácidos carboxí-
licos, aminas, carbohidratos, amino ácidos, aminas) es agregado a la muestra de
suelo y la cantidad de CO2 producido representa, para cada sustrato, la respuesta
catabólica de la comunidad microbiana (Peham y Bruckner., 2012), tanto de cul-
tivables como no cultivables.
Peham y Bruckner (2012) destacan dos problemas con este método rela-
cionado con su aplicabilidad en estudios a gran escala. Primero, el número de sus-
tratos usados en varios otros estudies es grande (Degens y Harris, 1997; Garland
y Mills, 1991) y las mediciones en campaña fueron laboriosas y costosas. El cri-
terio para la inclusión de sustratos específicos raramente fueron explicitados, y el
set de sustratos vario considerablemente entre autores y papers (Peham y Bruck-
ner., 2012). Degens y Harris (1997) hicieron su elección de acuerdo a la fuerza y
variabilidad de las respuestas catabólicas. Campbell et al (1997) sugiere que el
uso de sustratos “ecológicamente relevantes” (especialmente exudados radicula-
res) sería más eficiente y menos costoso. Por lo tanto, antes de adoptar este método
en programas a gran escala, debería identificarse un set mínimo de sustratos con
alto poder discriminativo (Peham y Bruckner., 2012). Segundo, las recomenda-
ciones para concentraciones óptimas difieren de autor a autor (Degens y Harris,
1997; Campbell et al., 2003). Además los resultados de Lalor et al (2007) indicaron
que el nivel de concentración afecta la sensibilidad del método.
Esta metodología por lo general consiste en la captura, por diferentes téc-
nicas, del CO2 producido y posterior determinación por cromatografía. Esto hace
que las mediciones sean muy laboriosas. En la actualidad existe un sistema de
medición llamado oxitop que permitiría simplificar la medición de CO2.
El sistema Oxitop consiste en una botella con cierre hermético y una cabeza
acoplada mediante rosca que lleva incorporado un sensor sensible a los cambios
de presión en el interior de la botella, esta cabeza se conecta a través de un sensor
infrarrojo a un control en cual tiene la función de transferencia de datos. Debido
a su aplicación reciente en estudios de suelo, se requerirá la puesta a punto del
método. La medición respirométrica consiste en una medición de diferencias de
presión. El consumo de oxigeno en un recipiente cerrado genera una presión ne-
gativa. El aparato registra la diferencia de presión del sistema dada por la dismi-
nución de presión generada por el consumo de O2 ya que el CO2 generado
producto de la respiración se une a un absorbente (NaOH) y por lo tanto no ejerce
presión. Las cabezas inteligentes, del sistema de control oxitop miden y registran
la presión a través del tiempo y calcula la demanda bioquímica de oxigeno según
la fórmula (Slevogt Strabe, 2006), los datos se convierten a mg C-CO2 kg-1 de
suelo.
-135-
El sistema es usado en monitoreo respirométrico de biodegradabilidad de

compuestos orgánicos en muestras ambientales (Reushenbach et al., 2003; Junker
et al, 2010); en monitoreo de actividad microbiana del suelo (Taok et al., 2007);
en evaluación del efecto de fungicidas sobre la respiración edáfica (Cernohlavková
et al., 2009), y Peham y Brunckner (2012) sugieren que el sistema es aplicable
en mediciones de respiración multiple sustrato inducido.
Por otra parte, este sistema, al registrar la producción de CO2 (consumo
O2) en el tiempo permite ajustar la curva de acumulación de CO2 a una ecuación
no lineal Ct = C0*(1-e-kc*t), donde Ct=la cantidad acumulada de carbono, x=el
tiempo en días y las constantes del modelo se interpretan como C0=la máxima
cantidad de carbono potencialmente mineralizable desde el carbono orgánico del
suelo por la actividad respiratoria de la microflora heterotrófica aeróbica (» capa-
cidad de carga de las poblaciones con crecimiento logístico), kc=la tasa de mine-
ralización y el producto kc*C0=la velocidad en el momento cero (Albanesi et al.,
2003).
Tabla 2. Cuadro comparativo de las metodologías bioquímicas
Método Ventajas Desventajas Costo

- Analiza solo microorga-
nismos cultivables
- Favorece a los organis-
mos de rápido creci-
- Rápido miento
Biolog ***
- Sencillo -Alta concentración de
sustrato puede inhibir el
crecimiento de algunos
grupos microbianos
- Alto costo
- Sencillo
- Explora la microflora
Repiración Múl- total (cultivables y no
tiple sustrato in- cultivables) Alto consumo de tiempo *
ducido - Se puede automatizar
las mediciones con el sis-
tema oxitop
Estudio de caso
En una experiencia llevada a cabo en el Chaco semiárido argentino (EEA

INTA Santiago del Estero) se evaluaron parámetros físicos, químicos y microbio-
lógicos en un bosque nativo (T) y en un sistema silvopastoril (SP) de 1 año y 5
años. En ambos tratamientos se estudio el suelo bajo la coberturas de las especies
-136-
arbóreas más representativas: Qc, suelo bajo la cobertura de quebracho colorado

(Schinopsis lorentzii); Qb, suelo bajo la cobertura de quebracho blanco (Aspidos-
perma quebracho blanco); M, suelo bajo la cobertura de mistol (Ziziphus mistol).
Se evaluó la estructura de las comunidades de microorganismos del suelo mediante
tRFLP y DGGE.
Los resultados demostraron que la transformación de bosque nativo a sis-
tema no modifica la DA y el pH del suelo (Tabla 3). El carbono orgánico del suelo
disminuye a los cinco años y la especie mistol tiene gran importancia por su ca-
pacidad de atenuar estos cambios. Los cambios en stock de C están relacionados
con la tasa de mineralización, que es mayor en SP.
Las metodologías tRFLP y DGGE (Figuras 4 y 5) fueron lo suficientemente
sensibles como para detectar cambios debidos al tratamiento y a la cobertura. Los
perfiles TRFLP evidencian que luego de cinco años del disturbio se ha generado
un cambio en la composición de las comunidades bacterianas del suelo, aumen-
tando su diversidad. Mediante TRFLP se detecto que la composición de las co-
munidades bacterianas en SP se distingue claramente de las de T y, en SP, depende
claramente de la especie arbórea. Por el contrario esta dependencia no se detecta
en el testigo probablemente debido a la heterogeneidad natural. Por otra parte,
mediante DGGE se observaron diferencias en la comunidades entre T y SP y, que
Aerobacterium sp y Escherichia spp solo están presentes en T, mientras que Ba-
cillus spp y Dehalococcus spp solo están en SP. A su vez, dentro de T, Actinobac-
terium sp está presente solo en Qb y, dentro de SP, Trichococcus spp aparece solo
bajo Qc. Cinco años de tratamiento es suficiente para generar cambios en la es-
tructura de las comunidades bacterianas del suelo. Este cambio, en coincidencia
con Kim et al. (2013) y Mitchell et al. (2012), está fuertemente asociado con el
cambio en la estructura de la vegetación y con el contenido de C orgánico.
Tabla 3. Densidad aparente (DA), pH, Carbono orgánico total (COT), carbono orgánico particu-
lado (COP) y respiración edáfica (RE); carbono potencialmente mineralizable (C0) y la tasa de
mineralización del carbono (kc) en los diferentes tratamientos y coberturas. P<0.05 indican dife-
rencias significativas
Tratatamiento Cob DA pH COT COP RE C0 kc

M 0,79 abc 6,36 ab 33,8 d 29,1 c 31 cd 312,8 a 0,11 b
T Qb 0,81 abc 6,74 bcd 29,7 bcd 22,9 b 32 cd 319,2 a 0,07 b
Qc 0,86 abc 6,63 bc 27,2 b 19,5 b 43 f 299,9 a 0,16 b
M 0,88 abc 6,15 a 27,8 bc 23,6 b 23 ab 229 b 0,28 a
SP Qb 0,93 c 6,59 bc 17,3 a 11,8 a 28 bcd 225,7 b 0,28 a
Qc 0,9 bc 6,66 bc 17,9 a 12,4 a 30 bcd 224,8 b 0,24 a
Referencias. T: Testigo, bosque nativo; SP: sistema silvopastoril.

-137-
Figura 4. Dendograma construido en base a la similitud de los perfiles TRFLP.
1-Aeromicrobacterium sp
2-Escherichia sp
3-Actinobacterium sp
4-Trichococcus sp
5-Bacillus sp
6-Dehalococcus sp
7-Uncultured bacterium
8- Uncultured Bacillus sp
Figura 5. Perfiles DGGE y bandas secuenciadas
-138-
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Microbiología y Bioquímica de suelos cultivados bajo
Siembra Directa en Argentina
Microbiology and Biochemistry of cultivated soils under

tillage in Argentina
Montero, Fabio A.a, Marcelo A. Sagardob*
Resumen
Durante los últimos 40 años los sistemas de conservación de suelos han

avanzado en los principales países agrícolas del Mundo, evolucionando desde 2,8
millones de hectáreas en los años 1973/74 hacia 111 millones en 2009. El interés
está dado principalmente a través de la Siembra Directa (SD), la que en los últimos
años ha incrementado a razón de 7 millones ha-1año-1. En esta presentación se ex-
ponen algunos de los estudios microbiológicos y bioquímicos realizados en Ar-
gentina, con suelos cultivados bajo SD. Así, se estudió: la diversidad de
Bradyrhizobium. japonicum en suelos bajo SD; la sensibilidad de parámetros bio-
químicos en suelos cultivados con distintos manejos; la mayor abundancia de las
comunidades microbianas en un suelo bajo SD, junto a la demostración de que
soja cultivada bajo SD no sufría el efecto de Macrophomina phaseolina (Tassi) y
que suelos de la zona semiárida, después de 10 años de SD, aumentaban el tenor
de C y de N. Finalmente, se presenta un trabajo que muestra la influencia de las
estaciones climáticas y el tiempo de manejo bajo condiciones exclusivas de SD,
incluyendo el efecto de la fertilización a campo, sobre el Carbono de la Biomasa
Microbiana de suelos de cuatro sitios agrícolas.
Palabras clave: microbiología, siembra directa, suelos.
Introducción
Durante los últimos 40 años se ha producido un avance en la aplicación de

los sistemas de conservación de suelos en los principales países agrícolas del
Mundo. Así en los años 1973/74 los sistemas de conservación cubrían solamente
2,8 millones de hectáreas en el Planeta y con el paso de los años esa extensión au-
a
Rizobacter Argentina S.A., Parque Industrial Pergamino, 2700 Pergamino, Pcia. Buenos Aires,
Argentina.
b
Departamento de Agronomía (CONICET), Universidad Nacional del Sur (UNSur), 8000 Bahía
Blanca, Pcia. Buenos Aires, Argentina. *Email: masagardoy@gmail.com
-145-
mentó hasta alcanzar 45 millones de hectáreas en 1999, 72 millones en 2003 y

111 millones en 2009 (Derpsch et al. 2010). Ese interés por una producción agrí-
cola conservacionista, principalmente a través de la Siembra Directa (SD), lo ra-
tifica el hecho de que en los últimos 11 años ha aumentado su aplicación a razón
de 7 millones ha-1año-1. En la Tabla 1 se puede comparar la aplicación de técnicas
conservacionistas realizadas en las Américas, principalmente en USA, Brasil, Ar-
gentina y Paraguay, con otros países. Además, desde un punto vista cuantitativo
se ha establecido que el área global bajo agricultura conservacionista en Sudamé-
rica alcanza al 45%, USA 32%, Australia y Nueva Zelanda 14% y 9% en el resto
del Mundo incluyendo Europa, Asia y África (Friedrich et al. 2012). En nuestro
país se realizó en 1977 en la Estación Experimental del INTA Marcos Juárez la
Primera Conferencia Nacional sobre Siembra Directa y en 1979, en la ciudad de
Rosario (Santa Fe) se realizó la Segunda Reunión Nacional. En 1986 se conformó
la Asociación Argentina de Productores de Siembra Directa (AAPRESID), reali-
zando esa Asociación a partir de esa fecha una extraordinaria actividad que se tra-
dujo en Estudios en campos de productores, Reuniones técnicas y Congresos
específicos sobre el tema, permitiendo que agricultores, ganaderos, técnicos e in-
vestigadores intercambien constantemente información sobre los beneficios y pro-
blemas que presenta el Sistema Siembra Directa a nivel de suelos y producción
agrícola en distintas áreas de nuestro país y del Mundo (Derpsch et al. 2010). En
esta presentación aceptando la importancia de la SD a nivel de los productores ar-
gentinos, se presentan algunos de los estudios microbiológicos y bioquímicos re-
alizados, durante estos últimos años, con suelos cultivados utilizando SD bajo
distintas condiciones ecológicas.
Tabla 1. Países que adoptan el sistema de agricultura conservacionista (países con más de 100.000
ha) (Friedrich et al., 2012).
Países Área (ha)

USA 26.500.000
Argentina 25.553.000
Brasil 25.502.000
Australia 17.000.000
Canadá 13.481.000
Rusia 4.500.000
China 3.100.000
Paraguay 2.400.000
Kazakstán 1.600.000
Bolivia 706.000
Uruguay 655.100
-146-
Microbiología y Bioquímica de suelos cultivados bajo Siembra Directa en Argentina
España 650.000
Ucrania 600.000
Sudáfrica 368.000
Venezuela 300.000
Francia 200.000
Zambia 20.000
Chile 180.000
Nueva Zelanda 162.000
Finlandia 160.000
Mozambique 152.000
Reino Unido 150.000
Zimbawe 139.300
Colombia 127.000
Otros 409.440
Total 124.794.840
Estudios microbianos y manejos
En nuestro país, Pastorino et al., (2011) estudiaron mediante técnicas tradi-

cionales y de biología molecular, la diversidad de rhizobios aislados de suelos de
la Provincia de Santa Fe, con capacidad para nodular a soja (Glycine max L.) Me-
rrill. Las muestras de suelos provenían de dos condiciones de cultivo diferentes:
por un lado suelos trabajados con siembra directa y cultivo antecesor soja, y por
otro lado suelos con siembra convencional y cultivo antecesor maíz. Los autores
evaluaron un total de 170 aislamientos de rhizobios demostrándose en lo que hace
a su capacidad de fijación de nitrógeno que: de 95 bacterias aisladas de los suelos
bajo siembra directa, 28 cepas mostraron niveles de fijación de nitrógeno supe-
riores a E109 (cepa INTA derivada de B. japonicum 138). A partir de los suelos
cultivados con labranza convencional se estudiaron 75 aislamientos, de ellos sólo
uno fijó más nitrógeno que E109. Además, las cepas que mostraron mayor capa-
cidad de fijación de N aumentaron la producción de materia seca de la parte aérea
de plantas de soja, bajo condiciones de laboratorio, entre un 10% y 20 % respecto
a E109. Finalmente, los investigadores estudiaron la supervivencia de los aisla-
mientos sobre la superficie de la semilla de soja (Figura 1). Los resultados mos-
traron que la tasa de mortalidad de esas bacterias sobre la superficie de la semilla
fue similar, demostrándose que sólo el 18,7% (SD-antecesor soja) y 10% (SC-an-
tecesor maíz) de los aislamientos, mostraron una mejor capacidad de sobreviven-
cia sobre la semilla que la estirpe testigo. Los autores concluyeron que los suelos
-147-
estudiados albergaban una relevante diversidad de rhizobios que probablemente

se originó a partir de las estirpes utilizadas para realizar las inoculaciones de la
soja.
Figura 1. Tasa de mortalidad de 170 rhizobios, aislados de suelos de Santa Fé, sobre semillas de
soja respecto al testigo E109 (SD= s. directa, SC= s. convencional).
En la práctica agrícola el tenor de la materia orgánica (MO) es reconocido

como un indicador de la calidad de un suelo (Rotenberg et al., 2007). Sin embargo,
la biomasa microbiana (BM) que actúa sobre la degradación de la MO puede re-
accionar más rápidamente que los cambios que se producen en el tenor de MO de
un suelo. Así, Nannipieri (1994) afirmó que ese tipo de parámetros, sensibles y
rápidos en su respuesta, pueden constituir una señal sensible y de utilidad para
calcular la calidad edáfica, incluso más rápidamente que las propiedades físicas y
químicas de un suelo. En 2009 Ferreras et al., estudiaron la sensibilidad de ocho
parámetros químicos y bioquímicos (C orgánico total-COT, C asociado a la frac-
ción fina-COff, C asociado a la fracción gruesa-COfg, C de la biomasa micro-
biana-CBM, actividad respiratoria microbiana-ARM y actividad de las enzimas
fosfatasa ácida-Pasa, deshidrogenasa-Dasa) y ureasa-Uasa) en suelos cultivados
bajo distintos manejos en Oliveros, Marcos Juárez y Rafaela. Uno de los objetivos
de los autores fue poder establecer parámetros que reflejaran de manera más sen-
sible y temprana el grado de degradación o recuperación de los suelos estudiados.
Los autores concluyeron que la estimación del CBM, el cociente metabólico mi-
crobiano-qCO2 (calculado como el cociente entre ARM y CBM) y la actividad
de las enzimas entre diferentes situaciones de trabajo agrícola, podían indicar en
el corto plazo cambios en la calidad del suelo.
Perez Brandan et al. (2012) realizaron un estudio en Salta o sea en la región
subtropical de nuestro país donde evaluaron, en un suelo franco cultivado con soja
y trabajado durante 20 años, el efecto de dos sistemas de labranza (mínima-LM y
-148-
convencional-LC), siembra directa (SD) y SD con escarificación (SDE), sobre las

propiedades biológicas, químicas y físicas del suelo. Los resultados mostraron
que la SD presentó valores mayores que LC en: hongos cultivables (26,33 x 105
vs. 2,33 x 105 UFC g-1 suelo seco), bacterias totales (182 x 107 vs. 64 x 107 UFC
g-1 suelo seco), respiración microbiana (0,77 vs. 0,45 mg CO2 semana-1) y en la
hidrólisis de fluoresceína diacetato (FDA) (4,17 vs. 1,70 µg fluoresceína g-1 h-1),
probándose mediante estudios de biología molecular que las comunidades fúngi-
cas y bacterianas fueron fuertemente influenciadas por el sistema de labranza uti-
lizado. Además, el estudio de los ácidos grasos (FAME) mostró que la estructura
de la comunidad microbiana en SD y LC era claramente diferente, presentando
SD una biomasa microbiana altamente significativa respecto de los otros tres tra-
tamientos estudiados, no detectándose diferencias significativas entre la biomasa
fúngica de los mismos.
Los autores observaron que las comunidades microbianas no sólo eran más
abundantes y activas en SD que en LC sino que bajo SD el suelo mostró mayor
tenor de MO, N total, K y Ca junto a un mejoramiento de la conductividad eléc-
trica y la estabilidad de los agregados respecto al suelo trabajado bajo LC. Final-
mente, la soja cultivada en directa no fue afectada por Macrophomina phaseolina
(Tassi); caso contrario fue bajo LC donde la incidencia de la enfermedad sobre
soja alcanzó al 54%. Esas diferencias estaban relacionadas con la mayor abun-
dancia y actividad biótica bajo SD respecto a LC, factor fundamental de la supre-
sión del patógeno de la soja en el suelo de la zona subtropical estudiada.
Abril et al. (2005) escribieron que la SD era relativamente reciente en la
Argentina y que además, la mayoría de los trabajos habían sido realizados en la
Región Húmeda pampeana siendo escasas las referencias para la zona semiárida
central, a pesar de que el incremento de la cobertura de rastrojo era particularmente
útil en suelos de regiones semiáridas con limitante de agua. Además, reconocían
que trabajando con SD los estudios de largo alcance eran esenciales debido a que
los cambios en las propiedades edáficas a corto plazo son usualmente poco detec-
tables. El estudio se realizó en la EEA INTA Manfredi, donde en 1992 se estable-
cieron dos ensayos en un lote de aproximadamente 10 ha cuyas condiciones de
fertilidad en el horizonte 0-20 cm eran: MO 2,0% y N total 0,12%. El lote selec-
cionado tenía historia ganadera y los últimos siete años previos al ensayo agricul-
tura continua con laboreo. Uno de los ensayos fue cultivado anualmente con soja
y el otro con una rotación soja-maíz. Ambos ensayos se sembraron anualmente
en el mes de noviembre con los siguientes tratamientos: a) laboreo conservacio-
nista (control) laboreado con cincel y cultivador en pre-siembra (LC); b) siembra
directa con un verdeo invernal generalmente avena (VI) y c) siembra directa con
control químico de malezas invernales (BQ). El maíz se fertilizó todos los años
(entre 60 y 120 kg de N ha-1, según los años), mientras que la soja y la avena no
se fertilizaron. Las unidades experimentales fueron parcelas de 35 m x 110 m con
un diseño completamente aleatorizado con dos repeticiones. Los estudiosos eva-
luaron los cambios, a los 5 y 10 años de implantados los estudios, de algunas pro-
-149-
piedades químicas (MO, N total y NO3-N) y biológicas del suelo (actividad y bio-
masa microbiana) y la cantidad y calidad de la cobertura de rastrojo en los sistemas
implantados.
En coincidencia con lo comúnmente observado, los suelos del horizonte
más superficial (0-10 cm) bajo SD ganaron en contenido de C y N siendo esa ga-
nancia claramente mayor con más años bajo SD. Los porcentajes de ganancia ob-
servados en este trabajo después de 10 años (aproximadamente 20% para C y 25%
para N) fueron semejantes a los obtenidos en suelos de igual profundidad en zonas
semiáridas de Australia luego de 21 años bajo SD (19%) (Heenan et al., 2004).
Los autores destacaron que los resultados obtenidos eran mayores a los obtenidos
en regiones húmedas de la Pampa con 10 años de SD, donde se obtuvieron ga-
nancias de 12% de C y N, y en el Sur de Brasil donde con 12 años de SD se re-
gistraron aumentos de 8% en C y 11% en N. El contenido de NO3-N, la biomasa
y actividad microbiana, de los tratamientos estudiados, mostraron alta variabilidad
en ambas fechas de muestreo, 5 y 10 años, mostrando una fuerte relación con las
condiciones climáticas imperantes al momento de los muestreos. La cobertura del
rastrojo fue mayor en la rotación maíz-soja con antecesor maíz (2473,9 g m-2) que
en el monocultivo de soja (1035,7 g m-2), siendo la fracción del rastrojo no iden-
tificable muy importante en todos los tratamientos (rangos entre 2-10 t ha-1), lo
que favorecería la formación de un nuevo suelo superficial. Los autores conclu-
yeron afirmando que la liberación de nutrientes, a partir de un abundante rastrojo
en descomposición puede constituir una importante fuente de nutrientes por lo
que debería incluirse en los cálculos para requerimientos de fertilización de los
cultivos.
La gran mayoría de estudios reportados acerca de los efectos de la labranza
sobre la microbiología del suelo están basados en la comparación de SD y LC.
Pero poco se conoce cómo afecta el paso del tiempo en suelos exclusivamente
cultivados bajo SD. Montero (2000) estudió el efecto del tiempo en sistemas con
SD dado por los años de cultivo bajo SD y por las estaciones climáticas, sobre
diez variables microbiológicas en el perfil superficial (0-10 cm) de suelos agrícolas
de nuestro país. Los suelos pertenecían a 4 establecimientos agrícolas, ubicados
en Fortín Olavarría (FO) (Buenos Aires), Don Cristóbal 2° (DC2) (Entre Ríos),
Bengolea (B) (Córdoba) y Arequito (A) (Santa Fe). Al inicio del estudio el suelo
de FO tenía 1 y 4 años de SD, el de DC2 1 y 7 años, el de B 3 y 5 años y el de A
1 y 7 años de SD. Además, en algunos suelos con determinado tiempo bajo SD,
se estudió el efecto de la fertilización mineral aplicada por el productor para cada
cultivo. En cada sitio se utilizó un diseño de Parcelas Divididas en el tiempo,
donde durante dos años fueron determinados estacionalmente los niveles de bac-
terias heterotróficas, oligotróficas y ureolíticas, hongos filamentosos, respiración
(producción de CO2), C de la biomasa microbiana (CBM), actividades enzimáti-
cas de la deshidrogenasa, catalasa, fosfotriesterasa y ureasa y cuatro variables fi-
sicoquímicas (contenido de agua, temperatura, pH y tenor de N-NO3- del suelo).
Los cultivos realizados durante el tiempo de estudio incluyeron trigo, soja, maíz
-150-
y girasol. Es conocido que la biomasa microbiana es el componente vivo de la

materia orgánica de un suelo y que el comportamiento dinámico del CBM puede
responder rápidamente a los cambios resultantes de las prácticas de manejo de
suelo (Liu et al., 2010). En ese trabajo la evolución de los contenidos de C micro-
biano durante el tiempo de estudio resultó en diferentes tendencias según el sitio
considerado, pero en todos los casos las fluctuaciones observadas no demostraron
estar relacionadas con las estaciones climáticas. Así, en los suelos Haplustoles de
FO y B los niveles de CBM (22-78 mg C 100 g-1 y 6-54 mg C 100 g-1, respectiva-
mente) mostraron una cierta estabilidad durante el período de estudio, aunque
acompañada por aumentos significativos de todas las actividades enzimáticas es-
tudiadas (Figura 2 y 4). De acuerdo a lo propuesto por Kandeler et al., (1999b), la
biomasa microbiana permaneció estable pero la misma fue incrementando la pro-
ducción de enzimas a través de los dos años de estudio. De acuerdo a lo expresado
por Wardle et al., (1999), es posible que en esos suelos la biomasa microbiana se
comporte como un indicador de los cambios ambientales del suelo pero en un
largo plazo. En los suelos Argiudoles de DC2 y A, los tenores de biomasa micro-
biana (47-98 mg C 100 g-1 y 20-64 mg C 100 g-1, respectivamente) presentaron
fluctuaciones y tendieron hacia un aumento de hasta 219 % después de 14-21
meses de estudio (Figura 3 y 5).
Los manejos de cultivos con un mayor número de años bajo SD, en prome-
dio, mostraron un efecto positivo sobre las cantidades de C de la biomasa micro-
biana en los suelos de FO, DC2 y A, con significación (p< 0,05 o 0,01) en varios
muestreos estacionales de los dos primeros. Estas situaciones reflejaron la res-
puesta de la biomasa microbiana a la acumulación de sustrato carbonado que se
produce, a través de los años, en los suelos superficiales tratados con SD y mane-
jados adecuadamente (Kandeler et al., 1999a, 1999b). La biomasa microbiana en
el suelo está relacionada normalmente al contenido de C orgánico del suelo (Goyal
et al., 1992) y primariamente a la disponibilidad de sustratos derivados de los re-
siduos de cultivos (Omay et al., 1997), aunque también pueden influenciar las ra-
íces y sus productos rizosféricos (exudados, mucílagos y células muertas)
(Franzluebbers et al., 1994, 1995). El autor detectó una relación positiva entre los
contenidos de materia orgánica y los de C de la biomasa microbiana (relación li-
neal, R2= 0,74, p< 0,01), cuando se consideraron todos los suelos estudiados.
Considerando cada sitio de estudio, en algunos casos se evidenciaron rela-
ciones entre la biomasa microbiana y factores abióticos de los suelos. Por ejemplo,
en los suelos de FO se detectó una correlación significativa entre el pH y el CBM
(r= 0,79, p< 0,01). En los suelos con un mayor contenido de arcilla (DC2 y A) se
detectaron correlaciones negativas entre el contenido de agua y el CBM (r= -0,43
y -0,61, respectivamente, p< 0,05). En los suelos más arenosos (FO y B) los teno-
res de CBM demostraron no estar asociados a los contenidos de agua.
La fertilización mineral realizada por el productor mostró diferentes ten-
dencias sobre el CBM. En el suelo de 4 años de SD en FO, el aporte de fertilizan-
tes, en promedio para 18 meses, resultó en un incremento significativo del 11,4
-151-
% en el tenor de C microbiano. Fauci y Dick (1994) propusieron que la biomasa

microbiana puede ser incrementada directamente por el aporte de fertilizantes al
suelo o indirectamente por el retorno de más residuos, originados como resultado
de un mejoramiento en la nutrición vegetal. En ese suelo de FO, posiblemente el
fertilizante estimuló en forma directa a la biomasa microbiana, puesto que la fer-
tilización no incrementó el contenido de materia orgánica del suelo, si se considera
el último muestreo realizado allí. Según Goyal et al., (1992) el aumento de la bio-
masa microbiana debido a la fertilización puede ser atribuido a la presencia de
exudados radicales, mucílagos y restos de células, productos que tienen una exis-
tencia transitoria en el suelo. En los suelos de 7 años de SD en DC2 y de 9 años
de SD en A, la fertilización mineral, en promedio para 14-15 meses, no influyó
significativamente sobre los tenores de C de la biomasa microbiana. En los suelos
de 1 año de SD en DC2 y de 5 años de SD en B, se evidenció, en promedio, una
disminución de 9,2 y 24,4 % en los niveles de CBM, respectivamente, cuando se
aplicaron fertilizantes minerales durante 18 meses. Este efecto pudo estar relacio-
nado con: 1) un aumento de la proporción de células dormantes respecto al total
de la población microbiana por efecto de la deficiencia de N (Omay et al., 1997),
y/o 2) una reducción de la masa radical en suelos tratados con fertilizantes nitro-
genados, lo que conduce a una menor cantidad de sustrato carbonado para la bio-
masa microbiana (Lovell et al., 1995; Ajwa et al., 1999).
Figura 2. Cambios en el tenor de CBM en el suelo de Fortín Olavarría (Buenos Aires), a partir de
1 y 4 años de manejo bajo SD (NF= no fertilizado; F= fertilizado).
(a) Significación entre Promedio Suelo 4 años SD (NF) y Promedio Suelo 4 años SD (F) [*:
p= 0,06; F; n= 21]; (b) LSD (/2= 0,025) para las comparaciones en el tiempo dentro de
Suelo 4 años SD (F) o Suelo 1 año SD (F) (n= 3); (c) significación dentro de cada muestreo
entre Suelo 4 años SD (F) y Suelo 1 año SD (F) [ns: p> 0,05; **: p< 0,01; LSD; n= 3].
-152-
Figura 3. Cambios en el tenor de CBM en el suelo de Don Cristóbal 2° (Entre Ríos), a partir de 1
y 7 años de manejo bajo SD (NF= no fertilizado; F= fertilizado).
(a) Significación dentro de cada muestreo entre Suelo 1 año SD (NF) y Suelo 1 año SD (F)
[ns: p> 0,05; **: p< 0,01; LSD; n= 3]; (b) significación entre Promedio Suelo 7 años SD (NF)
y Promedio Suelo 7 años SD (F) [ns: p> 0,75; F; n= 18]; (c) LSD (/2= 0,025) para las com-
paraciones en el tiempo dentro de Suelo 1 año SD (F) o Suelo 7 años SD (F) (n= 3); (d) signi-
ficación dentro de cada muestreo entre Suelo 1 año SD (F) y Suelo 7 años SD (F) [ns: p>
0,05; *: p< 0,05; **: p< 0,01; LSD; n= 3].
Figura 4. Cambios en el tenor de CBM en el suelo de Bengolea (Córdoba), a partir de 3 y 5 años

de manejo bajo SD (NF= no fertilizado; F= fertilizado).
(a) Significación entre Promedio Suelo 5 años SD (NF) y Promedio Suelo 5 años SD (F) (1)
[*:p< 0,05; F; n= 21]; (b) significación para Promedio Suelo 5 años SD (F) y Suelo 3 años SD
(F) en el tiempo [ns: p> 0,08; F; n= 6]; (c) significación entre Promedio Suelo 5 años SD (F)
(2) y Promedio Suelo 3 años SD (F) [**: p< 0,01; F; n= 24].
-153-
Fig. 5. Cambios en el tenor de CBM en el suelo de Arequito (Santa Fe), a partir de 6 y 9 años de
manejo bajo SD (NF= no fertilizado; F= fertilizado).
(a) Significación entre Promedio Suelo 9 años SD (NF) y Promedio Suelo 9 años SD (F) (1)
[ns: p >0,80; F; n= 18]; (b) LSD (/2= 0,025) para las comparaciones en el tiempo dentro de
Suelo 9 años SD (F) o Suelo 6 años SD (F) (n= 3); (c) significación entre Promedio Suelo 9
años SD (F) (2) y Promedio Suelo 6 años SD (F) [ns: p> 0,25; F; n= 24].
Conclusiones
Los trabajos presentados, realizados por distintos investigadores bajo diferentes

áreas geográficas, demuestran la diversidad de resultados que es posible obtener
en suelos de nuestro país cultivados bajo SD. En la actualidad, y aceptando los
datos obtenidos durante los últimos 30 años, es aconsejable iniciar una nueva etapa
y realizar un Plan de trabajo conjunto que integre los resultados de investigadores
interesados en la física, química y biología de suelos junto a los productores com-
prometidos con los princípios fundamentales del sistema de SD. Pensamos que
ese esfuerzo de distintas voluntades permitirá obtener una información más com-
pleta, que ayude a un mejor y mayor uso del sistema de SD por parte de los pro-
ductores interesados en producir en forma sustentable.
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-156-
Diversidad de hongos en suelos agrícolas
Fungi soil diversity in agricultural lands
Moreno María Virginiaa,b, Bianchinotti María Virginia, Silvestro Luciana

Beléna, Vázquez María Belénc, Merlos Cristinaa, Stenglein Sebastián Albertoa,b
Resumen
En gran parte de las regiones con agricultura templada se proyecta una ex-
pansión del área de cultivo, lo cual dará continuidad al proceso de intensificación.
En los suelos cultivados, el Reino Fungi constituye la mayor parte de la biomasa
microbiana total, aportando más del 50% de la biomasa en el suelo Comprender
la respuesta de los componentes fúngicos del suelo es un aspecto crucial, ya que
pueden subsistir en ese ambiente como saprótrofos, parásitos o simbiontes. Co-
nocer estos organismos no se limita a estudiar el rol que juegan en el equilibrio
ecológico como degradadores de restos orgánicos, con el consecuente retorno de
nutrientes al suelo o como reguladores de poblaciones de fitopatógenos y plagas
en el caso de los entomopatógenos, sino que implica reconocer su capacidad de
producir enzimas y metabolitos secundarios de potencial uso biotecnológico. Su
diversidad y abundancia dependen del cultivo y su manejo, del tipo y manejo del
suelo, el macro y microclima del lugar, entre otros. Por lo cual, los hongos, deben
ser considerados como eslabones de una cadena productiva dentro de los agroe-
cosistemas, tanto por sus efectos perjudiciales como por sus atributos para la de-
gradación de la materia orgánica, que finalmente tendrá una función clave en la
nutrición de los cultivos.
Palabras clave: Fungi, diversidad, agroecosistemas
Introducción
Los hongos son omnipresentes en la mayoría de los ambientes, donde sue-

len colonizar una amplia gama de sustratos, desempeñando papeles complejos y
a
Laboratorio de Biología Funcional y Biotecnología (BIOLAB-INBIOTEC-CONICET-CIC), Fa-
cultad de Agronomía, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. República
de Italia Nº 780, Azul CP B7300. E-mail: vmoreno@faa.unicen.edu.ar.
b
Microbiología Agrícola, FAA-UNCPBA. c Laboratorio de Estudios Básicos y Biotecnológicos en
Algas y Hongos, LEBBAH CERZOS CONICET, CCT Bahia Blanca.
-157-
diversos en los ecosistemas y en la sociedad humana (Cantrell et al., 2006). Hasta

el presente, se han descripto unas 100.000 especies en el Reino Fungi, pero su nú-
mero se estima en unos 5 millones (Blackwell, 2011). El término Fungi abarca
globalmente todos los organismos que pertenecen a los Eumycota (hongos verda-
deros). El grupo Eumycota es monofilético y abarca unos 10 phyla (Kirk et al.,
2008), de los cuales los Ascomycota, Basidiomycota, P. Chytridiomycota y Glo-
meromycota son los más conocidos (James et al., 2006).
Entre los hábitats colonizados por los hongos, el suelo es considerado uno
de los más complejos para estudiar. El suelo es un entorno dinámico en el que la
actividad biológica se rige principalmente por los microorganismos. Cresswell y
Wellington (1992), estiman la abundancia de microorganismos en los suelos en el
orden de 105-108 unidades formadoras de colonias (ufc) para bacterias, 106-107
ufc para actinomicetos y 105-106 ufc para los hongos por gramo de suelo. El papel
de los hongos es extremadamente complejo y fundamental para el ecosistema
suelo. Ellos constituyen el 50 % de la biomasa microbiana del suelo agrícola, des-
componen materia orgánica, proporcionan nutrientes a las plantas y actúan como
indicadores de la salud del ecosistema (Bridge y Spooner, 2001). Diferentes estu-
dios señalan la necesidad de ser cautos al estimar “la diversidad del R. Fungi en
el suelo”, especialmente teniendo en cuenta, el gran número de especies que en él
habitan, las diferencias entre sitios de estudio, la falta de personal capacitado y de
manuales de identificación correspondientes para caracterizar las especies. Entre
otros, el tamaño y la heterogeneidad de las muestras han sido reportados como un
punto crítico que afecta a la distribución y la densidad de los hongos del suelo
(Horner-Devine et al., 2004; Schwarzenbach et al., 2007). Cannon (1997), reco-
mendó que tanto inventarios como programas de muestreo, se deberían llevar a
cabo en conjunto con un estudio exhaustivo de la variedad de nichos ecológicos
disponibles para la colonización por los hongos. Tradicionalmente, los hongos del
suelo han sido estudiados a partir de aislamientos en placas de cultivo y, práctica-
mente toda la información sobre su existencia y la prevalencia, se ha rescatado a
partir de estudios de cultivos “in vitro”. Sin embargo, muchos autores han enun-
ciado las restricciones de este tipo de cultivo, señalando que el porcentaje de hon-
gos cultivables varía desde un mínimo de <1% hasta un máximo de 100%,
dependiendo de los organismos y del material estudiado (Toivola et al., 2002;
Chao et al., 2002; Niemeier et al., 2006). Se sabe que la identificación de los hon-
gos puede requerir días a semanas, y son necesarios profesionales con experiencia
para llevar a cabo una fiable identificación morfológica. Asimismo, algunos or-
ganismos sólo pueden ser identificados a nivel de género o de grupo, y algunos
pueden permanecer morfológicamente indistinguibles en condiciones de labora-
torio (Pitäranta et al., 2008). Un gran número de hongos no han podido ser co-
-158-
rrectamente investigados, debido a que necesitan condiciones especiales durante

el cultivo “in vitro”, o bien no pueden ser cultivados, tales como aquellos hongos
de nutrición biotrofica (ya sean parásitos o simbiontes). Por otra parte, muchos
de los hongos o bien requieren más tiempo de cultivo o no producen estructuras
fértiles que permitan su identificación (Borneman y Hartin, 2000). La investiga-
ción micológica de esta manera se ve obstaculizada por la falta de técnicas dispo-
nibles para llevar a cabo un aislamiento exhaustivo de los hongos del suelo. Con
el fin de identificar una fracción más grande de especies en las muestras naturales,
varias técnicas moleculares han sido desarrolladas durante los últimos 15 años
(Kullnig et al., 2000; Klaubauf et al., 2010). Estas técnicas también estuvieron,
en un principio, limitadas por la escasa disponibilidad de datos de secuencias de
referencia fiables (Bridge et al., 2003). Los métodos moleculares más utilizados
en los estudios de hongos incluyen reacción en cadena de la polimerasa conven-
cional o cuantitativa (PCR-qPCR), con cenadores específicos para especies o gru-
pos de hongos (Curlevski et al., 2010; Klaubauf et al, 2010). La PCR con
cebadores para regiones conservadas combinada con electrofóresis en gel de gra-
diente desnaturalizante (DGGE) o electroforesis en gel de gradiente de tempera-
tura (Marcial-Gomes et al., 2003; Nicolcheva et al., 2003; Zhao et al., 2005;
Oros-Sichler et al., 2006; Gao et al., 2008); el análisis de polimorfismo mediante
el uso de variación de longitud de fragmentos terminales de restricción (TRFLP)
(Klamer et al., 2002; Nicolcheva et al., 2003; Klamer y Hedlund, 2004; Avis et
al., 2010). En los últimos años, técnicas como el análisis automatizado del espacio
intergénico del ADN ribosomal (ADNr) (ARISA), han sido utilizados para el es-
tudio de la diversidad de los hongos (Avis et al., 2010). Los métodos moleculares
tienen la ventaja de obtener información acerca de los organismos no cultivables,
pero también tienen limitaciones que no pueden ser ignoradas. Cómo por ejemplo,
la falta de secuencias disponibles en las bases de datos, la correcta selección de
los cebadores entre otras. Por lo tanto, es complejo concluir si una técnica para el
estudio de la diversidad es mas apropiada que la otra (Bridge et al., 2003; Kirk et
al., 2004).
Este capítulo ha centrado en los estudios de la diversidad de comunidades
de hongos en los suelos agrícolas con herramientas tradicionales y/o moleculares,
con énfasis en la PCR-DGGE.
Los hongos del suelo en los sistemas agrícolas
La biodiversidad agrícola está en gran parte determinada por las actividades

humanas, tales como la introducción de germoplasma mejorado y las técnicas de
manejo de los cultivos, que permiten ampliar las zonas de producción a otras zonas
-159-
nuevas (Ekboir y Morris, 2001). Los principales países productores de cereales

han aumentado su productividad a través de la aplicación de tecnologías que com-
binan principalmente nuevos desarrollos genéticos y ajustes más precisos en el
manejo de los cultivos. Mediante la aplicación de distintas prácticas destinadas a
conservar los recursos del suelo, tales como la rotación de cultivos, la labranza,
cultivos de cobertura y la labranza reducida, entre otros, se evita la degradación
de los recursos, utilizando un uso racional de los fertilizantes y permitiendo una
reposición de los nutrientes del suelo exportados por los cultivos (Forjan y Manso,
2008; Apezteguía et al., 2009).
La importancia de los hongos del suelo está muy bien documentada y abarca
una amplia gama de aspectos fundamentales en el funcionamiento de los ecosis-
temas, tales como la descomposición y la calidad de la agregación del suelo, los
procesos de reciclaje de nutrientes, la estimulación del crecimiento vegetal, la pa-
togenicidad y la supresión de la enfermedad (Thorn, 1997; Christensen, 1989; Ko-
walchuck, 1999). En los suelos cultivados, los hongos constituyen la mayor parte
de la biomasa microbiana total en este entorno, contribuyendo con más del 50%
de la biomasa en el suelo (Espina, 1997; Heredia Abarca et al., 2004). La actividad
fisiológica de los hongos aislados en diferentes ecosistemas depende del tipo de
metabolismo de los hongos y el medio edáfico en el cual se están desarrollando.
Las principales influencias internas que se imponen a la comunidad de hongos
son: el nivel y el tipo de materia orgánica, el pH, la aplicación de fertilizantes or-
gánicos e inorgánicos, el contenido de humedad, la aireación, la temperatura, la
profundidad en el perfil del suelo, la estación del año y la composición de la ve-
getación nativa o cultivada (Hatakka, 2001). Los hongos son heterótrofos, usan
el carbono orgánico para la síntesis celular, siendo capaces de degradar materia
orgánica compleja. Entre las fuentes de carbono orgánico usan: azúcares, ácidos
orgánicos, disacáridos, almidón, pectina, celulosa, grasas y lignina, siendo esta
particularmente resistente a la degradación microbiana. Obtienen el nitrógeno del
amonio o nitratos, así como de proteínas y otros compuestos orgánicos nitroge-
nados (Atlas y Bartha, 1998; Bogan y Lamar, 1996). La diversidad/abundancia
de los distintos géneros fúngicos se relaciona con la disponibilidad de fuentes de
carbono, algunos géneros aumentan su abundancia con la adición de fuentes or-
gánicas de carbono, otros la disminuyen después de un aumento inicial; mientras
que otros mantienen elevadas densidades de población por periodos largos con la
incorporación de restos vegetales (Lynch, 1990). Así, en el suelo, los hongos son
responsables de la mineralización de la materia orgánica sencilla y compleja (Atlas
y Bartha, 1998; Bumpus, 1989) participando en la formación de humus al degradar
residuos vegetales y animales (Higson, 1991). Las hifas contribuyen significati-
vamente a la formación de agregados estables favoreciendo una buena estructura
-160-
del suelo (Bethlenfalvay y Barea, 1994; Miller y Jastrow, 2000). Los hongos del
suelo, así como otros microorganismos son críticos para el medio ambiente suelo
(Dalal, 1998), pueden actuar tanto como fuente o sumidero para muchos elemen-
tos, así también como, agentes de transformación de nutrientes y degradadores de
agroquímicos (Ellicot y Des Jardín, 2001; Imberger y Chiu, 2002).
En las últimas tres décadas, numerosos estudios se han realizado para de-
tectar el efecto de la agricultura ecológica y convencional sobre los hongos del
suelo (Labouriau y Elmholt, 2000; Nesci et al., 2006; Samaniego-Gaxiola y Chew-
Madinaveitia, 2007). Existen antecedentes del efecto de la labranza sobre los hon-
gos patógenos de plantas, los formadores de micorrizas vesiculo-arbusculares y
los entomopatógenos (Klingen et al., 2002; Steinkellner y Langer, 2004; Meyling
y Eilenberg, 2006; Porras-Alfaro et al., 2007; Quesada-Moraga et al., 2007; Fer-
nández et al., 2008). En nuestro país, desde el 2000 a la actualidad, se han reali-
zado trabajos con hongos de suelos agrícolas, principalmente sustentados por
metodologías convencionales basadas en el uso de medios de cultivo para estudiar
la diversidad fúngica (Luque et al., 2005; Bonel y Morrás, 2000; Fracchia et al.,
2003; Novas et al., 2005; Nesci et al., 2006; Schalamuck et al., 2006, 2007; Gomez
et al., 2007; Irrazabal et al., 2008; Lori et al., 2009; Moreno et al., 2011; Silvestro
et al., 2013; Velazquez et al., 2013).
Análisis de la comunidad fúngica
Herramientas tradicionales
El análisis de la micobiota del suelo se realiza tradicionalmente empleando
métodos de cultivo y observación directa. Ambos tipos de técnicas pueden resultar
en la detección de un gran número de especies. Tradicionalmente, la diversidad
de los hongos se evaluó mediante siembra en medios selectivos y recuentos viables
directos de propágulos y esporas. El uso de estas técnicas permite conocer la di-
versidad de microorganismos asociados con diferentes parámetros de calidad del
suelo, detectar suelos supresivos, analizar la descomposición de la materia orgá-
nica, y corroborar el efecto de la aplicación de fungicidas y herbicidas (Anastasi
et al., 2005; Elmholt y Labouriau, 2005; Cantrell et al., 2006). Entre los métodos
más usados se destacan la suspensión y posterior siembra por dilución del suelo
(Steinkellner y Langer, 2004; De Cal et al., 2005; Elmholt y Labouriau, 2005;
Nesci et al., 2006). Esta técnica ha sido ampliamente discutida, se sabe que los
hongos pueden existir en el suelo como micelio activo y como esporas inactivas,
esta técnica no permite discriminar entre estas dos formas. En 1955, Warcup pro-
pone como alternativa otra técnica para detectar sólo micelio activo asociado al
suelo, la misma se ha seguiod utilizando hasta el presente (Deacon, et al., 2006).
-161-
Una técnica adicional a esta ha sido propuesta por el Parkinson y Williams (1961),
siendo su aplicación masiva (Martínez, et al., 2001; Cabello y Arambarri, 2002;
Deacon et al., 2006; Samaniego-Gaxiola et al., 2007; Silvestro et al., 2013). El
medio de cultivo utilizado para el aislamiento de los hongos del suelo es de suma
importancia. Probablemente, el uso de una amplia gama de medios selectivos sería
el enfoque más eficiente para un estudio completo de la estructura de la comunidad
hongos del suelo. Generalmente, cuando el objetivo principal del estudio es des-
cribir la comunidad de los hongos del suelo, los medios de cultivo seleccionados
son agar papa glucosado (APG), agar extracto de malta (AEM) y Czapek-Dox.
Los resultados obtenidos con estas técnicas han sido ampliamente publicados. El
uso de las herramientas tradicionales debe considerarse como la principal herra-
mienta de aproximación a la realidad.
Herramientas moleculares
En las últimas décadas, las técnicas moleculares han demostrado ser una
herramienta muy útil para la identificación de las especies y el estudio de la bio-
diversidad microbiana produciendo resultados muy interesantes en la interpreta-
ción de los problemas de desarrollo, taxonomía y distribución de las especies.
Diversos enfoques en base a la biología molecular de las comunidades microbianas
se han desarrollado para superar algunas de las limitaciones asociadas con las téc-
nicas tradicionales basadas en el cultivo (Marcial Gomes et al., 2003). Entre estos,
los sistemas de identificación basados en análisis de secuencias nucleotidicas, es
uno de los más conocidos y masivamente aplicado (Tang et al., 2007). Entre las
técnicas que implican el uso de la PCR, la primera respuesta fue el desarrollo de
reacciones específicas para detectar hongos patógenos. Para esto, los cebadores
se seleccionaron de acuerdo con el objetivo propuesto. Blanco et al. (1990) des-
cribieron varios cebadores para la amplificación del ADNr de hongos a partir de
una amplia gama de grupos taxonómicos. En los últimos años, la disponibilidad
de secuencias del genoma de los hongos filamentosos ha permitido que el número
de estudios de los hongos ambientales se haya incrementado (Borneman y Hartin,
2000; Kullnig et al., 2000; Möhlenhoff et al., 2001; Schabereiter-Gurtner et al.,
2001; Klamer et al., 2002; Landerweert et al.,2003; Green et al., 2004; Das et al.,
2007; Tang et al., 2007; Hatamoto et al., 2008; Molnár et al., 2008; Klaubauf et
al., 2010). El análisis molecular de la comunidad de hongos en muestras ambien-
tales parece simple, sin embargo, la principal dificultad es el diseño de cebadores
de PCR adecuados con especificidad hacia ADN fúngico. Una de las regiones del
ADN más ampliamente utilizada para los cebadores de diseño para identificar a
nivel de especie, es el espaciador transcripto interno (ITS) del ADNr que contienen
dos regiones no codificantes variables que se encuentran entre la subregión pe-
-162-
queña altamente conservada (18S), la subunidad 5.8S y la subunidad grande (28S).

Varias características hacen que esta sea una región conveniente para la identifi-
cación molecular de los hongos: a) es de aproximadamente 600 y 800 pares de
bases y puede ser fácilmente amplificada con los cebadores complementarios a
las secuencias dentro de los genes ADNr (White et al.,1990), b) al ser de copias
múltiples el ADNr, hace que la región ITS sea fácil de amplificar a partir de poca
cantidad de templado y c) varios estudios han demostrado que la región ITS es
variable entre las especies y poco variable intra-especies (Gardes y Bruns, 1991;
Chen et al., 1992; Lee y Taylor, 1992; O’Donnell, 1992) Anderson y Cairney
(2004) consideran que la identificación taxonómica de los hongos basadas en la
subunidad 18S del ADNr es limitada, debido al tiempo de evolución del R. Fungi,
que es más corto que el de las bacterias de acuerdo con Hugenholtz y Pace (1986).
Los Hongos y su relación con las prácticas agrícolas
En nuestro país los sistemas de labranza más utilizados son la siembra di-
recta y labranza reducida y en algunas regiones la labranza convencional. En ge-
neral, se ha observado que los sistemas de labranza, tienen diferentes efectos sobre
la comunidad de hongos del suelo, pero éstos generalmente están asociados tam-
bién con algún otro factor relacionado al manejo del cultivo, como ser, secuencia
de cultivos, riego y aplicación de agroquímicos. Es complejo detectar un único
efecto que sea atribuible sólo al tipo de labranza. Existen estudios cuyo objetivo
ha sido comparar la comunidad fúngica desde suelos sin disturbar o “recuperados”
frente a suelos agrícolas. Klamer y Hedlund (2004), observaron mayores valores
del índice de riqueza de especies (S) en suelos naturales respecto a suelos agríco-
las. En general, los estudios de diversidad de hongos, en sistemas agrícolas, tienen
como objetivo el detectar el efecto de diferentes prácticas de manejo sobre las po-
blaciones de hongos fitopatógenos o aquellos de potencial efecto antagonista, los
denominados biocontroladores, ya sea de insectos o de otros hongos. Klingen et
al. (2002), observaron un aumento en la población de hongos entomopatógenos
cuando se pasa de una producción con manejos convencionales a una con manejos
orgánicos. Meyling y Eilenberg (2006) observaron la prevalencia de Beauveria
Bastiana en suelos cultivados respecto a los suelos protegidos, en los cuales se
observaron mayor frecuencia de Paecilomyces fumosoroseus. Así como se ha es-
tudiado el efecto sobre los entomopatógenos, también se ha profundizado el estu-
dio sobre patógenos y saprótrofos. Vargas Gil et al. (2011) observaron diferentes
perfiles moleculares para la comunidad fúngica, siendo significativa la diferencia
entre siembra directa (maíz-soja) y labranza reducida (monocultivo de soja), no
así entre los dos sistemas de labranza con monocultivo de soja. Hagn et al. (2003)
-163-
no observaron diferencias a nivel de comunidad entre sistemas de labranzas des-

arrollados en bajos y lomas para el cultivo de trigo. Sin embargo, sí detectaron
diferencias en estructura de la comunidad, respecto al periodo fisiológico del cul-
tivo. Nesci et al. (2006) observaron que la población de hongos de suelo prove-
nientes de cultivo de maíz, fue mayor en suelos bajo siembra directa con y sin
pastoreo, respecto a los suelos bajo labranza convencional. Wakelin et al. (2008)
sugirieron que la incorporación de rastrojos en el suelo puede producir aumento
de própagulos de Fusarium spp., debido a su condición de celulolítico y posibili-
dad de sobrevivir como clamidospora. Se ha comprobado que la incorporación de
rastrojos aumenta el desarrollo de los hongos (Collins et al., 1990). Hongos tales
como Cochiolobus sativus y Pyrenophora tritici-repentis, han sido aislados desde
rastrojos de trigo ambos con implicancias sanitarias para el cultivo. Nesci et al.
(2006) observaron una mayor frecuencia de Aspergillus spp. en suelos bajo siem-
bra directa y con pastoreo, respecto a suelos bajo labranza convencional. El en-
tendimiento de los efectos de las diferentes labranzas sobre los hongos del suelo
o colonizadores de los rastrojos contribuye a la interpretación de la dinámica y
estructura de la comunidad fúngica del suelo. En general, se ha dicho que la siem-
bra directa aumenta la diversidad de especies fúngicas, con poblaciones de alta
densidad en los primeros 5 cm del suelo, lo que se relaciona con la disponibilidad
de nutrientes y la actividad de la micobiota celulolítica (Jumpponen et al., 2010;
Silvestro et al., 2013). Así, como aumenta el número de propágulos de saprofitos,
también lo hace el número de propágulos de fitopatógenos. Una manera de sub-
sanar este hecho es profundizar los estudios de diversidad de la comunidad fúngica
del suelo en los diferentes sistemas de labranza, bajo diferentes secuencias de cul-
tivos a los efectos de minimizar este aumento de inóculo potencialmente patógeno.
Un sistema de producción sustentable tiene en la rotación de cultivos una
de las herramientas más importantes y válidas para potenciar el funcionamiento
de los agroecosistemas (Forján, 2012). La rotación de cultivos genera tanto efectos
inmediatos como a largo plazo, entre ellos, lo más relevante está asociado a la di-
námica de la materia orgánica del suelo. Burke et al. (2011) observaron que la co-
munidad de hongos saprótrofos correlacionó positivamente con diferentes
actividades enzimáticas lo que sugiere su relación con el ciclo del C. Kennedy et
al. (2005), detectaron diferencias en biomasa fúngica de suelos provenientes de
diferentes pasturas, no así a nivel de estructura de la comunidad. Singh et al.
(2009), observaron que la especie vegetal tiene un efecto significativo sobre la es-
tructura de la comunidad fúngica. Porras-Alfaro et al. (2011), observaron que la
comunidad fúngica de pasturas en regiones semiáridas, tanto de suelo rizosférico,
como del no rizosférico, estuvo mayormente representada por miembros del Orden
Pleosporales (Ascomycota). Sobre rastrojos de trigo se han aislado como géneros
-164-
dominantes Fusarium, Mucor, Penicillium y Trichoderma (Harper y Linch, 1985;

Luque et al., 2009). Es por ello que tanto la secuencia de cultivos y la duración de
los rastrojos en el suelo deben ser tenidos en cuenta para controlar la sanidad, ya
que los residuos vegetales son fuente de inóculo para cultivos sucesivos. Tanto F.
solani como F. graminearum han sido detectados sobre rastrojos de trigo, soja y
maíz (Shurtleff, 1980; Wiese, 1986; Roy et al., 1997). Se ha corroborado, a partir
de numerosos trabajos que la diversidad de Fusarium spp. en suelos agrícolas está
estrechamente ligada a la secuencia de cultivos utilizados en la rotación (Bateman
y Murray, 2001; Steinkellner y Langer, 2004; Wakelin et al., 2008). Silvestro et
al., (2013), no observaron diferencias significativas para el índice de Shannon (H’)
y S de Fusarium en suelos donde se aplican diferentes secuencias de cultivo bajo
siembra directa.
Es conocido que la agricultura moderna se apoya fuertemente en el uso de
fertilizantes y agroquímicos con el fin de obtener mejoras económicas, aumen-
tando la productividad para una población mundial en aumento. En general la es-
tructura de la comunidad fúngica se ve menos afectada que la bacteriana frente a
la aplicación de agroquímicos (Girvan et al., 2004; Treonis et al., 2004; Kennedy
et al., 2005). Se ha comprobado que la fertilización influye sobre la estructura y
biomasa de la comunidad fúngica del suelo (Bardgett et al., 1996; Donnison et
al., 2000; Singh et al., 2009). En varios estudios se ha observado que la fertiliza-
ción con N produce una reducción en la biomasa fúngica (Brodie et al., 2003;
Kennedy et al., 2005). Sin embargo, Schalamuk et al. (2006), no observaron dife-
rencias significativas entre los valores de H’ para micorrizas arbusculares, en sue-
los fertilizados y sin fertilizar. Klaubaf et al. (2010) observaron en suelos con alto
contenido de N la prevalencia de organismos pertenecientes al P. Ascomycota
(Sordariales, Hypocreales y Helotiales). Elmholt y Labouriau, (2005), observaron
una mayor presencia de Penicillium y Gliocladium en suelos con fertilizantes bio-
lógicos respecto a suelos con fertilizantes químicos, en los cuales el género más
abundante fue Trichoderma. Porras-Alfaro et al. (2011) no detectaron diferencias
significativas para S entre suelos fertilizados y no fertilizados. Sin embrago, sí
detectaron pequeños cambios a nivel de abundancia de ciertas especies.
Por otro lado, el uso de herbicidas en agricultura es un claro ejemplo del
dilema costo-beneficio que plantea toda actividad humana en un ecosistema. Por
un lado, los herbicidas introducen beneficios obvios como el aumento del rendi-
miento de los cultivos por el control de las malezas que compiten por el recurso
suelo con los cultivos (Cooper y Dobson, 2007); pero los efectos indeseados, di-
rectos o indirectos, son numerosos, y su destino final en el ambiente es un motivo
de preocupación en los últimos tiempos, dado que solo una pequeña fracción de
los productos llega a los organismos problema (Pimentel et al., 1997). Altieri
-165-
(1999) considera que el aumento de la biodiversidad microbiana en los suelos es

una estrategia ecológica clave en el funcionamiento de los agroecosistemas. Como
otros organismos del suelo, los hongos son un nexo importante en las relaciones
suelo-planta-herbicida-fauna-hombre, como degradadores y como bioindicadores,
ya que las variaciones en número y diversidad pueden ser una buena señal de los
cambios en la actividad biológica del suelo luego de la aplicación de los pesticidas.
La biotransformación fúngica de los herbicidas ha sido poco estudiada. El glifosato
es el herbicida más usado a nivel mundial. La investigación de la degradación fún-
gica de fosfonatos comenzó a principio de los años 90 (Singh y Walker, 2006).
Krysko-Lupicka y Orlik (1997) fueron los primeros en usar este herbicida como
agente de selección para el aislamiento de hongos de suelo. Ellos notaron que en
medio conteniendo glifosato la diversidad específica disminuía fuertemente, con
un aumento de la predominancia de Mucor, Fusarium y Trichoderma. Casi todas
las especies tolerantes crecían bien con glifosato como única fuente de P, pero
pocas podían hacerlo cuando éste era la única fuente de C. Klimek et al. (2001) y
Lipok et al. (2003) demostraron que algunos hongos pueden usarlo como fuente
de N. En la Argentina, Romero et al. (2004) demostraron por primera vez que le-
vaduras nativas aisladas de suelos tratados y no tratados eran capaces de crecer
con glifosato como única fuente de C. El glifosato ha sido considerado tradicio-
nalmente un herbicida “seguro”, de poco impacto sobre las comunidades fúngicas.
A pesar de que su toxicidad ha sido demostrada en experimentos en medios sin-
téticos, en los cuales los hongos fueron eliminados con dosis significativamente
menores que las necesarias para suprimir a las bacterias (Busse et al., 2000), pocos
cambios han sido observados en suelos luego de la aplicación de dosis recomen-
dadas del herbicida (Ratcliff et al., 2006). Sin embargo, la información es conflic-
tiva, ya que estudios recientes señalan que el herbicida induce cambios profundos
sobre las comunidades fúngicas, inhibiendo el desarrollo de algunos hongos y fa-
voreciendo el crecimiento de otros menos deseables, como algunos patógenos
(Johal y Huber, 2009). Krzyśko-Lupicka y Sudol (2008), observaron que luego
del tratamiento con el herbicida, existía una tendencia hacia la selección de espe-
cies autóctonas de Fusarium, confirmando observaciones previas como las de Me-
riles et al. (2006) y Means y Kremer (2007). Esta alteración ha sido relacionada
con cambios en las poblaciones microbianas que alteran el equilibrio y tienen
como resultado último una disminución de la diversidad, por ejemplo, el decreci-
miento de las poblaciones de bacterias antagonistas de los hongos patógenos (Kre-
mer y Means, 2009). En cuanto al 2,4D y al metsulfurón metilo (MM), el
conocimiento de la degradación mediada por hongos y de los posibles efectos de
su aplicación sobre las comunidades fúngicas es aún escaso. Donnelly et al. (1993)
estudiaron la capacidad de varios hongos ectomicorrízicos de degradar 2,4D, en-
-166-
contrando que sólo Phanerochaete chrysosporium podía hacerlo pero dependiendo

de fuentes externas de N. Más recientemente, Vroumsia et al. (2005) estudiaron
la capacidad de 90 cepas de hongos filamentosos de degradar el herbicida en
medio líquido. Entre las sulfonilureas, el metsulfurón metilo es muy usado por su
alta actividad aún en bajas dosis (Pons y Barriuso, 1998). Sin embargo, los pro-
blemas ambientales que plantea su uso son importantes, ya que niveles bajos de
residuos pueden causar daño a los cultivos utilizados en la rotación, contaminar
aguas y tener efectos nocivos sobre otros organismos (Ye et al., 2003; Wang et
al., 2010). La mayoría de los estudios se han enfocado sobre el destino ambiental
del MM, pero los estudios de degradación microbiológica son escasos. Zanardini
et al. (2002) aislaron una cepa de Pseudomonas capaz de degradar MM en condi-
ciones co-metabólicas y Boschin et al. (2003) estudiaron la biodegradación de
MM en medio de cultivo rico en energía usando Aspergillus niger, un hongo
común en los suelos. Usando MM como agente selectivo, Yu et al. (2005) aislaron
una cepa de Curvularia sp. capaz de utilizar el MM como única fuente de C y
energía. He et al. (2007) observaron que una cepa de Penicillium nativa de un
suelo tratado con MM al ser inoculada en rizósfera de trigo aumentaba la degra-
dación del herbicida. Vázquez y Bianchinotti, (2013) aislaron hongos filamentosos
capaces de crecer con MM como única fuente de C y energía. De éstas, solamente
las de Penicilium y Trichoderma fueron capaces de culminar su ciclo de vida en
medio con MM. Las cepas de Trichoderma aisladas fueron seleccionadas para re-
alizar ensayos de tolerancia debido a que fueron las que mostraron mejores capa-
cidades para crecer usando el herbicida (Vázquez et al., 2009).
Situación actual en la Argentina
En la Argentina, las investigaciones sobre comunidades de hongos del suelo

en sistemas agrícolas, han contribuído enormemente a la identificación y a la eva-
luación de la frecuencia y la densidad relativa haciendo especial hincapié en los
hongos entomopatógenos y formadores de micorrizas en diferentes sistemas agrí-
colas (Alvarez et al., 1991; Bonel y Morrás, 2000; Fracchia et al., 2003; Martínez
et al., 2004; Luque et al., 2005; Novas et al., 2005; Nesci et al., 2006; Gómez et
al., 2007; Irrazabal et al., 2008; Vargas Gil et al., 2008, 2011; Lori et al., 2009;.
Moreno et al., 2011; Schalamuck, et al., 2006, 2007, 2010, Silvestro et al., 2013).
En su mayoría estas investigaciones han empleado herramientas de la micología
clásica, siendo muy escasos los estudios en los cuales se emplean técnicas mole-
culares. Vargas Gil et al. (2011) evaluaron la respuesta de la comunidad de hongos
del suelo en un cultivo de soja usando los cebadores NS1/NS2-GC y la técnica
DGGE, observando que la estructura de la comunidad fúngica fue influenciada
-167-
por los efectos combinados de la secuencia creciente y la gestión de la labranza.

Dado que en la mayoría de las regiones templadas agrícolas el área de cul-
tivo está destinada a ser ampliada, y que continuará el proceso de intensificación,
es necesario entender la respuesta de los componentes de hongos del suelo, debido
a que son un grupo valioso, ya que pueden sobrevivir en el medio ambiente, ya
sea como saprófitos, parásitos o simbiontes. Por lo tanto es necesario conocer y
evaluar el efecto de los diferentes manejos agrícolas sobre la diversidad y la diná-
mica de la comunidad fúngica del suelo, y considerarla como uno de los eslabones
esenciales de la cadena de producción en el marco de la agricultura sostenible.
Agradecimientos
Este capítulo está dedicado a la memoria de la Dra. Angélica Margarita

Arambarri, quien supo introducirnos en el mundo de la Micología y fue nuestra
permanente guía y maestra. Este capítulo se realizó en el marco del subsidio PIP
0295-CONICET.
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Biodiversidad de hongos formadores de micorrizas
arbusculares reportada para Argentina
Biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi

recorded for Argentina
Marta Cabello
Resumen
Los hongos formadores de micorrizas arbusculares constituyen una asocia-

ción simbiótica con la mayoría de las plantas terrestres, acuáticas, epífitas y con
talos de briofitas, siendo de amplia distribución geográfica. La composición de
las comunidades de hongos arbusculares afecta la estructura y funcionamiento
de las comunidades de plantas. El reconocimiento de las especies es fundamental
para el entendimiento de cómo su diversidad afecta los procesos ecosistémicos.
En la actualidad los hongos formadores de micorrizas arbusculares están
agrupados en el phylum Glomeromycota, Clase Glomeromycetes y se reconocen
4 Ordenes, 11 Familias, 26 géneros y cerca de 220 especies. Las características
más sobresalientes que los reúnen en este grupo es el carácter de organismos bió-
trofos obligados que penetran intracelularmente las células de la corteza radical y
forman estructuras típicas llamadas arbúsculos.
El propósito de esta revisión es señalar las principales características mor-
fológicas a tener en cuenta para una correcta identificación de las especies (= mor-
foespecies, taxa, morfotaxa) y su distribución en diferentes ecosistemas de
Argentina.
Palabras clave: micorrizas arbusculares, taxonomía, Glomeromycota, biodiver-

sidad.
Introducción
Los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) phylum Glo-

meromycota, Clase Glomeromycetes son organismos biótrofos obligados, que se
Instituto de Botánica Spegazzini, FCNyM-UNLP Avenida 53# 477, 1900 La Plata
Comisión de Investigaciones Científicas de la provincia de Buenos Aires.
Mail: mcabello@netverk.com.ar
-179-
asocian a las raíces de las plantas vasculares terrestres, epífitas, acuáticas y tam-
bién a rizoides y talos de briofitas formando una relación simbiótica mutualista
denominada micorriza arbuscular (MA) y micotalia, para vegetales con y sin raíces
respectivamente.
En los últimos años se les ha prestado especial atención debido al papel que
estos hongos cumplen en la adquisición de nutrientes por las plantas, fundamen-
talmente del fósforo (P) que es uno de los elementos limitantes en la mayoría de
los cultivos agronómicos.
Los suelos naturales, con las más diversas coberturas vegetales, contienen
naturalmente comunidades HFMA asociados a las raíces de las plantas. Determi-
nar la diversidad y los factores que afectan la estructura y función de esas comu-
nidades y su contribución para el crecimiento de diversas plantas cultivadas o
nativas ha sido el objetivo de numerosas investigaciones realizadas en nuestro
país. De este modo se han efectuado estudios tendientes a las identificaciones de
las comunidades fúngicas y su relación con las comunidades de plantas y factores
ambientales en ecosistemas naturales y practicas agronómicas empleadas en los
agroecosistemas. Cuanto más exacta sea la identificación de las especies, mayores
serán las chances de comprender su ecología y el efecto de los factores bióticos y
abióticos sobre ellos. En este capítulo se abordaran aspectos básicos de la biología
y morfología de los Glomeromycota como así también la diversidad reportada
para Argentina.
Características de los Glomeromycota
Los Glomeromycota forman un grupo monofilético de hongos clasificados

en 4 Ordenes, 11 familias y 26 géneros (Redecker et al., 2013) con cerca de 220
especies descriptas.
Como características fundamentales del phylum podríamos señalar: i) mi-
celio cenocítico o espaciadamente septado; ii) habitat hipogeo, a veces epigeo y
iii) clamidosporas (esporas) blásticas formadas en el extremo de la hifa, seguido
por engrosamientos de los componentes estructurales de la pared y ocluido por
un septo, engrosamiento de la pared de la espora o deposición de un tapón amorfo
en el lumen de la hifa sustentora (o esporógena).
Morfología de la colonización
Existen tres componentes fundamentales en el sistema radical micorrizado
– la raíz y los dos sistemas miceliares asociados: uno dentro de la raíz: el intrara-
dical y otro en el suelo: micelio extraradical. Las descripciones e ilustraciones del
micelio interno fueron realizadas por Janse en 1897. Detalles de las interacciones
-180-
Biodiversidad de hongos formadores de micorrizas arbusculares reportada para Argentina
fúngicas con las células y tejidos vegetales fueron publicados por Gallaud en 1905.
En sus observaciones Gallaud describió 2 tipos básicos en la colonización, el Arum
y el Paris. El tipo Arum: “típica micorriza arbuscular” se da en un sistema radical
de rápido crecimiento. El hongo se dispersa rápido en la corteza de la raíz mediante
hifas intercelulares; ramas cortas y laterales penetran las células y desarrollan los
típicos arbúsculos. En el tipo Paris la colonización se caracteriza por un extenso
desarrollo de hifas “coils” intracelulares, las cuales se dispersan de célula a célula
entre la corteza. Estos “coils” (también llamados circunvoluciones), más que los
arbúsculos, predominan en gametofitos de Psilotum, en la briofita aclorófila
Cryptothallus mirabilis y en raíces de miembros aclorófilos de las Gentianaceae
y Burmanniaceae.
En Argentina los estudios relacionados a los diferentes tipos de colonización
dan como resultados que el tipo Arum está presente en el 90% de las especies ve-
getales analizadas en el Parque Nacional el Palmar (Velázquez y Cabello, 2010).
Este resultado coincide con los hallazgos de Fracchia et al., (2009), quienes tam-
bién encontraron este tipo de colonización como el más abundante en los bosques
del Chaco Serrano. El tipo Paris fue dominante en la vegetación de la Selva de
las Yungas (Becerra et al., 2007) y en bosques de Polylepis (Menoyo et al., 2007).
Aunque la formación de los tipos Arum y Paris está principalmente bajo el control
genético de la planta hospedadora (Jacquelinet-Jeanmougin y Gianinazzi-Pearson,
1983), existiendo una fuerte relación entre el tipo de colonización y la identidad
de las familias vegetales (Yamato 2004), existen evidencias que la especie fúngica
puede tener también su efecto en la determinación del tipo de colonización (Ca-
vagnaro et al., 2001).
Esporas
Los Glomeromycota producen esporas con características únicas en el
Reino Fungi. La organización de las paredes en las esporas es uno de los princi-
pales atributos morfológicos utilizados en su caracterización con fines taxonómi-
cos. Cada espora producida por hongos arbusculares es una única célula
multinucleada, y los fenotipos de los caracteres subcelulares que constituyen las
paredes de la espora presentan alta variabilidad que no es encontrada en otros gru-
pos fúngicos. Diversas características morfológicas y ontogenéticas de las esporas
son utilizadas para describir y clasificar a estos hongos.
Mediante microscopia electrónica de barrido se han confirmado observa-
ciones realizadas con microscopios ópticos relativas a las ornamentaciones de las
paredes de las esporas (Figura 1A, B y C). Con microscopia electrónica de trans-
misión las investigaciones han revelado variaciones en la arquitectura fina de com-
ponentes de paredes e hifas.
-181-
Figura 1A, B y C. Microfotografías de microscopio electrónico de barrido mostrando ornamenta-

ciones en las paredes: A- espora de Acaulospora birreticulata; B- detalle de la ornamentación de
la espora; C- Acaulospora excavata; D y E microfotografías de microscopio óptico mostrando los
grupos de paredes: D- Acaulospora entreriana mostrando los grupos de paredes de la espora
(sw1-3) y paredes germinales (gw1 y 3); E- Acaulospora sp. la flecha señala el grupo de paredes
germinales.
Los Glomeromycota no poseen mecanismos de reproducción sexual, se re-

producen por esporas asexuales o clamidosporas. Estas esporas son unidades bio-
lógicas preprogramadas, en estado de quiescencia, que necesitan ser activadas
para desencadenar los procesos normales de su biología celular y las funciones
metabólicas que sustentan su germinación y crecimiento de la fase filamentosa.
No se conocen los mecanismos exactos por los cuales las esporas se activan e ini-
-182-
cian el proceso de germinación, aunque se sabe que contienen los factores bioló-
gicos requeridos para germinar. No poseen los sistemas genéticos y metabólicos
para su crecimiento continuo y esporulación a menos que se asocien a células de
raíces vivas.
La taxonomía tradicional de los Glomeromycota se basa en la morfología
de las esporas. Actualmente, las identificaciones de las especies se están corrobo-
rando con asistencia de técnicas moleculares las cuales proveen las evidencias fi-
logenéticas que soportan su filogenia.
Características morfológicas de las esporas

Las identificaciones taxonómicas de las especies se hace sobre las siguientes
bases: modo de formación de la espora, forma, color y dimensiones de las esporas
y de la hifa sustentora (=hifa esporógena), color, engrosamiento y estructuras de
las paredes de la espora, reacciones histoquímicas de las paredes con reactivo de
Melzer. Esta última característica está relacionada directamente con la composi-
ción química de las capas de paredes, cambiando el color cuando se combina con
el iodo y se torna amarillenta (inamiloide) rosa pálido a púrpura oscuro (dextri-
noide) o azulado a negro (amiloide).
En Glomeromycota existen tres modos ontogenéticos de formación de las
esporas: en el extremo de la hifa eporógena = morfotipo glomoide (Figura 2A);
sobre una base bulbosa en la hifa esporógena = morfotipo gigasporoide (Figura
2B) o a partir de un sáculo esporífero o vesícula madre =morfotipo acaulosporoide
(Figura 2C).
Figura 2 A- Funneliformis mossea (morfotipo glomoide) con hifa de sustentación; B- Racocetra

fulgida (morfotipo gigasporoide) mostrando base bulbosa de la hifa de sustentación; C- Acaulos-
pora entreriana (morfotipo acaulosporoide) observar el sáculo colapsado sobre la espora
-183-
Las esporas son típicamente unicelulares y presentan uno o varios grupos

de paredes, la más externa es el soporte esqueletal y de protección del contenido
protoplasmático, a estas se las denomina pared de la espora (Figura 1D, E). Las
capas más internas, generalmente flexibles, son responsables de la formación de
tubos germinativos directamente o bien por la formación de estructuras más ela-
boradas, es por ello que se las llama paredes germinativas (Fig 1D, E).
El morfotipo glomoide es compartido por los géneros Claroideoglomus,
Diversispora, Funneliformis, Glomus, Pacispora, Paraglomus, Rhizophagus, Sep-
toglomus y Sclerocystis.
El morfotipo gigasporoide se forma en las especies de Cetraspora, Gigas-
pora, Racocetra y Scutellospora.
El morfotipo acaulosporoide está presente en especies de Acaulospora y
Entrophospora; y en Archaeospora y Ambispora están presentes, simultánea-
mente, los morfotipos glomoide y acaulosporoide.
Walker (1983) fue el primero en proponer una nomenclatura para los dife-
rentes caracteres subcelulares que constituyen las esporas y que denominó paredes.
Estas paredes pueden ser representadas gráficamente en los murogramas. Las pa-
redes formadas en las esporas durante el proceso de maduración también son usa-
das con fines clasificatorios. Así podemos definir los diferentes tipos de paredes
como sigue de acuerdo con de Souza et al., (2010).
Evanescente – aquella que es efímera, desapareciendo con la madurez de
la espora. Esta pared puede ser única o con múltiples capas; generalmente tiene
aspecto gelatinoso, pudiendo aglutinar detritos del suelo.
Unitaria – aquella que se presenta rígida, dando forma a la espora, única,
no laminada, pudiendo ser lisa u ornamentada, pigmentada o hialina.
Laminada – formada por varias lamelas finas y rígidas íntimamente adhe-
ridas, presentando función estructural. El número de lamelas y el espesor de la
pared pueden aumentar con la madurez de la espora. Puede ser pigmentada o hia-
lina, lisa u ornamentada.
Expansiva – se trata de una pared única o laminada que se expande, cuando
entra en contacto con medio ácido de montaje (como las resinas PVL e PVLG).
Membranosa – pared fina, 0,5-2,0µm espesor, flexible, generalmente hia-
lina, que colapsa en medios hipertónicos. En Acaulospora, la pared más interna
presenta una capa membranosa dotada de granulaciones en la superficie externa,
siendo denominada membranosa “beaded”.
Coriácea – pared flexible, significativamente más espesa que el tipo anterior
(2,0-5,0µm) y más resistente también. Cuando entra en contacto con soluciones
hipertónicas, la superficie externa se torna rugosa, aparentemente áspera.
Amorfa – pared flexible, puede ser resistente, afectada por líquidos preser-
-184-
vativos, como glicerina y formaldehido. Éstos modifican su plasticidad, confirién-

dole aspecto rígido, típico de las paredes unitarias. El espesor de esta pared varía
de acuerdo con el líquido preservativo y medio de montaje. Su superficie externa
frecuentemente colapsa, a semejanza de la pared membranosa.
Germinativa – se trata de una pared única, flexible, hialina o pigmentada,
generalmente fina, que origina papilas redondeadas, inmediatamente antes de la
germinación.
El desarrollo de metodologías basadas en el análisis molecular aplicadas a
los estudios de ecología y biodiversidad de Glomeromycota ha revolucionado el
campo de la ecología del suelo, y evidentemente el estudio de la ecología y siste-
mática de hongos arbusculares. El uso de metodologías moleculares de identifi-
cación de hongos arbusculares en un sistema radical e incluso en un suelo, sin
necesidad de esporas, abre un abanico de innumerables posibilidades de aplicación
a estudios ecológicos.
La mayoría de los estudios de sistemática molecular se han centrado casi
exclusivamente en el análisis de genes que codifican para ARN ribosómico
(ADNr), principalmente la región de la subunidad pequeña (18S), denominada
SSU RNA (Small SubUnit). El ADNr en eucariotas está organizado de acuerdo a
un esquema general (Fig. 3) que consiste en repeticiones de una unidad básica de
transcripción constituida por las regiones codificantes del ARNr 18S (SSU RNA),
5,8S y 28S (LSU RNA = Large SubUNit RNA), unidas entre sí por unidades es-
paciadores de transcripción interna (ITS). Cada unidad básica está separada de la
anterior y posterior por una región intergénica (IGS).
De estos estudios moleculares surge una radical modernización de la taxo-
nomía la cual será un punto de referencia para futuros estudios. Redecker et al.,
(2013) establecen una clasificación consensuada de los Glomeromycotas con 4
Ordenes, 11 Familias y 26 géneros.
Especies de Glomeromycota relevadas en Argentina.
La tabla 1 muestra el listado de las especies registradas para el país. El pri-

mer registro de un hongo formador de micorrizas arbusculares lo realizó Spegaz-
zini (1887) quien colectó Glomus fuegianum (descripto por el autor como
Endogone fuegiana) en Isla de Los Estados e Isla Clarence durante su viaje al sur
argentino en 1882. Spegazzini describió la especie relacionándola con las trufas,
no pudiendo advertir en ese momento la relación entre este hongo y las raíces de
las plantas.
-185-
Tabla 1. Lista de especies de Glomeromycota identificadas en ecosistemas de la República Argentina

Ordenes Familias
Claroideo- Claroideoglomus claroideum (Schenck & Sm.) Walker & Schüβler
glomeraceae Claroideoglomus etunicatum ( Becker & Gerd.) Walker & Schüβler
Claroideoglomus luteum ( Kenn., Stutz & Morton) Walker & Schüβler
Glomeraceae Funneliformis caledonium (Nicolson & Gerd.) Walker & Schüβler
Funneliformis coronatum (Giovann.) Walker & Schüβler
Funneliformis geosporum ( Nicolson & Gerd.) Walker & Schüβler
Funneliformis mosseae (Nicolson & Gerd.) Walker & Schüβler
Glomus aggregatum Schenck & Sm.
Glomus ambisporum Sm. & Schenck
Glomus antarcticum Cabello
Glomus brohultii Herrera, Ferrer & Sieverd.
Glomus deserticola Trappe, Bloss & Menge
GLOMERALES
Glomus dimorphicum Boyetchko &Tewari

Glomus fuegianum (Speg.) Trappe & Gerd.
Glomus globiferum Koske & Walker
Glomus glomerulatum Sieverd.
Glomus lacteum Rose & Trappe
Glomus magnicaule Hall
Glomus microaggregatum Koske, Gemma & Olexia
Glomus tortuosum Schenck & Sm.
Rhizophagus clarus (Nicolson & Schenck) Walker & Schüβler
Rhizophagus diaphanus ( Morton & Walker) Walker & Schüβler
Rhizophagus fasciculatus (Thaxt.) Walker & Schüβler
Rhizophagus intraradices (Schenck & Sm.) Walker & Schüβler
Septoglomus constrictum (Trappe) Sieverd., Silva & Oehl
Sclerocystis coremioides Berk. Broome Gerd. &
Sclerocystis rubiformis Trappe
Sclerocystis sinuosa Gerd. & Bakshi
Paraglomera- Paraglomus laccatum (Błaszk.) Renker, Błaszk. & Buscot
PARAGLO-
MERALES
ceae
Diversispo- Diversispora spurca (Pfeiff., Walker & Bloss) Walker & Schüβler
raceae
Acaulospora- Acaulospora bireticulata Rothwell & Trappe
ceae Acaulospora delicata Walker, Pfeiff. & Bloss
DIVERSISPORALES
Acaulospora denticulata Sieverd. & Toro

Acaulospora dilatata Morton
Acaulospora elegans Trappe & Gerd.
Acaulospora entreriana Velázquez & Cabello
Acaulospora excavata Ingleby & Walker
Acaulospora foveata Trappe & Janos
Acaulospora lacunosa Morton
Acaulospora laevis Gerd. & Trappe
Acaulospora mellea Spain & Schenck
-186-
Continúa Tabla 1
Acaulospora nicolsoni Walker, Reed & Sanders
Acaulospora paulinae Blaszkowiski
Acaulospora rehmii Sieverd. & Toro
Acaulospora rugosa Morton
Acaulospora scrobiculata Trappe
Acaulospora spinosa Walker & Trappe
Acaulospora tuberculata Janos & Trappe
Acaulospora undulata Sieverd.
Entrophos- infrequens ( Hall) Ames & Schneid.
pora
Gigaspora- Gigaspora candida Bhattacharjee, Mukerji,Tewari & Skoropad
ceae Gigaspora decipiens Hall & Abbott
Gigaspora gigantea (Nicolson & Gerd.) Gerd. & Trappe
DIVERSISPORALES
Gigaspora margarita Becker & Hall

Gigaspora aff. margarita Becker & Hall
Gigaspora rosea Nicolson & Schenck
Cetraspora gilmorei (Trappe & Gerd.) Oehl, Souza & Sieverd.
Cetraspora pellucida (Nicolson & Schenck) Oehl, Souza & Sieverd.
Dentiscutata heterogama Nicol & Gerd.) Sieverd. Souza & Oehl
Scutellospora aurigloba (I.R. Hall) Walker & Sanders
Scutellospora biornata Spain, Sieverd. & S. Toro
Scutellospora calospora ( Nicolson & Gerd.) Walker & Sanders
Scutellospora dipapillosa ( Walker & Koske) Walker & Sanders
Scutellospora gregaria (Schenck & Nicolson) Walker & Sanders
Racocetra coralloidea (Trappe, Gerd. & Ho) Oehl, Souza & Sieverd.
Racocetra fulgida (Koske & C. Walker) Oehl, Souza & Sieverd.
Racocetra weresubiae (Koske & C. Walker) Oehl, Souza & Sieverd.
Pacispora- Pacispora chimonobambu- ( Wu & Y.S. Liu) Walker, Vestberg & Schüβler
ceae sea
Pacispora patagonica (Novas & Fracchia) Walker, Vestberg & Schüβler
Pacispora scintillans (Rose & Trappe) Walker, Vestberg & Schüβler
Archaeos- Archaeospora schenckii (Sieverd. & Toro) Walker & Schüβler
ARCHAEOSPO-
pora Archaeospora trappei (Ames & Linderman) Morton & Redecker

RALES
Ambispora- Ambispora fecundispora ( Schenck & Sm.) Walker

ceae Ambispora gerdemanii ( Rose, Daniels & Trappe) Walker, Vestberg &
Schüβler
Ambispora leptoticha (Schenck & Sm.) Walker, Vestberg & Schüβler
Pasados 100 años desde este hallazgo, comenzaron a identificarse otras es-
pecies de Glomeromycota aisladas en suelos de diferentes ambientes (Cabello,
2001; Fracchia et al., 2003, Irrazabal et al., 2005; Lugo et al., 1995, 1997, 1999
ab; Mohadeb 1985, 1986).
Schüβler et al., (2001) utilizaron especies de Gigasporaceae (Gigaspora
aff. margarita, Racocetra fulgida y R. weresubiae (citadas como Scutellospora),
-187-
aisladas de suelos de dunas de la Provincia de Buenos Aires, para su análisis filo-

genético en el cual los Glomeromycota fueron reconocidos como un phylum.
A la descripción de Glomus fuegianum (originalmente llamado Endogone)
como nueva especie para la Ciencia, realizada por Spegazzini, se suman actual-
mente las de Glomus antarcticum identificado en rizosfera de Deschampsia an-
tarctica, Costa Danco, Península Antártica (Cabello et al., 1994); Pacispora
patagónica (originalmente nombrada Glomus) descubierta en suelo rizosférico de
Bromus setifolius cerca de Calafate, Santa Cruz (Novas et al., 2005) y Acaulospora
entreriana identificada en suelos del Parque Nacional El Palmar en la Provincia
de Entre Ríos (Velázquez et al.; 2008)
Análisis de biodiversidad
En los 2000 comenzaron a evaluarse la composición de las comunidades
de Glomeromycota; de esta manera Menéndez et al., (2001) en una parcela de 12
ha perteneciente a la Estación Experimental de INTA Castelar (provincia de Bue-
nos Aires) relevó 17 especies fúngicas. Por su parte Schalamuk et al., (2006) en
la Estación Experimental Ing. Agr. Hirshhorn, perteneciente a la Facultad de Agro-
nomía de la Universidad Nacional de La Plata (prov. de Buenos Aires), describie-
ron la influencia del monocultivo y las diferentes prácticas agronómicas sobre
estos hongos, identificando 24 especies de Glomeromycota. Covacevich et al.,
(2006, 2007) estudian el efecto del fósforo sobre colonización y número de pro-
págulos de hongos arbusculares en campos del SE de la Provincia de Buenos
Aires.
Lugo y Cabello (2002) evaluaron el efecto del pastoreo sobre las poblacio-
nes de esporas de Glomeromycota en pastizales de altura en Pampa de Achala, en
la Provincia de Córdoba, recuperando 17 especies fúngicas; en la misma localidad
Lugo et al., (2003) analizaron la colonización radical en esos pastizales. El efecto
del pastoreo sobre comunidades de esporas de hongos arbusculares también fue
abordado por Mendoza et al., (2011) en pastizales de Tierra del fuego, contando
con una diversidad compuesta por 25 morfotaxa.
Irrazabal et al., (2004) publicaron los hallazgos de 26 especies de hongos
arbusculares en bosques xéricos dominados por Celtis tala (tala) y Scutia buxifolia
(coronillo) en la Reserva de Biosfera (MAB-UNESCO) en el Partido de Magda-
lena, Provincia de Buenos Aires y Lugo et al., (2005) estudiaron las comunidades
de Glomeromycota en un ecosistema de arbustal árido denominado “Jarillal” en
Centro Argentina dominado por Larrea divaricata donde se relevaron 7 morfoes-
pecies.
Soteras et al., (2012) investigaron las comunidades de hongos micorricicos
y su presencia en raíces de Chaenopodiaceae a diferentes profundidades de suelo
-188-
en las Salinas de Ambargasta y Salinas Grandes en la Provincia de Córdoba, iden-

tificando 18 especies de Glomeromycota.
Becerra y Cabello (2008), Becerra et al., (2009, 2011) analizan la coloni-
zación y describen comunidades de hongos arbusculares en bosques de aliso del
cerro (Alnus acuminata) presentes en la Selva de las Yungas de las Provincias de
Catamarca y Tucumán. En estos bosques se identificaron 22 especies de hongos
arbusculares.
Urcelay et al., (2009) analizaron el efecto de los tipos funcionales de vege-
tación sobre la presencia de Glomeromycota, registrando 13 morfotaxas.
Velazquez et al., (2008, 2010, 2011 y 2013) realizaron estudios de comuni-
dades de hongos arbusculares en el Parque Nacional El Palmar en la Provincia de
Entre Ríos. En este Parque se encontró el mayor registro de para nuestro país al-
canzando un total de 55 especies identificadas.
Las investigaciones de hongos micorrícico-arbusculares son aún incipientes

en Argentina y falta el reconocimiento de su importancia por la comunidad cien-
tífica local. Esta situación no ocurre a nivel internacional, donde se hacen grandes
esfuerzos por conocer la diversidad de estos organismos dada la importancia que
tienen en el funcionamiento de los ecosistemas. Argentina presenta un enorme po-
tencial a ser explorado en términos de riqueza de especies de hongos arbusculares
por la extensión geográfica y la multiplicidad de regiones que posee. La diversidad
de Glomeromycota reportada para nuestro país representa sólo el 34% de la di-
versidad conocida. Esta diversidad es el resultado de pocos estudios concentrados
en regiones muy puntuales de nuestro vasto territorio. Resulta por ello importante,
la urgente realización de inventarios de especies en todos los ecosistemas argen-
tinos, acompañados de técnicas de aislamiento de los hongos obtenidos y su pos-
terior depósito en bancos de germoplasma. Esto requiere de una urgente política
de investigación sobre todo si tenemos en cuenta que en 1996 se permitió la in-
troducción de la soja transgénica en nuestros campos. Esta introducción se hizo
sin estudios de impacto ambiental independientes. Desde entonces, mes a mes,
vivimos en Argentina la emergencia de un nuevo problema socioambiental debido
a la invasión territorial producida por la imposición del monocultivo de soja trans-
génica. Los impactos de las fumigaciones, el desmonte, el desplazamiento de cam-
pesinos, aparece relacionada con la “sojización”. Y junto a ello la perdida
acelerada de biodiversidad de microorganismos afectados por el herbicida utili-
zado para el cultivo de esta leguminosa, cuya base es el glifosato. Druille et al.,
(2013) reportaron que la aplicación del glifosato al suelo reduce significativamente
-189-
(entre 28 y 63%) la viabilidad de las esporas de Glomeromycota. Biomas amena-

zados por la creciente desforestación que viene de la mano de la “sojización”,
como ocurre en la Región Chaqueña, cuentan con especies aún no descriptas para
la Ciencia, seguramente de invalorable importancia para el mantenimiento de esos
sistemas.
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Microorganismos nativos para una gestión
sustentable de los ecosistemas terrestres
Native microorganisms for sustainable management

of terrestrial ecosystems
Correa, Olga S*., Viviana M. Chiocchio, Marcela S. Montecchia, Micaela Tosi,

Agustina Fernandez Di Pardo, Ester Simonetti, Federico Spagnoletti, Oksana
Sydorenko, Jimena Vogrig.
Resumen
En este capítulo expondremos parte de nuestro trabajo, el cual está orientado

al estudio y aplicación de bacterias y hongos nativos como alternativas para un
manejo más sustentable de la producción agrícola. Esa mayor sustentabilidad se
basa, entre otras cosas, en una reducción en el uso de agroquímicos, y en ese marco
las bacterias y los hongos juegan un rol fundamental. Las bacterias, por ejemplo,
son capaces de promover el crecimiento de las plantas a través de variados meca-
nismos, entre ellos el aumento de la disponibilidad o la eficiencia en el uso de los
nutrientes. El control biológico de enfermedades utilizando microorganismos po-
sibilita un manejo ecológico de las adversidades bióticas. Los hongos de las mi-
corrizas favorecen el crecimiento y establecimiento de las plantas en condiciones
de deficiencia de fósforo, de otros nutrientes y de agua, así como en presencia de
patógenos o de contaminantes como agroquímicos y metales pesados. Por último,
en este capítulo no sólo haremos referencia a estas áreas sino también a un tema
que, en los últimos años, preocupa a productores, profesionales y científicos: la
sensibilidad y utilidad de los microorganismos para evidenciar cambios en el uso
del suelo y su relación con la calidad del mismo.
Palabras clave: micorrizas arbusculares, hongos septados oscuros (DSE) y sa-

probios, bacterias antagonistas, comunidades microbianas, sustentabilidad.
Cátedra de Microbiología Agrícola. Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires. Av. San
Martín 4453 (c1417DSE). Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina. correa@agro.uba.ar
-195-
Las bacterias y el control de enfermedades fúngicas en plantas
Introducción
El control biológico de enfermedades constituye una alternativa que permite
la obtención de cultivos limpios, con trazas mínimas o nulas de agroquímicos que
afecten la salud humana y la calidad del ambiente. Algunas cepas de bacterias aso-
ciadas a las raíces, denominadas PGPR (del inglés Plant Growth Promoting Rhi-
zobacteria), pueden ser empleadas como fitoestimuladores y agentes de control
biológico de enfermedades vegetales. Entre los agentes de biocontrol bacterianos
más estudiados se encuentran los géneros Pseudomonas y Bacillus, en los que se
han descripto diversos mecanismos que les permiten actuar contra patógenos pre-
sentes en el suelo, hojas y frutos, tanto en las distintas etapas fenológicas de cultivo
como en postcosecha. Estas bacterias tienen capacidad de excretar enzimas hidro-
líticas que degradan las paredes celulares (Chernin y Chet, 2002), sideróforos que-
lantes de hierro (Renault et al., 2007), y lipopéptidos cíclicos activos (Raaijmakers
et al., 2010), además de inducir resistencia sistémica en la planta, siendo este tipo
de resistencia efectiva frente a un amplio espectro de patógenos. Últimamente, el
género Bacillus ha adquirido mayor relevancia debido a su capacidad de esporular,
lo que le permite persistir en el ambiente por largos períodos de tiempo aún bajo
condiciones adversas (Shoda, 2000).
En Argentina, el cultivo de soja (Glycine max (L.) Merr.) ha experimentado
una creciente evolución, constituyéndose actualmente en el más importante de los
cultivos extensivos, con un área sembrada de más de 18 millones de hectáreas y
una producción de más de 40 millones de toneladas durante la campaña 2011/2012
(MinAgri, 2013). Sin embargo, las enfermedades, causadas principalmente por
hongos patógenos de plantas, representan limitantes para su cultivo, destacándose
algunas enfermedades/patologías foliares, y de raíz y tallo.
Control biológico de hongos fitopatógenos

Teniendo en cuenta estos antecedentes, nuestro grupo de trabajo se ha en-
focado en aislar, identificar y caracterizar funcionalmente cepas de bacterias na-
tivas con actividad antifúngica a partir de la rizosfera de plantas de soja. Para ello
se utilizaron muestras de suelo de campos cultivados con soja en diferentes loca-
ciones de la Provincia de Buenos Aires. Los aislamientos bacterianos se evaluaron
mediante ensayos de antagonismo en placa frente a distintos hongos fitopatógenos
y también se caracterizaron en base a su capacidad de producir sideróforos, bio-
surfactantes, compuestos volátiles, auxinas, enzimas hidrolíticas y antibióticos, y
de acuerdo a su actividad solubilizadora de fosfatos. Finalmente se seleccionaron
tres aislamientos designados como Pseudomonas fluorescens BNM297, P. fluo-
-196-
Microorganismos nativos para una gestión sustentable de los ecosistemas terrestres
rescens BNM296 y Bacillus amyloliquefaciens BNM340, para ser probados como

inoculantes de semillas en diferentes ensayos. De estos aislamientos, sólo
BNM296 y BNM340 mostraron ser efectivos en la supresión de la enfermedad
de damping-off causada por el hongo Pythium ultimum (León et al., 2009). Estas
mismas cepas también fueron utilizadas para evaluar su capacidad de control sobre
hongos patógenos que afectan severamente al cultivo de colza (Brassica napus
L.): Botrytis cinerea (Pers.): Fr. y Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. En un
cultivo dual de BNM296 ó BNM340 con cada uno de estos hongos, se pudo ob-
servar una reducción significativa del crecimiento micelial de S. sclerotiorum (con
un porcentaje de inhibición de 39 y 71%, respectivamente) y de B. cinerea (46 y
66%, respectivamente) con respecto a las placas control, en las que se inoculaba
el hongo solo (Simonetti et al., 2012b). Para determinar si estas bacterias eran ca-
Figura 1. Reducción de los síntomas de enfermedad luego del tratamiento de semillas de B. napus
con bacterias antagonistas en ensayos sobre hoja cortada. (a) Ejemplo de hojas de colza infectadas
con B. cinerea, (b) Severidad de la enfermedad causada por B. cinerea sobre hojas de plántulas de
colza provenientes de semillas sin inocular (control); inoculadas con B. amyloliquefaciens BNM340
y con P. fluorescens BNM296. El nivel de infección fue medido como porcentaje de área con necrosis
producida por el hongo a las 96 hs luego de la inoculación (c) Hojas inoculadas con S. sclerotiorum,
(d) Incidencia de la enfermedad causada por S. scleotiorum expresada como porcentaje de lesiones
extendidas a las 96 h post-inoculación. Se repitieron dos experimentos independientes para cada pa-
tógeno, empleando 24 hojas por tratamiento. Se realizó una comparación de medias mediante
ANOVA de una vía. Las barras indicadas con * representan diferencias significativas respecto al
control (p<0,05).
-197-
paces de inducir algún tipo de protección sistémica en plantas de colza, se inocu-

laron semillas de B. napus var. Filial Precoz (Bioproductos S.A., Buenos Aires)
con una suspensión de células de BNM340 o BNM296 (108 ufc mL-1 en agua es-
téril). Estas semillas tratadas con bacterias y otras semillas control (sumergidas
en agua estéril) se sembraron en macetas hasta alcanzar el estadio de 4 hojas ver-
daderas. De cada planta se seleccionaron dos hojas verdaderas y las mismas se
ubicaron en cámaras húmedas para realizar ensayos de inoculación con los dos
hongos patógenos. En la figura 1 se puede apreciar que la pre-inoculación de las
semillas con la cepa BNM296, así como con BNM340, produjo una protección
sistémica en las hojas cortadas de colza frente a B. cinerea y S. sclerotiorum. Estos
resultados destacan el potencial de estas cepas de bacterias nativas para ser utili-
zadas como agentes de control biológico frente a distintos hongos fitopatógenos
que afectan el cultivo de colza.
En otro trabajo, llevado a cabo también por miembros de la Cátedra de Mi-
crobiología de la FAUBA, se aisló una cepa de B. amyloliquefaciens, BNM122,
con capacidad de producir metabolitos con actividad antifúngica. Esta cepa fue
obtenida a partir de un esclerocio de Sclerotinia sclerotiorum que infectaba un ca-
pítulo de girasol. Los metabolitos excretados por esta bacteria, identificados como
compuestos tipo iturina y surfactina, poseían la capacidad de suprimir el creci-
miento micelial de distintas especies de hongos. La inoculación de BNM122 sobre
semillas de soja ejerció un efecto protector frente al damping-off ocasionado por
Rhizoctonia solani (Souto et al. 2004). Estos resultados, junto con los previamente
obtenidos, nos alentaron a llevar a cabo otro trabajo con el fin de evaluar la habi-
lidad de las cepas aisladas en controlar el hongo Cercospora sojina. Este hongo
constituye el agente causal de la denominada Mancha Ojo de Rana (MOR), una
de las enfermedades de soja más importantes de la Argentina, causante severas
pérdidas en el rendimiento de este cultivo.
Ensayos preliminares de antagonismo frente a C. sojina nos permitieron la
selección de dos cepas de Bacillus, BNM340 y BNM122, y el aislamiento de
Pseudomonas BNM297. La actividad antifúngica in vitro de cada una de las bac-
terias se estudió en células enteras (suspensiones celulares, 108 CFU mL-1 en agua
estéril) y en los compuestos excretados al medio de cultivo (sobrenadantes libres
de células obtenidos por filtración). La inhibición del crecimiento micelial de C.
sojina se evaluó mediante ensayos de antagonismo en placa y los efectos sobre la
germinación de sus conidios mediante el co-cultivo de éstos con las bacterias o
sus sobrenadantes. En general, se observó que las suspensiones celulares de las
bacterias presentaron un mayor efecto inhibidor in vitro que sus respectivos so-
brenadantes libres de células (Simonetti et al., 2012a). Las tres cepas evaluadas
redujeron significativamente el crecimiento del hongo. Las células de Bacillus
-198-
BNM122 y BNM340 exhibieron un mayor porcentaje de inhibición (~52–53 %),

mientras que las suspensiones celulares de BNM297 produjeron una menor re-
ducción en el diámetro de la colonia fúngica (~32–34 %). El porcentaje de germi-
nación de los conidios a las 24 h de incubación en ausencia de las bacterias
(control) fue alrededor del 75%. Los filtrados libres de células de BNM340 y
BNM297 no redujeron significativamente la germinación de los conidios con res-
pecto al control, mientras que el sobrenadante correspondiente a la cepa BNM122
inhibió sólo moderadamente la germinación de los mismos (~26%). Sin embargo,
a las 72 h luego de la incubación con el filtrado libre de células de BNM122, se
observó un inusual hinchamiento de los conidios y un anormal desarrollo de los
tubos germinativos del hongo, figura 2a, con sus citoplasmas mostrando una apa-
riencia más desorganizada y granulada, figura 2b. Estudios previos demostraron
que la cepa BNM122 era capaz de producir lipopéptidos cíclicos de la clase de la
surfactina e iturina (Souto et al., 2004; León et al., 2009). Entre todos los meta-
bolitos de Bacillus descriptos, la iturina A se ha asociado con la capacidad de in-
hibir la germinación normal de los conidios de hongos. Este lipopéptido penetra
la bicapa lipídica de la membrana citoplasmática e interactúa con los lípidos for-
mando poros en ella. Esto causa una alteración de la morfología celular, la apari-
ción de pequeñas vesículas, la salida de electrolitos intracelulares y componentes
de alta masa molecular, y la presencia de agregados de partículas intramembra-
nosas (Thimon et al., 1995). Posiblemente éste sea el mecanismo que permita ex-
plicar las alteraciones observadas en los conidios de C. sojina al incubarse con el
filtrado libre de células de la cepa BNM122.
Figura 2. Desarrollo de las hifas de C. sojina durante la germinación de las esporas, vistas al mi-
croscopio óptico, luego de la incubación por 72 h con el filtrado libre de células de BNM122: (a)
Hifas deformadas y ensanchadas luego del tratamiento con el sobrenadante deBNM122 (b) hifas
con apariencia desorganizada y presencia de gránulos en su interior (c, d) germinación normal de
los conidios en agua estéril (control).
-199-
Por otro lado, se llevaron a cabo ensayos de biocontrol in vivo bajo condi-
ciones de invernáculo, utilizando plántulas del cultivar de soja NIDERA A
4613RG, susceptible a la infección por C. sojina. Los tratamientos consistieron
en la aplicación foliar de suspensiones de BNM297 (109 UFC mL-1), BNM340 y
BNM122 (108 UFC mL-1) a los 21 días de emergencia de las plántulas. Luego de
24 horas, estas mismas plantas fueron inoculadas con una suspensión de conidios
del hongo, y la severidad de la enfermedad se estimó a los 20 días, calculando el
área del folíolo central (%) afectada con lesiones típicas del hongo. Se observó
que la aplicación foliar de las dos cepas de Bacillus evaluadas redujo significati-
vamente la severidad de la enfermedad, con respecto a las plantas control (sin tra-
tar). Sin embargo, el pre-tratamiento con Pseudomonas BNM297 no mostró
ningún efecto sobre la severidad de la MOR (Tabla 1), a pesar de que colonizó
eficientemente la superficie de las hojas de soja. Es frecuente observar estas dis-
crepancias en los resultados obtenidos a partir de ensayos in vitro e in vivo (Dal
Bello et al., 2008). La pérdida de actividad antifúngica de BNM297 bajo condi-
ciones de invernáculo podría deberse a su reducida habilidad de adaptarse a un
ambiente altamente variable como es la superficie de las hojas. De aquí se des-
prende la necesidad de corroborar los resultados obtenidos in vitro mediante en-
sayos realizados bajo condiciones naturales. El uso de bacterias antagonistas,
aplicadas de modo preventivo, constituye una opción prometedora para el manejo
de la MOR, más aún si se considera la reducción de costos, de contaminación am-
biental y de riesgo para la salud humana respecto de los fungicidas clásicos.
Tabla 1. Severidad de la enfermedad causada por el hongo C. sojina sobre plantas de soja tratadas
mediante la aplicación foliar de suspensiones de bacterias, bajo condiciones de invernadero.
Tratamientos Severidad (%)*

Control (H2O) 5.11a
P. fluorescens BNM297 3.45a
B. amyloliquefaciens BNM340 0.48b
B. amyloliquefaciens BNM122 0.88b
* Los datos mostrados corresponden a valores medios de dos experimentos independientes. Las
disitntas letras indican diferencias significativas (P=0,0002) según el test de Tukey.
Como parte de esta línea de trabajo, en otra serie de experimentos, se evaluó

el impacto que pudiera tener la inoculación de semillas de soja con cultivos de la
cepa BNM122 sobre la comunidad microbiana del suelo, la nodulación y la mi-
corrización de las plantas, y se lo comparó con el efecto del tratamiento de las se-
millas con thiram y carbendazim. La inoculación de las semillas con la cepa
BNM122 tuvo menor impacto que el tratamiento con fungicidas sobre todas las
-200-
variables medidas: estructura (PCR-DGGE), función (perfiles fisiológicos de uso

de sustratos carbonados) y tipos eco-fisiológicos (estrategas r y K) de las comu-
nidades microbianas del suelo rizosférico. También se observó una menor reduc-
ción de la micorrización con hongos nativos que la producida por el tratamiento
con los fungicidas. Estos resultados confirman el menor impacto del control bio-
lógico sobre organismos no blanco, algunos de ellos de importancia para la pro-
ductividad de los cultivos (Correa et al., 2009).
Biorremediación de glifosato en suelos agrícolas mediante la utiliza-

ción de hongos saprobios
Introducción
En los cultivos extensivos es frecuente la aplicación de herbicidas, con el
fin de controlar las malezas que disminuyen el rendimiento. En Argentina, la apli-
cación del paquete tecnológico ligado al cultivo de soja RR (Glycine max, L.,
“Roundup Ready”) aumentó, tanto en superficie como en frecuencia, el uso de
N-phosphonomethylglycine (nombre comercial: Glifosato), un herbicida de am-
plio espectro que no afecta el crecimiento de esta variedad de soja. Dado su uso
difundido y las potenciales alteraciones que puede provocar en las comunidades
de microorganismos que viven en el suelo, así como en algunos de los procesos
llevados a cabo por éstos, estudiar el comportamiento de este herbicida resulta de
fundamental importancia.
Existen microorganismos capaces de degradar el N-phosphonomethylgly-
cine. En este sentido, los hongos cuentan con la particularidad de poder penetrar
en los agregados con sus hifas y llegar así al herbicida adsorbido a las arcillas.
Además, los hongos producen enzimas extracelulares que pueden difundir y ex-
plorar más volumen de suelo que sus hifas (Mujica et al., 1999). Por ello, el ob-
jetivo general de este trabajo consiste en lograr la implementación de un consorcio
de hongos filamentosos a partir de una formulación de esporas fúngicas, con el
fin de biorremediar suelos agrícolas con acumulación de glifosato (Fernandez di
Pardo et al., 2010). Para ello, se aislaron e identificaron taxonómicamente cepas
de hongos provenientes de la localidad de Chivilcoy (provincia de Buenos Aires)
en lotes de soja con aplicación del herbicida.
Hongos saprobios tolerantes al glifosato

Las especies predominantes fueron Trichoderma harzianum en el lote con
aplicación de glifosato, y Fusarium oxysporum en el suelo control. Éstas y las
demás cepas obtenidas (Paecilomyces lilacinus, Cylindrocarpon sp, Acremoniella
sp, Aspergillus sp, Humicola grisea y Drechslera dematioidea) fueron evaluadas
-201-
en su cinética de crecimiento in vitro, en presencia y ausencia del herbicida. Se

pudo observar que, en todos los casos, la velocidad de crecimiento fue mayor en
ausencia del herbicida. Las especies difirieron en su cinética de crecimiento
(p<0,0001) a los 10 días de ensayo, y las que presentaron mayor tolerancia al gli-
fosato fueron: T. harzianum, F. oxysporum; P. lilacinus y Cylindrocarpon sp. Ade-
más, T. harzianum, Acremoniella sp, Cylindrocarpon sp, D. dematioidea y H.
grisea mostraron diferencias entre el crecimiento en presencia y en ausencia del
herbicida (p<0,05). Las cepas que tuvieron mayor crecimiento en presencia de
glifosato podrían ser utilizadas en una formulación comercial que favorezca la de-
gradación de este herbicida en suelos agrícolas.
Aislamiento, identificación y comportamiento de hongos septados os-

curos (DSE) frente a diferentes tipos de estrés
Introducción
Los hongos endofíticos septados oscuros (DSE) son un grupo de microor-
ganismos poco estudiados en su comportamiento y su relación con las plantas y
el ambiente. Pertenecen a la división Ascomycota, presentan hifas septadas oscu-
ras, son capaces de colonizar raíces inter- e intracelularmente, y ocasionan efectos
benéficos para el hospedante (Peterson et al., 2004). Esto último ocurre princi-
palmente en ambientes extremos, como son los suelos afectados por distintos tipos
de estrés abiótico como salinidad o exceso en el uso de agroquímicos. Algunos
autores creen que los DSE pueden ser considerados como hongos micorrícicos,
debido a que manifiestan un efecto benéfico sobre el hospedante. También lo son
en función y efecto, es decir, los efectos benéficos en las plantas se vinculan a la
toma de nutrientes debido a un extenso micelio extrarradical y su transferencia a
la planta vía intercambio intracelular.
Los hongos DSE y el estrés salino

Se han realizado estudios en suelos con baja capacidad productiva en la
Pampa Deprimida, donde se está avanzando en el implante de especies megatér-
micas como Panicum coloratum y Chloris gayana (Tobar et al., 2012). A partir
de estas forrajeras se realizaron aislamientos, algunos de los cuales presentaron
características compatibles con hongos DSE. Hasta el momento, siguiendo la ta-
xonomía clásica, pudieron identificarse Drechslera sp1, Drechslera sp2 y Mono-
dictys sp. en C. Gayana, y Pteroconium sp. en P. coloratum. Se analizó la
tolerancia de los hongos DSE aislados a distintas concentraciones de sales de
sodio, encontrando que la respuesta fue diferente frente a distintos aniones. Mien-
tras que todos los aislamientos presentaron menor crecimiento al aumentar la con-
-202-
centración de NaCl y Na2SO4, la respuesta al agregado de NaHCO3 fue disímil.

NaHCO3 resultó la forma más tóxica para la mayoría de las especies, con mayor
inhibición del crecimiento a mayor dosis, excepto en Drechslera sp1, en la cual
el bicarbonato promovió el crecimiento. Este comportamiento fue registrado pre-
viamente y se continúan estudiando sus causas.
Los hongos DSE y su tolerancia a agroquímicos

Existe un número limitado de estudios que trate la participación de los hon-
gos en la degradación de agroquímicos. La mayor cantidad de investigaciones en
esta área ha sido con bacterias, siendo todavía un problema a resolver el estable-
cimiento y supervivencia de cepas fúngicas. Entre otros, los hongos de la podre-
dumbre blanca son conocidos por sus ventajas y aplicaciones en procesos de
biorremedación (Bennett y Faison, 1997). Este estudio preliminar manifiesta que
estos procesos podrían extenderse a otros grupos de hongos, como los endofitos
septados oscuros, dada la similitud que presentan en la actividad de enzimas ex-
tracelulares.
Al momento contamos con 5 aislamientos provenientes de raíces de trigo
(Triticum aestivum) que, dado que aún no han presentado conidiación, no han po-
dido identificarse. En un futuro probaremos su crecimiento en distintos medios
de cultivo y distintas condiciones de luz y temperatura y, si aun así no fuera posible
identificar dichos aislamientos a través de la taxonomía clásica, se recurrirá a la
secuenciación de la región ITS1-ITS4 del DNA genómico. Estos 5 aislamientos
se evaluaron en su comportamiento in vitro frente a distintas dosis de fungicida,
herbicida e insecticida en medio mínimo (Spagnoletti y Chiocchio, 2011). Para
ello, se midió el crecimiento luego de 5 días de incubación a 25ºC.
El crecimiento se evaluó luego de cinco días de incubación en medio mí-
nimo a 25°C y difirió entre las 5 cepas (p < 0.0001) y se notó un cambio en la ci-
nética de crecimiento al adicionar agroquímicos al medio de cultivo. En el caso
del glifosato, se observó que dos de las cepas presentaron mayor diámetro (p <
0.0001) de colonia en una, dos y 10 veces la dosis agronómica (D.A.). Una tercera
cepa se unió al grupo de mayor diámetro al aplicar 10 D.A. Frente al agregado
del fungicida carbendazim en una y dos D.A., las dos mismas cepas lograron cre-
cer, aunque con diferencias entre ellas (p<0.0001). El crecimiento disminuyó con-
siderablemente al incrementar la dosis a 10 D.A. Por último, al probarse el
crecimiento en presencia de insecticida, se observó que en D.A. tres de las cepas
presentaron un diámetro de la colonia menor a los 2 cm (p <0.0001). La cepa que
presentó mayor diámetro fue una de las que había crecido en presencia de glifosato
y de fungicida. Con dos D.A. se mantuvieron las diferencias pero los diámetros
fueron considerablemente menores (e.g.: 2 cm para la cepa con mayor creci-
-203-
miento). Finalmente, en 10 D.A., la misma cepa volvió a distinguirse del resto (p

<0.0001), alcanzando un diámetro de 1,2 cm. Estos resultados destacan la impor-
tancia de someter a este tipo de estudios a un mayor número de cepas, con el ob-
jetivo de seleccionar las más efectivas en la tolerancia/utilización de estos
agroquímicos.
Las micorrizas arbusculares (MA) y su relación con el arsénico (As):

germinación de MA frente a distinta dosis de As
Introducción
La simbiosis micorrícica que se da entre las raíces de plantas y hongos bio-
trofos obligados pertenecientes al Phylum Glomeromycota se encuentra amplia-
mente difundida en el reino vegetal. Los hongos micorrícicos, además de mejorar
el crecimiento de sus hospedantes debido a un mayor aporte de nutrientes(funda-
mentalmente N y P) , también pueden incrementar su tolerancia a una amplia va-
riedad de estreses bióticos y abióticos, tales como el estrés salino, hídrico y la
presencia de contaminantes (Pearson et al., 2006). En los últimos años, se ha ob-
servado la presencia de altos niveles de As debido a la irrigación con aguas que
poseen concentraciones elevadas de este metal (Franco et al., 2012). Existen es-
tudios que evidencian que en plantas micorrizadas se activan los transportadores
fúngicos de fosfato ante la presencia de As (Rausch et al., 2001), provocando, en
algunas asociaciones, una pérdida de la función de captación directa de P por parte
del hospedante (Smith et al., 2003). La interrupción de la actividad de los trans-
portadores de fosfato de las raíces podría incrementar la tolerancia al arsenato
(Gonzalez-Chavez et al., 2002).
Efecto del As sobre la germinación de esporas y la longitud hifal.

Nuestro trabajo puso a prueba la hipótesis de que el nivel creciente de As
en el medio de cultivo afecta negativamente la germinación de esporas de MA y
la longitud de sus hifas. Los porcentajes de germinación de esporas de G. intra-
radices tendieron a disminuir a medida que se incrementó la concentración de As.
Los tratamientos con bajas concentraciones de As (0,5; 1y 5 mg As L-1) retrasaron
su germinación con respecto al control (día 15) pero estas diferencias se mitigaron
al día 23. El largo hifal disminuyó al aumentar los niveles de As, aunque sin dife-
rencias entre el control y las dosis bajas. Un menor porcentaje de germinación de
esporas y una menor longitud hifal en G. intraradices podrían disminuir la posi-
bilidad de colonizar plantas hospederas (Spagnoletti et al., 2012). Al transferir las
esporas a un medio con agar-agua, se observó una disminución en la germinación
tanto a dosis bajas como a 25 mg As L-1. A una concentración intermedia, de 10
-204-
mg As L-1, los porcentajes de germinación aumentaron, mostrando una eventual

reversión de la toxicidad (Spagnoletti et al., 2013). Estos resultados podrían ser
deberse a factores como la viabilidad de esporas y/o la susceptibilidad al As dados
por la diversidad intraespecífica de la población.
Las comunidades microbianas responden a cambios en el uso y ma-

nejo del suelo
Introducción
La intensificación en el uso agrícola del suelo, particularmente en las últi-
mas décadas, ha despertado preocupación sobre los eventuales cambios negativos,
y quizás irreversibles, que puedan afectar su calidad. Estos cambios podrían estar
relacionados con alteraciones en su fertilidad química, su capacidad para almace-
nar agua, su aireación, entre otros. Por ello, para asegurar uso sostenible de este
recurso, es preciso contar con indicadores que permitan evaluar el estado actual
del suelo y predecir su evolución, sobre todo en ecosistemas influenciados por las
actividades humanas. Dado que los microorganismos desempeñan un papel fun-
damental en el funcionamiento del suelo, influyendo en su fertilidad y los servicios
que éste presta al ecosistema, existe una necesidad particular de desarrollar indi-
cadores microbianos, cuya variación pueda ser entendida como señales tempranas
de cambios en el ambiente (Anderson, 2003; Bastida et al., 2008). Algunos autores
han mostrado que los monocultivos tienden a una homogeneización del ambiente
que atenta contra la biodiversidad, incluida la del suelo, donde los microorganis-
mos representan la mayor biomasa y fuente de diversidad. La importancia de la
diversidad microbiana para el funcionamiento del ecosistema es todavía una cues-
tión que se debate. Un trabajo reciente, por ejemplo, mostró que la pérdida de di-
versidad microbiana altera la actividad de desnitrificadores y, por ende, del ciclo
del nitrógeno (Philippot et al., 2013). Otros autores, sin embargo, midieron pará-
metros microbianos del suelo en un experimento a campo de larga duración y no
observaron efectos negativos ligados a la intensificación agrícola (Wardle et al.,
1999).
El objetivo de esta línea de trabajo es analizar atributos microbiológicos de
suelos para contribuir a un mejor conocimiento de la dinámica y diversidad mi-
crobiana, y establecer una relación entre esta última y el funcionamiento de las
comunidades microbianas. Asimismo, la integración de propiedades microbioló-
gicas y parámetros químicos y físicos de los suelos posibilitará, en el mediano
plazo, generar información útil para el manejo sustentable de los sistemas agríco-
las. El estudio de las comunidades microbianas en un sistema tan complejo como
el suelo requiere de la utilización de distintas técnicas que provean información
-205-
complementaria y permitan un análisis integral. Es por ello que nosotros analiza-

mos la estructura y función de las comunidades microbianas desde distintos en-
foques, los cuales serán detallados a continuación.
Respuesta al cambio de uso en suelos del NOA

En esta línea de trabajo estudiamos suelos del noroeste argentino, en las
provincias de Salta y Jujuy, prístinos y bajo monocultivo de caña de azúcar o soja
con diferente cantidad de años desde el desmonte.
Al inicio de nuestra investigación realizamos un muestreo exploratorio
sobre ambientes contrastantes de la región bajo estudio. Analizamos la estructura
de las comunidades microbianas de estos suelos mediante PCR-DGGE (Reacción
en cadena de la polimerasa y Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante)
y perfiles de ácidos grasos de los fosfolípidos (PLFA), y la funcionalidad mediante
perfiles de utilización se sustratos carbonados (CLPP) y determinaciones bioquí-
micas de actividad global y específica. Las comunidades de los suelos cultivados
se diferenciaron claramente entre sí y de las de los suelos adyacentes no cultivados,
observándose una marcada reducción de la biomasa microbiana viable y del car-
bono orgánico en el suelo recientemente desmontado. Adicionalmente, el des-
monte afectó la estructura y función de las comunidades microbianas de manera
tal que los ambientes recientemente desmontados fueron más parecidos a los cul-
tivados con soja durante veinte años que a los del monte original (Montecchia et
al., 2007; 2008; 2009; 2011). Esto denota el profundo impacto que el cambio en
el uso tiene sobre los microorganismos del suelo, sobre todo durante los primeros
años luego del desmonte.
A partir del año 2011 nuestro estudio abarcó un área mucho más amplia
que incluyó 4 fincas productoras de caña de azúcar en Jujuy y 3 fincas productoras
de soja en Salta. En cada finca se obtuvieron muestras de suelos de distinta can-
tidad de años bajo uso agrícola (desde 2 hasta más de 40 años) y de suelos prístinos
adyacentes (cortina de monte o selva pedemontana). Este muestreo nos permitió
encarar un estudio de la dinámica de los atributos microbiológicos y fisicoquími-
cos a lo largo de una cronosecuencia agrícola (Montecchia et al., 2012; Tosi et al.,
2012). En los primeros años de la cronosecuencia de suelos sojeros observamos
una importante caída en el carbono microbiano con aumento en la respiración del
suelo, figura 3, lo cual nos sugirió la presencia de comunidades microbianas menos
eficientes en términos metabólicos, en particular en la utilización del carbono (Tosi
et al., 2013a).
-206-
Figura 3. Evolución del carbono de la biomasa microbiana (A: CBm) y la respiración basal del
suelo (B: RS) en una cronosecuencia de uso agrícola de Las Lajitas, Salta. La leyenda presenta las
tres fincas estudiadas y su denominación. Letras distintas señalan diferencias significativas entre
categorías de años de uso (p<0,05).
Una situación de este tipo podría implicar pérdidas de carbono del sistema
y, de hecho, en estos suelos observamos que el carbono orgánico parecería dismi-
nuir más pronunciadamente entre los 3-5 y los 11-14 años desde el desmonte. Por
otro lado, en estos suelos se observó una aparente estabilización del valor de car-
bono de la biomasa microbiana durante más de veinte años, fenómeno que hasta
ahora no ha sido reportado y que tal vez pueda vincularse con alguno de los be-
neficios de la siembra directa implementada en los últimos 15 años (Tosi et al.,
2013b).
-207-
Figura 4. Dendrograma (Pearson/UPGMA) de los perfiles genéticos (PCR-DGGE) de las comuni-

dades bacterianas. Suelos con cultivo antecesor maíz (a) y soja (b). Siembra directa (SD) y la-
branza convencional (LC) con (P+) o sin (P-) fertilización fosforada.
En el área de metagenómica debemos mencionar como resultado preliminar

el relevamiento mediante pirosecuenciación de amplicones correspondientes a una
de las zonas hipervariables del gen que codifica para el ARN ribosomal de 16S
(16S rRNA). Este relevamiento nos permitió estimar la riqueza, diversidad, com-
posición y las diferencias entre las comunidades bacterianas de suelos bajo dife-
rente uso (Montecchia et al., 2012; Soria et al., 2012). De los suelos estudiados,
seleccionamos muestras de diferentes lotes con agricultura de corta duración (hasta
5 años después del desmonte), larga duración (más de 20 años) y los montes cer-
canos en las fincas ya mencionadas de Jujuy y Salta. En todos los casos se obtu-
vieron más de 6.000 secuencias por sitio de muestreo. Los resultados para los
diferentes sitios de muestreo mostraron la arquitectura típica de las comunidades
de suelos con gran cantidad de especies y con distribuciones marcadamente asi-
métricas: la mayoría de los grupos taxonómicos tienen muy pocos representantes
y unos pocos tienen una gran cantidad de miembros. Pudimos observar que la es-
tructura de la comunidad bacteriana cambia rápidamente después de la deforesta-
ción, y, si bien luego se siguen observando cambios, éstos ya no son tan marcados
a los veinte o incluso cien años de agricultura continua. Sin embargo, el resultado
más sorprendente se refiere a las diferencias en diversidad medidas como riqueza
(cantidad de grupos taxonómicos diferentes) entre suelos con diferentes usos, ya
que los suelos de los montes presentan menor diversidad que los lotes bajo agri-
cultura, tanto de corta como de larga duración. Como parte de este estudio se pro-
cederá con la evaluación sistemática de los grupos taxonómicos a diferentes
-208-
niveles (género, familia, órdenes y clases), cuya presencia difiera significativa-

mente entre tipos de uso y duración de la actividad agrícola (monte, corta y larga).
Actualmente estamos evaluando la utilidad del género Trichoderma como
indicador de la salud de los suelos. Según resultados preliminares, algunas espe-
cies de Trichoderma resultarían muy útiles para discriminar los suelos según su
uso (Vogrig et al., 2010). También hemos encarado el estudio de la diversidad de
hongos de las micorrizas como indicador del cambio en el uso de estos suelos,
observando una reducción en la presencia y diversidad de estos hongos en los sue-
los agrícolas en comparación con los suelos prístinos o con pocos años de cultivo
(Chiocchio et al., 2010). Resultados similares se han encontrado en la literatura
(Lugo y Cabello, 2002; Becerra y Cabello, 2008), y pueden atribuirse a la mayor
riqueza florística y a la ausencia de perturbación antrópica. Se conoce que en sue-
los perturbados hay mayor número de esporas pero menor diversidad. Además,
los diferentes ambientes se caracterizaron por los distintos géneros de hongos mi-
corrícicos presentes, lo cual estaría indicando el impacto que tiene el uso de los
suelos sobre su establecimiento y proliferación. La presencia de diferentes especies
de micorrizas arbusculares puede inducir interacción competitiva entre las especies
vegetales así como también influir en la composición de la comunidad vegetal
(Bever et al, 2001). Por todo lo expuesto, podemos concluir que tanto la diversidad
como el número de esporas de hongos micorrícicos son muy sensibles al cambio
en el uso de los suelos, por lo que podrían constituirse como potenciales indica-
dores de la calidad edáfica en las ecorregiones de Yungas y Chaco.
Respuesta al manejo agrícola en suelos del oeste de la provincia de Buenos

Aires
En un experimento de larga duración que se lleva a cabo desde 1991 en
EEA INTA-Gral. Villegas se están estudiando los efectos de distintos manejos de
labranza, convencional (LC) y siembra directa (SD), y de la fertilización fosforada
sobre las comunidades microbianas del suelo (Sydorenko et al., 2013).
La labranza resultó ser el factor más determinante en modular la estructura
de las comunidades microbianas, mientras que la magnitud de los efectos de la
labranza sobre la estructura dependió del cultivo antecesor, como se muestra en
la figura 5. Cuando el antecesor fue soja, las diferencias estructurales de los grupos
pertenecientes a LC y SD fueron mucho menores que para maíz. Asimismo, dentro
de cada grupo se evidenció una mayor homogeneidad bajo LC, sobre todo con
maíz como antecesor. Una mayor heterogeneidad en SD puede ser explicada por
una diversificación mayor de nichos ecológicos en estos suelos, debido a una
mejor conservación de la estructura, materia orgánica y humedad. Basándonos en
nuestros resultados de estructura genética, podemos sugerir una mayor heteroge-
-209-
neidad de las comunidades microbianas bajo SD, la cual podría relacionarse con
la preservación de una mayor diversidad.
La función también se vio afectada principalmente por el sistema de la-
branza. Al evaluar la actividad enzimática global mediante la técnica de hidrólisis
de diacetato de fluoresceína y la descomposición de rastrojo en microcosmos, fi-
gura 5 a y b, se detectó una mayor actividad en los suelos bajo SD. Esta tendencia
ha sido frecuentemente reportada en la bibliografía.
Figura 5. Análisis de la actividad microbiana global [hidrólisis de diacetato de fluoresceína (a)] y

saprofítica [descomposición de rastrojo (b)]. Las columnas rayadas corresponden a LC y las va-
cías a SD. Letras distintas indican diferencias significativas (p <0,5) para cada cultivo.
El menor disturbio mecánico, el mayor contenido de materia orgánica y una

mejor conservación de la humedad han sido los factores a los cuales se han atri-
buido estos resultados. Basándonos en nuestros resultados de estructura genética
podemos sugerir una mayor heterogeneidad de las comunidades microbianas bajo
SD, la cual podría relacionarse con la preservación de una mayor diversidad mi-
crobiana.
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Interrelaciones microbianas en la rizósfera de plantas
cultivadas de interés económico en el Noroeste Argentino
Rhizosphere microbial interrelationships of cultivated plants

of economic interest in the Northwest Argentina
Brandán de Weht, Celia Ia*, Josefina A. Amigoa, Elsa L. Ullaa.
Resumen
Los hongos y bacterias colonizan nichos ecológicos en suelo, rizósfera, ri-

zoplan y filoplan. Interactúan con las plantas, transforman la materia orgánica,
solubilizan los fosfatos entre otras. Establecen relaciones simbióticas con las raíces
de las plantas (micorrizas y rizobios); mantienen los agregados del suelo por efec-
tos físicos y químicos, de proteínas y por la producción de exopolímeros de hongos
saprotróficos. En la solubilización de los fosfatos del suelo intervienen también
los ácidos orgánicos excretados por las raíces de las plantas. El transporte de nu-
trientes del suelo a la planta, en el caso de las micorrizas es mediado por el mi-
celio extrarradical el que los conduce por el micelio intrarradical y los entrega a
las células radicales por medio de los arbúsculos. Los rizobios, (formadores de
nódulos en la raíz de la planta), captan el nitrógeno de la atmósfera y lo entregan
a la planta en un proceso de transaminación. La solubilización de fosfatos se rea-
liza en el suelo en una combinación de ácidos orgánicos e inorgánicos producidos
por agentes bióticos de la rizósfera; una vez solubilizados de inmediato son to-
mados por la planta y por los microorganismos para su nutrición. Se exponen re-
sultados de experiencias desarrolladas con estos microorganismos en varios
cultivos.
Palabras clave: micorrizas, rizobios, solubilizadores de fosfatos.
Rizósfera
La rizósfera es un nicho ecológicamente especializado de la zona de la raíz

de la planta-suelo, donde las interrelaciones microbianas y sus actividades están
potenciadas y ampliamente puestas en evidencia. Los microorganismos interac-
a
Cátedra de Microbiología Agrícola. Fac. de Agronomía y Zootecnia, Universidad Nacional de
Tucumán. Avda. Kirchner 1900. 4000 San Miguel de Tucumán.* celiainesbrandan@yahoo.com.ar
-215-
túan en forma simultánea y/o independiente, en sinergia y/o antagonismo con re-
sultados benéficos o perjudiciales (Manoharachary and Mukerji, 2006). Entre las
relaciones más estrechas que se encuentran en la rizósfera están las simbióticas
como: rizobios-fabáceas y las micorrícicas entre hongos-raíces de las plantas.
Micorrizas
La simbiosis micorrícica, fue descubierta por Frank en 1885, y debe su

nombre a la estrecha relación entre ambos componentes de la asociación con re-
sultados benéficos para los dos miembros, por lo que se constituyen en una rela-
ción simbiótica mutualista. Las micorrizas son categorizadas en sietes grupos
principales de acuerdo a su morfología. En general las herbáceas y las gramíneas
son colonizadas con micorrizas endótrofas (ENM); árboles de las familias de las
Betulaceae, Fagaceae, Pinaceae y Salicaceae con ectomicorrizas (ECM), princi-
palmente con hongos Basidiomycota en general y finalmente los arbustos son
colonizados con micorrizas ericoides, pertenecientes a Ascomycota y Fungi Im-
perfecti. Los otros tipos de micorrizas tales como las arbutoides y monotropoides
son colonizadas por Basidiomycota (Harley & Smith, 1983). Se sabe de la exis-
tencia de otras clases de hongos que cumplirían el rol de las micorrizas. Son co-
nocidos como endófitos septados oscuros (ESO); Los distingue la formación de
hifas fuertemente pigmentadas y órganos de reserva y multiplicación llamados
microesclerocios, que son reservorios de proteínas, glicógeno y polifosfatos (Pe-
terson et al., 2004). Incrementan el crecimiento de la planta por la absorción de
fósforo y en ecosistemas extremos, como los alpinos, adoptarían la función de las
micorrizas (Jumpponen et al., 2001). En Tucumán los primeros registros de mi-
corrizas ectótrofas (ECM) fueron realizados por Singer y Moser en 1965. El pri-
mer estudio sistemático de presencia de micorrizas endótrofas (MA), ectótrofas
(ECM) y ESO, en la Provincia, se realizó en una tesis doctoral. Las muestras es-
tudiadas se extrajeron de tres ambientes: disturbados, no disturbados y en recupe-
ración; de dos niveles altitudinales; el I a 800 msnm y II a 1350 msnm, en el
Parque Sierra de San Javier. Se relevaron 40 especies vegetales (arbóreas, arbus-
tivas, herbáceas y helechos). Se determinaron 29 especies de MA, cuatro de ECM
(una identificada por sus carpóforos epígeos y tres en caracterizaciones en raicillas
de Eucalyptus viminalis, Phoebe porfiria y Juglans australis) y una sola ESO ca-
racterizada. El porcentaje de colonización en campo en general fue bajo; como
ECM se identificó a Scleroderma aff. verrucosum (Guzmán,1970). La cantidad
de esporas de MA en campo fue baja, se infiere que se debe a la escasa presencia
de plantas detectadas que garanticen la multiplicación in situ y al ecosistema sub-
tropical húmedo por lo que la permanencia de las micorrizas en el sistema se debe
-216-
Interrelaciones microbianas en la rizósfera de plantas cultivadas de interés económico...
a las hifas extramatriciales e intrarradicales y pertenecen a 6 géneros, uno del

orden Glomerales y 5 del orden Diversisporales. Las especies identificadas fueron:
Acaulospora aff. delicata, A. aff. laevis, A. rehmii, A. scrobiculata, A. sp 1, A. sp2,
A. sp3, A. spinosa, Entrophospora infrequens, E. sp1, Gigaspora margarita, Gi-
gaspora sp, Scutellospora aff dipapillosa, S sp 1, S. sp 2,Pacispora sp1, P. sp 2,
Glomus aff. claroideum, Gl. aff. clarum, Gl. aff. mosseae, Gl. Clarum, G. cons-
trictum, Gl. etunicatum, Gl. intraradices, Gl. mosseae, Gl sp 1, Gl. sp 2, Gl. sp 3
y Gl. sp 4 (Brandán de Weht y Cabello, 2006; Brandán de Weht, 2013). Las áreas
no disturbadas deben ser respetadas; a las disturbadas se las debe recuperar me-
diante proyectos evolutivos, a distintos plazos, con especies nativas micorrizadas
específicamente con Acaulospora spp y Scutellospora spp que predominan en las
arbóreas de crecimiento lento; las áreas en recuperación natural deben ser mane-
jadas con picadas de eliminación de especies invasoras carentes de valor e incor-
poración de especies autóctonas micorrizadas; merece destacarse el valor de la
especie exótica Ligustrum sinense y de las nativas Axonopus fissifolius y Plantago
tomentosa como buenas multiplicadoras de micorrizas arbusculares (Brandán de
Weht, 2013).
En la provincia de Catamarca, se realizaron estudios pioneros de detección
e identificación de micorrizas en una especie productiva, el nogal (Juglans regia
L.), Los resultados se plasmaron en una tesina de grado para aspirar al título de
Licenciatura en Biología. Se seleccionaron ejemplares de dos localidades del De-
partamento Ambato: La Puerta (con suelo franco limoso) y El Rodeo (con suelo
franco limoso y franco arenoso). Las variedades estudiadas fueron Franquette de
la primera localidad y Eureka, Sorrento y Turk de la segunda. Se realizaron tami-
zados húmedos para recolección, recuento y captación de esporas de MA y se
identificaron en cultivos de enriquecimiento de suelo con Sorghum bicolor y
Pisum sativum. Se tomaron muestras de raicillas para realizar observaciones mi-
croscópicas a fin detectar colonizaciones con ECM. Los resultados mostraron que
todas las variedades estudiadas estuvieron colonizadas por ECM y MA. En cuanto
a los porcentajes de colonización, en las var. Sorrento, Eureka y Turk fluctuaron
de 41-46% de ECM frente a 38-17% de MA. Las ECM se caracterizaron en seis
morfotipos según una clave específica (Agerer, 1991). Las especies identificadas
fueron: Glomus geosporum, G. albidus, G. heterosporum, G. macrocarpum, G.
flavisporum, G. australe, G. mosseae, G. aggregatum y Sclerocystis sp, las que
fueron comunes en varios casos a las var. de nogales estudiadas (Agüero, 2002).
En Tucumán, un cultivo introducido es el arándano (Vaccinium corymbosum
L.). Esta especie arbustiva, pertenece a la familia botánica de las Ericaceae, del
orden Ericales. En su lugar de origen, zonas frías del Hemisferio Norte y Sur de
América y Europa, son colonizadas naturalmente por micorrizas específicas y
-217-
dado lo estrecho y particular de la relación con estas familias botánicas, se las de-
nominó ericoides (Peterson et al., 2004). Las raicillas del arándano se caracterizan
por ser muy finas y las zonas de la epidermis, corteza y endodermis en estudios
anatómicos realizados y observados al microscopio se destacan por estar formadas
por monocapas celulares. En estudios realizados se comprobó que estas especies
tienen la capacidad de captar el nitrógeno del suelo en forma orgánica, mediada
por micorrizas específicas y únicas de estas familias, las ericoides. Estas asocia-
ciones se caracterizan por formar en las células de la corteza sus hifas en super-
enrollamientos, llamados ovillos; las células se conectan por medio de las hifas.
El hongo más estudiado formador de estas asociaciones aunque no es el único es
Hymenoscyphus ericae= Pezizella ericae (Leotiales); se caracteriza por formar
propágulos asexuales (artroconidios). Otra especie muy frecuente es Scytalidium
vaccinii (estado anamórfico de Hymenosciphus ericae). Otro género identificado
es Oidiodendron y sus estados teleomórficos ( Myxotrichum y Byssoascus) son
muy importantes. Las hifas de Oidiodendron se caracterizan por ser septadas, me-
lanizadas y articuladas.
En Tucumán se llevaron a cabo estudios, en un trabajo final para acceder al
grado de Licenciado en Biotecnología, de detección de la posible colonización de
arándanos con hongos micorrícicos ericoides. Se determinó que la var. Misty, es-
tuvo colonizada con un hongo pseudomicorrícico. El mismo presentaba los super-
enrollamientos de densidad variable en la capa de células epidérmicas y en la
corteza, con una estructura similar a un manto muy fino y se concluyó después de
su aislamiento en medio de cultivo semisintético, que pertenecía a la categoría de
los endófitos septados oscuros y que respondió a las características de Phialoce-
phala fortinii Wang and Wilcox (Botta, 2005). Esto coincide con estudios llevados
a cabo por otros autores, los que constataron que los hongos endófitos septados
oscuros reemplazan en determinadas condiciones a los micorrícicos cuando ellos
no están presentes, o si lo están, su cantidad es insuficiente para los requerimientos
nutricionales de las plantas (Jumpponen, 2001).
Se realizaron estudios pioneros de micorrizas ericoides en ericáceas nativas
en el marco de una Tesis de Maestría en Ciencias Agrarias or Producción Soste-
nible. Las mismas fueron detectadas en el departamento Santa Victoria a 3500
msnm, en la provincia de Salta, Los individuos fueron identificados como Gaul-
theria Kalm ex L. (= Pernettya). A esta única especie de las ericáceas se la ubicó
en nichos rocosos, donde se concentraba la humedad, con elevado contenido de
materia orgánica proveniente de la misma planta, en estado de floración y fructi-
ficación abundante. En preparados microscópicos se observaron morfologías si-
milares a Hymenoscyphus ericae= Pezizella ericae, los que se aislaron en medios
de cultivo semisintéticos al igual que P. fortinii (Diéguez et al., 2004 y 2005).
-218-
Los estudios de las micorrizas también abarcaron especies arbóreas de an-

tigua data en la Provincia respecto a su introducción en el país, Eucalyptus spp.
Se citaron numerosos registros de su colonización con hongos ECM mayoritaria-
mente y en menor grado con MA (Brundrett et al., 1996). En Tucumán, se reali-
zaron estudios de micorrizas en una plantación de tres años de Eucalyptus grandis
Hill ex Maiden, implantados en Río Nío, Dto de Burruyacu (Pitre, et al., 2006).
La superficie implantada en la Provincia con esta especie forestal de gran reque-
rimiento local y regional es importante, por lo que motivó a realizar un Trabajo
Final de grado de Lic. en Biotecnología. Los estudios se realizaron en dos zonas
forestadas con E. grandis; una en El Manantial (FEM), Dto. Lules y la otra en
Villa Padre Monti (VPM), Dto Burruyacu. Los resultados más relevantes de la
misma, mostraron que en ambas localidades se registraron ECM en raicillas y es-
porocarpos epígeos de Scleroderma bovista. Se utilizó un inóculo miceliar (A) en
plantines de E. grandis (10, 15 y 20 ml/planta). Otro inóculo, himenio-esporal (B)
se aplicó en plantines (10 y 20 ml/planta) que se mantuvieron en invernadero con
humedad y temperatura controlada durante tres y cinco meses respectivamente.
En VPM y FEM las muestras de raíces presentaron estructuras típicas de ECM.
Se aislaron dos cepas, una a partir de raicillas de E. grandis de FEM (MB1FEM),
y otra a partir de porciones de peridio de esporocarpos de VPM. Se detectaron las
raicillas colonizadas a los 30 días de la inoculación y se observaron estructuras
características de ECM. Los plantines inoculados con (B) presentaron mayor por-
centaje de colonización que los inoculados con (A). Los parámetros que presen-
taron importancia desde el punto de vista estadístico fueron: peso seco aéreo y
radical, longitud de parte aérea y longitud radical. Se reaislaron, se seleccionaron
y se conservaron las cepas de ECM a partir de raíces de plantines de E. grandis
inoculados. La detección, el aislamiento y la multiplicación de hongos formadores
de micorrizas, cepa MB1FEM y S. bovista asociados a E. grandis confirma la in-
terrelación, la interacción y la dependencia en algún grado de E. grandis en FEM
y VPM. La presencia de S. bovista en los dos sitios de estudio, refleja la ubicuidad
de la misma y la elevada compatibilidad con E. grandis. Se aconseja la alternativa
al uso del inóculo (B) siempre y cuando los esporocarpos sean frescos y riguro-
samente desinfectados. La cepa MB1FEM no se mostró superior como inóculo
miceliar único en E. grandis. S. bovista es el hongo más adecuado para su uso
biotecnológico en E. grandis en vivero. Se prevé continuar con los estudios para
indagar el comportamiento de estos plantines en campo. (Borrás, 2009).
La otra especie forestal ampliamente difundida en Tucumán es Pinus taeda
L. originaria del Sudeste de los EEUU; allí se asocia naturalmente con ECM y es
dependiente de ellas (Allen et al.., 1995).
-219-
A fin de indagar en la flora fúngica formadora de ECM en Pinus taeda L.

en la Provincia se realizó un Trabajo Final de grado. Los datos más relevantes que
se obtuvieron respecto a los objetivos fijados fueron: se detectaron en campo hon-
gos asociados a P. taeda; se aislaron y multiplicaron en medios de cultivo sintéti-
cos; se identificaron con claves específicas; se elaboraron dos tipos de inoculantes;
se aplicaron en plantines de pino en vivero y se evaluaron los resultados. Los sitios
de estudio fueron bosques con P. taeda de Villa Padre Monti (VPM) y San Javier
(SJ), Tucumán. Los hongos recolectados en VPM asociados a P. taeda pertenecen
al género Scleroderma bovista (ECM) y los de SJ a los géneros Scleroderma bo-
vista y Russula sp. Las raicillas presentaron modificaciones en su morfología. Se
aislaron dos cepas, una del peridio de esporocarpos de VPM, y otra de porciones
de rizoides de hongos de SJ. Se contabilizaron 9,6 x 106 esporas mLl-1 en la sus-
pensión inoculante esporo-himenial de Scleroderma de VPM; 3,28 x 106 esporas
mL-1 en la de Scleroderma de SJ y 6,2 x 106 esporas ml-1 de Russula sp. de SJ.
Los inóculos esporo-himeniales micorrizaron los plantines de P. taeda, indepen-
dientemente de la concentración y dosis empleada, produciendo el mayor porcen-
taje de micorrización los de SJ. Los inóculos miceliares de S. bovista de VPM
fueron mejores que S. bovista de SJ. Se reaislaron, seleccionaron y se conservan
las cepas de hongos ECM a partir de raíces de plantines de P. taeda inoculados.
Se concluyó que la concentración de inoculante mixto esporo-himenial de Scle-
roderma bovista diluído 1/100 en solución medio de cultivo: agua estéril aplicada
20 ml/plantín en maceta fue la más eficiente en los parámetros agronómicos fija-
dos. Los inóculos miceliares aplicados a los plantines fueron superiores a los es-
poro-himeniales en los parámetros agronómicos frente a los testigos sin inocular.
Se estableció que Scleroderma bovista, hasta ahora, es el hongo más adecuado
para su uso biotecnológico en P. taeda en las dos localidades en vivero, tanto como
inóculo miceliar como por la cantidad de carpóforos frescos que pueden cose-
charse en campo para la formulación del inóculo esporo-himenial. Con este estu-
dio también se demostró que los carpóforos de S. bovista colectados en campo
(próximos a su madurez) y desinfectados adecuadamente, son una fuente segura
y económica para aplicaciones de estos hongos en plantines de P. taeda. No se
puede afirmar lo mismo respecto a Russula sp, debido a que los esporos y el hi-
menio están muy expuestos al ambiente, lo que podría conllevar contaminantes
patogénos a los plantines a tratar (Ale, 2010). Resta estudiar si estos hongos con-
servan la capacidad de micorrizar a sus hospederos, mantenidos y repicados en
medios de cultivos artificiales en forma permanente.
Otras especies arbóreas frutícolas estudiadas fueron citrus (Lenis y Brandán
de Weht, 2000) y palto (Ascárate et al., 2000) y sus resultados evidenciaron que
se colonizaron sólo con micorrizas arbusculares nativas.
-220-
Por último, se encuentra actualmente en estudio la detección e incidencia

de MA y solubilizadores de fosfato en yacón cultivado (Smallanthus sonchifolius)
originario de los Andes Peruanos (Mercado et al.., 2007, Mercado et al., 2013) y
en sus parientes asociados de Tucumán, yacón del campo (Smallanthus macros-
cyphus) que también se observaron colonizadas con ESO (Coll Aráoz et al., 2007).
Estas plantas pertenecientes a la familia de las Asteraceae, son motivos de intensos
y avanzados estudios realizados y comprobados biológicamente en su actividad
hipoglucemiante (Grau et al., 2007).
Fijadores simbióticos del nitrógeno atmosférico
La Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) es uno de los mecanismos me-

diante el cual los cultivos cubren la demanda de este elemento. En la actualidad,
la forma de trasladar los beneficios de la FBN a los sistemas productivos, es a tra-
vés de la práctica de la inoculación de semillas con cepas comerciales de rizobios.
La soja (Glycine max L. Merr) necesita acumular grandes cantidades de N2
para su normal crecimiento, habiéndose determinado que para lograr 1 t de soja
se requieren entre 60 y 80 kg de N2. (Hungría, 2001). Tal demanda de N2 por el
cultivo es cubierta principalmente a través del aporte realizado por la mineraliza-
ción de la materia orgánica (MO) del suelo, fertilizantes y a través del mecanismo
de FBN, a partir de la asociación con bacterias pertenecientes a la familia de las
Rhizobiáceas y en el caso de la soja, ésta se asocia con la especie Bradyrhizobium
japonicum (Racca, 2002).
La práctica más recomendable para lograr que la FBN sea una fuente impor-
tante de N2 para el cultivo, es la inoculación de la semilla con cepas de rizobios in-
corporadas por medio de inoculantes de alta calidad. La respuesta a la inoculación
es mayor cuando los lotes no cuentan con antecedentes de soja. En áreas con varias
secuencias del cultivo, la repetida inoculación anual ha permitido que los rizobios
introducidos capaces de nodular, se hayan establecido y naturalizado. Por esta razón,
es posible observar la presencia de nódulos en las raíces de soja no inoculada en
suelos con historia sojera previa (Amigo et al., 2003, Díaz Zorita et al., 2005). Existe
una tendencia a suspender la inoculación luego de varios años de repetición, porque
al observarse nodulación espontánea, se considera que la fijación de N2 para el cul-
tivo ya está asegurada. En trabajos de investigación se han demostrado que los ri-
zobios que se naturalizan en el suelo van perdiendo eficiencia en la fijación de N2,
pero mantienen una alta capacidad para formar nódulos. Los rizobios introducidos
en el suelo deben competir por los nutrientes y el uso eficiente de las fuentes natu-
rales de carbono y energía. Una vez colonizado el hospedante, deben fijar gran can-
tidad de N2 para asegurar un rendimiento adecuado (Perticari, 2005).
-221-
Una estrategia para disminuir el número de nódulos con bacterias naturali-

zadas e incrementar los nódulos con las introducidas, es realizar una correcta ino-
culación y siembra de soja, utilizando productos de conocida eficiencia y alta
carga bacteriana (Albanesi, 2006).
La eficiencia del proceso de FBN atmosférico depende de diversos facto-
res que condicionan la adecuada formación de nódulos con las cepas selecciona-
das provistas por los inoculantes. La temperatura y la humedad son importantes
ya que afectan el crecimiento del rizobio, su supervivencia en el suelo y la sim-
biosis (Graham, 1992). Por lo tanto, se supone que las condiciones edáficas pre-
sentes en siembra directa (mayor humedad, menor nivel de nitratos, mayor
porcentaje de fuentes carbonadas, etc.) interactuarían favorablemente sobre la
nodulación inicial del cultivo de soja.
En menos de 10 años se duplicaron en la provincia de Tucumán tanto el área
sembrada como los rendimientos del cultivo de soja (Micucci et al., 2009), y de este
hecho surgió la necesidad de evaluar la respuesta a la inoculación de diferentes for-
mulados comerciales de B. japonicum, con el propósito de comprobar los beneficios
que derivan de su adecuado empleo en la región del norte argentino; evaluar la efi-
cacia de inoculantes con diferentes tecnologías en su formulación (tradicional y mo-
dernos) y conocer si la respuesta a la inoculación mejora con el uso de aditivos
protectores bacterianos durante el tratamiento de semillas (Micucci et al., 2010).
La inoculación en soja no era un procedimiento generalizado entre los pro-
ductores (Amigo, 2003; Devani, 2002). Teniendo en cuenta este aspecto y el hecho
que varias empresas de inoculantes comenzaron a ofrecer sus productos en el
medio, desde el año 2002 en conjunto con la Sección Granos de la Estación Ex-
perimental Agroindustrial “Obispo Colombres”, se han llevado a cabo diversos
ensayos en campo destinados a evaluar la importancia y efectividad de la práctica
de la inoculación con diferentes cepas comerciales de B. japonicum, con el pro-
pósito de comprobar los beneficios que derivan del adecuado empleo de inocu-
lantes y su incidencia directa sobre el rendimiento cultural del cultivo
Durante las campañas agrícolas evaluadas se comprobó la infectividad y
efectividad de los inoculantes comerciales de soja bajo las condiciones ambienta-
les de la región este de la provincia de Tucumán y bajo un sistema de cultivo de
siembra directa. Se observó una tendencia a favor en la cantidad y tamaño de nó-
dulos, tanto en raíces primarias como secundarias de los tratamientos inoculados
con la bacteria. Con respecto a los rendimientos, el aumento en granos por unidad
de superficie estuvo entre 4%-12% en los tratamientos donde se utilizaron los ino-
culantes comerciales.
La respuesta a la inoculación es mayor cuando los lotes no cuentan con an-
tecedentes de soja, siendo cercano al 50 % en suelos nuevos (Perticari, 2007), sin
-222-
embargo, hoy en día se estima que el área sembrada con soja sin antecedentes pre-
vios es menor al 10 %, por lo que la mayoría de los suelos presentan poblaciones
naturalizadas de rizobios (Devani et al., 2002). No obstante, se han observado res-
puestas a la reinoculación en lotes con antecedentes de soja. En áreas con varias
secuencias del cultivo de soja, la repetida inoculación anual ha permitido que los
rizobios introducidos capaces de nodular soja, se hayan establecido y naturalizado.
(Amigo et al., 2003).
Por otro lado, los tradicionales tratamientos biológicos de semillas basados
en el mejoramiento de la fijación de nitrógeno requirieron del uso de cepas selec-
cionadas, con adecuada sobrevivencia y comportamiento bajo condiciones de uso
a campo. Las nuevas tecnologías están focalizadas hacia los efectos combinados
de fijación biológica de nitrógeno mejorada y la promoción del crecimiento de las
plantas en respuesta a la presencia de moléculas activas (ej. Factores nod) solo o
en combinación con cepas de otros microorganismos promotores del crecimiento
vegetal (Micucci et al., 2010).
Otros factores de estrés a los que se exponen las bacterias del inoculante al
ser aplicadas sobre la semillas son cuando estas tratadas junto con curasemillas
(fungicidas, insecticidas, micronutrientes), práctica ampliamente difundida en los
sistemas de producción de soja en el cono sur. Varios autores han comprobado
que después de la inoculación se produce la mortalidad de B. japonicum sobre la
semilla y existe una incompatibilidad entre el producto químico y el inoculante.
Para evitar esto, se han desarrollado agentes de protección bacteriano (protectores)
que se aplican junto con el inoculante para prevenir el efecto tóxico de los pro-
ductos químicos (Montero et al.., 2005). La inoculación incrementó el número y
el peso seco de nódulos alcanzando los mayores valores en los tratamientos donde
se aplicó el protector bacteriano con lo que se estaría demostrando un efecto po-
sitivo del uso del mismo sobre la nodulación y los rendimientos cuando es incor-
porado a la semilla inoculada junto con fungicidas compatibles (Amigo et al.,
2007).
El uso de inoculantes con protectores bacterianos permitió mejorar la su-
pervivencia de las bacterias sobre las semillas de soja cuando se emplean fungi-
cidas e insecticidas curasemillas sobre estas (Penna et al.., 2002; Montero et al.,
2003; Montero et al., 2005).
Es interesante reseñar que las cepas de algunos rizobios muestran una ele-
vada especificidad por los diferentes cultivares de soja, lo que significa que una
determinada cepa puede ser muy efectiva con un cultivar y a su vez ser mediocre
con otro cultivar (Virnardell et al., 2006). Existen conceptos básicos sobre la FBN
que establecen que las diferentes estirpes de rizobios difieren en su capacidad de
fijar y nodular; que la eficiencia de la fijación varía con las características del
-223-
suelo y del ambiente; y que distintos cultivares de plantas difieren en su suscep-

tibilidad a la inoculación y con ello en su capacidad de nodular y fijar nitrógeno
Teniendo en cuenta este último aspecto, se planteó como objetivo evaluar
la respuesta de cultivares de soja a la inoculación. Los resultados de rendimiento
cultural, demostraron que la respuesta a la inoculación varía según el cultivar em-
pleado, incrementos que varían entre 2 y 13% cuando la semilla fue inoculada,
no observándose incrementos en otros cultivares y en otros ningún tipo de res-
puesta, es decir que el comportamiento es igual en el tratamiento testigo y en el
inoculado (Amigo et al., 2009)
De lo analizado por el grupo de trabajo, se infiere que en algunas zonas del
cultivo de soja de la Región NOA:
La práctica de la inoculación ha sido adoptada por un creciente número de
productores a nivel nacional, siendo hoy en día de uso generalizado.
Tanto el número y el peso de nódulos por planta como el rendimiento, mos-
traron todos diferencias significativas entre los tratamientos, independientemente
del factor a evaluar (respuesta a la inoculación; la diferente tecnología de los ino-
culantes; mejor respuesta a la inoculación con aditivos protectores. En todos los
casos se observó una tendencia a incrementar los rendimientos al aumentar la pro-
porción de nódulos por planta.
Hubo respuesta en rendimiento a la práctica de inoculación en el cultivo de
soja en el norte argentino, con valores de hasta 16% de incremento. Las respuestas
estuvieron fuertemente condicionadas a la productividad por el ambiente (lluvias,
fecha de siembra, etc.).
El uso de inoculantes de nueva tecnología, permitió duplicar las respuestas
a la inoculación pasando de 3,11 % con el uso de inoculantes tradicionales a in-
crementos de 7,62%.
Las respuestas a la inoculación mejoran significativamente con el uso de
aditivos protectores. Dicha mejora en promedio fue de 6%, respecto al no uso de
aditivos en el tratamiento de semillas.
Los distintos cultivares difieren en su susceptibilidad a la inoculación y con
ello en su capacidad de nodular y fijar nitrógeno.
Continuando con la temática, nuestro grupo de trabajo comenzó a realizar
una serie de ensayos en campo y en laboratorio en el cultivo de garbanzo (Cicer
arietinum L.). En la Provincia de Tucumán, el cultivo del garbanzo está en expan-
sión, demostrando posibilidades como una alternativa de buena a alta rentabilidad
(INTA, 2007). Existen buenas perspectivas por lo que resulta interesante incrementar
la producción orientando la misma a nuevas zonas a fin de poder aumentar la diver-
sificación de la producción. Como toda Fabacea posee la capacidad de fijar nitrógeno
a través de los nódulos radicales con bacterias del género Mesorhizobium (Figura
-224-
1). Al no registrarse estudios sistemáticos en la zona de influencia de esta práctica

sobre los rendimientos, se planteó como objetivo evaluar la eficacia y la respuesta
a la inoculación en el cultivo de garbanzo (Lorefice et al., 2009).
Figura 1a. Nódulos en raíces de garbanzo Figura 1b. Arbúsculos e hifas en raíces de gar-
banzo
Durante 4 campañas agrícolas, a partir del 2008, se realizaron ensayos con
el propósito de evaluar la incidencia de la práctica de la inoculación sobre los ren-
dimientos del cultivo en condiciones de secano y bajo riego (Ulla et al., 2010).
Las evaluaciones se centraron en analizar parámetros de crecimiento y rendimiento
cultural. Así se observó que la inoculación ejerció un efecto positivo sobre los pa-
rámetros analizados. En lo que respecta al rendimiento del garbanzo en kg ha-1,
los valores promedio superan en el tratamiento inoculado entre 23% y 25% con
respecto al testigo con riego y se observaron incrementos debidos a la práctica de
inoculación en promedio de 14% -19% en condiciones de secano, las respuestas
estuvieron fuertemente condicionadas al tipo de ambiente y a las condiciones de
siembra empleada (Amigo et al., 2011).
Las evidencias demuestran el efecto estimulante para la planta de la inocu-
lación, lo que estaría indicando que este cultivo presenta una fuerte dependencia
de esta práctica y se destaca la conveniencia de la adopción de tecnologías mo-
dernas del uso de inoculantes para el sostenimiento de altos rendimientos en el
cultivo de garbanzo en la provincia de Tucumán.
Microorganismos solubilizadores de fosfatos
El concepto de usar los microorganismos para mejorar la movilización de

las formas no disponibles del fósforo en el suelo, no es nuevo. Ya en 1948 se de-
mostró que cultivos puros de bacterias del suelo podían incrementar la nutrición
-225-
fosforada en las plantas a través de la solubilización de fosfatos de calcio. A partir

de allí, se ha publicado una amplia bibliografía con resultados promisorios. Las
interacciones microorganismos-planta son complejas y, con algunas excepciones,
se presentan dificultades en la manipulación (Richardson, 2007). En consecuencia
ha crecido el interés en el manejo de los microorganismos para mejorar la nutrición
fosforada de las plantas, con el propósito de incrementar la eficiencia del uso del
fósforo en los sistemas agrícolas.
Los mecanismos de solubilización de fosfatos por bacterias de la rizósfera
están asociados con la producción de ácidos orgánicos e inorgánicos, excreción
de protones y actividad fosfatasa. Los fosfatos insolubles pueden ser llevados a
formas solubles por la acción de variados microorganismos y la vía principal de
solubilización es mediante la producción de ácidos orgánicos tales como: acético,
láctico, oxálico, cítrico, butírico, succínico, málico, glucónico, fumárico y 2-ce-
toglucónico (Khan et al., 2009).
Los microorganismos solubilizadores de fosfatos han sido estudiados en
España, Brasil, Egipto, USA, Canadá, Argentina y otros países más y se han mos-
trado resultados favorables en relación a la producción en fabáceas, poáceas, hor-
tícolas y frutales (De Freitas et al.., 1997; Wahid et al.., 2000; Grassano et al.,
2003, Altamirano et al., 2005; Souchie et al., 2007; Kannan et al., 2007; Trujillo
et al., 2007; Ferreyra et al., 2009; Zankar et al., 2009; Rosas et al., 2011). Se ha
encontrado también, una diversidad de rizobios solubilizadores de fosfato aislados
en diferentes territorios de España y de suelos iraníes, que son capaces de movi-
lizar el fosfato de fuentes orgánicas e inorgánicas, con efectos benéficos en dife-
rentes cultivos (Rivas et al., 2006).
En investigaciones realizadas por el equipo de trabajo en la provincia de
Catamarca, se determinó que la flora microbiana solubilizadora de fosfatos se vio
estimulada en la rizósfera de orégano fertilizado con guano de vaca con respecto
a la no fertilizada y al suelo no rizosférico y podría ser la responsable del aumento
de P disponible encontrado (Ulla et al., 2006) (Figura 2).
Figura 2. Solubilizadores de fosfatos
-226-
Se demostró la capacidad de Pseudomonas extremorientalis TSAU20 y P.

chlororaphis TSAU13 para colonizar y sobrevivir en la rizósfera de poroto en sue-
los salinos (Egamberdieva, 2011) y en ensayos realizados en suelos con distintas
características físico-químicas en el NOA, se registró la presencia de microorga-
nismos solubilizadores de fosfatos en pH que varían de 6,2 a 8,7 y, en condiciones
de extrema salinidad (CE 25,08) la actividad de estos microorganismos no se ve
alterada (Ulla et al., 2007).
Con el propósito de evaluar el comportamiento del arroz (Oryza sativa L.)
frente a la acción de microorganismos solubilizadores de fosfatos, se realizaron
ensayos en el campo experimental de la FAZ-UNT en Finca El Manantial. Se uti-
lizó la var. Tangara sin inocular e inoculada con un producto comercial con bac-
terias del género Pseudomonas y los resultados preliminares evidenciaron
diferencias significativas en peso fresco de parte aérea y peso de granos a favor
del tratamiento inoculado (Mazza, et al., 2009).
En experiencias llevadas a cabo para determinar el comportamiento de la
microflora solubilizadora de fosfatos en la rizósfera de soja y arveja en Tucumán
y de orégano y anís en Catamarca, se demostró la presencia de microorganismos
solubilizadores de fosfatos en la rizósfera de los cuatro cultivos analizados, pre-
sentando mejores niveles de respuesta cuando baja la intensidad de fósforo dis-
ponible (Ulla et al., 2010, Ulla et al., 2011).
Sobre la base de que los microorganismos solubilizadores de fosfatos pre-
sentan una amplia diversidad morfofisiológica y desempeñan un importante papel
en el suplemento de fósforo para las plantas, se desarrolló un trabajo cuyos resul-
tados se plasmaron en la tesina “Microorganismos solubilizadores de fosfatos en
dos regiones agroecológicas de Tucumán”, finalizada y defendida en abril de 2011.
Se aislaron 14 microorganismos de la rizósfera de soja; cuatro resultaron ser pro-
ductores de sideróforos e indoles y presentaron eficiencia de solubilización supe-
rior a 100. Los aislamientos se caracterizaron, a través de morfología y pruebas
bioquímicas, como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Kleb-
siella spp. y Serratia spp. (Brito y Ulla, 2012).
Muchos microorganismos del suelo y de la rizósfera han sido valorados por
su capacidad para disolver fosfatos en cultivo puro y en asociaciones con las raíces
de las plantas y se ha informado que los hongos tienen mayor habilidad para so-
lubilizar fosfatos que las bacterias (Vera et al.., 2002). Por ello, se están llevando
a cabo ensayos de aislamiento y determinación de la capacidad para solubilizar
fosfatos de hongos aislados de suelos de Catamarca y Tucumán. Los aislamientos
se caracterizaron como Aspergillus sp. (M3CN, M3CB), Penicillium sp, (MA),
Rhizopus sp,(MD), Gliocladium sp. (MC) y Aspergillus niger (ME). El potencial
solubilizador de fosfatos se determinó en medio NBRIP líquido y se realizaron
-227-
las mediciones de fosfato soluble en espectrofotómetro. Los resultados mostraron

valores significativos para las cepas MA (54,4 mgL-1), MD (60,3 mgL-1), M3 CN
(55,8 mgL-1) y M3CB (54,2 mgL-1), característica que los hace promisorios para
ser usados como inoculantes (Agüero et al., 2011; Agüero et al., 2012).
Según las diferencias en la exudación de las raíces, las comunidades mi-
crobianas de la rizósfera pueden variar en su estructura o en relación al tipo de
suelo, especies de plantas, estado nutricional, edad, estrés, enfermedad y otros
factores ambientales. Con el propósito de investigar acerca del comportamiento
de la microflora solubilizadora de fosfatos en un sistema silvopastoril en el Parque
Chaqueño Húmedo, se realizó un ensayo en el que se tomaron muestras compues-
tas de rizósfera de arbóreas y de pasturas. Los resultados preliminares mostraron
que el 39% de los microorganismos encontrados solubilizaron fosfato tricálcico
en arbóreas y sólo el 1,7% en pasturas, por lo que se infiere que los exudados de
las pasturas ejercen un efecto inhibitorio sobre este grupo de microorganismos
(Mijaluk et al., 2012).
La caracterización y evaluación de nuevos aislamientos bacterianos solu-
bilizadores de fosfatos como promotores del crecimiento vegetal, constituye un
desafío para el desarrollo de una agricultura sostenible, y es lo que fundamentó la
realización de la tesina “Bacterias solubilizadoras de fosfatos de tres localidades
del NOA”, finalizada y defendida. Se aislaron diez bacterias solubilizadoras de
fosfatos que de acuerdo a la identificación fenotípica y pruebas bioquímicas se
correspondieron con Pseudomonas spp. (Ca2), Pseudomonas aurantiaca, Bacillus
subtilis, Bacillus spp, Bacillus megaterium, Serratia fonticola, Proteus spp. Me-
diante el secuenciamiento del gen 16S ADNr se confirmó la identidad de Bacillus
subtilis (NC2) y de Bacillus spp. como Bacillus amiloliquefaciens (NC4). Se ino-
cularon semillas de maíz con B. amiloliquefaciens, B. subtilis y Pseudomonas spp
por ser las que presentaron mayor eficiencia de solubilización y se compararon
con controles sin inocular. Los resultados, a 30 días de la siembra, mostraron que
las plantas inoculadas fueron las de mejor comportamiento, se produjeron aumen-
tos de longitud, peso fresco y peso seco de tallos y longitud, peso fresco y peso
seco de raíz (García, 2012).
En la Provincia de Tucumán, el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.)
está en expansión y no se registran estudios sistemáticos sobre la influencia de
las interacciones microbianas sobre el crecimiento y desarrollo de la planta. En
el campo experimental de la FAZ-UNT, se realizaron ensayos con el propósito
de evaluar la incidencia de la inoculación sobre la actividad microorganismos
solubilizadores de fósforo. Se utilizó un formulado comercial de rizobios, a
dosis de marbete y los resultados mostraron un aumento del 25% en el rendi-
miento y del 21% en la cantidad de estos microorganismos (Ulla et al., 2010).
-228-
Por otro lado, en un ensayo en una explotación privada, se demostró que el

riego estimuló la actividad de los microorganismos solubilizadores de fosfatos y
fue determinante en la producción de garbanzo. Se trabajó con un inoculante co-
mercial líquido a base de Mesorhizobium ciceri y los resultados mostraron un au-
mento en el número de UFC g-1 de 5,6 x 106 en secano a 1,25 x 107 con riego y la
producción cultural, con riego, se vio incrementada en un 90% (Ulla, et al., 2012).
La expansión de la agricultura en el NOA y la reducida y/o casi nula apli-

cación de fertilizantes en algunas zonas han generado balances negativos de nu-
trientes en el suelo. Es por eso que las inoculaciones con microorganismos, tienen
una importancia central en la sustentabilidad de los sistemas productivos de la re-
gión, tanto por su aporte en mayores rendimientos como el mejoramiento en el
balance de los nutrientes de los suelos.
Un dato importante a tener en cuenta es que está en incremento la integra-
ción del uso de inoculantes en base a fijadores de N, solubilizadores de fosfatos y
micorrizas en la región.
La región NOA es depositaria de un stock de biodiversidad muy importante
donde los recursos genéticos están distribuidos en áreas geográficas muy diversas.
Es por ello que se considera de interés las cepas nativas de micorrizas y solubili-
zadores de fosfatos, detectadas y aplicadas en varios de los cultivos.
Actualmente se considera que el mejor desarrollo de la planta sería el re-
sultado de la interacción de la FBN, producción de fitohormonas y sustancias so-
lubilizadoras de fósforo entre otras. Esto ha llevado a nuestro grupo de trabajo, al
estudio de la microflora de la rizósfera, endófitos y de bacterias promotoras de
crecimiento de las plantas. Por todo ello se hace necesario continuar con los estu-
dios básicos y aplicados para generar tecnologías que permitan la utilización ma-
siva de biofertilizantes microbianos como alternativa en una agricultura
sustentable.
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Los rizobios que nodulan la soja en sitios con
ambientes nativos y cultivados de la Argentina
Rhizobia that nodulate soybean in native and cultivated

environments of Argentina
López Silvina a, Graciela N. Pastorinoab, Virginia Martínez Alcántaraab, Darío

Salvuccia y Pedro Alberto Balattibc*
Resumen
La soja es una leguminosa que establece simbiosis con diez especies dis-
tintas de rizobios entre las que se encuentran bacterias de crecimiento rápido y
lento. La interacción es el resultado de la expresión de un conjunto de genes en la
planta y en la bacteria. En este trabajo se describe que los cultivares de soja de la
Argentina presentan variabilidad en su capacidad de nodulación y que se han en-
contrado dos satélites asociados a este carácter. Por otro lado el análisis de la di-
versidad en suelos sin historia del cultivo de soja demostró que los rizobios nativos
de esas áreas podrían aportar genes para la evolución de los rizobios simbiontes
de la soja. Es más, la diversidad de suelos y ambientes en los que se cultiva la
soja es probable conduzca a la evolución de asilamientos con capacidades sim-
bióticas contrastantes.
Palabras Clave: Soja-Bradyrhizobium-nodulación-marcadores moleculares-di-

versidad
a
INFIVE Instituto de Fisiología Vegetal-Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales-Universidad
Nacional de La Plata
b
Cátedra de Microbiología Agrícola Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales-Universidad Na-
cional de La Plata
c
CIDEFI Centro de Investigaciones de Fitopatología- Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales-
Universidad Nacional de La Plata. *pbalatti@gmail.com
-237-
Introducción
La soja es una planta de la familia Fabaceae, su origen está asociado a las

provincias del noroeste de China y Manchuria. En el año 2853 A.C. el emperador
de China Sheng-Nung la nombró planta sagrada, momento en el que se convirtió
en un grano importante. Fue domesticada en el noreste de Asia entre 3000 y 5000
anos a de C. La primer planta de soja se documentó en el este de Asia y provenía
de Daundong y del río Nam in Korea del Sur (Crawford, Lee 2003), lo que con-
firma que la soja fue domesticada en el Nor-este de Asia entre los años 3000 y
5000 a de C (Hymowitz, 2004). Entre los años 1700 y 110 a de C en el oeste de
China fue cultivada como una forrajera y a partir del año 100 d de C esta fue in-
troducida en países como Japón, Indonesia, Filipinas, Vietnam, Tailandia, Malasia,
Burma, Nepal y la India y a partir de estos países, siguiendo las rutas del comercio
internacional, se dispersó por el mundo. Los taxónomos sugieren que los cultiva-
res comerciales de soja Glycine max (L.) Merr, derivan de Glycine soja (syn G.
usuriensis o G. formosana), Regal and Mack, una planta trepadora anual que se
encuentra en el norte de China en Korea, Taiwan y Japón (Broich and Palmer,
1981). La soja de la misma manera que otras leguminosas establecen simbiosis
con bacterias del suelo como Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982), Bradyr-
hizobium elkanii (Kuykendall, 1992) Bradyrhizobium liaoningense (Xu, 1995),
Bradyrhizobium yuamingense (Yao, 2002) Bradyrhizobium canariensis (Vinuesa
et al., 2005), Bradyrhizobium daqingense (Wang et al, 2013) Ensifer fredii, Ensifer
sojae (Chon et al, 1988), Mesorhizobium tianshanense (Chen, 1995) and Rhizo-
bium tropici (Hungría et al, 2006), a los que se denominan comúnmente como ri-
zobios. El género Bradyrhizobium tiene cierta complejidad en lo que hace a su
constitución, que ha sido el resultado de la identificación de nuevas especies de
organismos (Tabla 1). Estos además tal cual sugieren Kopeela y Parker (2012) se
destacan por la promiscuidad, que parece ser una característica de los integrantes
del género Bradyrhizobium.
-238-
Los rizobios que nodulan la soja en sitios con ambientes nativos y cultivados de la Argentina
Tabla 1. Especies bacterianas que conforman el género Bradyrhizobium. A= nombre de la espe-

cie; b=cepas tipo simbología con que se la puede encontrar en la bibliografía; c= Número de ac-
ceso al NCBI de cada una de las secuencias del RNA16S
Nombre Cepa Tipo RNA 16S Ref. Bibliográfica

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26795 Qi Hu, Li Ya Zhang, Wen Xin
Chen
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Bradyrhizobium deni- 1113 = HAMBI 2266 =
X66025 Eardly B.D. Syst. Appl. Mi-
trificans LMG 8443 = VKM B-
crobiol., 2006,29, 207-215
2062.
USDA 76 = ATCC
Kuykendall L.D., Saxena B.,
49852 = DSM 11554 =
Bradyrhizobium elkanii U35000 Devine T.E. Udell S.E . Can. J.
IFO (now NBRC)
Microbiol., 1992, 38, 501-505.
14791 = LMG 6134.
-239-
Continúa de Tabla 1
Zhang Y.M., Li Y.J., Chen W.F.,

CCBAU 23303 =
Wang E.T., Sui X.H., Li Q.Q.,
Bradyrhizobium huang- CGMCC 1.10948 =
HQ231463. Zhang Y.Z., Zhou Y.G., Chen
huaihaiense HAMBI 3180 = LMG
W.X.:.Int. J. Syst. Evol. Micro-
26136
biol., 2012, 62, 1951-1957.
Kawasaki H., Muramatsu Y.,
Bradyrhizobium irio- EK05 = LMG 24129 = Nakagawa Y., Seki T. Biosci.
AB300992
motense NBRC 102520. Biotechnol. Biochem., 2008,
72, 1416-1429.
Jordan D.C. Transfer of Rhi-
zobium japonicum Buchanan
strain ATCC 10324 = 1980 to Bradyrhizobium gen.
Bradyrhizobium japoni- CCUG 27876 = CIP nov., a genus of slow-gro-
U69638
cum 106093 = DSM 30131 wing, root nodule bacteria
= HAMBI 2314 from leguminous plants. Int.
J. Syst. Bacteriol., 1982, 32,
136-139.
Ramirez-Bahena M.H., Peix
A., Rivas R., Camacho M.,
Rodriguez-Navarro D.N., Ma-
teos P.F., Martinez-Molina E.,
Willems A., Velazquez E.:
Bradyrhizobium jica- PAC68 = CECT 7395 =
AY624134 Bradyrhizobium pachyrhizi sp.
mae LMG 24556.
nov. and Bradyrhizobium jica-
mae sp. nov., isolated from ef-
fective nodules of Pachyrhizus
erosus. Int. J. Syst. Evol. Mi-
crobiol., 2009, 59, 1929-1934.
Chang Y.L., Wang J.Y., Wang
E.T., Liu H.C., Sui X.H.,
Chen W.X.: Bradyrhizobium-
CCBAU 23086 =
lablabi sp. nov., isolated from
Bradyrhizobium lablabi HAMBI 3052 = LMG GU433448
effective nodules of Lablab
25572
purpureus and Arachis hypo-
gaea. Int. J. Syst. Evol. Micro-
biol., 2011, 61, 2496-2502.
Xu L.M., Ge C., Cui Z., Li
J.,Fan H.: Bradyrhizobium
ATCC 700350 = CIP
Bradyrhizobium liao- liaoningense sp. nov., isolated
104858 = NBRC AF208513
ningense from the root nodules of soy-
100396 = LMG 18230.
beans. Int. J. Syst. Bacteriol.,
1995, 45, 706-711
-240-
Continúa de Tabla 1
Ramirez-Bahena (M.H.),
Chahboune R., Peix A., Ve-
lazquez E.: Reclassification of
Agromonas oligotrophica into
Bradyrhizobium oligo- ATCC 43045 = JCM
JQ619230. the genus Bradyrhizobium as
trophicum 1494 = LMG 10732.
Bradyrhizobium oligotrophi-
cum comb. nov. Int. J. Syst.
1013-1016.
Ramirez-Bahena M.H., Peix
A., Rivas R., Camacho M.,
Rodriguez-Navarro D.N., Ma-
Bradyrhizobium PAC48 = CECT 7396 =
AY624135. teos P.F., Martinez-Molina E.,
pachyrhizi LMG 24246
Willems A., Velazquez E. Int.
J. Syst. Evol. Microbiol.,
2009, 59, 1929-1934
Chahboume R.,Carro L., Peix

A., Ramirez-Bahena, M.H.,
CTAW71=LMG26781= Barrijal S., Velazquez E.,
Bradyrhizobium rifense EU561074
CECT8066 Bedmar E.J. 2012. Systematic
and applied microbiology
35,302-305.
CCBAU 10071 = Yao Z.Y., Kan F.L., Wang

Bradyrhizobium yuan- CFNEB 101 = CIP E.T., Wei G.H., Chen W.X.:
AF193818
mingense 108027 = NBRC Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
100594 2002, 52, 2219-2230.
Los organismos que interactúan tienden a evolucionar en conjunto porque

comparten los ambientes (Stukenbrock and McDonald, 2008), es decir que las re-
giones de origen de la soja son potenciales fuentes de rizobios que nodulan y fijan
nitrógeno con la soja. Si bien hasta no hace tanto tiempo se consideraba que no-
dulaba solo con Bradyrhizobium japonicum (Kirchner, 1896), una bacteria de cre-
cimiento lento. Más recientemente, Trinick (1980) en Papua Nueva Guinea,
Keyser et al. (1982) y Dowdley y Bohlool (1985) en suelos de la China describie-
ron la existencia de estirpes de rizobios de crecimiento rápido que nodulan la soja.
A esto le siguieron investigaciones realizadas por Cleyet Marel (1987) en Vietnam
en donde también aisló bacterias de crecimiento rápido que nodulan soja. Más
tarde investigadores chinos y Europeos aislaron rizobios e hicieron un detallado
estudio de los suelos y los rizobios contenidos por estos (Oates et al., 2003; Ca-
-241-
macho et al., 2002, Chen, 2004, Zhang et al., 2011; Li et al., 2011). Se encontró
que en las regiones tropicales y subtropicales de China con climas húmedos y sue-
los ácidos, la soja establece simbiosis con B. japonicum, B. elkanii y difícilmente
con B. liaoningense, B. yuanmingense and B. canariensis (Barcellos et al., 2007;
Yang, 2006), excepto en Hubei sitio de donde se aislaron diversas cepas de Ensifer
fredii (Camacho et al., 2002). En Heilongiang, una provincia al Noreste de la
China que tiene clima húmedo y suelos neutros o ligeramente ácidos, la soja es
nodulada primordialmente por B. japonicum, muy poco por B. elkanii y nunca por
E. fredii (Wang et al., 2009). Tanto la provincia de Hubei como de Heilongiang se
cree que son los centros de origen de la soja. Esta también fue introducida en la
provincia de Xinjiang, que tiene clima seco y suelos alcalinos en los que las es-
pecies de rizobios que nodulan soja son Ensifer fredii y B. liaoningense. Es im-
portante destacar que en los sitios descriptos se cultivan distintos cultivares de
soja. Todos estos resultados sugieren entre otras cosas que la diversidad de los ri-
zobios que interactúan con la soja no es completamente clara, más aún algunos
de estos rizobios nodulan preferencialmente con ciertos materiales genéticos y
por lo tanto el cultivar utilizado como trampa define la diversidad encontrada. Por
otro lado, también se concluyó que el pH de los suelos y la disponibilidad de un
conjunto de nutrientes claves definen la distribución geográfica de los rizobios.
La capacidad de la soja para interactuar con los rizobios está determinada
genéticamente y cada cultivar de soja responde específicamente a la interacción
con cepas seleccionadas y en este sentido no solo se han identificado genes que
regulan la respuesta de la planta a determinadas bacterias (Balatti, 2008), sinoque
además se identificaron caracteres cuantitativos asociados a marcadores SSR que
determinan la capacidad de nodulación de la soja (Nicola´s et al., 2006; Santos et
al., 2006; Salvucci et al., 2011). Más aún, Yang et al. (2010) encontraron que la
respuesta de incompatibilidad de algunos cultivares de soja con estirpes de Ensifer
fredii se debía a un gen de resistencia a enfermedades. Es posible que, de la misma
manera que los genes de resistencia determinan que la planta reconozca a las bac-
terias patógenas, algo similar ocurra con los rizobios, desencadenando así una re-
acción de hipersensibilidad. Una de las características de los rizobios es la
especificidad, esto es que una bacteria aún con su genoma completo solo induce
formación de nódulos fijadores de nitrógeno en una planta pero no en la otra, lo
que podría estar regulado, al menos en parte, por los genes de resistencia a enfer-
medades, que se encuentran en gran cantidad en el genoma de las plantas.
Con la idea de identificar interacciones leguminosa-rizobios de alto poten-
cial de fijación de nitrógeno se trabajó sobre la planta de soja. Se evaluó si los
marcadores moleculares asociados a caracteres cuantitativos de nodulación, des-
criptos por otros investigadores, son herramientas útiles para identificar estos ca-
-242-
racteres en los cultivares nacionales. El objetivo general fue primero identificar

cultivares con alta capacidad de nodulación. Al mismo tiempo, se analizó la po-
blación de rizobios simbiontes de la soja, con el fin fue identificar cepas con me-
jores aptitudes simbióticas, en suelos de la provincia de Salta sin historia del
cultivo de soja pero con leguminosas nativas y en suelos con historia del cultivo
de soja bajo distintos sistemas de manejo. Considerando el primer objetivo se pro-
cedió a evaluarla capacidad de nodulación de materiales provenientes de tres se-
milleros Nidera, Semillero Santa Rosa y Don Mario. Se trabajó con 30 cultivares
de cada compañía. En la Figura 1 se presentan resultados parciales y representa-
tivos de los ensayos.
Figura 1. Capacidad de nodulación de cultivares comerciales de soja provenientes del semillero

. Los resultados son promedios de 10 plantas de cada cultivar.
En primer lugar se demostró que la nodulación es variable en los cultivares

de soja. Los cultivares de baja capacidad de nodulación producen 2.5 veces menos
nódulos que los cultivares de alta capacidad de nodulación. Esto último también
se confirmó realizando estudios de características cuantitativas y cualitativas de
un set de cultivares comerciales de argentina y tres cultivares de Brasil. Un grupo
contuvo plantas altas, de crecimiento indeterminado y ciclo de vida largo, otro
grupo de plantas tuvo baja altura, crecimiento determinado, ciclo de vida largo y
un tercer grupo de plantas con altura y ciclo de vida medio; mientras cultivares
de los primeros dos grupos mostraron baja capacidad de nodulación, el tercer
grupo mostró alta capacidad. En estos mismos estudios se asociaron dos microsa-
telites Satt 251 y Satt 233 con la nodulación en los cultivares comerciales de soja.
Este carácter variable de la nodulación y fijación de N es probable que responda
al aporte de un conjunto de genes. Se han realizado cruzamientos entre cultivares
de alta y baja capacidad de nodulación, se obtuvieron las F1 y se procedió a ge-
-243-
nerar la F2. En la descendencia se evaluó el fenotipo de nodulación y se analizaron

los genomas de estas plantas con marcadores SSR. En estos momentos se están
construyendo los mapas de ligamiento (Salvucci, Aulicino, Balatti datos no pu-
blicados).
La biología molecular ha aportado herramientas útiles para la identificación
de las especies de bacterias que interactúan con las leguminosas pero además, ha
permitido realizar no solo el análisis de la diversidad, sino también determinar
cuáles fueron los procesos que la generaron. La secuencia del RNA16S ha contri-
buido fuertemente a nuestra comprensión de los grupos bacterianos, sin embargo
como es una secuencia muy conservada no muestra determinados niveles de va-
riabilidad (Willems et al., 2001). La región espaciadora del RNA16S y el
RNA23S es variable en el largo y la secuencia nucleotídica (Gurtler and Stanisich,
1996). Además los Bradyrhizobium contienen regiones repetitivas del genoma
RSα, RSβ y IS1631, que son conservadas y se encuentran dispersas en el genoma
(Minamisawa, 1998). Vale la pena destacar que las secuencias repetitivas descrip-
tas en Bradyrhizobium se ubican primordialmente en la isla simbiótica y que esta
bacteria en general evoluciona a través de re-arreglos y recombinaciones en el ge-
noma (Vinuesa, 2005). Otras herramientas moleculares utilizadas son las secuen-
cias BOX, REP y Eric descriptas por De Brujin (1992). En base a todo lo dicho y
a la potencialidad de cada marcador se desarrollaron un conjunto de reacciones
REP, BOX, Multiplex PCR-RSα tendientes a identificar a los aislamientos de
Bradyrhizobium (López y Balatti, 2012)
Burkart ha descripto un número importante de leguminosas nativas de las
cuales se conoce muy poco en lo que hace a las estirpes con las que establecen
interacciones simbióticas. En base a la bibliografía y trabajos realizados con estas
especies u otras relacionadas, en otros sitios del planeta, se conoce que muchas
de ellas establecen simbiosis con rizobios de crecimiento lento muy probablemente
pertenecientes al género Bradyrhizobium. Esto y el hecho de que los bradyrizobios
son promiscuos, hacen que los rizobios simbióticos de las especies nativas sean
potenciales simbiontes de soja y por lo tanto competidores de los inoculantes co-
merciales. Se analizó con reacciones de PCR con primers BOX la diversidad de
aproximadamente 160 aislamientos provenientes de sitios de la provincia de Salta
con plantas nativas. En el análisis se incluyeron las estirpes de Bradyrhizobium
que se utilizan en los inoculantes comerciales de Argentina (E109=USDA138;
Semia 5019; Semia 587, Semia 5079 y Semia 5080. Los resultados se presentan
en la Figura 2.
-244-
Figura 2. Rizobios aislados de suelos del norte Argentino sin historia del cultivo de la soja
-245-
Se observa en primer lugar que el nivel de diversidad es considerable y que

los aislamientos no se agruparon en clados que contengan las cepas comerciales
de Bradyrhizobium. Más aun, dos de los aislamientos fueron de crecimiento rápido
lo que se confirmó por medio de la reacción de multiplex PCR (Pastorino et al,
2003), esta reacción demostró la presencia de genes específicos en el genoma de
E. fredii. El resto de los aislamientos fueron de crecimiento lento y contuvieron
secuencias repetitivas RSα por lo que probablemente son bradyrizobios. Estas
estirpes desarrollaron nódulos en cultivares comerciales de soja, si bien un grupo
lo hizo más eficientemente en cowpea. Además, el análisis de las pruebas fisio-
lógicas agrupó a las especies que nodularon la soja 90 sp y otras distintas70 sp
que nodularon el cowpea. Otra observación fue que los aislamientos no se agru-
paron en base a su origen geográfico, lo que quiere decir que los genotipos bacte-
rianos no estuvieron influenciados por el ambiente o alternativamente, que todos
los ambientes muestreados presentaron características similares. Melchiore et al.
(2011) y Chavez Díaz et al. (2013) analizaron la diversidad si bien los objetivos
fueron distintos. Melchiore tuvo como objetivo identificar cepas resistentes a con-
diciones de estrés de agua y encontró, en estudios realizados en diversos lotes, ni-
veles considerables de diversidad. Chávez Díaz describió la diversidad de los
rizobios que nodulan Prosopis alba en los suelos del parque chaqueño y también
encontró niveles considerables de diversidad. Vinuesa et al. (2005) demostró in-
congruencias entre arboles filogenéticos realizados con “house keeping genes” y
genes de simbiosis, sugiriendo que es muy frecuente la transferencia horizontal
de genes entre representantes de Bradyrhizobium, y esta sería una manera de ad-
quirir genes de resistencia a estreses ambientales
La diversidad de los rizobios también se estudió en aislamientos realizados a
partir de suelos bajo distinto sistema de manejo, uno consistió en siembra directa
con cultivo antecesor soja y otro en labranza convencional con cultivo antecesor
maíz. Los rizobios se aislaron por medio de plantas trampa para lo cual se inocularon
semillas de soja esterilizadas superficialmente con una serie de diluciones de suelo.
Nuevamente se analizó la diversidad, con fingerprints generados con primers BOX,
en este caso el total de aislamientos analizados fue de 200 (Figura 3).
-246-
Figura 3. Rizobios de suelos bajo distinto sistema de manejo (siembra directa con cultivo antece-
sor soja y labranza convencional con cultivo antecesor maíz)
-247-
La diversidad de los bradyrizobios no estuvo relacionada con la dilución

de suelo a partir de la cual se obtuvieron. Se ha mencionado que en algunos estu-
dios distintas diluciones de suelo muestran niveles de diversidad distintos. En
todos los análisis siempre se incluyeron las cinco estirpes de rizobios con que se
formulan los inoculantes comerciales E109 (USDA138), SEMIA5019,
SEMIA587, SEMIA5079 y SEMIA5080. El porcentaje de haplotipos distintos
fue de aproximadamente 38%; dicho de otra manera, todos los aislamientos se re-
presentan con aproximadamente 70 haplotipos. En la Fig. 3 se presenta el feno-
grama realizado sobre la base del análisis de agrupamiento de los fingerprint BOX.
Se observa que los patrones de las cepas comerciales aparecen en el fenograma
mezclados con el resto de los aislamientos. Además, estos no se agruparon en base
al sitio de recolección ni en base a la especie de bradyrizobio. Los aislamientos
se analizaron con los fragmentos RSα y se observó que si bien gran parte de los
mismos son Bradyrhizobium japonicum, otros que producen en medio extracto
de levadura-manitol-agar pequeñas colonias a los 7 días de cultivo, son B. elkanii.
Esto fue confirmado en base a la secuencia del ITS (Figura 4).
Figura 4. Análisis de secuencias ITS de rizobios aislados de suelos y cepas controles de las espe-
cies B. japonicum y B. elkanii, utilizadas en formulaciones comerciales.
Los rizobios se adaptan a diversos suelos lo que resulta en la aparición de

linajes adaptados a condiciones específicas (Koppel y Parker, 2012). Ellos encon-
traron que en regiones endémicas en las que B. japonicum y B. elkanii comparten
ambientes, Bradyrhizobium cambia sus estructura de población por sobre los li-
najes, que suelen ocupar lugares o sitios distintos y distantes. Esto quiere decir
-248-
que las características ambientales de los suelos pueden generar linajes o grupos
de Bradyrhizobium u otros rizobios con características propias, tal cual se descri-
bió que ocurrió en los suelos de la China. Algo importante, que aun no está claro,
es si es común que las leguminosas establezcan relaciones exclusivas con ciertos
rizobios, o si es que se asocian con rizobios menos especializados que pueden aso-
ciarse con otras leguminosas que coexisten. Este sería el caso de lo encontrado en
los suelos de Salta en donde probablemente simbiontes de plantas nativas nodulan
soja. Recientemente, Tian et al. (2013) demostraron que el genoma de Bradyrhi-
zobium es desproporcionadamente rico en lípidos y metabolitos secundarios; por
otro lado, genes de osmo-protección y de adaptación a pH alcalino son específicos
del genoma de Sinorhizobium. Estos resultados sugieren que los genomas de los
rizobios evolucionan preferentemente por recombinación que incluye a la trans-
ferencia lateral de genes; y en esto, la adaptación de los rizobios a interacciones
simbióticas y otras condiciones ambientales demanda incorporar genes de pro-
tección procedentes de otros linajes, en lo que es un proceso de especiación que
ocurre permanentemente en el suelo.
Siguiendo con el análisis de los aislamientos de suelos con diversos mane-
jos, se seleccionaron 12 representantes (115, 665, 457, 9110, 2614, 2615, 163,
366, 458, 2112, 455 y 953). Estos aislados fueron evaluados en un ensayo bajo
condiciones controladas en lo que hace a su capacidad de fijación de nitrógeno,
lo que se determinó indirectamente en base al peso seco de la parte aérea de las
plantas. El ensayo consistió en 18 tratamientos con 10 repeticiones de cada uno,
en el mismo se incluyeron además las cepas de uso comercial de B. japonicum
(Semia 5079, Semia 5080 y E109) y B. elkanii (Semia 587y Semia 5019). Se en-
contró que las plantas inoculadas con las cepas de crecimiento lento 366, 115,
665, 457, 2614, 2615, 458, 2112, 455 y 953 mostraron una producción mayor de
biomasa vegetal que las plantas inoculadas con la cepa de control E109. También
se observó que en las plantas inoculadas con las cepas 366 y 665 se produjo una
mayor biomasa nodular que en las plantas inoculadas con la cepa E109 y las plan-
tas inoculadas con la cepa 953 mostraron menor producción de biomasa nodular
en relación a las plantas inoculadas con la cepa E109 control. Estos resultados
fueron reconfirmados en dos nuevos test de inoculación en plantas, con una sub-
selección de cepas que en el primer ensayo mostraron comportamientos contras-
tantes a la cepa control E109, conforme se continuaba con la caracterización de
las mismas.
Simultáneamente, se realizó una caracterización genética de los aislados
con marcadores moleculares REP, BOX, Multiplex PCR-RSα. El conjunto de estas
secuencias suelen ser útiles para diferenciar aislados de Bradyrhizobium en al
menos dos grupos, uno de cepas de B. elkanii y el otro de B. japonicum (López
-249-
y Balatti, 2012). La combinación de los fingerprints generados por este conjunto

de marcadores permitió diferenciar los genomas de las cinco cepas comerciales
más utilizadas en inoculantes comerciales de Brasil, Uruguay y Argentina. Ade-
más, el análisis de la combinación de fingerprints generados con REP, BOX y
RSα agrupó a los aislados y a las estirpes control en dos clusters, uno formado
por las estirpes 115, 665 y 9110 y B. elkanii SEMIA587 y 5019. El otro cluster
incluyó a las estirpes control de B. japonicum y el resto de los aislados. En con-
clusión el uso combinado de los tres fingerprints resultó en una herramienta para
la identificación precisa de las cepas naturalizadas que frecuentemente acumulan
mutaciones.
La identidad de los aislados se confirmó con la secuencia del ITS (Interge-
nic Transcribed Spacer). Las secuencias ITS de cada aislado (GenBanck accession
numbers: GI390136076 a GI390136091) fueron analizadas utilizando la herra-
mienta Basic Local Alignment Search de la base de datos National Center for
Biotechnology Information (NCBI). Este análisis confirmó el agrupamiento ge-
nerado con fingerprints en dos grupos [B. japonicum (163, 366, 457, 2614, 2615,
458, 2112, 455 y 953) y B. elkanii (cepas: 115, 665, 9110)]. Los ITS se utilizaron
para hacer un análisis evolutivo en la Fig. 4 se presenta los resultados y se puede
observar que hay considerables niveles de evolución.
En conclusión hemos realizado análisis de diversidad de los suelos con y
sin historia del cultivo de soja y en los dos identificamos potenciales competidores
de las bacterias que se adicionan a partir de los inoculantes. La presencia de pooles
de bacterias provenientes de diversas especies de leguminosas nativas y aun las
estirpes naturalizadas, que se incorporaron con los inoculantes comerciales, son
fuente de genes que a través de la transferencia lateral y la recombinación pueden
provenir de la incorporación de genes por transferencia lateral de genes asocia.
Considerando que la soja se cultiva en una extensa región de la Argentina
que incluye muy distintos tipos de suelo y condiciones ambientales y que en estas
bacterias es común la variación por transferencia horizontal de genes a partir de
cepas dadoras, es probable que esté ocurriendo una suerte de evolución de grupos
de bradyrizobios diferenciados por sus capacidades simbióticas que no son más
que el resultado de variaciones a nivel genético. Futuros trabajos deberán orien-
tarse a muestreos sistemáticos de diversas áreas de cultivo para analizar los rizo-
bios de la soja.
Por otro lado se reporta la disponibilidad de satélites para la selección de
cultivares con alta capacidad de nodulación, característica que además se demostró
tiene cierta variabilidad en los cultivares comerciales de soja y por lo tanto el ca-
rácter puede ser objetivo de un plan de mejoramiento. Por otro lado sería intere-
sante correlacionar la presencia de genes de resistencia a enfermedades y la
-250-
capacidad de nodulación de los cultivares de soja, de manera de identificar si los

genes R de la planta condicionan la respuesta simbiótica.
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bridization analysis of Bradyrhizobium species. Int.J. Syst. Evol. Micro-
biol. 51, 111-117.
-252-
Estudios de la movilidad y distribución de
Bradyrhizobium japonicum en el suelo
Studies about motility and distribution of
Bradyrhizobium japonicum in the soil
Althabegoiti, Ma. Julia, Julieta M. Covelli, Aníbal R. Lodeiro*, Ma. Florencia

López, Silvina L. López García, Elías J. Mongiardini, Julieta Pérez Giménez,
Juan Ignacio Quelas, Chandrasekar B. Rajeswari
Resumen
La biofertilización de cultivos de soja con Bradyrhizobium japonicum fija-

dores de N2 suele arrojar magros resultados en términos de rendimiento en grano,
fundamentalmente debido a la competición que ejercen los rizobios de la pobla-
ción naturalizada del suelo por la ocupación de los nódulos. Por lo tanto, para
aprovechar cualquier mejora en las cepas inoculadas y/o en la formulación de los
biofertilizantes se requiere vencer esta barrera competitiva. Para ello, es necesario
mejorar tanto la competitividad intrínseca de las cepas a ser inoculadas como la
tecnología de aplicación de los biofertilizantes. En la simbiosis B. japonicum-soja
la movilidad mediada por flagelos, la canalización del exceso de carbono hacia
distintos biopolímeros y la distribución de los rizobios en el suelo se han revelado
como factores tanto intrínsecos como ambientales que pueden manipularse con el
fin de mejorar la competitividad del biofertilizante para nodular soja.
Palabras clave: Bradyrhizobium japonicum, soja, biofertilizantes, nodulación
Introducción
La población humana ha superado los 7000 millones de habitantes en el

mundo y, según estimaciones de la ONU, para 2015 se estarían por alcanzar los
7300 millones (http://esa.un.org/unpd/wpp/unpp/p2k0data.asp). Contrariamente
a este aumento sostenido en el número de habitantes, la superficie cultivable está
llegando al límite. El Banco Mundial estima esta superficie en unos 4900 millones
de hectáreas cultivables (http://data.worldbank.org/indicator), lo que implica una
Laboratorio de Interacciones entre Rizobios y Soja (LIRyS). IBBM, Departamento de Ciencias

Biológicas. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de la Plata-CONICET. Calles 47
y 115 (1900) La Plata, Argentina. *Correo electrónico: lodeiro@biol.unlp.edu.ar
-253-
creciente presión sobre la productividad del suelo. Tal aumento de productividad

puede lograrse, pero a expensas de una mayor tasa de extracción de nutrientes.
La reposición total de estos nutrientes mediante fertilizantes químicos no es sos-
tenible, ya que por un lado, la producción de estos fertilizantes consume gran can-
tidad de combustibles fósiles, al tiempo que produce emisiones de CO2 y NO2
entre otros y por otro lado, la aplicación indiscriminada de fertilizantes químicos
al suelo produce desbalances nutricionales, alteraciones en la materia orgánica,
eutrofización, y frecuentemente, acidificación. Por lo tanto, desde hace varios años
se viene trabajando en el desarrollo y producción de biofertilizantes basados en
microorganismos promotores del crecimiento vegetal. Estos biofertilizantes, solos
o en combinación con dosis bajas de fertilizantes químicos, pueden mantener la
fertilidad del suelo sin alterar otros parámetros como la estructura, la biodiversidad
y el contenido de materia orgánica (Martínez Viera et al., 2010). Entre ellos, los
más conocidos y ampliamente utilizados son los rizobios fijadores de N2 en sim-
biosis con leguminosas.
En nuestro país el cultivo de leguminosas más extendido es la soja, cuya
inoculación con Bradyrhizobium japonicum fijadores de N2 es una práctica bien
conocida, para lo cual existen en el mercado diversos biofertilizantes de calidad.
Esta simbiosis comprende la formación de unos 100 nódulos en cada raíz de soja,
dentro de los cuales se alojan los rizobios fijadores de N2. Casi siempre los rizo-
bios que invaden el interior de un nódulo dado descienden clonalmente de una
única célula que inició la infección en un pelo radical (Jones et al., 2007). La ri-
zósfera de una planta es habitualmente colonizada por unas 105-106 células de ri-
zobios, con lo cual la progenie de solo uno de cada 1000-10000 de esos rizobios
es capaz de ocupar un nódulo. Así, se genera una fuerte competición entre los ri-
zobios de la rizósfera para colonizar y ocupar los limitados sitios de infección.
Esto no resulta problemático siempre y cuando haya una sola cepa de rizobios en
la rizósfera. Sin embargo, debido a la repetida introducción de rizobios al suelo
por biofertilización año tras año se va generando una población de rizobios natu-
ralizados que, por deriva genética y transmisión génica horizontal, va diversifi-
cándose hasta constituir una población muy diversa, eficiente para nodular, pero
variable desde el punto de vista de su aptitud para fijar N2 (Gomes Barcellos et
al., 2007; González, 2007; López García et al., 2009; Melchiorre et al., 2011). Fi-
nalmente, esta población conforma una formidable barrera competitiva a la intro-
ducción de biofertilizantes más eficaces, constituyendo actualmente el principal
cuello de botella para el éxito de la biofertilización, especialmente en soja.
Además de esta cuestión simplemente numérica, existen otros aspectos, fi-
siológicos y ecológicos, que conducen a que los biofertilizantes ocupen solo una
mínima parte de los nódulos (para una revisión, véase Pérez Giménez et al., 2011).
Por lo tanto, el resultado de la fijación de N2 total va a estar dado solo marginal-
mente por la capacidad fijadora de N2 del biofertilizante, con lo cual la bioferti-
lización raramente produce aumentos estadísticamente significativos del
rendimiento en grano. Está claro que de nada sirve poseer biofertilizantes con
-254-
Estudios de la movilidad y distribución de Bradyrhizobium japonicum en el suelo
cepas seleccionadas de alta calidad, preparados con formulaciones cuidadosa-

mente desarrolladas y balanceadas, si después los rizobios inoculados no pueden
ocupar los nódulos debido a la competición ejercida por los rizobios de la pobla-
ción del suelo. Más aún, se trata de un problema generalizado en todo el país, que
se observa con independencia de las condiciones agroecológicas locales (Gonzá-
lez, 2007; López García et al., 2009; Melchiorre et al., 2011). En este capítulo ha-
remos una reseña de nuestras investigaciones sobre algunos aspectos de este
problema.
Competición para la nodulación
El problema de la competición para la nodulación es muy complejo porque

depende tanto de factores propios de la bacteria (a los que nos referiremos como
competitividad intrínseca) como de la planta hospedante y del ambiente, los cuales
además están interrelacionados. En los 10 años transcurridos desde la primera edi-
ción de “Microbiología Agrícola. Un aporte de la investigación en Argentina”
nuestro laboratorio viene realizando un esfuerzo por identificar y manipular va-
riables clave de la competitividad de B. japonicum para nodular soja. Así, se han
detectado en los rizobios varios rasgos relacionados con su competitividad intrín-
seca, entre ellos: i) la movilidad mediada por flagelos y ii) la capacidad de formar
biopelículas, influida por la producción de biopolímeros tales como exopolisacá-
ridos y polihidroxialcanoatos (Althabegoiti et al., 2008; 2011; Pérez Giménez et
al., 2009; Quelas et al., 2006; 2010; 2013). También hemos observado que la po-
sición y distribución de los rizobios en el suelo es un factor clave (Althabegoiti et
al., 2008; López García et al., 2002; 2009). En este capítulo resumiremos nuestros
estudios relacionados con la movilidad, la producción de biopolímeros y la distri-
bución de los rizobios en el suelo, aspectos que consideramos de gran importancia
para la obtención de biofertilizantes promotores del crecimiento con alta capacidad
competitiva para nodular y fijar N2.
Movilidad
Debido a que en nuestros primeros estudios observamos que la movilidad
vertical de B. japonicum en vermiculita a capacidad de campo es muy escasa
(López García et al., 2002), decidimos encarar una serie de experimentos para ver
si era posible mejorarla. Así logramos, mediante selección artificial, una cepa con
movilidad aumentada y más infectiva que la cepa parental, derivada de USDA
110, a la que denominamos LP 3008 (Althabegoiti et al., 2008). La cepa LP 3008
fue obtenida por selección recurrente a partir del borde de halos de movilidad en
agar blando sin manipulación genética, lo cual nos permitió liberarla para estudios
a campo. Por lo tanto, los cambios seleccionados son desconocidos a nivel mole-
cular, aunque sabemos que han sido estables luego del pasaje por nódulos y a lo
largo de varios repiques, durante unos diez años. Por lo tanto, creemos que dichos
-255-
cambios ocurrieron a nivel genético. Para ver el comportamiento de LP 3008 a

campo, realizamos estudios durante varios años en cinco localidades diferentes
cuyos suelos poseen poblaciones naturalizadas de rizobios noduladores de soja de
más de 105 rizobios por gramo de suelo (Althabegoiti et al. 2008; López García,
et al., 2009). Allí comparamos el efecto de la inoculación en las semillas (como
es tradicional) con una inoculación en el surco de siembra, en ambos casos con
inoculante líquido y utilizando tanto a la cepa salvaje como a la más móvil. Como
resultado, observamos que la inoculación de LP 3008 en el surco de siembra con-
dujo a un incremento en el rendimiento de 340 kg/ha (promedio de tres localida-
des), lo que significó un 11 % por encima del rendimiento promedio en las parcelas
sin inocular, cuando en los mismos sitios la inoculación en semillas no tuvo efecto
alguno sobre el rendimiento. El pico de aumento de rendimiento fue de 820 kg/ha
(28 % sobre el testigo sin inocular) con la inoculación en el surco de siembra en
Concepción del Uruguay (López García et al., 2009). El método de selección ar-
tificial se ha aplicado también a la cepa E109, que se utiliza normalmente para la
preparación de inoculantes comerciales obteniéndose variantes más móviles que
también promovieron significativos aumentos de rendimiento en cultivos a campo
en la localidad de San Pedro, aún con inoculación en las semillas (Lodeiro et al.,
2009).
Análisis detallados mostraron que B. japonicum posee dos tipos de flagelos:
uno subpolar y otro lateral, siendo esta una característica única entre los rizobios.
En la cepa de referencia USDA 110 el flagelo subpolar es constitutivo mientras
que el lateral se induce diferencialmente en distintos medios de cultivo (Althabe-
goiti et al., 2008; 2011). Asimismo, las flagelinas (proteínas estructurales del fi-
lamento del flagelo) también poseen distintos patrones de expresión. Mientras en
la cepa LP 3008 la expresión de las flagelinas subpolares, fliC1-4, y laterales,
lafA1-2 es constitutiva, en el tipo salvaje la expresión de lafA1-2 es inducible, y
al parecer está controlada a nivel de la traducción por el tipo de fuente de carbono
del medio: no se expresa con manitol pero sí lo hace con arabinosa (Covelli et al.,
2013). Estos resultados nos señalaron la necesidad de profundizar los estudios
sobre movilidad dependiente de flagelos en LP 3008.
Las bacterias pueden moverse de muchas formas diferentes, utilizando para
ello aparatos de lo más diversos (Henrichsen, 1972). Solo dos tipos de movi-
miento, conocidos como natación (swimming) y verbenear (swarming) son im-
pulsados por los flagelos (Harshey, 2003). En LP 3008, estos dos tipos de
movimiento dependientes de flagelos están aumentados, como así también su qui-
miotaxis hacia manitol y aminoácidos (Althabegoiti et al., 2008; Covelli et al.,
2013). Para ver si la desrepresión del flagelo lateral es importante a la hora de ex-
plicar las propiedades de LP 3008, obtuvimos mutantes delecionales en fliC1-4 y
-256-
lafA1-2, como así también dobles mutantes, tanto en el acervo genético de la cepa
salvaje como de LP 3008 (Althabegoiti et al., 2011) y estudiamos, en cada uno de
ellos, la contribución de cada flagelo a la movilidad y a la competitividad para
nodular en vermiculita. Observamos que el flagelo subpolar, que gira en sentido
horario y antihorario, promueve trayectorias más rectilíneas pero no contribuye a
la movilidad en un medio viscoso, mientras que el lateral, que gira sólo en sentido
antihorario, promueve mayor frecuencia de cambios de dirección y es requerido
para la movilidad en un medio viscoso (Althabegoiti et al. 2008 y resultados no
publicados). Si bien ambos flagelos se requieren para la natación y el verbenear,
el flagelo lateral parece ser el más importante para el verbenear (Covelli et al.,
2013). Sin embargo, el verbenear no fue relevante para el desplazamiento en suelo
a capacidad de campo (Covelli et al., 2013). Esto nos motivó a conocer más acerca
de la movilidad de esta bacteria en un medio poroso.
La movilidad de las bacterias ha sido ampliamente estudiada en medios lí-
quidos o en agar semisólido. A diferencia de estos medios, el suelo es una matriz
particulada, donde existen poros de distintos tamaños formando canales tortuosos,
que según el estado hídrico del suelo tienen diferentes contenidos de agua y aire.
A medida que el contenido de agua del suelo disminuye, también lo hace el rango
de diámetros máximos de los poros que aún pueden retener agua. Así, las bacterias
del suelo pueden encontrarse en estado planctónico y nadar libremente en suelos
anegados, aprovechando este estado del suelo para desplazarse en busca de nuevos
hábitats y formar allí biopelículas (Stoodley et al., 2002). Por el contrario, en sue-
los a capacidad de campo o menor, solo podrían desplazarse en canales más es-
trechos y tortuosos donde la solución del suelo es más viscosa, o bien asociarse y
formar biopelículas sobre superficies bióticas o abióticas, siendo estas asociacio-
nes más tolerantes a las adversidades ambientales (Stoodley et al., 2002). En con-
cordancia con ello, observamos que nuestras dobles mutantes desprovistas de
ambos flagelos fueron igualmente competitivas que la cepa salvaje para nodular
soja en vermiculita a capacidad de campo; sin embargo, cuando la vermiculita se
encontraba saturada de agua, la competitividad de la cepa salvaje sí fue mucho
mayor que la de la doble mutante desprovista de los dos flagelos (Fig. 1). Estos
resultados se repitieron utilizando tanto el acervo genómico de USDA 110 como
el de la cepa de mayor movilidad LP 3008 (Althabegoiti et al., 2011) y concorda-
ron con estudios previos de la colonización radical en vermiculita o perlita con
distintos contenidos hídricos (Althabegoiti et al., 2008; 2010). Tomados en con-
junto, estos resultados indicaron que el tipo de movilidad relevante para la dis-
persión en suelo y la competitividad es la natación, pero que dichos
desplazamientos podrían esperarse en el suelo sólo en cortos períodos de anega-
miento.
-257-
Figura 1. Competición para la nodulación entre la cepa salvaje (WT) y la mutante desprovista de
flagelos, en plantas de soja cultivadas en vermiculita a capacidad de campo o inundada.
La capacidad de las bacterias para moverse libremente o en canales tortuo-

sos puede requerir diferentes aptitudes. Por ejemplo, la velocidad promedio de la
natación de B. japonicum en trayectorias rectilíneas es de 20-30 mm s–1 (Kanbe et
al., 2007 y Quelas, no publicado), la cual está dentro del rango observado en la
mayoría de las especies móviles. Estas trayectorias rectilíneas son interrumpidas
por bruscos cambios de dirección, cuya frecuencia está determinada por el sistema
de quimiotaxis: a medida que aumenta la concentración de un quimioatractante
el intervalo entre cambios de dirección también aumenta. Típicamente, la duración
de una trayectoria rectilínea en ausencia de quimioatractantes es de un segundo
(recorriendo unos 25 mm), pudiendo triplicarse en presencia de quimioatractantes
(recorriendo unos 75 mm antes del cambio de dirección). Teniendo en cuenta que
el rango de diámetros de poros que contienen agua cuando el suelo está a capaci-
dad de campo es de 0,2 mm a 50 mm, y que la tortuosidad de los canales del suelo
puede determinar que el recorrido rectilíneo se interrumpa dentro ese rango de
longitudes, no parece que la quimiotaxis resulte de utilidad para el desplazamiento
-258-
de las bacterias en suelos a capacidad de campo y en cambio sí lo sea la frecuencia

de cambios de dirección, tal como sugieren los experimentos de movilidad reali-
zados en medios porosos (Barton y Ford, 1995; Jiménez Sánchez et al., 2012; Liu
y Ford, 2009). Por lo tanto, la capacidad intrínseca de B. japonicum para regular
ambos aspectos del movimiento bacteriano determinará su capacidad de disper-
sarse en el suelo y con ello, determinará en parte su competitividad (López García
et al., 2002). Asimismo, la capacidad para nadar en medios viscosos también puede
ser determinante de la dispersión en suelos a capacidad de campo. En este sentido,
resultó interesante que el flagelo lateral posea la potencia necesaria para la nata-
ción en medios viscosos (Althabegoiti, no publicado) y promueva una mayor fre-
cuencia de cambios de dirección que el subpolar (Quelas, no publicado), con lo
cual la expresión del flagelo lateral en suelo a capacidad de campo podría resultar
de utilidad para el desplazamiento de la bacteria en este medio tortuoso, sobre
todo a medida que disminuye su contenido hídrico.
Si bien la mayor movilidad de la cepa LP 3008 no pudo atribuirse solamente
a la desrepresión del flagelo lateral (Althabegoiti et al., 2011), el control de la ex-
presión de uno y otro flagelo parece estar íntimamente ligado a la capacidad de
esta bacteria para moverse en suelos anegados o a capacidad de campo, o bien
formar biopelículas, con lo cual decidimos encarar estudios acerca del control de
la expresión de los flagelos en B. japonicum.
La mayoría de los genes que se requieren para la síntesis y regulación de
cada uno de los sistemas de flagelos se encuentran asociados en cúmulos (clusters)
separados en el genoma. El flagelo subpolar es similar al flagelo de Caulobacter
crescentus, mientras que el lateral es similar al de Ensifer (previamente Sinorhi-
zobium) meliloti, y parecería haberse adquirido por transferencia horizontal de
material genético, tal como se ha sugerido en la especie taxonómicamente cercana
Rhodobacter sphaeroides (Liu y Ochman, 2007; Poggio et al., 2007). Cada tipo
de flagelo posee su propio motor, y se ha sugerido que ambos tipos son movidos
por la fuerza protomotriz (Kanbe et al., 2007), aunque los experimentos que so-
portan esta afirmación no son del todo concluyentes.
En general, en la estructura de los flagelos pueden distinguirse tres compo-
nentes principales: el cuerpo basal, el gancho o conector y el filamento, siendo
los dos últimos grandes estructuras extracelulares (Fig. 2A). La biosíntesis del fla-
gelo está regulada de manera muy estricta por parte de un regulador maestro bajo
el cual se escalonan una serie de etapas, cada una limitada por un punto de control,
para asegurar que la estructura del cuerpo basal y los sistemas de secreción estén
ensamblados antes de proceder a la síntesis de los componentes extracelulares
(Fig. 2B).
-259-
Figura 2. Esquema de la estructura general de un flagelo mostrando las proteínas constituyentes de

la estructura principal (A). Regulación de la síntesis de un flagelo en tres etapas, demarcadas por
puntos de control, mostrándose los reguladores principales (B). En el caso de FlbT y el ARNm de
las flagelinas no está claro si se trata de una inhibición o una activación de la traducción. Tcr.: trans-
cripción; Tdc.: traducción.
En C. crescentus, que posee un flagelo similar al subpolar de B. japonicum,

el regulador maestro es CtrA, un regulador de respuesta que se fosforila en res-
puesta a señales del ciclo celular, siendo CckA la histidina kinasa asociada (Do-
mian et al., 1997). CtrA fosforilada activa al regulador de ensamblado flbD y a un
controlador de flbD, llamado fliX (Fig. 2B). FlbD es un regulador de respuesta
para la segunda etapa, aunque en este caso su socia sensora no se conoce. Una
vez fosforilada, FlbD activa genes que codifican constituyentes más tardíos del
cuerpo basal y también del bastón interno y el gancho (Muir et al., 2005), e induce
la síntesis del controlador de la tercera etapa, llamado FlbT (Mangan et al., 1999).
En esta tercera etapa se forma el filamento, constituido por miles de moléculas de
flagelina, cuya síntesis está controlada a nivel de la traducción por FlbT (Fig. 2B).
Se cree que FlbT se une a la zona 5’ no traducida (UTR) del mRNA de fljK, uno
de los genes que codifican flagelinas en C. crescentus, bloqueando de este modo
la secuencia de unión al ribosoma (RBS) e impidiendo la traducción hasta tanto
el sistema de secreción y el gancho han sido completados.
La regulación en E. meliloti, cuyo flagelo es similar al flagelo lateral de B.
japonicum, es menos conocida. A diferencia de C. crescentus, el regulador maestro
en E. meliloti es el par de proteínas VisNR, que pertenecen a la familia LuxR
(Sourjik et al., 2000; Rotter et al., 2006). Corriente abajo de VisNR en la cascada
regulatoria se encuentra Rem, que es un regulador de respuesta que parece actuar
sin necesidad de ser fosforilado (Rotter et al., 2006). Rem parece estar involucrado
en una segunda etapa de construcción del flagelo, seguida por una tercera etapa
-260-
también controlada por FlbT, aunque en Brucella melitensis, pariente cercano de

E. meliloti, no parece haber una jerarquía regulatoria tan marcada como en las
otras especies (Ferooz et al., 2011). Además, una particularidad de B. melitensis
es que FlbT no actúa como represor, sino como activador.
Realizando búsquedas en el genoma de la cepa USDA 110 hemos encon-
trado marcos de lectura abiertos (ORF) candidatos a codificar la mayoría de los
reguladores antes mencionados, y hemos iniciado la construcción de mutantes
para ver si cumplen un rol similar a los descriptos en C. crescentus y E. meliloti.
Hemos avanzado en la caracterización del homólogo de rem. Este ORF se encuen-
tra dentro del cúmulo del flagelo lateral y posee, al contrario de las secuencias
Rem de E. meliloti, B. melitensis, Rhizobium sp., R. leguminosarum, Mesorhizo-
bium loti y Agrobacterium tumefaciens, un residuo de aspartato fosforilable en la
posición donde las especies mencionadas poseen glutamato, glutamina o arginina.
Este cambio sugiere que en B. japonicum Rem podría ser fosforilable y por lo
tanto, inducible como regulador de respuesta, en acuerdo con el carácter inducible
del flagelo lateral observado por nosotros. Hemos obtenido un mutante en este
gen y observamos que, efectivamente, se trata del regulador del flagelo lateral ya
que dicho mutante no produce flagelina lateral pero sí flagelina subpolar, y ade-
más, hemos observado que otro mutante que lleva rem bajo el control de un pro-
motor constitutivo (del gen nptII) produce flagelina lateral tanto en condiciones
de inducción (con arabinosa como fuente de C) como de represión (con manitol
como fuente de C). Además, la sustitución del residuo de aspartato por un residuo
de glicina vuelve al rem de B. japonicum insensible a la fuente de C cuando es
expresado en trans sobre el fondo del mutante delecional en rem (Mongiardini et
al., 2013). De todos modos, se observa que cuando la cepa salvaje es cultivada
con manitol como única fuente de C existe un cierto nivel de expresión de lafA1-
2, lo cual indica que, además del control jerárquico de rem sobre la transcripción
de lafA1-2, existe un control a nivel de la traducción. Este control puede estar ejer-
cido por el homólogo a FlbT, del cual también hemos obtenido un mutante (Quelas
et al., no publicado). Se ha reportado que FlbT regula la traducción mediante su
unión a la UTR del ARNm de las flagelinas; sin embargo, esta unión se pudo ob-
servar con extractos celulares pero no con los componentes purificados, razón por
la cual se sugirió que existe un tercer elemento aún desconocido, llamado “proteína
X”, que posibilita la unión (Anderson y Gober, 2000). Si bien FlbT no ha sido ca-
racterizada como sensible a diferentes fuentes de C, existen otros reguladores, lla-
mados RNA pequeños (sRNA), que sí se expresan diferencialmente en respuesta
a situaciones de cambio nutricional de la fuente de C (Görke y Vogel, 2008). Los
sRNA son moléculas de entre 50 y 150 nucleótidos de longitud que no codifican
polipéptidos y que en general se asocian a secuencias no traducidas (UTR) de di-
-261-
versos mRNA modulando la traducción. Para la actividad de estos sRNA es nece-

saria la intervención de una chaperona llamada Hfq, que parece jugar un papel en
la asociación de los sRNA a las UTR (Storz et al., 2011). Utilizando Riboswitch
Explorer (http://132.248.32.45/cgi-bin/ribex.cgi) hemos observado que en la UTR
de los genes que codifican las flagelinas laterales se encuentran estructuras de ri-
boswitch, en particular la estructura denominada RLE0315. A menudo se ha ob-
servado que los sRNA se acoplan a este tipo de estructuras y en este caso particular
hemos podido localizar en el riboswitch de las flagelinas laterales a dos regiones
de posible acople de los sRNA Bjrc174 y Bjrc80, que ya fueron caracterizados en
B. japonicum (Madhugiri et al., 2012). Estos resultados preliminares nos sugieren
que la “proteína X” que se requeriría para la unión de FlbT a la UTR de las flage-
linas laterales podría ser Hfq asociada a los sRNA mencionados. Además, el hecho
de que varios sRNA puedan unirse diferentemente al riboswitch de mRNA de la
flagelina podría explicar por qué algunas veces FlbT parece actuar como inhibi-
dora y otras como activadora.
La regulación de la construcción del flagelo descripta en los párrafos ante-
riores solamente asegura que cada componente se sintetice cuando el aparato de
secreción correspondiente es funcional, pero no necesariamente garantiza que los
flagelos se sinteticen cuando es necesaria la movilidad en vez del estado sésil.
Para ello existe otro sistema regulatorio de transducción de señales yuxtapuesto
al anterior, que en respuesta al ambiente induce alternativamente la expresión de
los flagelos y la movilidad, o bien la inhibe y promueve la formación de biopelí-
culas. Dicho sistema de conmutación entre los estados planctónico y sésil está go-
bernado por el segundo mensajero diguanilato cíclico (c-di-GMP, Wolfe y Visick,
2008). Esta molécula es sintetizada a partir de dos moléculas de GTP en una re-
acción catalizada por la diguanilato ciclasa (DGC) y su ruptura a dos moléculas
de GMP se inicia en otra reacción catalizada por una fosfodiesterasa (PDE). Así,
las tasas relativas de actividad de DGC y PDE mantienen un cierto nivel de c-di-
GMP, que regula, en general de forma alostérica, la actividad de parte del sistema
de señales de la bacteria (Galperin, 2004). Se ha observado que estas actividades
se relacionan con dos dominios cuyas secuencias de aminoácidos típicas son:
GGDEF, para la actividad DGC, y EAL y HD-GYP, para la actividad PDE. Estos
dominios están presentes en diversas proteínas, indicando que la regulación del
nivel de c-di-GMP parece ocurrir en forma compartimentalizada, quizás no solo
espacialmente sino también temporalmente. Mediante estudios bioinformáticos
hemos localizado en el genoma de B. japoncium varios ORF que contienen do-
minios de DGC y PDE y por lo tanto, podrían estar relacionados con la síntesis y
degradación de c-di-GMP y otros con dominios PilZ, que son posibles sitios de
unión de c-di-GMP. Una posterior depuración de estos ORF indicó que algunos
-262-
pueden coincidir con genes que se sabe que están involucrados en la conmutación
de flagelos en otras especies bacterianas. Entre ellos podemos mencionar una copia
de fliL dentro del cúmulo del flagelo subpolar y otra dentro del cúmulo del flagelo
lateral. FliL ha sido propuesta como parte de un mecanismo que controla la tran-
sición entre el estado móvil y el sésil en C. crescentus (Christen et al., 2007), pa-
rece requerirse para la rotación del flagelo, y es inhibida por un complejo formado
por otra proteína, llamada DgrB, y c-di-GMP. Sin embargo, no está claro si estos
efectos ocurren por alguna interacción con el motor. Además encontramos ORF
que codifican proteínas integrales de membrana involucradas en la conmutación
entre estados móvil y sésil en Pseudomonas spp. Entre ellas, dos copias de bifA y
una copia de scrG. Lo interesante de estas proteínas es que parecen estar involu-
cradas en un fenotipo pleiotrópico que incluye no sólo la transición entre natación,
verbenear y la formación de biopelículas, sino también la síntesis de EPS y la
morfología de la colonia en medio semisólido, todos fenotipos que nosotros hemos
visto ligados entre sí. Actualmente hemos obtenido mutantes en estos genes y es-
tamos realizando su caracterización fenotípica.
Formación de biopelículas
La contracara de la movilidad es el estado sésil, en general formando bio-
películas sobre distintos tipos de superficies. Se ha señalado que el estado sésil
podría ser el modo de vida más corriente de las bacterias, ya que en este estado
las colonias bacterianas se diferencian y estratifican con tipos celulares especiali-
zados, y son más tolerantes a las adversidades ambientales. Así, quienes proponen
que el estado sésil es asimilable al somático en organismos más complejos, su-
gieren que el estado móvil o planctónico semejaría al estado de propágulo (Stoo-
dley et al., 2002). Por lo tanto, es posible que el estado más común en que se
encuentren los rizobios en el suelo sea el de biopelículas, y que el estado móvil o
natatorio solo sea empleado cuando se dan las condiciones edáficas relevantes
(e.g. anegamiento durante una lluvia) como para abandonar una biopelícula ave-
jentada e iniciar una nueva en otro lugar.
Así, a diferencia de los rizobios inoculados, los de la población del suelo
probablemente se encuentren distribuidos más o menos uniformemente en los pri-
meros cm del perfil como biopelículas ya sea sobre materia orgánica en descom-
posición (Seneviratne y Jayasinghearachchi, 2003) o sobre agregados de suelo,
con la participación de proteínas o restos vegetales. Por lo tanto, en suelos con
contenido hídrico a capacidad de campo o menor las raíces en crecimiento “ba-
rrerían” microcolonias de rizobios de las biopelículas, lo cual daría inicio a la co-
lonización de la rizósfera y la infección de la raíz por parte, mayoritariamente, de
los rizobios de la población del suelo en detrimento de los del biofertilizante.
-263-
Cuando los rizobios se inoculan aplicando los biofertilizantes sobre las se-
millas, ocurren tres fenómenos que conspiran contra una buena distribución bac-
teriana en la rizósfera. Por un lado, más del 90 % de los rizobios muere sobre las
superficies seminales (Streeter, 2007). Además, de los rizobios que quedan vivos,
una fracción considerable entra en la etapa de adhesión irreversible a los tegu-
mentos y es llevada por los cotiledones fuera del suelo, dado que la soja es una
planta epífita. Finalmente, los pocos rizobios que se desprenden de las superficies
seminales y quedan vivos en las inmediaciones de la raíz se concentran en la pe-
queña región de suelo donde se depositó la semilla pero no se dispersan hacia las
zonas más profundas exploradas por las raíces en crecimiento, debido a su escasa
movilidad especialmente en sentido vertical (Althabegoiti et al., 2008; 2011; Ho-
riuchi et al., 2005; Liu et al., 1989; López García et al., 2002; Madsen y Alexander,
1982; McDermott y Graham, 1989). Por tanto, los rizobios inoculados en las se-
millas alcanzarían muy lentamente las zonas infectables de las raíces (zona de los
pelos emergentes) en situaciones de capacidad de campo y sólo lo harían a una
velocidad razonable como para competir con los rizobios del suelo en cortos pe-
ríodos de anegamiento como las que ocurren luego de una lluvia, o bien mediante
movimientos pasivos, e.g. llevados por la mesofauna del suelo o por las labores
culturales (Horiuchi et al., 2006; Madsen y Alexander, 1982).
En base a estas consideraciones, hemos iniciado estudios de la capacidad
de B. japonicum para formar biopelículas mediante la metodología de cuantifica-
ción en placas de poliestireno. Hemos observado que, tal como ocurre en otras
especies bacterianas, la formación de biopelículas es un proceso lento, que re-
quiere varios días. Esto indica que no sería una etapa temprana de la infección ra-
dical, ya que la misma debe completarse en unas pocas horas antes de que el tejido
vegetal se vuelva no infectable (es decir, que maduren completamente los pelos
radicales). En B. japonicum, la formación de biopelículas depende en parte de la
composición del exopolisacárido (EPS). Esta macromolécula posee en su com-
posición dos clases de residuos galactósidos: galactosa y ácido galacturónico. Aun-
que aún no está claro el lugar que ocupan estos residuos en la estructura del EPS
(Quelas et al., 2006; 2010) pudimos observar que si el EPS está desprovisto de
galactosa la bacteria no forma biopelículas pero en cambio si está desprovisto de
ácido galacturónico se forma una cantidad normal de biopelículas (Quelas et al.,
2010). Sin embargo, la cantidad de EPS por célula se ve muy reducida tanto en
los mutantes que no poseen galactosa como en los que no poseen ácido galactu-
rónico, lo que sugiere que la formación de biopelículas no está correlacionada con
la cantidad sino con la composición de los EPS. En particular, el EPS desprovisto
de ácido galacturónico no posee carga negativa, lo cual podría explicar en parte
la mayor adhesividad de estos mutantes a la superficie de poliestireno. Así como
-264-
la capacidad de formar biopelículas, la adhesión a raíces de soja también se vio

afectada en los mutantes con EPS desprovisto de galactosa. Resultó interesante
que, en concordancia con ello, la formación de biopelículas se viera favorecida
por la presencia de lectina vegetal (Pérez Giménez et al., 2009). Esta proteína es
muy estable, con lo cual nuestra hipótesis es que la lectina que es liberada al suelo
ya sea en exudados o raíces muertas podría servir como punto de nucleación para
la formación de biopelículas que a su vez contribuirían a la permanencia de colo-
nias de B. japonicum en lugares donde hay o hubo plantas de soja. Esta capacidad
contribuiría a su vez a la colonización del suelo en los lugares propicios para no-
dular soja.
La síntesis de EPS implica la utilización de compuestos carbonados intra-
celulares para formar un polímero compuesto esencialmente por C, H y O, el cual
es secretado al exterior de la célula. Otro compuesto de estas características es el
polihidroxialcanoato (PHA), que es un polímero de C, H y O más reducido que el
EPS y de localización intracelular. Por lo tanto, la síntesis de EPS o PHA se ven
favorecidas alternativamente según las condiciones metabólicas y en particular,
según la relación C/N intracelular: una alta relación C/N y bajo contenido de poder
reductor favorece la síntesis de EPS, mientras que una baja relación C/N y alto
contenido de poder reductor favorece la síntesis de PHA (López García et al.,
2001; Quelas et al., 2006).
Los PHA están contenidos en gránulos alojados en el citoplasma. La bio-
síntesis de estos polímeros se inicia con la condensación de dos moléculas de ace-
til-CoA para formar acetoacetil-CoA, seguida de la reducción del acetoacetil-CoA
a hidroxibutiril-CoA y finalmente la polimerización del hidroxibutiril-CoA en po-
lihidroxibutirato. Modificaciones en el hidroxibutiril-CoA dan lugar a los diversos
hidroxialcanoil-CoA que sirven como unidades estructurales de los PHA. La po-
limerización de los hidroxialcanoil-CoA en PHA está catalizada por la PHA sin-
tasa, que es una de las enzimas clave de esta vía metabólica (Rehm, 2003). Se
cree que los PHA podrían contribuir a la supervivencia de los rizobios en medios
pobres y así mejorar la estabilidad de las biopelículas en el suelo.
El genoma de B. japonicum USDA 110 contiene cinco genes anotados como
codificantes de PHA sintasa, pero hemos observado que en USDA 110 solo se ex-
presan dos de ellos, a los cuales hemos denominado phaC1 y phaC2 (Quelas et
al., 2013). Hemos obtenido mutantes delecionales en cada uno de estos genes y
hemos observado que, mientras el mutante DphaC1 es incapaz de sintetizar PHA,
el contenido de este polímero en el mutante DphaC2 se encuentra fuertemente au-
mentado. Curiosamente, en este mutante se induce la expresión de un tercer ho-
mólogo de PHA sintasa, que denominamos phaC3, y que podría ser responsable,
al menos en parte, del aumento del nivel de PHA (Quelas et al., 2013). Además,
-265-
en ensayos de competición para la nodulación frente a la cepa salvaje, el mutante

DphaC2 ocupó aproximadamente un 80 % de los nódulos, y no se vio afectado ni
en la supervivencia en un medio desprovisto de fuentes de carbono ni en la capa-
cidad fijadora de N2 en plantas de soja (Quelas et al., 2013). La mayor competi-
tividad intrínseca de la cepa mutante en DphaC2 podría deberse al menos en parte
a que su mayor contenido de PHA le serviría para producir mayor cantidad de in-
fecciones exitosas. Se sabe que las infecciones radicales suelen abortar y solo al-
gunas de las infecciones iniciadas en la punta del pelo radical llegan a generar un
nódulo funcional. Dado que el ambiente del pelo radical es hostil para los rizobios,
es posible que un mayor contenido de PHA les permita atravesar mejor esas con-
diciones, lo que conduciría a una menor tasa de infecciones abortadas.
Conclusiones
La eficiencia de los biofertilizantes para nodular soja debe ser mejorada

desde el punto de vista de la competitividad de los rizobios para nodular. Ello debe
encararse desde dos puntos de vista complementarios: mejora de la competitividad
intrínseca de la(s) cepa(s) incluida(s) en el biofertilizante, y mejora de su distri-
bución en el suelo una vez inoculadas. De acuerdo con nuestros estudios podría-
mos esperar que la mejora de la movilidad, la inoculación en el surco de siembra
y la mejora en el contenido de PHA puedan conducir a la obtención de un biofer-
tilizante capaz de promover incrementos del rendimiento de alrededor de 10-15
% en términos globales, con relación a la respuesta a los biofertilizantes actuales.
Agradecimientos
Los trabajos del LIRyS son financiados por subsidios de la ANPCyT y el

CONICET y por un convenio de vinculación tecnológica con Barenbrug-Palaver-
sich SA. MJA, ARL, SLLG, EJM y JIQ son investigadores del CONICET. JMC
y MFL son becarias del CONICET. JPG es investigadora-docente de la UNLP.
CBR es becario de ANPCyT.
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-270-
Aportes de las moléculas señal producidas
por rizobios a la producción de soja
The contribution of signal molecules produced by rhizobia

on soybean grain production
Martín Díaz-Zorita
Resumen
Los beneficios de la fijación biológica de nitrógeno en la simbiosis entre

rizobios y leguminosas sobre la nutrición nitrogenada de estas plantas son cono-
cidos y han sido ampliamente reportados. Este proceso ocurre luego de intercam-
bios de moléculas señal entre la planta huésped y las bacterias. Las moléculas
señal producidas por Bradyrhizobium japonicum (lipo-quito-oligosacáridos, LCO)
al ser percibidos por las plantas desencadenan la actividad de algunos genes que
aportan a mejorar no sólo la nodulación sino la germinación y el crecimiento de
soja. En este artículo se presentan algunos de los efectos de la aplicación de tra-
tamientos con LCO sobre el crecimiento y los rendimientos de soja. Resultados
de evaluaciones de la inoculación con Bradyrhizobium japonicum y lipo-quito-
oligosacáridos en 520 condiciones extensivas de producción en la República Ar-
gentina entre 2002 y 2012 muestran aumentos en los rendimientos del 8,7 % con
76% de casos con respuesta. Este comportamiento supera la respuesta media de
6,7 % y 69 % de casos con respuesta observados al inocular sólo con Bradyrhizo-
bium japonicum. La incorporación de estas moléculas señal producidas por rizo-
bios específicos contribuye a mejorar la eficiencia y los aportes de inoculantes
convencionales conteniendo sólo rizobios.
Palabras clave: lipo-quito-oligosacáridos, fijación biológica de nitrógeno, pro-

moción del crecimiento, inoculación con Bradyrhizobium japonicum.
Instituto de Investigaciones en Biociencias Agrícolas y Ambientales (INBA-CONICET/ FAUBA),

Av. San Martín 4453 (C1417DSE), C.A.B.A. (Argentina) y Departamento de Agronomía, Novozy-
mes Bioag S.A. Calle 10 N°753 (1629), Parque Industrial Pilar, Pilar, Buenos Aires (Argentina).
mdzorita@agro.uba.ar
-271-
Introducción
Los efectos benéficos de la asociación simbiótica entre rizobium y legumi-

nosas son conocidos siendo la fijación biológica de nitrógeno (FBN) un proceso
efectivo para lograr la adecuada nutrición nitrogenada de estas plantas. Es por esto
que los inoculantes microbianos aportando cepas élite de Bradyrhizobium japo-
nicum para una máxima FBN de soja [Glycine max (L.) Merrill] han sido utiliza-
dos por más de un siglo y su contribución sobre la nutrición nitrogenada del
cultivo, su crecimiento y producción de granos está abundantemente documentada
(Hungría et al., 2006; Perticari, 2013).
En la simbiosis rizobium-leguminosa ocurre una secuencia de pasos hasta
llegar a la infección de la raíz y la formación de nódulos de la que participan varias
las moléculas señal que son intercambiadas entre la planta huésped y la bacteria
(Holguín Zehfuss, 2008). Para que esto ocurra, el momento y la concentración de
las señales es crucial, su ausencia o alteraciones en estas moléculas resultan en la
falta o en el aborto de nodulación. La acción de moléculas señal específicas du-
rante la nodulación ha sido ampliamente revisada y publicada (Cullimore et al.,
2001) y su aplicación exógena mejorar el resultado de este proceso en leguminosas
con importante valor económico (Hungría y Stacey, 1997).
Son abundantes los estudios sobre las estructuras de las moléculas produ-
cidas por los rizobios (D’Haeze y Holsters 2002, Andourel et al., 1994), de los si-
tios de enlace en los pelos radicales (Limpens et al., 2003) y la posterior cascada
de señales genéticas en la planta (Gough y Cullimore, 2011) que conduce a la in-
fección de los pelos radicales con rizobios y a la morfogénesis de los nódulos (Ol-
droyd y Downie, 2008). Sin embargo, los estudios aplicados en condiciones
extensivas de producción de cultivos investigando los efectos directos o combi-
nados de moléculas señal producidas por rizobios sobre el crecimiento y los ren-
dimientos de leguminosas son recientes y escasos. Es propósito de este artículo
presentar y discutir algunos de los efectos de la aplicación de tratamientos con
moléculas señal sobre el crecimiento y los rendimientos de soja, en particular pro-
venientes de estudios desarrollados en condiciones representativas de producción
en Argentina.
Intercambio de señales durante el desarrollo de los nódulos

Las moléculas señal producidas por microorganismos simbióticos benéficos
son esenciales para la penetración de estos en las raíces de las plantas. Los rizobios
penetran en las raíces de las leguminosas por los pelos radicales para desarrollar
en los nódulos el proceso de fijación de nitrógeno atmosférico. Los lipo-quito-
oligosacáridos (LCO según sus siglas en inglés) son moléculas señal del tipo de
-272-
Aportes de las moléculas señal producidas por rizobios a la producción de soja
los factores Nod sinterizados y liberados por rizobios luego que la planta de legu-
minosa exuda una mezcla de azúcares, ácidos carboxílicos y flavonoides (Oldroyd,
2001) que se enlaza con los rizobios y activa sus genes (Kamst et al. 1998). El
primer paso en el “diálogo” molecular entre la planta y las bacterias es la detección
por el rizobium de los flavonoides y otras moléculas relacionadas que son secre-
tadas por las raíces de la leguminosa para sintetizar los LCO (Figura 1).
Figura 1. Estructura generalizada de un lipo-quito-oligosacarido producido por Bradyrhizobium ja-

ponicum. R1 = H, R2 = methyl fucosyl, R3 = H, Q = cadena fatty acyl, R4 = H, R5 =H (Hirsch et
al. 2001)
Las señales producidas por las plantas son específicas para cada leguminosa
y son reconocidas por rizobios específicos dónde la molécula señal se vincula con
la caja Nod activando la expresión genética en los microorganismos. Se han iden-
tificado muchas moléculas de LCO producidas por diferentes especies de rizobium
y estas son “huésped específicas”. En la planta, receptores tipo quinasas son los
receptores de las moléculas señal producidas por rizobios y, en respuesta a la pre-
sencia de concentraciones adecuadas de estos, activan los genes nodulin y una
cascada de eventos en las plantas. Los efectos directos y derivados sobre el creci-
miento de las plantas en presencia de los LCO se ha descripto en un amplio y bajo
rango de concentraciones de aplicación entre 10-6 y 10-12 M (Prithivaraj et al.,
2003, Kahn et al., 2008, Kidaj et al., 2012, Olah et al. 2005). En general, las res-
puestas más efectivas se reportaron con aplicaciones en el rango de entre 10-7 y
10-9 M.
La nodulación es el resultado natural de la combinación de rizobios infec-
tivos con su leguminosa huésped. Varios estudios muestran tanto nodulación tem-
prana o mayor cuando el inoculo de rizobios es complementado con la molécula
LCO requerida para este proceso (Macchiavelli y Brelles-Marino, 2004; Kidaj et
al., 2012; Maj et al., 2009). La producción y el intercambio de señales y la sim-
biosis entre rizobios y leguminosas es interrumpido por factores ambientales de
-273-
estrés y condiciones subóptimas de crecimiento tanto de las plantas y como del

rizobium. Entre estos factores se encuentran tanto bajas como altas temperaturas
en la rizosfera, alta salinidad, y bajo pH. Por ejemplo, con altas temperaturas ri-
zosfericas la producción de exudados de raíces inductores de genes nod en los ri-
zobios disminuye pudiendo explicar la reducción en la infección y formación de
nódulos en estas condiciones (Hungria, 1995). El agregado de productos especí-
ficos involucrados en el proceso de comunicación planta-microbio puede revertir
esta inhibición. Duzan et al. (2004) describieron que el agregado de moléculas del
tipo de los LCO induce a la deformación de pelos radicales en condiciones de cre-
cimiento con bajas temperaturas o de bajo pH. Las mejoras en nodulación fueron
más evidentes bajo condiciones sub-optimas de crecimiento de las raíces (Zhang
y Smith, 1995).
Efectos de la aplicación de moléculas señal sobre el crecimiento de soja

Los beneficios de los LCO se extienden más allá de las mejoras en nodula-
ción. La aplicación sobre las semillas de formulaciones de LCO, en forma inde-
pendiente, o combinados con rizobios específicos de leguminosas aporta
positivamente al crecimiento de las plantas. Por ejemplo, en estudios de inverná-
culo y en condiciones de campo, se ha observado que los LCO producidos por
Bradyrhizobium japonicum mejoran la germinación de soja y de poroto (Phaseolus
vulgaris) aún antes de la manifestación de la nodulación (Prithiviraj et al., 2003,
Smith et al., 2002). Similares resultados se han descripto al aplicar los LCO de
Rhizobium leguminosarum biovar viciae sobre la germinación de arveja (Pisum
sativum), de vicia (Vicia villosa) (Kidaj et al., 2012), de Medicago truncatula
(Macchiavelli y Brelles-Marino, 2004), y de Trifolium pratense (Maj et al., 2009).
También, en presencia de estas moléculas, se observan mejoras en el crecimiento
inicial de leguminosas y de otros cultivos (Souleimanov et al. 2002, Prithiviraj et
al. 2003, Kidaj et al. 2012, Maj et al. 2009).
Spaink et al. (1993) y Mulder et al. (2005) describieron que las moléculas
señal producidas por los rizobios son activas sobre las plantas aún en ausencia de
bacterias. Por ejemplo, los LCO inducen a la división de células corticales y esti-
mulan a la embriogénesis de cultivos de células. La presencia de estas moléculas
mejora el crecimiento de plantas de soja resultando en 5 a 9 % más de longitud de
raíces y 4 a 6 % más de materia seca aérea a los 10 días desde la germinación
(Tabla 1). El tratamiento estimula la ramificación de las raíces y la biomasa de
los nódulos (Souleimanov et al. 2002).
-274-
Tabla 1: Efecto de la concentración de moléculas señal producidas por rizobios sobre la masa seca
de raíces y de la parte aérea de plántulas de soja 10 días luego de su germinación (Adaptado de Sou-
leimanov et al.2002)
Materia seca
Aérea de raíces
Concentración (mg planta-1)
0M 178 63.5
10-7 M 184 73.5
10-9 M 183 68.1
10-11 M 178 64.0
El primer efecto directo de la aplicación de los LCO es la deformación de

los pelos radicales, proceso que en condiciones desfavorables de producción de
flavonoides, moléculas de inducción natural producidas por las leguminosas, es
retrasado. Zhang y Smith (1995) mostraron que al favorecerse la producción de
los LCO se reduce el tiempo para la formación inicial de nódulos al inocular con
Bradyrhizobium japonicum en condiciones sub-optimas de temperatura (15 a
17ºC). Además, con la aplicación de la molécula señal producida por este rizobio
[LCO BjV(C18:1,MeFuc)] se han descripto mejoras en la germinación y en la
emergencia de plántulas no solo de soja (Figura 2) sino de varios otros cultivos
(Prithiviraj et al., 2003).
Figura 2. Efecto de la aplicación del lipo-quito-oligosacarido, LCO Bj V(C18:1,MeFuc), sobre la

emergencia de plántulas de soja en condiciones de campo luego de 10 días de la siembra. Letras di-
ferentes sobre cada columna indican diferencias significativas (p<0,05). (Adaptado de Prithiviraj et
al., 2003).
-275-
Según Miransari et al. (2006), las respuestas a los LCO permiten superar
condiciones abióticas estresantes, tales como bajos niveles de pH, que afectan el
enrulamiento de los pelos radicales. Además, los LCO son moléculas activas que
en baja concentración incrementan la colonización con micorrizas y promueven
al desarrollo de raíces laterales (Olah et al. 2005). Estas moléculas tienen recep-
tores específicos del tipo de receptores de quinasas (LsyM) ubicados sobre las ra-
íces que activan cascadas genéticas especificas (Gherbi et al. 2008) que participan
en la nodulación con rizobios o en la penetración de micorrizas en las raíces.
Moléculas señal y producción de soja

Los primeros resultados reportados de los aportes de la aplicación de LCO
sobre la producción de soja provienen de estudios desarrollados en suelos de la
región central de los E.U.A. con y sin presencia de Bradyrhizobium japonicum
(Smith et al., 2004a). Estos autores describieron que el tratamiento sólo con LCO
no aportaba mejoras en producción en el suelo sin presencia de Bradyrhizobium
japonicum pero en ambos sitios los mayores rendimientos fueron logrados al ino-
cular con Bradyrhizobium japonicum en combinación con el tratamiento con LCO
(Tabla 2).
Tabla 2. Producción de grano de soja (kg ha-1) según tratamientos de inoculación con Bradyrhizobium
japonicum y la aplicación de lipo-quito-oligosacáridos (LCO) en suelos con y sin presencia de
Bradyrhizobium japonicum naturalizado (Adaptado de Smith et al., 2004a).
Bradyrhizobium japonicum naturalizado en el suelo

Tratamiento No Si
Control sin inocular 3335 2499
Bradyrhizobium japonicum 3588 2721
LCO 3487 2916
B. japonicum + LCO 3635 2923
Diferencia mínima significativa (10%) 235 134
Coeficiente de variación (%) 5,6 4,0
Catroux (2005) reportó mejoras en nodulación y mayores rendimientos en

grano de plantas de soja en presencia de concentraciones crecientes de moléculas
señal producidas por los rizobios (Tabla 3). Los rendimientos fueron mayores en
todas las concentraciones evaluadas y el comportamiento fue mejor con la apli-
cación de 106 unidades formadoras de colonias de Bradyrhizobium japonicum por
semilla que con una concentración menor de estas.
-276-
Tabla 3. Efectos de concentraciones de moléculas señal producidas por rizobios y de las unidades
formadoras de colonias (ufc) de Bradyrhizobium japonicum sobre semillas sobre los rendimientos
de soja (kg ha-1) (Adaptado de Catroux, 2005)
Bradyrhizobium Japoni-
Concentración de lipo-quito-oligosacáridos (M)
cum (ufc semilla-1)
0 10-7 10-8 10-9
104 2746 3129 3075 3061
106 4118 4325 4203 4222
En Argentina, entre las campañas agrícolas 2002/3 y la 2012/13, se esta-

blecieron estudios para evaluar los aportes de aplicar los LCO junto con la inocu-
lación con Bradyrhizobium japonicum en diversas condiciones y regiones de
producción de soja. Sobre 520 sitios evaluados se observó que la respuesta pro-
medio a la aplicación de LCO al inocular con Bradyrhizobium japonicum fue de
234 kg ha-1 equivalentes a 8.7 % de mejora y con 76 % de casos con respuestas
sobre el control (Figura 3). En la misma región y condiciones de producción, sobre
171 casos evaluados, la respuesta a la inoculación solo con la misma cepa de
Bradyrhizobium japonicum pero en ausencia del aporte complementario de los
LCO fue de 179 kg ha-1, equivalentes a 6,7 % de mejora en los rendimientos con
un 67 % de casos superiores al control (Figura 3). Además de los efectos de este
tratamiento sobre la producción de granos se han observado mejoras en el creci-
miento temprano de los cultivos (mayor densidad y vigor de plantas, cierre del
canopeo temprano), formación temprana de nódulos (Tabla 4, Smith et al. 2004b).
Figura 3. Rendimientos de soja según tratamientos de inoculación con Bradyrhizobium japonicum

sólo o combinado con lipo-quito-oligosacáridos en evaluaciones de campo en la República Argentina
(Díaz-Zorita, inédito).
-277-
Tabla 4. Respuesta media de cultivos de soja al tratamiento líquido de semillas de soja Bradyrhizo-
bium japonicum en 22 evaluaciones de campo en los E.U.A. y 4 en la República Argentina (Adaptado
de Smith et al. 2004b). Índice de “vigor”: rango entre muy bajo (1) y excelente (9) estado de creci-
miento del cultivo.
E.U.A. Argentina
Control Tratado Control Tratado
Plantas m-2 14,5 16,6 33,7 36,6
Indice de “vigor” 5,3 7,2 5,7 8,0
Nodulos planta-1 2,9 11,9 6,0 20,0
Rendimiento en grano (kg ha-1) 2613 2928 1936 2528
Comentarios finales
En la producción de soja, la adecuada nutrición nitrogenada depende de la

efectividad de la fijación biológica del nutriente en la simbiosis entre la leguminosa
y rizobios en un proceso coordinado por moléculas señal. Los lipo-quito-
oligosacáridos, son las moléculas señal producidas por los rizobios al ser percibidos
por las plantas de soja proveen mejoras en la nodulación, aumentos en la actividad
de algunos genes en las plantas contribuyendo a mejoras en el establecimiento de
los cultivos, en el vigor de las plantas y en la producción de granos.
Resultados de evaluaciones de la inoculación con Bradyrhizobium japoni-
cum y lipo-quito-oligosacáridos en 520 condiciones extensivas de producción en
la República Argentina entre 2002 y 2012 muestran aumentos en los rendimientos
del 8,7 % con 76% de casos con respuesta. Este comportamiento supera la res-
puesta media de 6,7 % y 69 % de casos con respuesta observados al inocular sólo
con Bradyrhizobium japonicum.
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-281-
Efectos positivos de la inoculación de soja sobre
la nodulación, la FBN y en los parámetros
de producción del cultivo
Positive effects of inoculation of soybean on nodulation,

BNF and the parameters of crop production
Piccinetti Carlos1*, Norma Arias2, Luis Ventimiglia3, Martín Díaz Zorita4, León
Murua5, Héctor Sanchez6, Gustavo Ferraris7, Fernando Mousegne8, Hugo
Fontanetto9, Eduardo Sá Pereira10, Julia Capurro11, JM Enrico12; Carlos
Lopez13, Adolfo Sebastían Carrizo14, Fernando Salvagiotti12, Daniel Collino15
y Alejandro Perticari1
Resumen
El cultivo de soja en nuestro país desde sus comienzos fue acompañado por
la inoculación dado la inexistencia o escasa presencia en nuestros suelos de los
rizobios específicos de las especies Bradyrhizobium japonicum y B. elkanii. Los
efectos de esta tecnología sobre el cultivo eran altamente significativos avalando
su uso por los productores agropecuarios. En suelos con historia de soja se esta-
blecieron poblaciones de rizobios introducidos por la repetida inoculación anual
y estos promovieron la aparición de nódulos en la soja sin inocular. Esta situación
generó dudas sobre los efectos de la inoculación. La incorporación de los sistemas
de siembra directa al cultivo de soja acompañado de nuevos cultivares con mayor
capacidad productiva, junto a precios y costos favorables permitieron la fuerte
expansión del cultivo a nuevas áreas. En concomitancia, se aumentaron los nece-
sidades de inoculación para las nuevas áreas y los requerimientos de N de la soja
para alcanzar los rindes esperados con los nuevos cultivares. Esto representó una
oportunidad para que la inoculación o el aporte biológico de N sea incorporada
definitivamente en los sistemas productivos. Por intermedio del Proyecto Inocular,
se evaluó el comportamiento de esta práctica en los diferentes ambientes cultiva-
1
INTA IMYZA 2EEA INTA Concepción del Uruguay 3AER INTA 9 de Julio 4FAUBA-Novozi-
mes Argentina 5AER Jesús María 6 EEA INTA Famaillá 7EEA INTA-Pergamino 8AER INTA San
Antonio de Areco INTA 9EEA INTA Rafaela 10AER Coronel Suárez 11 AER Cañada de Gómez
12
EEA INTA Oliveros 13AER Río Primero, 14EEA INTA Salta 15 INTA IFVRG CIAP.
*cpiccinetti@cnia.inta.gov.ar
-283-
dos con esta leguminosa. Los efectos positivos de la aplicación de esta tecnología
se expresan en la número y peso de nódulos en raíz primaria, en la producción de
biomasa aérea, en el rendimiento y en los aportes de N.
Palabras clave: Bradyrhizobium japonicum, fijación de nitrógeno, promoción de

crecimiento.
Introducción
La soja, en su ambiente natural de origen, Sudeste Asiático, evolucionó es-

tableciendo relaciones simbióticas con bacterias del suelo fijadoras de N2, deno-
minadas en forma genérica rizobios. Como fruto de esta asociación se forman
nuevas estructuras en las raíces, los nódulos donde se realiza la Fijación Biológica
de Nitrógeno (FBN). La FBN es la capacidad de transformar una molécula inerte
y abundante del aire (N2) en amonio, mediante un complejo sistema enzimático
denominado nitrogenasa. La soja cubre sus requerimientos de Nitrógeno (N) desde
dos fuentes una proveniente del aporte del suelo y otra desde la FBN. El N tiene
un rol crucial en la producción del cultivo de soja, está determinado que para pro-
ducir un qq de grano de soja se requieren en promedio entre 7-8 kg de N. La pro-
ducción de soja en nuestro país desde sus inicios fue acompañada por la
inoculación, dado la inexistencia en nuestros suelos de las bacterias específicas
capaces de establecer simbiosis funcional con soja, como por ejemplo Bradyrhi-
zobium japonicum o B. elkanii. El producto biológico desarrollado para este fin
se denomina inoculante. Este se puede definir como un insumo biológico desarro-
llado de tal forma que permite contener a los rizobios seleccionadas por capacidad
de fijar N2 en soja, vivos y en condición fisiológica activa hasta su empleo. En el
listado del SENASA, organismo de registro de este insumo, se puede verificar
que existen más de 100 productos registrados para soja con alta diversidad de tipos
ya sean líquidos o sólidos, con la incorporación o no de factores de nodulación o
bioinductores, y también existen registros de sistemas de protección que permiti-
rían la inoculación anticipada o preinoculación ya sea para tratamientos en el
campo o profesionales.
Selección de cepas
Las cepas utilizadas para la producción de inoculantes han sido seleccionadas

por su capacidad para formar nódulos, (infectividad) y para fijar N (efectividad), la
sobrevivencia en las semillas y en el suelo, la adaptación o tolerancia a situaciones
de estrés, la estabilidad genética, como así también es fundamental la capacidad de
-284-
Efectos positivos de la inoculación de soja sobre la nodulación, la FBN y en los parámetros ...
crecimiento en las condiciones de producción de los inoculantes. Los estudios de

selección comienzan en laboratorio, continúan en invernáculo y finalizan con ensa-
yos en condiciones de campo en las diferentes áreas cultivadas con soja.
Luego de un programa de selección de cepas iniciado en 1980 por el Insti-
tuto de Microbiología y Zoología Agrícola del INTA con numerosos ensayos en
diferentes áreas productivas, se eligió a la cepa E109 de B. japonicum como reco-
mendable para la inoculación de soja. En Salta y Tucumán se ha seleccionado nue-
vas cepas a partir de poblaciones naturalizadas de suelos cultivados con soja. El
empleo de estas cepas como inoculante, en ambientes similares a las condiciones
de aislamiento promovió mayores rendimientos del cultivo de soja. Estos estudios
sugieren que en las poblaciones presentes en el suelo hay potencial genético para
aumentar el aporte de la fijación de N2 desde el punto de vista del microsimbionte.
La actividad privada también realiza sus propios estudios de selección llegando
en algunos casos a determinar que para su producto la cepa a emplear sea distinta
a la recomendada oficialmente.
Inoculación
El inoculante es un producto tecnológico (formulado microbiano) que per-

mite mantener microorganismos vivos y fisiológicamente activos hasta su utili-
zación. Y la inoculación es la práctica agronómica que incorpora artificialmente
a las semillas o al suelo microorganismos seleccionados que cumplan una función
benéfica sobre el crecimiento y/o desarrollo del cultivo. La inoculación de soja
en este caso es la única práctica agrícola difundida que se dispone en la actualidad
que nos proporciona mayor certidumbre de poder generar simbiosis temprana en
el cultivo, esto permite disponer lo antes posible del N de la atmósfera. Con esta
tecnología se logra la incorporación efectiva de un alto número de bacterias del
suelo fijadoras de N2 sobre la superficie de las semillas de soja previo a la siembra
de las mismas o al suelo acompañando la siembra. En el procedimiento se debe
lograr que cada semilla contenga una carga de rizobios óptima para una adecuada
nodulación. En suelos sin rotación con soja previa es frecuente observar un fuerte
impacto negativo sobre la producción del cultivo cuando hay fallas de nodulación
y muchas plantas de soja se presentan de color verde amarillentas sin nódulos por
la tanto no fijan N2. En suelos con historia de soja se establecen poblaciones de
rizobios introducidos por la repetida inoculación. Sin embargo como se sabe el
rizobio es poco móvil en el suelo siendo su distribución no homogénea y no toda
la semilla estará en contacto con poblaciones de rizobios presentes en el suelo.
En cambio, con la inoculación aseguramos que cada semilla cuente con el número
de rizobios necesarios para una rápida y adecuada nodulación. Además, el disponer
-285-
el inoculante de las cepas seleccionadas por su alta capacidad de fijar de N2 crea

las mejores condiciones para una mayor expresión del proceso de la FBN desde
las etapas tempranas del cultivo de soja manteniendo el mayor tiempo posible los
aportes desde esta vía. En cambio si no se inocula dependemos de las poblaciones
naturalizadas de rizobios presentes en el suelo que con frecuencia no son homo-
géneas en su composición dado las diferentes situaciones de estrés a las que han
sido expuestos, como sequías intensas, inundaciones, aplicación de diferentes
agroquímicos, altas temperaturas, desecación, etc. En general son muy infectivas
con alta capacidad para nodular y por otro lado tienen variado grado de eficiencia
para fijar N2, encontrándose dentro de la población cepas eficientes hasta incluso
cepas ineficientes (parásitas).
Proyecto Inocular
En el año 2000 en áreas nuevas para el cultivo de soja en particular en am-

bientes de la Mesopotamia en suelos previamente cultivados con arroz. Dada la
frecuencia de casos con escasa o nula nodulación se desarrollaron experimentos
junto con 12 empresas productoras de inoculantes. Este trabajo inicial generó la
necesidad de darle un marco institucional a esta actividad y se fijó como objetivo
principal continuar los ensayos ampliando el área de estudio y dando difusión de
los resultados, señalando los beneficios que derivan del adecuado empleo de ino-
culantes para leguminosas. Esto generó la base para constituir un Convenio de
Asistencia Técnica, denominado “PROYECTO INOCULAR” entre el INTA y 25
empresas.
En suelos no rotados con soja si no hay limitaciones nutricionales ó hídricas
se esperan aumentos de rendimiento mínimos del 50% (suelos nuevos de Entre
Ríos, S de Córdoba y Chaco) y de menor impacto en el C y S de Buenos Aires,
con incrementos de rendimientos observados de 500 kg a 3.000 kg.ha-1. En cam-
bio, en suelos con historia de soja en la rotación de acuerdo a la base de datos del
Proyecto Inocular acumulados hasta el año 2007, más de 700 entradas, la respuesta
esperada oscila entre 6 al 10% según año. La comparación entre tratamientos ino-
culados y control sin inocular muestran una diferencia hacia los tratamientos ino-
culados de 243 kg/ha siendo altamente significativo (p=0,0001). En la Figura 1
se puede observar cómo se comportan los tratamientos realizados en diferentes
ambientes sembrados con soja y su ajuste a una regresión simple.
Respecto al uso de inoculantes en el año 2010 a solicitud del Proyecto Ino-
cular realizó una encuesta a nivel nacional a través de la consultara ICASA que
arrojó la siguiente información (Tabla1). El uso es muy alto en todos los ambientes
cultivados con soja.
-286-
Figura 1. Rendimientos de los tratamientos inoculados (negro) y el tratamiento control (gris) de

ensayos que se encuentran en la base de datos del Proyecto Inocular desde 1990 hasta el año
2007.
Tabla 1. Uso de inoculantes para soja en Argentina. (fuente: Proyecto Inocular-ICASA 2010)
Centro
Norte Oeste SE de Sur de Centro Este de Sur
Pregunta Total Sur de NOA NEA
de BA de BA BA SF de SF CDBA de ER
CDBA
Siempre/
94% 86% 98% 95% 93% 100% 92% 95% 100% 86% 100%
casi siempre
A veces/ Es-
porádica- 4% 12% 2% 5% 0% 0% 6% 3% 0% 8% 0%
mente
Casi nunca/
2% 2% 0% 0% 7% 0% 2% 3% 0% 5% 0%
nunca
El cultivo de soja en la Argentina
Las características agroecológicas de la región pampeana y los ambientes

de regiones extrapampeanas, en concordancia con la capacidad adaptativa de los
diferentes grupos y cultivares de soja, permiten lograr una producción económi-
camente rentable de este cultivo y de ahí su expansión.
En la región pampeana las prácticas de manejo del cultivo de soja suelen
variar dentro de un ambiente e inclusive de acuerdo a las características del lote
-287-
de producción. Dicha prácticas dependen de las bondades (presencia de napa), de

limitaciones moderadas y temporarias conocidas (déficits/excesos hídricos, nutri-
cionales, térmicos, etc), o que provienen del propio ambiente (pe poca profundidad
efectiva, baja retención hídrica del perfil de suelos, heladas tempranas, etc.). Los
ambientes extrapampeanos también presentan bondades y limitaciones, la atención
es mayor por la fragilidad del sistema agroecológico, causados principalmente por
las características del suelo, momento e intensidad de las precipitaciones y tem-
peraturas que repercuten además sobre el potencial productivo.
La inoculación es parte de las prácticas disponibles para el productor que
se utilizan como herramientas tecnológicas para mejorar la productividad. Para
mejorar la performance con las distintas formulaciones de los inoculantes hoy se
encuentran en el mercado productos con cantidades adicionales de factores Nod
o los llamados bioinductores que mejoran la capacidad noduladora de la planta;
los aditivos osmoprotectores que mejoran la tolerancia de las bacterias con la ino-
culación anticipada e inclusive la protección después de la siembra ante situacio-
nes de estrés (desecación) o alternativas como la inoculación en el surco cuando
ya sea por logística o porque es imprescindible la utilización de insecticidas y/o
fungicidas muy agresivos para los rizobios.
Efectos de la inoculación sobre la nodulación en soja
El primer efecto de la inoculación con Bradyrhizobium japonicum (Bj) en

soja es la presencia de un nuevo órgano en el sistema radicular de la planta que se
denomina nódulo. Éste órgano no es esencial para la supervivencia del vegetal,
pero sí es fundamental para los requerimientos de N del cultivo. La presencia de
los nódulos está relacionada con la capacidad de fijar N2. Dado los aportes extra
de N por esta vía afectan en forma positiva sobre la productividad del cultivo.
Mientras que aspectos relacionados con la promoción del crecimiento o la res-
puesta inmune ante eventos bióticos, (pe menor incidencia de enfermedades por
estar en mejor condición nutricional) o la activación de mecanismos de defensa;
o abióticos (pe tolerancia a encharcamiento, bajas temperaturas); o de biorreme-
diación a través de la desactivación de moléculas tóxicas (pe bioacumulación de
arsénico en la biomasa) requieren investigación y es posible que estos aspectos
apuntalen la estabilidad de la producción del cultivo de soja.
Con la inoculación anual se detectan beneficios cuantificables en el número
y peso seco de nódulos por planta, y también se observan cambios en el perfil de
nodulación de la planta.
Sobre 28 ensayos (Tabla 2) realizados sobre lotes con distinta historia agrí-
cola, tipos de suelo, utilizando las variedades de soja recomendadas para cada am-
-288-
biente y con las variaciones interanuales normales de temperatura, precipitaciones,

radiación, etc. la respuesta promedio a la inoculación es significativa (p=0.023)
en el número de nódulos por planta. El número de nódulos en raíz principal (Figura
2) es altamente significativo a favor del tratamiento inoculado sobre el control
(p=0.0083) con una frecuencia de incremento del 80% y en cambio el número de
nódulos sobre las raíces laterales es menos modificado por la inoculación siendo
significativo a una menor probabilidad (p=0.059) y con una frecuencia del 70%.
Esto indicaría que la inoculación podría modificar en parte el perfil de nodulación
formándose más nódulos en raíz primaria que en secundarias, sin dejar de consi-
derar que cada cultivar de soja puede poseer perfiles de nodulación distintos (Eöry
C. , 2011, comunicación personal). En el parámetro biomasa de nódulos por planta
se detectan las mismas diferencias observadas en el número de nódulos (Tabla 2
y Figura 2). Esto efectos de la inoculación podrían ser empleados como indica-
dores simples a considerar en las evaluaciones de campo, es decir determinar nú-
mero y tamaño de nódulos en raíz principal podrían ser útiles para verificar efectos
positivos de la inoculación.
Tabla 2. Efecto de la inoculación sobre la nodulación en condiciones productivas. Número de nó-
dulos raíz principal, raíces laterales y por planta, respectivamente (NNRP, NNRL y NNP). Peso
seco (mg.planta-1) de nódulos en raíz principal, en raíces laterales y por planta, respectivamente
(PSNRP, PSNRL y PSNP). Control sin inocular (C) e inoculado (I). (Fuente: Proyecto Inocular).
NNRP NNRL NNP PSNRP* PSNRL* PSNP*

Tratamiento C I C I C I C I C I C I
Media 7.8 9.3 24 27 32 36 50 58 87 92 138 162
Incremento % 19 10 12 16 5.7 17
CV % 20 9 9 15,6 11 11
P valor 0.008 0.059 0.002 0.07 0.15 0.02
Figura 2. Efectos de la inoculación el número y peso de nódulos en raíz principal.
-289-
Biomasa aérea total en soja
La soja como todo vegetal utiliza radiación solar, agua y nutrientes para lle-
var adelante su ciclo de vida, en primera instancia para su crecimiento y desarrollo
y finalmente sustancias de reserva que le permitirán transferirlas a los órganos re-
lacionados a su descendencia (granos). Durante el ciclo del cultivo en las plantas
existe un momento donde encuentra su máxima capacidad de acumulación de nu-
trientes, que coincide con su máxima capacidad de acumular biomasa. La cuanti-
ficación de la biomasa aérea acumulada en soja es un parámetro productivo donde
confluye la dinámica de crecimiento y desarrollo del vegetal durante la campaña,
el tipo de manejo y las meteorológicas (radiación, disponibilidad hídrica, tempe-
ratura, disponibilidad de nutrientes, etc.) y los aportes de la interacción entre Bj-
soja. Por lo tanto, es un fiel reflejo de las características particulares de cada
ambiente (lote), del cultivar de soja y que explica gran parte del rendimiento de
granos. En este sentido, con la inoculación se detectan beneficios cuantificables
en la cantidad acumulada de biomasa aérea en el momento previo a la caída prin-
cipal de hojas (R6.9).
Con el análisis de 22 ensayos de inoculación de soja (Tabla 3) se determinó
un incremento promedio significativo de la biomasa aérea total en el cultivo
(p=0.04) a favor de los tratamientos inoculados sobre los lotes de distinta historia
agrícola respecto del control sin inocular. En el rendimiento de granos la respuesta
a la inoculación es altamente significativa (p=0.001). En cambio, el índice de co-
secha tiende a ser más alto cuando se inocula pero esa mejora promedio no es sig-
nificativa (Tabla 2). La evaluación de componentes de rendimiento determinada
en 14 ensayos indica efectos positivos significativos frecuentes en el número de
granos por m-2 con la inoculación (p=0.03) y respuestas no significativas en el
peso de mil granos (p=0.11)
Tabla 3. Efectos de la inoculación de soja sobre la biomasa aérea total (BAT) en R6, rendimiento
de granos (RG) e índice de cosecha (IC) realizados en diferentes ambientes y campañas. Trata-
mientos control sin inocular (C) e inoculados (C) con Bradyrhizobium japonicum (fuente: Pro-
yecto Inocular).
BAT* RG* IC**
Tratamientos C I C I C I
Media 9288 9569 3262 3511 37.5 39.6
Incremento(%) 3.0 7.6 5.4
p valor 0.04 0.001 0.08
CV 3.0 6.7 10.3
*BAT y RG están expresados en kg/ha
**IC está expresado en %
-290-
Experiencias realizadas de inoculación de soja sobre diferentes

ambientes de Argentina
Son numerosas las experiencias de campo realizadas sobre diferentes am-

bientes relevantes de producción de Argentina por investigadores del INTA, Agen-
cias de Extensión Rural y Estaciones Experimentales del INTA sobre inoculación
de soja con Bj. El principal efecto evaluado es el rendimiento de granos, de los
cuales en la Tabla 4 se presentan los promedios de rendimiento, las diferencias
entre los tratamientos control e inoculados y la ganancia en la producción con la
aplicación de inoculantes a base de Bj.
Tabla 4. Experiencias de campo en diferentes ambientes productivos de Argentina realizadas por in-
vestigadores de INTA. Efecto de la inoculación de soja sobre el rendimiento promedio de granos y
la ganancia en la producción (Fuente: Relevancia de la Inoculación en Argentina, en edición)
Ambiente Investigadores Institución N° Exp RG*

C I G*
Centro-
Norte de Hugo Fontanetto EEA Rafaela, Santa Fe 15 2809 3175 366
Santa Fe
(1) EEA Famaillá. Tucu-
Héctor Sanchez1;
Noroeste mán (2) Facultad de
Josefina Amigo2; 26 2826 3191 365
Argentino. Agronomía y Zootecnia-
Raúl Pedraza1
UNT. Tucumán
Norma Arias1,
(1) EEA Concepción del
Entre Ríos Diego Santos2 31 2946 3269 323
Uruguay (2) EEA Paraná
y Raúl Vicentini2
(1) AER Cañada de

Sur de Julia Capurro1
Gómez (2) EEA 56 3022 3183 161
Santa Fe y Juan Martín Enrico2
Oliveros
Centro-
Luis A. Ventimiglia AER 9 de Julio 15 3362 3815 453
Oeste Bs As.
Norte y CO Gustavo N. Ferraris(1)

EEA Pergamino. 186 2945 3159 214
y Bs. As. y F. Mousegne(2)
Sudoeste
Eduardo de Sá Pereira AER Coronel Suárez 5 1282 1708 426
Bonaerense
León Murúa2, (1)AER Huinca Renancó
Carlos López3, (2)AER Jesús María,
Córdoba 13 3330 3463 134
Francisco Fuentes4, (3)AER Río Primer
Guillermo Resch1 (4)EEA Marcos Juárez
*RG y G están expresados en kg/ha
-291-
Aportes de N desde la Fijación Biológica de Nitrógeno
La planta de soja tiene una constitución orgánica muy particular, ya que al-
rededor del 3% en las estructuras de su biomasa vegetal es N total. Y para producir
un Mg de granos necesita en promedio acumular en la biomasa aérea 84.3 kg de
N (n: 248, fuente: Proyecto Inocular), lo que implica una más que elevada cantidad
de N en la estructura del cultivo. Además, la planta acumula en sus granos apro-
ximadamente un 73% del total adquirido y que se exporta del ambiente como pro-
ducto (61.5 kg de N/Mg de grano producido). Es altamente dependiente para la
construcción del rinde de la capacidad de adquirir N, por tal motivo lo puede tomar
de dos fuentes naturales, la que proviene principalmente de la mineralización de
la materia orgánica del suelo y/o de la simbiosis mutualista generada por la inter-
acción con rizobios específicos.
Distintos procesos físico-químicos suceden para que la planta de soja dis-
crimine la adquisición del 14N en detrimento del 15N consecuencia de las diferen-
cias entre las características de los isótopos y este proceso puede ser más selectivo
dependiendo de la cepa de rizobio utilizada del inoculante o naturalizada del suelo
y en última instancia de su enzima nitrogenasa. En las evaluaciones realizadas por
Guimaraes et al. (2008) encontraron que las cepas B. japonicum tuvieron un rango
de discriminación entre -1.84 y -0.50‰, mientras las cepas de B. elkanii el rango
estuvo entre -3.67 y -1‰.
Básicamente son dos los métodos utilizados para la determinación del por-
centaje de la FBN en condiciones de campo con historia previa del cultivo, uno de
ellos es “dilución isotópica de 15N” y el otro “abundancia natural de 15N”. En refe-
rencia al método de dilución isotópica, se debe conocer la tasa o enriquecimiento
del fertilizante y en consecuencia la cantidad a aplicar. Esta cantidad debe permitir
cambiar la composición isotópica del suelo para ser detectado por el espectrómetro
(de masa o de emisión). La aplicación del fertilizante enriquecido se realiza en sitios
bien delimitados dentro de las parcelas y generalmente se utiliza 1 m2. En relación
al método de abundancia natural propuesto por Boddey y col. (2000) se basa en la
composición isotópica del 15N/14N de las estructuras del vegetal, sin el agregado de
fertilizante nitrogenado enriquecido al suelo. En ambos métodos de cuantificación
de la FBN se utiliza la biomasa seca finamente molida del vegetal fijador de N, el
mismo procedimiento se realiza con el vegetal no fijador de N o control negativo.
La diferencia entre los métodos radica en que con la abundancia natural del 15N re-
quiere además de un control positivo o factor β, es decir, en el que todo el N de la
estructura del vegetal fijador de N provenga de la FBN.
Del análisis de las experiencias de campo utilizando el método de abun-
dancia natural (Tabla 5) sobre porcentaje de la FBN se observa que las diferencias
-292-
no son significativas (p=0.342) aunque se manifiesta una tendencia en favor del

tratamiento inoculado (I) respecto del control (C), la misma respuesta (p=0.373)
se encuentra en el porcentaje de N de la biomasa aérea total (%N BAT). Estos
baja respuesta está condicionada al manejo y particularmente a las interacciones
genotipo de soja y las cepas de rizobios.
Las respuestas sobre la biomasa aérea total (BAT) sí es significativa
(p=0.017); en el N acumulado en la biomasa aérea total (N BAT) es altamente sig-
nificativa (p=0.001). Respecto del N derivado de la FBN (N dFBN) la respuesta
es significativa (p=0.025) en favor del tratamiento inoculado por sobre el control
(Tabla 5).
Tabla 5. Resultados obtenidos de los estudios realizados en distintas localidades de la Región
Pampeana, ciclos de cultivo y variedades de soja en relación al %FBN, %N BAT, BAT (kg.ha-1),
NBAT (kg.ha-1) y N dFBN (kg.ha-1).
Cam-
Localidad Variedad %FBN %N BAT BAT N BAT N dFBN
paña
C I C I C I C I C I
Runciman 2005-6 DM 4200 54.8 65,8 2.9 2.7 9816 10630 287 291 158 192
Vedia 2005-6 A4303 61.8 46.3 2.33 2.3 7634 8484 178 194 110 90
Casilda 2005-6 DM3700 50.8 63.4 2.9 3.0 5980 6281 173 189 88 120
Cañada
2005-6 DM4800 88.3 85.7 2.72 2.9 9919 10196 270 295 238 253
Loma
Cañada
2005-6 DM4800 63.9 67.6 2.83 3 10163 9539 288 286 184 193
Bajo
Jesús
2006-7 A6445 79.3 73.3 3 3 6423 6715 193 201 153 148
María
Huinca
2005-6 DM 4800 32.6 43.9 2.2 2.2 3345 4322 74 95 24 42
Renancó
Río
2005-6 DM 4800 50 64.6 2.6 2.8 10800 10864 281 304 140 197
Primero
Oliveros 2004-5 DM 4800 63.3 67.5 3 2.9 8181 9031 245 262 155 177
Oliveros 2006-7 DM 5.5i 78.4 75 2.55 2.6 8389 9613 214 250 168 187
Media 62.3 65.3 2.71 2.74 8065 8568 220 237 142 160
Incremento
4.8 1.4 6.2 7.5 12.7
(%)
p valor 0.342 0.373 0.017 0.001 0.025
La emisión de Óxido Nitroso y el cultivo de soja
El Óxido Nitroso es un gas que se produce en la naturaleza mediada por

microorganismos. Está considerado uno de los principales gases que provocan el
-293-
calentamiento global, es decir, del aumento de la temperatura de la tierra. Los au-

mentos considerables sucedidos en las últimas décadas provienen de las activida-
des actuales del hombre y la agricultura es la fuente principal de las emisiones de
este gas. Según el Panel Intergubernamental para el Cambio Climático (IPCC) a
través de la caracterización de los efectos del N2O respecto de la capacidad de
calentamiento (proyección a 100 años), se basa en tres aspectos: 1-la capacidad
de absorción de la radiación infrarroja, 2- la ubicación espectral de sus longitudes
de onda de absorción y 3- la vida en la atmósfera de la especie.
Las fuentes nitrogenadas del suelo son la materia prima que generan las
emisiones de N2O mediada por los procesos de nitrificación y denitrificación. Con
la nitrificación se produce la oxidación del NH4 a NO3. Y con la denitrificación,
considerado el más importante en términos de cantidad emitida de N2O, se pro-
duce en condiciones anaeróbicas (o microaerófilas) donde los nitratos (NO3) o
nitritos (NO2) son reducidos a N2, vía intermediarios gaseosos como el óxido ní-
trico (NO) y el óxido nitroso (N2O) (Jones, 2007). El último paso de N2O a N2
contempla la formación de la triple ligadura catalizada por la enzima oxido nitroso
reductasa (Velazco et al., 2004). Entre los microorganismos capaces de producir
este proceso, Bradyrhizobium japonicum contiene los genes necesarios para rea-
lizar el proceso completo de denitrificación (Nap, Nip, Nor y Nos), y además tiene
la capacidad de crecer en condiciones limitantes de O2 y utilizar el NO3 como
fuente de energía y nutrición de N (Bedmar y col, 2005). En este sentido sería in-
teresante conocer la tasa de denitrificación de las cepas utilizadas en nuestro país
de Bj ya que dentro de las estructuras nodulares hay “rizobios” consecuencia de
la infección que no están transformados en bacteroides y condiciones ambientales
propicias para que se limite la emisión de N2O porque por una parte el N intro-
ducido como NO3 sea transformado en N2 fuente de la FBN y por otra restaría
NO3 a los denitrificadores emisores de N2O.
La FBN no asociativa sería una fuente natural de emisión pero estaría in-
cluida en las formas nitrogenadas del suelo, mientras que la aplicación de fertili-
zantes nitrogenados son una fuente adicional introducida en los esquemas actuales
de producción. Otro ingreso natural de N es la fijación simbiótica de N en las le-
guminosas, que actualmente fue descartada por el IPCC como fuente directa de
emisión, ya que se encuentra contemplada cuando se cuantifica el rastrojo.
Otro aspecto relevante son los factores que promueven las emisiones de N2O,
estas pueden ser por las condiciones agroecológicas de los ambientes, el manejo y
características del rastrojo del cultivo. Los ensayos realizados en Argentina en refe-
rencia al balance de N en soja resultan ser negativos, lo que en principio no sería
una importante fuente de N, ya que este es exportado en los granos (73% del N acu-
mulado en la planta) y porque no se aplican fertilizantes nitrogenados en el cultivo.
-294-
Sin embargo, el sistema Siembra Directa en la Región Pampeana, las condiciones

climáticas propias de esta región y las características del suelo predisponen las emi-
siones de N2O. La alta tasa de monocultivo de soja en estos ambientes podría ser
también un factor determinante de las emisiones de N2O.
Las investigaciones publicadas en Argentina hasta el momento son puntua-
les para tener una idea de promedio de las emisiones dada la heterogeneidad de
los sitios evaluados (Tabla 6). En la actualidad entrará en vigencia una red de mo-
nitoreo de N2O sobre cultivos extensivos en diferentes ambientes de Argentina.
Tabla 6: Investigaciones recientes de Argentina relacionadas a las emisiones reportadas de N2O

(ug N-N2O/m2/h) y de países con historia del cultivo de soja.
Flujo ug N-
Año publi-
País Cultivos estudiados N2O/m2/h repor- Autores
cación
tado
Argentina 2012 Soja-Maíz-Trigo 0-314 Cosentino y Taboada
Argentina 2012 Soja-Trigo/Soja-Maíz 62,58-145,99 Cosentino et al.
Argentina 2012 Soja 13,54-82,17 Lewczuk y Posse
Argentina 2012 Soja-Maíz 6,39-82,8 Alvarez et al.
Argentina 2012 Campo Natural 7,06 Alvarez et al.
Argentina 2012 Soja-Maíz-Intercultivo 11,5-14,0 Dyer et al.
Estados Unidos 2004 Soja 21-151 Marinho et al.
Canadá 2009 Soja 88-483 Almaraz et al.
Brasil 2008 Soja 8-18,7 Jantalia et al.
Nuevos desafíos
Los niveles de biomasa nodular promedio por planta son muy bajos (150-200 mg)
respecto a los potenciales (900-1000 mg). Ante esto se considera que se deberían
evaluar prácticas de manejo que incentiven a un mayor peso de nódulos por planta,
como el empleo de rotaciones y/o el agregado de cultivos de cobertura que favo-
rezcan la relación C/N favorable a la simbiosis, el aporte nutricional acorde a esta
premisa en particular de P y Ca, disminuyendo las situaciones de compactación
entre otros. En paralelo se debería incentivar líneas de investigación de mejora-
miento de soja que incluyen la FBN y la masa nodular. En otro contexto existen
publicaciones en condiciones controladas que muestran que determinadas cepas
de Bradyrhizobium japonicum podrían hacer que las plantas emitan menos N2O
esto debería evaluarse en nuestras condiciones. El conjunto de estas propuestas
de obtener más biomasa nodular, más FBN y menor emisión de N2O conducen
a reubicar al cultivo de soja y colocarlo en prácticas agrícolas tendientes a la sos-
tenibilidad .
-295-
Conclusiones
La inoculación de soja es una práctica instalada a nivel productivo. La in-

formación obtenida por intermedio de las actividades realizadas en el marco del
Proyecto Inocular indican respuestas significativas favorables de la inoculación
sobre el control sin inocular en el número y peso de nódulos, sobre la biomasa
aérea, el número de granos por m-2, el rendimiento en grano y en los aportes totales
de N provenientes de la FBN.
Bibliografía
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ductase of Bradyrhizobium japonicum. Antonie van Leeuwenhoek 85:
229–235
-297-
Aplicación de la tecnología RIVET
(Recombination-based In Vivo Expression Technology)
a la caracterización molecular de la interacción simbiótica
Sinorhizobium meliloti – Medicago spp.
RIVET Technology Application (Recombination-based In Vivo
Expression Technology) to the molecular characterization
of the Sinorhizobium meliloti
symbiotic interaction - Medicago spp.
Lozano Mauricio J., María Eugenia Salas, José L. López., Francisco J.

Albicoro, María Florencia Del Papa, Mariano Pistorio y Antonio Lagares*
Resumen
El estudio molecular de las interacciones simbióticas entre rizobios y legu-

minosas ha sido abordado por diversas metodologías, clásicamente por estrategias
de mutagénesis y más recientemente mediante análisis genómicos, transcriptómi-
cos y proteómicos. Si bien estos estudios permitieron la identificación de muchos
genes indispensables para la vida libre o la simbiosis, el juego completo de genes
y señales expresados durante la colonización e infección de la raíz, el crecimiento
dentro del hilo de infección, y la diferenciación de los rizobios en el nódulo ma-
duro, es aún desconocido. Esto se ha debido en parte a limitaciones técnicas de
los métodos utilizados, particularmente, a la dificultad de acceder a nichos bioló-
gicos complejos. En tales situaciones se ha utilizado con éxito en otros sistemas
la tecnología RIVET (Recombination-based In Vivo Expression Technology). En
nuestro laboratorio hemos construido herramientas RIVET diseñadas para el es-
tudio de la simbiosis rizobio-leguminosa que permiten la identificación y el se-
guimiento espacio-temporal de genes expresados en condiciones de interés. Dichas
herramientas han sido validadas con genes conocidos de expresión exclusivamente
simbiótica (nifH), y utilizado luego con éxito en una fase de prueba para la detec-
ción de genes expresados en condiciones de estrés salino.
Palabras clave: RIVET, Rhizobium, simbiosis

Instituto de Biotecnología y Biología Molecular – CONICET – Departamento de Ciencias Bioló-
gicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. *lagares@biol.unlp.edu.ar
-299-
Introducción
Los rizobios son bacterias Gram negativas que poseen la capacidad de aso-
ciarse con raíces de plantas leguminosas para formar nódulos radicales fijadores
de nitrógeno atmosférico. Los beneficios económicos y ecológicos del aprove-
chamiento agronómico de la fijación biológica de nitrógeno son indiscutibles
(Muslera Pardo y Ratera García, 1984; Peoples et al., 1995; Flores y Sarandón,
2002). Lamentablemente, dada la sensibilidad de las interacciones simbióticas
frente a diferentes factores ambientales (bióticos y abióticos) y a la competencia
por la colonización y nodulación con cepas de rizobios naturalizadas, la utilización
de inoculantes no siempre resulta en una simbiosis eficiente. Para poder corregir,
cuando sea posible, los efectos adversos de los factores ambientales sobre la sim-
biosis, es necesario conocer del modo más acabado posible las etapas y eventos
moleculares que de modo secuencial conducen a una asociación madura (Jones
et al., 2007; Oldroyd et al., 2011; Saeki, 2011; Oldroyd, 2013).
En este sentido, durante los últimos 30 años se han realizado muchos esfuer-
zos orientados a dilucidar a escala molecular el diálogo planta-rizobio, y los meca-
nismos involucrados en la tolerancia y adaptabilidad a diversas condiciones de estrés
ambiental. Como primera aproximación, durante los años 80s y 90s, se utilizaron
con mucho éxito estrategias de mutagénesis, basadas en la generación de colecciones
de mutantes y el posterior análisis del fenotipo simbiótico, o de resistencia a condi-
ciones particulares de estés, de los mismos. Estos estudios permitieron identificar
un gran número de genes requeridos para el éxito de la interacción simbiótica (Long,
2001). Con el advenimiento de las tecnologías “ómicas” (i.e. genómica, transcrip-
tómica y proteómica) (Colebatch et al., 2002), a partir del año 2000 se ha encarado
la identificación a gran escala de genes inducidos o reprimidos durante la interacción
simbiótica, y bajo diferentes condiciones de vida libre. Los resultados obtenidos han
permitido grandes avances en la identificación de genes expresados durante la sim-
biosis (Cabanes et al., 2000; Ampe et al., 2003; Djordjevic et al., 2003; Rolfe et al.,
2003; Barnett et al., 2004; Bestel-Corre et al., 2004; Capela et al., 2006), en diversas
condiciones de estrés (Ruberg et al., 2003; Becker et al., 2004; Krol y Becker, 2004;
Dominguez-Ferreras et al., 2006; Shamseldin et al., 2006), y también, la identifica-
ción de genes controlados por diferentes reguladores transcripcionales asociados a
la vida libre y/o simbiótica (Chen et al., 2003; Capela et al., 2005; Krol y Becker,
2011; Yurgel et al., 2013). Sin embargo, gran parte de la información generada re-
sulta muy difícil de interpretar, y en particular, resulta muy complicado asociar los
genes identificados a una función particular.
Como resultado de estos estudios, se conocen hoy con detalle muchos de
los genes implicados en la síntesis de productos cruciales para el desarrollo de
-300-
Aplicación de la tecnología RIVET ...
nódulos fijadores (ej. nod, nif, fix) (Long, 2001). Se ha descripto también, la exis-
tencia de muchas proteínas que son secretadas al entorno, y que si bien en muchos
casos no resultan indispensables, tienen un rol en el establecimiento de la simbiosis
(CasA, ExoK, ExpE1, ExsH, NodO, PlyA,PlyB, RapA1, RapA2 y RapC, y NOPs
entre otras) (Fauvart y Michiels, 2008). En cuanto a la caracterización del proceso
de infección y diferenciación al estadio de bacteroide fijador de nitrógeno, se han
identificado y caracterizado también genes cuyo rol es relevante ya sea para el
progreso del hilo de infección (exo, lps, katB, cbrA, ndvA, ndvB), o para la forma-
ción del simbiosoma (bacA, hemA), aunque para varios de ellos se desconocen
aún los mecanismos precisos implicados (Jones et al., 2007; Gibson et al., 2008).
A este respecto, recientemente se ha vinculado a la proteína BacA con la impor-
tación de péptidos ricos en cisteína secretados de manera específica por células
del nódulo (NCRP). Estos péptidos, que poseen en altas concentraciones caracte-
rísticas antimicrobianas, son necesarios para la diferenciación del rizobio al estadio
de bacteroide (Haag et al., 2012). En paralelo, y especialmente durante la última
década, se han logrado grandes avances en la caracterización molecular de las cas-
cadas de señalización y diferenciación celular que ocurren en las raíces de la planta
leguminosa durante el desarrollo de la simbiosis (ver las revisiones de Oldroyd y
Downie, 2008; Oldroyd et al., 2011; Oldroyd, 2013).
Sin embargo, a pesar los avances alcanzados en los últimos años, el cono-
cimiento del proceso simbiótico es aun fragmentario. Esto se ha debido principal-
mente a la dificultad de reproducir en condiciones de laboratorio los entornos
complejos y dinámicos en los que existen y se desarrollan los microorganismos
(Rediers, et al., 2005). Para abordar experimentalmente estos casos, fueron ideados
varios métodos que permiten evaluar la expresión de genes “in vivo”. Entre estos
se incluyen: a-. la creación de fusiones transcripcionales de promotores conocidos
(o de bibliotecas genómicas) con un gen reportero del tipo gusA, lacZ o gfp (Cowie
et al., 2006). La utilización de este tipo de aproximaciones en conjunto con tec-
nologías de separación celular, condujo al desarrollo de la metodología de Induc-
ción de Fluorescencia Diferencial DFI (del inglés: Differential fluorescence
indution) (Valdivia y Falkow, 1997; Allaway et al., 2001); b-. la generación de bi-
bliotecas de mutantes con etiquetas moleculares (Singature Tagged Mutagenesis)
(Pobigaylo et al., 2006; Pobigaylo et al., 2008); c-. la metodología de huella digital
de ARN con cebadores arbitrarios (Cabanes et al., 2000); y d-. los métodos de
“trampa de promotores”, como la tecnología de expresión in vivo IVET (In Vivo
Expression Technology) y sus variantes RIVET.
El método IVET (Mahan et al., 1993) es esencialmente un sistema de
trampa de promotores que permite la identificación de genes bacterianos que se
expresaron in vivo en estudios de interacción con modelos animales o con plantas.
-301-
Para lograr este objetivo Mahan et al. (1993) diseñaron un sistema en el que a una
cepa mutante auxotrófica para el gen purA (requiere adenina para crecer) de Sal-
monella typhimurium se le introdujo por recombinación homóloga una colección
de plásmidos que provee fusiones de los genes purA (que revertirá la auxotrofía)
y lacZ (gen reportero) carentes de promotor, idealmente, a todas las unidades trans-
cripcionales de S. typhimurium. Dicha colección de recombinantes fue sometida
por un tiempo determinado a una condición de interés (e. g. infección de ratones),
recuperando luego del huésped las bacterias que fueron capaces de colonizarlo /
infectarlo utilizando placas con medio de cultivo suplementado con adenina. En
un ensayo como el anterior solo pueden sobrevivir in vivo (y luego recuperarse)
aquellos clones capaces de sintetizar adenina, que son los que presentaron una fu-
sión transcripcional del gen purA a una región genómica con actividad promotora,
ya sea constitutiva o inducida diferencialmente en el interior de los ratones. Fi-
nalmente, se evaluó la actividad β-galactosidasa de los clones sobrevivientes,
siendo los clones de interés aquellos que no mostraron actividad β-galactosidasa
in vitro (colonias blancas en placas suplementadas con X-Gal). A partir del sistema
IVET original se han desarrollado diferentes modificaciones, clasificables según
el sistema de selección que utilizan (Angelichio y Camilli, 2002; Rediers et al.,
2005). Entre las más usadas se encuentran las basadas en resistencia a antibióticos
(Camilli y Mekalanos, 1995) y en la complementación de mutantes auxótrofos
(Rediers et al., 2003; Silby y Levy, 2004; Zhang y Cheng, 2006).
Una variante adicional a la metodología IVET es la técnica basada en el
uso de recombinación específica de sitio, RIVET (Recombination Based In Vivo
Expression Technology) (Camilli et al., 1994). Esta se basa en la utilización del
mecanismo de recombinación específica de sitio del transposón-gd (TnpR/res)
para la generación de un sistema que permite la selección y posterior identificación
de genes inducidos en una condición in vivo de interés. Para ello se vale de la ca-
pacidad de la resolvasa TnpR de producir la pérdida de un cassette de selección,
si el mismo se encuentra flanqueado por secuencias res. Los sistema RIVET re-
quieren, en general, de dos módulos: a) un módulo que actúa de trampa de pro-
motores, y en el cual se deben generar fusiones transcripcionales al gen tnpR sin
promotor, y eventualmente también a lacZ (fusiones transcripcionales promotor-
tnpR-lacZ) y b) un sistema indicador constituido por un cassette de resistencia a
antibióticos (e. g. tetraciclina, Tc) flanqueado por dos sitios res (blancos de la re-
solvasa TnpR) que deben encontrarse en la misma orientación.
La utilización de este sistema para la búsqueda e identificación de genes
expresados en una condición de interés requiere la integración en el genoma del
microorganismo en estudio, tanto de la trampa de promotores, como del sistema
indicador. En una primera etapa se construye una cepa portadora del módulo in-
dicador, en la que luego se integra por recombinación homóloga una colección de
-302-
fusiones transcripcionales a tnpR-lacZ generada en un vector plasmídico. La co-

lección de bacterias así obtenida se utiliza a continuación para el desafío contra
una condición de interés. Si en la condición de estudio la resolvasa se expresa
bajo la dirección de un promotor determinado (fusión transcripcional promotor-
tnpR-lacZ), el cassette de resistencia a antibióticos se escinde y como consecuen-
cia la bacteria se vuelve sensible a dicho antibiótico, característica que permite su
ulterior selección.
Las metodologías “in vivo” en el estudio de las simbiosis rizobio-leguminosa
El primer trabajo en el que se utiliza la metodología IVET en rizobios fue

realizado por Oke y Long (1999). En este estudio se utilizó una cepa de S. meliloti
mutante en el gen bacA (incapaz de diferenciarse a bacteroide) que fue luego com-
plementada mediante una biblioteca genómica de fusiones transcripcionales a los
genes bacA-gus sin promotor. Con este sistema, Oke y Long (1999) identificaron
23 secuencias expresadas mayoritariamente “in planta” (nódulos Fix+, actividad
Gus+), de las cuales sólo 6 correspondieron a genes simbióticos previamente iden-
tificados. El método utilizado, sin embargo, no permitió la selección positiva di-
recta de los clones de interés, debiendo realizarse un segundo screening luego del
aislamiento de rizobios de nódulo para descartar aquellos clones que también ex-
presaban bacA-gus en el estadío de vida libre (promotores constitutivos). Más re-
cientemente se utilizó una aproximación similar con el objetivo de encontrar genes
expresados tempranamente en la simbiosis (Zhang y Cheng, 2006), en la que se
utilizó como estrategia la complementación in vivo de mutantes exoY, incapaces
de formar hilos de infección. Finalmente solo hay un reporte de la utilización de
metodologías de tipo RIVET para el estudio de simbiosis rizobio-leguminosa (Gao
y Teplitski, 2008) en el que se utiliza una adaptación del sistema RIVET desarro-
llado por Camilli et al. (1994) para caracterizar las condiciones en las que se in-
ducen una serie de promotores de importancia simbiótica que habían sido
identificados con herramientas diferentes en estudios previos.
Desarrollo, construcción y validación de nuevas herramientas RIVET para

el estudio de interacciones planta-microorganismo
Construcción de un nuevo cassette de selección positiva y de nuevos vectores
trampa de promotores para sistemas RIVET
Basados en el sistema desarrollado por Camilli et al. (1994), en nuestro labo-
ratorio hemos diseñado y construido un sistema RIVET orientado al estudio de inter-
acciones microorganismo-planta, y que permita la selección positiva de los clones
de interés, esto es poner directamente en evidencia los clones que han perdido el
marcador flanqueado por las secuencias res. Entre los marcadores de selección po-
-303-
sitiva se encuentra el gen sacB, codificante de la enzima levanosucrasa de Bacillus

subtilis. Esta enzima está involucrada en la síntesis intracelular del polisacárido le-
vano a partir de sacarosa, tóxico para bacterias Gram negativas y para algunas Gram
positivas (Gay et al., 1985). Cuando las bacterias portadoras del gen sacB se cultivan
en medios suplementados con sacarosa 5% la producción de levano resulta letal
para las células. No obstante, teniendo en cuenta que la sacarosa es la principal mo-
lécula implicada en el transporte de fuentes carbonadas en plantas y por esta razón
de amplia distribución en tejidos vegetales, el gen sacB no se presenta como una
buena opción para su uso como marcador de selección positiva en el estudio de la
interacción entre bacterias que colonizan/invaden tejidos vegetales.
Sobre la base de los comentarios precedentes, diseñamos un nuevo sistema
de selección positiva basado en ganancia/pérdida de resistencia a antibióticos. La
estrategia se presenta en la Figura 1 (Lozano et al., 2011).
Figura 1. Sistema de selección positiva basado en ganancia / pérdida de cassettes de resistencia

a antibióticos: RΩNGG.A. Estructura del sistema de selección positiva RΩNGG. ΩNm: cassette
de resistencia a Nm / Km (neomicina fosfotransferasa, nptII), proveniente del plásmido pHP45Ω-
Nm. Posee codones stop, en todos los marcos de lectura, y una secuencia de terminación de trans-
cripción. accC1: gen de resistencia a gentamicina (aminoglucósido acetiltransferasa), SIN promotor.
gfp: variante del gen de la proteína verde fluorescente (GFP) de A. victoria, SIN promotor. res:
sitios de reconocimiento de la resolvasa TnpR. p-nptII: promotor del gen nptII (neomicina fosfo-
transferasa). B. Estructura del sistema de selección positiva RΩNGG luego de la recombinación es-
pecífica de sitio mediada por TnpR.
El nuevo sistema presenta en el módulo de selección la siguiente estructura:
promotornptII -[ res –ΩNm – res ]- (aacCI-gfp)ambos sin promotor
Este módulo se halla bajo el control del promotor nptII que se expresa de
modo constitutivo y fuerte en varios rizobios y en diferentes bacterias Gram nega-
-304-
tivas. Al inicio del experimento RIVET la transcripción a partir de este promotor

está interrumpida por la presencia del cassette de resistencia a antibióticos
ΩNm/Km (Fellay et al., 1987) que contiene terminadores de traducción y trans-
cripción. La presencia de secuencias res en los extremos del cassette ΩNm/Km
permiten que el mismo sea escindido por acción de la resolvasa TnpR. Cuando el
cassette ΩNm/Km se pierde, el promotor nptII transcribe los genes aacC1 y gfp,
carentes de promotor, que confieren resistencia al aminoglucósido gentamicina
(Gm) y fluorescencia verde bajo luz azul, respectivamente (i. e. cambio fenotípico
NmR-GmS®NmS-GmR-GFP+). Para la utilización de este sistema de selección en
sistemas RIVET, es necesario introducirlo previamente en la cepa de estudio, en
nuestro caso S. meliloti 2011 (resistente a estreptomicina, Str). Para ello el cassette
de selección fue construido en el plásmido pSM10 (Selbitschka et al., 1995) de
modo que quedara flanqueado por las secuencias recA y alas (presentes en dicho
plásmido), útiles para la integración estable por doble recombinación homóloga en
el genoma del rizobio. El uso del mismo cassette en otras bacterias requerirá su in-
tegración de modo estable en algún lugar del genoma (usualmente en un sitio “neu-
tro” que no genere cambios fenotípicos por la mera presencia del cassette).
Adicionalmente hemos construido tres herramientas diferentes en las que una
fusión transcripcional tnpR-lacZ forma parte de un vector de amplio rango de hués-
pedes (pRIVET-R), de un vector suicida (pRIVET-I) (Lozano et al., 2011), o de un
mini-transposón Tn5 (pMES1, pMES2, pMES3) (Lozano et al., 2013) (Figura 2).
Figura 2. Vectores para la construcción de colecciones de fusiones trasncripcionales promotor-

tnpR-lacZ. A. pRIVET-I. Módulo de trampa de promotores basado en un vector suicida. B. pRIVET-
R. Módulo de trampa de promotores basado en un plásmido de amplio rango de huéspedes. C.
Diferentes variantes del módulo de trampa de promotores transposicional. Elementos relevantes: TcR:
Gen de resistencia a tetraciclina. tnpR: resolvasa del transposón-gd sin promotor. lacZ: gen reportero
sin promotor, β-galactosidasa. OriR6K: origen de replicación del plásmido R6K. tetA-tetR: genes de
resistencia a tetraciclina. oriV: origen de replicación del plásmido RK2 de amplio rango de huéspedes.
parABCDE: genes de estabilidad plasmídica del plásmido RK2. neo: gen de resistencia a neomicina
/ kanamicina. ME-O, ME-I, secuencias necesarias para la transposición (Reproducido de J. Microbiol.
Meth. Lozano et al., 93:9-11, 2013 con permiso de la editorial, con modificaciones).
-305-
En el caso del plásmido pRIVET-I, el gen tnpR (codificante para la resolvasa) sin
promotor se encuentra situado inmediatamente río abajo de un sitio BglII único
en el vector. Dicho sitio se utiliza para la generación de bibliotecas de fragmentos
de ADN (usualmente obtenidos por digestión parcial SauIIIA de ADN genómico)
de modo que la misma represente de la mejor manera posible todas las regiones
promotoras de la bacteria cuyo estudio quiere abordarse. En este caso, luego de la
integración del vector por recombinación homóloga en el genoma de la bacteria
que se desea estudiar (y de la que se preparará la biblioteca), la resolvasa quedará
bajo el control transcripcional de la región genómica en la que se ha integrado el
vector, aun en el caso de insertos chicos. La identificación de los genes inducidos
in vivo requerirá finalmente la recuperación del vector con las secuencias genó-
micas asociadas a la región río arriba de la resolvasa, mediante clonados genómi-
cos al final del estudio RIVET. Una alternativa a los sistemas de tipo integrativo,
en nuestro caso pRIVET-R, implica la utilización de vectores trampa de promo-
tores basados en plásmidos con la capacidad de replicar en la bacteria que se desea
estudiar (vectores de amplio rango de huéspedes). La ventaja principal de estos
sistemas es la fácil recuperación de los plásmidos de interés al final del estudio
RIVET (por simple “miniprep”). Sin embargo el uso de vectores replicativos re-
quiere bibliotecas con mayores coberturas que las bibliotecas integrativas, atento
a que no todos los insertos incluirán promotores. En las bibliotecas integrativas
todos los insertos orientados de manera adecuada servirán para detectar activida-
des promotoras. Finalmente hemos construido una serie de mini-transposones para
la generación de fusiones transcripcionales a tnpR por transposición, evitándose
de esta manera, la necesidad de construir bibliotecas genómicas, lo que simplifi-
cará la implementación de estudios RIVET. Estos vectores derivados del vector
pBAM (Martinez-Garcia et al., 2011) poseen bajas tasas de cointegración (inte-
gración del vector entero) y una alta frecuencia de transposición en diferentes es-
pecies bacterianas (Lozano et al., 2013).
Validación funcional en un sistema modelo: Búsqueda de genes inducidos du-

rante la interacción entre S. meliloti y M. sativa.
El sistema RIVET integrativo fue validado mediante la evaluación de la
respuesta de la fusión transcripcional de la región promotora de ungen rizobiano
de inducción simbiótica tardía, nifH, a tnpR. El promotor del gen nifH (Fischer,
1994; Cabanes et al., 2000) controla la expresión de una de las subunidades de la
enzima nitrogenasa, y se induce específicamente en los nódulos radiculares fija-
dores de nitrógeno. La región promotora del gen nifH fue clonada en el vector
pRIVET-I e integrada por recombinación homóloga en el genoma de las cepas S.
meliloti 2011RWNGG y 2011R1WNGG (Str, Nm) portadoras ambas de un cas-
-306-
sette de selección positiva (el cassette R1WNGG, en la segunda cepa, posee en

reemplazo de los sitios res, sitios res1 que resultan en una menor eficiencia de es-
cisión. Véase en la Figura 1 la estructura del cassette RWNGG). Se pudo observar
que mientras estas cepas se cultivaban in vitro las mismas presentaban porcentajes
de escisión siempre menor que 1% (determinado como número de clones GmR /
número de clones StrR x 100), en consistencia con bajos niveles de inducción de
tnpR fusionada al promotor nifH.
Una vez verificado que el promotor nifH mostraba muy bajos niveles de
expresión de tnpR en condiciones de medio de cultivo, se procedió a realizar un
ensayo in vivo en plantas para verificar el correcto funcionamiento del sistema.
Para ello se inocularon plantas de alfalfa con las cepas S. meliloti 2011R1WNGG
(control) y S. meliloti 2011R1WNGG-NifH, portadora de la fusión transcripcional
nifH-tnpR. Todas las plantas fueron crecidas durante 25 días en cámara de plantas,
tras los cuales se recolectaron nódulos y se procesaron para el aislamiento de ri-
zobios. Las suspensiones bacterianas obtenidas se plaqueron en cajas con medio
TY suplementado con Str y Str-Gm. Adicionalmente, a diferentes tiempos post-
inoculación (1, 2 y 3 semanas) se observaron los nódulos bajo luz azul para evi-
denciar clones escindidos por aparición de fluorescencia verde. Solo ocurrió
escisión del cassette de selección positiva en las cepas portadoras de la fusión
nifH-tnpR. Así mismo, se observó que a partir de la segunda semana post-inocu-
lación los nódulos de plantas inoculadas con la cepa S. meliloti 2011R1WNGG-
NifH presentaban niveles crecientes de fluorescencia, con los mayores valores
hacia la tercer semana post-inoculación.
Construcción de una biblioteca genómica en el vector pRIVET-I

Como se discutió precedentemente, los tres sistemas trampa de promotores
RIVET (plásmidos replicativos, plásmidos integrativos, y de transposición) poseen
características propias que definen la conveniencia del uso de una u otra variante.
Según hemos visto deberán contemplarse especialmente: el trabajo requerido para
generar la biblioteca de fusiones a tnpR en la bacteria de interés, y el grado de
complejidad experimental requerido para recuperar, al final del ensayo, aquellas
fusiones que sean de interés por su respuesta diferencial a la condición de desafío.
En una primera aproximación al uso de la herramienta RIVET decidimos construir
una biblioteca utilizando el sistema integrativo del vector pRIVET-I. El uso de
este sistema tiene en principio las ventajas de: a) no generar efectos indeseados
de dosis génica dado que generan sólo una fusión tnpR por célula bacteriana (el
uso de vectores replicativos puede generar niveles de TnpR altos, y escisiones no
deseadas del cassette de selección, derivados del número de copias del vector y
no de la propia inducción de tnpR) , y b) la representación de todos los promotores
-307-
estará garantizada en tanto se generen fusiones de tnpR a todos los genes, o al

menos, a un gen por unidad transcripcional (operón). Esta última consideración
reduce el número de clones necesarios para tener una biblioteca de buena calidad
comparada con las bibliotecas en plásmidos replicativos.
Para calcular el número de clones necesario para construir una biblioteca
genómica para el sistema integrativo deben tenerse en cuenta algunas considera-
ciones particulares que se discuten a continuación. En primer lugar, para que un
operón cualquiera esté representado en una biblioteca RIVET será suficiente con
que exista al menos un clon que contenga una fracción de secuencia de dicho ope-
rón. Tal razonamiento extendido a la totalidad del genoma deriva en que el número
de clones necesarios para cubrir todas las unidades transcripcionales existentes
será dependiente del número total de operones y no del número total de genes.
Resulta claro, por tanto, que la estimación clásica del número de clones necesario
para cubrir la totalidad de la secuencia genómica con una cierta probabilidad será
por exceso una buena estimación del número de clones necesarios para construir
la biblioteca RIVET (dicho calculo considerará el número de clones necesarios
para representar con la probabilidad fijada las secuencias completas de todos los
genes del genoma, y no sólo de un gen por operón como lo exige el requisito mí-
nimo de una biblioteca RIVET). En este marco de análisis, para calcular el número
de clones requeridos para que una secuencia de ADN cualquiera esté presente en
una biblioteca genómica con una dada probabilidad, utilizamos para un primer
cálculo la siguiente ecuación (Sambrook et al., 1989):
Donde como hemos dicho N es el número de clones requeridos, α es la pro-
babilidad de que cualquier secuencia genómica esté presente en la biblioteca al
menos un vez, y f es la proporción del genoma en cada fragmento de ADN clo-
nado, siendo F el tamaño promedio de los fragmentos clonados y G el tamaño del
genoma.
Para un valor de N determinado, se puede calcular la cobertura, es decir, la
cantidad de veces que está representado el tamaño del genoma en la biblioteca,
como:
Esto implica que para una cobertura C, cada fragmento F estará presente,
en promedio, C veces. Siendo el tamaño promedio de una unidad transcripcional
(con T, el número de unidades transcripcionales) se puede considerar que cada
operón estará representado clones en la biblioteca RIVET.
Inicialmente se obtuvo una biblioteca de fragmentos de aproximadamente
1 kb que contó con 9940 clones independientes. Teniendo en cuenta que el número
de marcos de lectura abierta (ORFs) de la cepa de S. meliloti 1021 (cepa secuen-
ciada) es de 6.317 (Humann et al., 2008) y que estos se encuentran organizados
en 1.274 operones (Pertea et al., 2009), se puede estimar que para nuestra biblio-
-308-
teca cada operón estará representado por al menos 7 clones (C=1.49, O= 5.25 Kb,
F=1 kb) de los cuales la mitad deberían estar (estadísticamente) en la orientación
correcta.
Esta biblioteca fue transferida a la cepa S. meliloti 2011R1WNGG por con-
jugación y se colectaron más de 50.000 transconjugantes. La colección presentaba
en ausencia de condiciones inductoras niveles moderadamente elevados de esci-
sión (cercanos al 5%). Trabajos previos (Osorio et al., 2005) sugerían que este
valor fuera inferior al 1%, por lo que se procedió a una depuración de la biblioteca
obtenida por análisis de clones individuales y eliminación de clones con alta fre-
cuencia de escisión en medio de cultivo hasta alcanzar valores de escisión <1%.
El procesamiento de 25.536 clones escogidos al azar, permitió seleccionar para
su mezcla y preservación posterior 6.485 clones de baja frecuencia de escisión.
Evaluación del comportamiento del sistema RIVET integrativo durante la ca-

racterización de la respuesta de S. meliloti a una condición de estrés en vida
libre. Estrés salino como estudio de caso
Se considera una condición de estrés, a toda situación que no es óptima para
el desarrollo y que modifica de algún modo el comportamiento del organismo en
consideración, sin ser necesaria una reducción en la velocidad de crecimiento, y
que se vincula generalmente a cambios en la expresión de genes (Storz y Hengge-
Aronis, 2002). En el caso de las interacciones simbióticas, tanto los rizobios como
la planta se ven frecuentemente afectados por condiciones de estrés que resultan
no sólo en la limitación de la simbiosis sino de la propia supervivencia de los par-
ticipantes.
La salinidad en particular es un factor ambiental importante que limita la
producción agropecuaria, estando potencialmente afectados cerca de 40% de los
suelos cultivados. Respecto de los rizobios, las observaciones disponibles indican
que la salinidad afecta de modo severo a la simbiosis con leguminosas. En parti-
cular, las altas concentraciones salinas afectan las etapas tempranas (colonización
radicular, infección y desarrollo nodular) de la simbiosis, y también la fijación
biológica de nitrógeno (Zahran, 1999). En el caso de los rizobios en general, y de
S. meliloti en particular, el estrés salino ha sido extensivamente caracterizado con
aproximaciones clásicas y más recientemente con herramientas ómicas (Rüberg
et al., 2003; Dominguez-Ferreras et al., 2006; Shamseldin et al., 2006). Estos es-
tudios han revelado genes que muestran niveles diferenciales de expresión cata-
logados en diferentes grupos funcionales, principalmente relacionados a
movilidad, quimiotaxis, estructura superficial, biosíntesis de aminoácidos, capta-
ción de hierro, transporte de pequeñas moléculas, así como gran cantidad de genes
con función desconocida. Domínguez-Ferreras et al. (2006) reportan que aproxi-
-309-
madamente 1000 genes se encuentran expresados diferencialmente, siendo 539

los inducidos. Es interesante notar que cerca de 65% corresponde a genes hipoté-
ticos o de función desconocida. El resto de los genes inducidos está anotado con
funciones en procesos celulares, metabolismo central y de pequeñas moléculas,
reguladores no clasificados, o elementos estructurales.
Con el objetivo de evaluar la respuesta del sistema frente a una condición
de estrés previamente descripta, la biblioteca RIVET construida fue crecida 24
horas bajo condiciones de estrés salino (0,38 M NaCl) y a continuación se calculó
el porcentaje de escisión como la proporción de clones GmR. Los valores de esci-
sión de estos cultivos fueron de: 0.91 ± 0.22% para el cultivo en condiciones de
estrés (Caldo TY suplementado con 0,38 M NaCl), y de 0.21 ± 0.05% para el cul-
tivo en condición control (Caldo TY). Lo que significa un aumento en 4 veces del
número de clones que presentaron escisión, y por lo tanto, que aproximadamente
el 75% de los clones GmR recuperados de la condición de estrés son portadores
de una fusión transcripcional a tnpR que es inducida diferencialmente en esas con-
diciones. Para caracterizar las fusiones transcripcionales que presentaron induc-
ción por estrés salino, se recuperó el vector pRIVET-I, y se secuenció la región
fusionada a tnpR de 15 clones, de los cuales 3 presentaron fusiones al gen
Smc04182 (redundancia). Este hecho, indica que la inducción de la expresión de
tnpR por Smc04182, es probablemente inducida específicamente por el estrés sa-
lino. Para confirmar este resultado, se regeneró la fusión transcripcional
Smc04182-tnpR en la cepa S. meliloti 2011R1WNGG portadora del cassette indi-
cador. Esta cepa fue crecida en medio control y en medio suplementado con NaCl
0,38 M, y luego de 24 horas se determinó el porcentaje de escisión. Como era es-
perable, el nivel de escisión aumentó aproximadamente al doble en la condición
de estrés con respecto al control (i.e. 13.5 ± 1.8% vs. 6.1 ± 1.1%, respectivamente).
Conclusiones
Hemos diseñado, construido y validado un nuevo sistema RIVET que puede

ser aplicado a la identificación de genes de rizobios y otras bacterias inducidos a
nivel transcripcional ya sea en condiciones específicas de la vida libre, o durante
la interacción simbiótica con la planta huésped. Los sistemas de expresión in vivo
del tipo RIVET han demostrado en diversas ocasiones ser útiles para la caracteri-
zación de genes inducidos durante interacciones planta-microorganismo contando
entre sus principales ventajas: a) la posibilidad de ser utilizados para analizar genes
inducidos en nichos complejos difíciles de abordar con otras metodologías (ej.
dentro del hospedador), y b) la posibilidad del sistema de detectar genes que se
expresan durante breves intervalos de tiempo (expresión transiente). Ambas ca-
-310-
racterísticas han posicionado a la herramienta RIVET como una metodología muy

valiosa para el estudio de genes inducidos dentro del hospedador difíciles de ana-
lizar con otras aproximaciones experimentales como las transcriptómicas y pro-
teómicas (Camilli et al., 1994; Osorio et al., 2005; Rediers et al., 2005).
El sistema que hemos desarrollado provee una herramienta muy potente
para la búsqueda sistemática de genes expresados por bacterias in planta. En par-
ticular para el estudio de aquellos estadios que transcurren dentro del huésped, en
los que la cantidad de bacterias es escasa. El hecho de que la escisión específica
de una única bacteria (in vivo, en su nicho natural) resulte en una descendencia
detectable GmR, hace del sistema RIVET que hemos desarrollado una herramienta
potencialmente muy útil para rescatar clones bacterianos que han expresado genes
de interés en el curso de la interacción. El sitio de la expresión podrá ser caracte-
rizado a posteriori por técnicas complementarias (eg. Microscopía clásica / con-
focal, otras). El uso del sistema RIVET que hemos desarrollado (dirigido a
bacterias gran negativas que interactúan con plantas) podrá ser eventualmente ex-
tendido al análisis de interacciones patogénicas, y especialmente a asociaciones
endofíticas donde por falta de herramientas adecuadas existe poca información
molecular respecto del conjunto de genes requeridos por dichas bacterias para la
colonización radicular inicial, y para su migración y establecimiento posterior en
otros tejidos de la planta.
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Efectos del nitrato sobre la simbiosis
Bradyrhizobium japonicum – soja
Effects of nitrate on symbiosis soybean - Bradyrhizobium japonicum
Thuar, Alicia M a* ,Carla V. Bruno a ,Stella M. Castro b
Resumen
Las bacterias capaces de fijar nitrógeno en simbiosis con leguminosas in-

crementan el rendimiento de los cultivos. Entre las bacterias, Bradyrhizobium ja-
ponicum es capaz de fijar y desnitrificar en simbiosis siendo esto de gran interés
ya que las cepas caracterizadas por una elevada actividad nitrato reductasa son
menos susceptibles a la inhibición por nitrato. Por lo tanto, la fijación de nitrógeno
y la desnitrificación, dos procesos que son antagonistas en el ciclo del nitrógeno,
pueden actuar en forma complementaria permitiendo la sobrevivencia de la bac-
teria en el interior de los nódulos. El objetivo de este trabajo fue estimar el efecto
del nitrato sobre el crecimiento y la fijación de nitrógeno en plantas de soja ino-
culadas con las cepas de Bradyrhizobium japonicum USDA110, USDA110/CC41
(mutante defectiva en la enzima nitrato reductasa) y Per3.64 (aislamiento nativo
obtenido de suelos de Pergamino). Para ello, las semillas de soja pregerminadas
se sometieron a cuatro tratamientos: a) control, b) fertilizadas con nitrato 5 mM,
c) inoculadas con las cepas de bradirizobios, d) inoculadas y fertilizadas Las plan-
tas se cosecharon en estado fenológico R2 (plena floración), los ensayos se reali-
zaron en condiciones de invernáculo. Los resultados obtenidos indicaron que la
fertilización con nitrato no afectó el crecimiento, cuantificado por la biomasa aérea
de las plantas de soja inoculadas con las cepas de Bradyrhizobium japonicum, sin
embargo, tuvo un impacto negativo en la nodulación. Por otra parte, el comporta-
miento de la capacidad desnitrificante de Bradyrhizobium japonicum USDA110
no resultó suficiente para mejorar la fijación biológica del nitrógeno en presencia
del nitrato. La cepa nativa Per3.64 mostró una alta efectividad simbiótica relacio-
nada con el contenido de nitrógeno de las plantas en presencia de nitrato. En con-
clusión, las cepas de Bradyrhizobium japonicum presentan un comportamiento
diferencial como inoculante de soja en presencia de nitrato.
Palabras clave: Bradyrhizobium japonicum; soja; nitrato.

a
Departamento de Biología Agrícola. Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC) 5800 Río Cuarto.
Córdoba. Argentina.*athuar@ayv.unrc.edu.ar
b
Departamento de Biología. Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC) 5800 Río Cuarto. Córdoba.
Argentina.
-317-
Introducción
Las leguminosas representan un conjunto de cultivos agrícolas de gran re-

levancia, ya que su alto contenido en proteína es de crucial importancia para la
alimentación humana y animal. Además, su capacidad para establecer relaciones
simbióticas con bacterias del suelo les permite satisfacer sus necesidades nitroge-
nadas mediante la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en los nódulos y, por
tanto, evita el uso de fertilizantes nitrogenados, contribuyendo a mejorar la ferti-
lidad del suelo y la calidad de las tierras agrícola, así como a recuperar zonas ero-
sionadas y suelos empobrecidos, lo que las hace esenciales para la agricultura y
la sostenibilidad del medio ambiente (Bedmar Gómez et al., 2011).
La interacción simbiótica establecida entre las leguminosas se realiza con
los microorganismos comúnmente conocidos con el nombre de rizobios, repre-
sentando uno de los sistemas de fijación de nitrógeno más eficiente. Además, este
tipo de interacción es altamente benéfica para ambos miembros del par simbiótico
ya que la bacteria fija N2 y cede gran parte de éste a la planta permitiendo su cre-
cimiento. La planta, por su parte, fija carbono por medio de la fotosíntesis y aporta
gran cantidad de compuestos carbonados a la bacteria. Este tipo de simbiosis no
sólo favorece significativamente al ciclo global del nitrógeno sino que además
permite mantener la fertilidad de los suelos incrementando la productividad de
las plantas. La FBN es llevada a cabo por un escaso grupo de microorganismos
procariotas llamados
diazótrofos cuya característica principal es la de poseer el complejo nitro-
genasa, encargado de transformar el nitrógeno atmosférico en amonio (Figura 1).
Figura 1. Ciclo biogeoquímico del nitrógeno en la naturaleza.

-318-
Efectos del nitrato sobre la simbiosis Bradyrhizobium japonicum – soja
Complejo nitrogenasa
Una vez diferenciados los rizobios en bacteroides comienza la transforma-
ción del nitrógeno atmosférico a amonio, proceso llevado a cabo por el complejo
nitrogenasa. Este complejo es altamente sensible al oxígeno y consta de dos su-
bunidades, una ferroproteína (Fe-proteína) o di-nitrogenasa reductasa, y una fe-
rromolibdenoproteína (FeMo-proteína) o dinitrogenasa (Olivares et al., 2006). La
reacción estequiométrica de la reducción de N2, en condiciones óptimas, es la si-
guiente:
El donador de electrones de la nitrogenasa es la ferredoxina, una proteína
de potencial redox muy negativo. En la conversión del N2 a NH4+, la ruptura del
triple enlace (N≡N) de la molécula de nitrógeno posee una elevada demanda de
energía. Es por ello que la reacción está acompañada de la hidrólisis de 16 molé-
culas de ATP por cada molécula de N2 que se reduce.
Los bacteroides dependen totalmente de la planta para obtener la energía
necesaria para la fijación de N2. Los principales compuestos orgánicos transpor-
tados al interior de los bacteroides son los intermediarios del ciclo del ácido cítrico,
en particular los ácidos de cuatro carbonos succinato, malato y fumarato. Estos
ácidos son utilizados como donadores de electrones para la producción de ATP y,
después de su conversión a piruvato, como última fuente de electrones para la re-
ducción del N2.
El primer producto estable que se obtiene de la FBN es el amoníaco (NH3+),
el cual es transportado desde el bacteroide a la célula vegetal y es asimilado por
la planta en forma del aminoácido glutamina (Gln) y glutamato (Glu), a través de
la enzima glutamina sintetasa y glutamato sintasa. Una vez asimilado el nitrógeno
en Gln y Glu se incorpora a otros aminoácidos por reacciones de transaminación
a través de aminotransferasas, como por ej: aspartato aminotransferasa (AAT),
que transfiere el grupo amino del Glu al aspartato (Asp). La transferencia del grupo
amino de la Gln al Asp forma asparagina (Asn) por la acción de la asparagina sin-
tetasa (AS). La asparagina junto con la glutamina son productos de exportaciones
en los nódulos indeterminados de las leguminosas de climas templados, las cuales
son llamadas, exportadoras de amidas. Los ureídos (alantoína y ácido alantoico)
son transportados en el xilema desde los nódulos determinados de las leguminosas
tropicales, las cuales son llamadas, exportadores de ureídos (Gonzalez et al.,
2006).
Durante el establecimiento de la asociación simbiótica, la planta expresa
proteínas específicas llamadas nodulinas. Entre ellas, la leghemoglobina la cual
tiene como función aportar y controlar los niveles de O2 en los bacteroides. Esta
proteína se localiza en el citosol de las células de la planta infectada por bacteroi-
des y es la que da el típico color rosado de los nódulos funcionales.
-319-
Desnitrificación
La desnitrificación es una forma alternativa de respiración por la que, en
condiciones limitantes de oxígeno, el nitrato, y sus óxidos de nitrógeno deriva-
dos, actúan como aceptores finales de electrones en una cadena de transporte
hasta la formación de dinitrógeno molecular, de acuerdo con la reacción:
La reducción de los óxidos de nitrógeno está acoplada a la formación de
ATP, lo que permite el crecimiento en ausencia de oxígeno.
La desnitrificación es un proceso clave en el ciclo biogeoquímico del ni-
trógeno (N) en la naturaleza, ya que es el mecanismo por el cual se devuelve a la
atmósfera el N2 que se reduce durante la fijación biológica del mismo. Este pro-
ceso es la principal reacción para eliminar el exceso de nitratos que contaminan
los ecosistemas terrestres y acuáticos.
El óxido nítrico (NO) y el óxido nitroso (N2O), productos intermediarios
de la desnitrificación, tienen un enorme impacto sobre la contaminación atmosfé-
rica ya que son potentes gases invernadero que se liberan a la atmósfera e inter-
vienen en la formación de la lluvia ácida, en el calentamiento global de la
atmósfera, y en la destrucción de la capa de ozono. El NO es, por otra parte, una
importante molécula señal que desempeña diferentes funciones en los sistemas
biológicos, tanto eucariotas como procariotas (Robles et al., 2007).
La capacidad de desnitrificar está muy extendida entre los procariotas y se
encuentra en bacterias que pertenecen taxonómicamente a varias subclases de las
Proteobacterias y de las Arqueobacterias. Aunque la desnitrificación es propia de
las bacterias anaerobias facultativas, y se considera que solo ocurre en ausencia
de oxígeno, se han descripto algunas especies del género Paracoccus capaces de
desnitrificar en condiciones aeróbicas (Delgado et al., 2006). También se ha de-
mostrado la existencia de genes implicados en la desnitrificación en bacterias ni-
trificantes . Algunos hongos del género Fusarium también tienen la capacidad de
desnitrificar (Robles et al., 2007).
La desnitrificación se lleva a cabo de forma secuencial por la actuación con-
secutiva de las enzimas nitrato reductasa (Nap/Nar), nitrito reductasa (Cu-Nir/cd1-
Nir), óxido nítrico reductasa (qNor/cNor) y óxido nitroso reductasa (Nos),
codificadas por los genes nap/nar, niK/nirS, c-nor/q-nor y nos respectivamente.
Aunque la reducción de nitrato inicia la desnitrificación, se considera que la re-
ducción de nitrito a NO es, en sentido estricto, la reacción clave que define el pro-
ceso ya que la reducción de nitrato también puede ocurrir en microorganismos no
desnitrificantes. En general, se considera que un microorganismo es desnitrificante
si es capaz de crecer microaeróbicamente con nitrato/nitrito como única fuente de
energía. No obstante, hay bacterias que, en ausencia de oxígeno, son capaces de
utilizar exclusivamente el nitrato/nitrito, a la vez, como fuente de energía y como
fuente de N para los procesos biosintéticos celulares.
-320-
Capacidad desnitrificante de las cepas de Bradyrhizobium japonicum

En 1975 se pudo detectar actividad NR tanto en el citosol como en las mem-
branas de Bradyrhizobium japonicum. Sin embargo, la capacidad de desnitrificar
no está muy extendida entre los rizobios, ya que sólo B. japonicum y Azorhizobium
caulinodans son capaces de crecer cuando se cultivan en condiciones limitantes
de oxígeno y en presencia de nitrato como aceptor final de electrones. Se ha su-
gerido que la capacidad de desnitrificar pudiera constituir una ventaja competitiva
para la permanencia y distribución en el suelo y para la capacidad de colonización
de aquellas bacterias que la poseen. Entre los rizobios, se han caracterizado genes
que codifican enzimas de la desnitrificación en R. sullae (antes R. hedysari), R.
etli, S. meliloti, y B. japonicum. Sin embargo, B. japonicum es el único donde,
hasta la fecha, se han aislado y caracterizado los genes de la desnitrificación na-
pEDABC, nirK, norCBQD Y nosRZDFYLX, implicados en la síntesis de las enzi-
mas nitrato reductasa periplásmica (Nap), nitrito reductasa (Nir), óxido nítrico
reductasa (Nor) y óxido nitrosoreductasa (Nos), respectivamente. Se ha demos-
trado que la expresión de los genes de la desnitrificación en bacteroides de B. ja-
ponicum está determinada por la propia microaerobiosis del nódulo (Sánchez et
al., 2011).
Estudios realizados en suelos de la región sojera de Pergamino (Buenos
Aires) y Manfredi (Córdoba) indicaron que de los 250 aislamientos de Bradyrhi-
zobium sólo 41 mostraron un comportamiento típico de desnitrificación. La pro-
ducción óxido nitroso y los genes de desnitrificación fueron analizados en 10 cepas
mostrando diferentes grados de pérdida de la eficiencia de nitrógeno. Así, se en-
contró que las cepas que desnitrifican pertenecen a los suelos de Pergamino y las
características genotípicas sugirieron que eran Bradyhrizobium japonicum. En
contraste, dos cepas del suelo de Manfredi eran no-desnitrificantes y la caracteri-
zación genotípica reveló que podrían ser aparentemente, Bradyhrizobium elkani
(Fernández et al., 2008).
Efecto del nitrato en la interacción Bradyrhizobium japonicum-soja
Es conocido que para una exitosa asociación simbiótica rizobio-soja se re-

quiere que no haya condicionantes por exceso o por defecto para el desarrollo nor-
mal del cultivo. Así, uno de los factores que limitan la FBN en soja es la presencia
de formas combinadas de N en el suelo. Los suelos fértiles con moderada o alta
disponibilidad de formas inorgánicas de N en el momento de la siembra y/o im-
portantes tasas de mineralización durante el ciclo del cultivo afectan al estableci-
miento de la simbiosis, ya que retardan el inicio de la inoculación y/o inhiben el
funcionamiento del sistema fijador.
-321-
Estudios realizados sobre el efecto del nitrato en leguminosas demostraron

que el NO3-, inhibe estadíos tempranos de la nodulación como: la deformación
de los pelos radiculares, el anclaje de los rizobios a los mismos o el desarrollo de
los cordones de infección. La presencia NO3- también retrasa la formación de los
nódulos y disminuye la masa nodular (Dazzo y Brill 1978, Ralston y Ismande
1983; Ligero, et al. 1991).
Las asociaciones simbióticas en la cual la función de la nitrato reductasa es
complementaria con la función de la nitrogenasa depende de los bacteroides ca-
paces de reducir el nitrato por la vía desnitrificante. Es decir que además de fijar
N2, algunas especies de rizobios, entre ellas Bradyrhizobium japonicum USDA
110, son también capaces de desnitrificar en simbiosis, siendo ésto de gran interés
ya que las cepas de rizobios caracterizadas por una elevada actividad nitrato re-
ductasa son menos susceptibles a la inhibición por nitrato (Chamber-Pérez et al.,
1997). Los compuestos, que pueden producirse como intermediarios de la reduc-
ción de nitrato en los bacteroides, o por la planta como productos de la nitrato re-
ductasa o la oxido nítrico sintasa, pueden dañar a la nitrogenasa o unirse a la
leghemoglobina y formar complejos nitrosil-leghemoglobina afectando de esta
manera a la fijación de nitrógeno (Meakin et al., 2007). Además el oxido nitroso
es un inhibidor competitivo de la nitrogenasa, ya que es sustrato de la misma, que
puede reducirlo a N2. Así, el rol de la desnitrificación podría ser dual ya que po-
dría remover los compuestos tóxicos o bien suministrar ATP a la nitrogenasa (Gar-
cía-Plazaola et al., 1993). Por lo tanto, la fijación de nitrógeno y la desnitrificación,
dos procesos que son antagonistas en el ciclo del nitrógeno, pueden actuar en
forma complementaria y permitiría la sobrevivencia de la bacteria en el interior
de los nódulos de las raíces (Lucinski, et al. 2002).
Uno de los objetivos que persigue la agricultura sustentable es el manejo
eficiente del N en el medio ambiente. El uso exitoso del N en sistemas agrope-
cuarios a través de la FBN resulta en prácticas económicamente viables para el
medio ambiente. Sobre la base de estos antecedentes, la FBN en el cultivo de soja
resulta ser una herramienta muy útil para mantener una agricultura sustentable
pero se encuentra limitado por diferentes condiciones, entre ellas el exceso de ni-
trato en el suelo. El objetivo es estimar el efecto del nitrato sobre el crecimiento
y la fijación de nitrógeno en plantas de soja inoculadas con las cepas Bradyrhi-
zobium japonicum USDA110, USDA110/CC41 (mutante defectiva en la enzima
nitrato reductasa) y Per3.64 (aislamiento nativo obtenido de suelos de Pergamino).
-322-
Evaluaciones realizadas
Las cepas de Bradyrhizobium japonicum que se usaron en este estudio fue-

ron USDA 110 (cepa de referencia), USDA 110/CC41, mutante defectiva en la
enzima nitrato reductasa, cedida por el Dr. Manuel Chamber-Pérez, CIFA, Sevi-
lla-España y Per 3.64, aislamiento nativo de suelos de Pergamino, cedida por la
Dra. Leticia Fernández, UNS-Bahía Blanca.
Se utilizó el medio YEM (Vincent, 1970) para la preparación de los inocu-
lantes. El crecimiento de los microorganismos se realizó a 28ºC en un agitador a
140 rpm hasta alcanzar la fase exponencial a una absorbancia de 1 correspondiente
a 1 x 108 ufc/ml.
Para el crecimiento de la mutante defectiva en la enzima nitrato reductasa
(Bradyrhizobium japonicum USDA 110/CC41) se adicionó al medio YEM los an-
tibióticos Estreptomicina (250 ppm) y Kanamicina (100 ppm), ésta última resis-
tencia se la confiere el transposón Tn-5 que tiene insertado en su cromosoma. El
crecimiento bacteriano a 28 °C se determinó por medición de la absorbancia a
620 nm.
Se utilizó semillas de soja (Glycine max L. Merril) variedad Don Mario
4210 RR (Grupo IVC). Las semillas de soja desinfectadas y pregerminadas se
transfirieron a macetas estériles con arena volcánica estéril, que no constituye nin-
gún aporte al vegetal ni a los microorganismos y se realizaron los siguientes tra-
tamientos: i. Control: sin inocular y sin adición de nitrato de potasio, ii. Inoculada:
con las diferentes cepas de bradyrizobios (1x 108 ufc/ml), iii. Fertilizada: sin ino-
cular y con la adición de 5 mM KNO3. Esta concentración de KNO3 es la reco-
mendada como control de N en los ensayos de efectividad simbiótica (Vincent,
1970), iv. Inoculada y fertilizada: inoculada y con la adición de 5 mM KNO3.
Las macetas se llevaron a invernáculo con fotoperíodo de 16/8 h (luz/oscu-
ridad), 200 µmol/m2/s de intensidad de luz, a una temperatura constante de 28 ºC
y 50 % de humedad relativa. El tratamiento de inoculación se realizó a la semana
de la siembra colocando 5 ml del inoculante en la corona de la raíz de la planta.
Las plantas de los diferentes tratamientos se regaron con agua estéril y cada 15
días las plantas controles e inoculadas se regaron con medio Hoagland estéril y
las plantas fertilizadas con la solución estéril de 5 mM KNO3.Las plantas se co-
secharon en la etapa fenológica R2 para determinar los siguientes parámetros: i.
Fisiológicos: Peso seco de raíz ((PSR), y de parte aérea (PSA) y Contenido de
nitrógeno; y simbióticos: Número y peso seco de nódulos (PSN); Peso normali-
zado de nódulos (PNN) y Actividad de la enzima nitrogenasa.
Con los datos del contenido de nitrógeno se estimó el N2 fijado y la efec-
tividad simbiótica, según ICARDA (1990). El contenido de nitrato se determinó
-323-
según el método del ácido salicílico descripto por Cataldo et al., 1975. En el
análisis estadístico se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de
Duncan para las comparaciones múltiples de las medias con un nivel de signifi-
cancia de 5 %. Se realizaron correlaciones de Pearson de las variables apropia-
das. Los tratamientos se asignarán a un diseño experimental completamente
aleatorizado con 10 réplicas por tratamiento.
Parámetros fisiológicos y simbióticos
Con el fin de estimar el crecimiento y la fijación biológica del nitrógeno en

plantas de soja en respuesta a la inoculación y agregado de nitrato se evaluaron
parámetros fisiológicos y simbióticos en plantas expuestas a los diferentes trata-
mientos.
En la tabla 1 se muestran los resultados de los parámetros fisiológicos de
la interacción de las cepas de Bradyrhizobim japonicum con la planta de soja en
ausencia y presencia de 5 mM de nitrato.
Tabla 1.Estimación de los parámetros fisiológicos en la asociación soja-Bradyrhizobium
japonicum.
Concentración de Bradyrhizobium Peso seco aéreo Peso seco raíz Contenido de N

KNO3 (mM) japonicum mg/planta mg/planta mg/planta
Control 599,23±44,89 ab 381,15±44,33 a 14,69±2,79 c
0 USDA 110 570,50±51,18 b 198,00±58,36 b 12,72±3,74 c
USDA110/CC41 565,65±47,73 b 290,43±47,13 ab 15,64±3,74 c
PER 3.64 606,67±59,10 ab 176,00 ± 58,36 b 16,00±5,89 c
Control 736,15± 4,89 a 382,31±44,33 a 28,47±2,79 b
5 USDA 110 742,50± 51,18 a 304,67±58,36 ab 19,57±3,41 bc
USDA110/CC41 680,87±47,73 ab 418,26±47,13 a 21,73±3,74 bc
PER 3.64 736,67±59,10 a 202,00±58,36 b 37,95±5,89 a
Los datos representan la media ± ES de 10 determinaciones independientes. Las letras
diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05) según prueba de Duncan.
Las plantas de soja inoculadas con la cepa USDA110 mostraron un aumento

significativo en el peso seco de la parte aérea (PSA) en presencia de nitrato. En
cambio, no se observaron cambios significativos de PSA en las plantas de soja
inoculadas con las cepas de Bradyrhizobium japonicum (USDA110/CC41 y
Per3.64) en las condiciones de crecimiento. En relación al peso seco de las raíces
(PSR), las plantas inoculadas con las diferentes cepas no mostraron diferencias
con y sin la adición de nitrato. El contenido total de N de las plantas inoculadas
con la cepa Per3.64 y fertilizadas resultó ser el doble de lo encontrado en las plan-
tas inoculadas con la misma cepa y sin fertilizar. No se observó diferencia signi-
-324-
ficativa en el contenido de N en las plantas inoculadas con las cepas Bradyrhizo-

bium japonicum (USDA110 y USDA110/CC41) con y sin nitrato. El análisis de
correlación de Pearson mostró solamente una asociación alta y significativa entre
PSR y contenido de N (r=0,95 p< 0,01) sin adición de nitrato.
En plantas de soja inoculadas con la cepa USDA110, el número de nódulos
mostró un disminución significativa en presencia de nitrato, sin cambio, en las
plantas inoculadas con las otras cepas de Bradyrhizobium japonicum. Además, se
encontró un incremento en el peso seco de nódulos (PSN) en USDA110 respecto
a su mutante USDA110/CC41 y a la cepa Per3.64 en ambas condiciones. El peso
normalizado de nódulos, obtenido de la relación entre el peso seco de parte aérea
y peso seco de los nódulos, indicó que la inoculación con la cepa Per 3.64 resultó
disminuida en comparación con las otras cepas sin la adición de nitrato. Esta dis-
minución en el peso normalizado de nódulos es más marcada cuando la cepa
Per3.64 está en presencia del nitrato (Tabla 2).
Tabla 2. Estimación de parámetros simbióticos en la asociación soja-Bradyrhizobium japonicum.
Concentración de Bradyrhizobium Número de Peso seco de Peso normalizado

KNO3 (mM) japonicum nódulos/planta nódulos mg/planta de nódulos
USDA 110 14,60±1,55 a 27,65±2,78 a 0,05±0,01 a

0 USDA 110/CC41 9,67±1,55 b 18,09±3,40 b 0,04±0,01 ab
PER 3.64 11,93±1,60 ab 14,61±2,88 b 0,03± 0,01 bc
USDA 110 9,27±1,55 b 23,20±3,40 ab 0,03 ± 0,01 bc
5 USDA 110/CC41 8,47±1,55 b 4,61±2,78 c 0,01 ±0,01 cd
PER 3.64 8,69±1,66 b 3,87±2,98 c 0,004±0,01 d
El análisis de correlación de Pearson reveló una asociación moderada y signifi-

cativa entre PSA y número de nódulos (r=0.60 p<0.05) y también entre el PSR y
PSN (r=0,75 p<0.05) en los tratamientos sin la adición de nitrato. Entre el conte-
nido de N y número de nódulos se observó una asociación alta y significativa
(r=0,93 p<0.05) sin nitrato y moderada (r=0,75 p<0.05) con nitrato. Entre el PSN
y número de nódulos la asociación fue moderada y significativa (r=0,65 p<0.05).
Los datos de la cantidad de N2 fijado y efectividad simbiótica de las diferentes
cepas de Bradyrhizobium japonicum no mostraron variaciones en ausencia y pre-
sencia de nitrato. Sin embargo, la cepa Per3.64 mostró ser más efectiva que la
cepa USDA110 en presencia de nitrato (Tabla 3).
-325-
Tabla 3. Estimación del N2 fijado y de la efectividad simbiótica en los diferentes tratamientos.
Concentración de Bradyrhizobium % Efectividad

N2 fijado mg/planta
KNO3 (mM) japonicum simbiótica
USDA 110 1,11±0,27 b 82,20± 8,31 b
0 USDA 110/CC41 1,66±0,27 ab 99,40± 8,31 ab
PER 3.64 1,61±0,42 ab 97,50±12,96 ab
USDA 110 0,87±0,24 b 74,50± 7,59 b
5 USDA 110/CC41 1,78±0,27 ab 102,80± 8,31 ab
PER 3.64 2,20±0,42 a 115,50±12,96 a

Es conocido que la presencia de N combinado es esencial en las primeras

etapas de desarrollo de la mayoría de las leguminosas, una vez que han consumido
las reservas de la semilla y, antes de que la FBN esté suficientemente activa. Una
vez desarrollados los nódulos, la aplicación de nitrato puede causar la inhibición
de su actividad fijadora de nitrógeno y, provocar una senescencia prematura (Be-
cana et al., 1985). No obstante, existen diferencias entre las especies y cultivares
de leguminosas en cuanto a su sensibilidad a la adición de nitrato (Lucinski et al.,
2002). En base a los parámetros fisiológicos y simbióticos estimados en este tra-
bajo se observó que las plantas de soja inoculadas con la cepa Bradyrhizobium
japonicum Per3.64 y fertilizadas presentaron un alto valor de PSA y del contenido
de nitrógeno pero una disminución en el PSN. Este comportamiento indicaría que
la estimulación del crecimiento vegetativo como consecuencia de la aplicación
del nitrato ocurre en detrimento de la producción de la biomasa nodular. Resulta-
dos similares fueron hallados por Gonzalez et al., (2006) en planta de poroto con
la adición de 5 mM de nitrato mostrando un efecto sinérgico entre el nitrato y la
FBN. O’ Hara y Daniel (1985) informaron que las plantas de lupino inoculadas
con cepas de Rhizobium spp., capaces de desnitrificar en vida libre, lo que tendría
una ventaja competitiva si las concentraciones inhibitorias de nitrato y nitrito fue-
ran eliminadas de la rizosfera mediante la actividad desnitrificante de dichas cepas.
En este trabajo, es de destacar que la capacidad fijadora de nitrógeno (estimado
en base al contenido de nitrógeno total) de la cepa Bradyrhizobium japonicum
Per3.64 no se vio afectada en presencia de nitrato, posiblemente debido a la capa-
cidad desnitrificante de dicha cepa.
-326-
Conclusiones
La fertilización con nitrato no afectó el crecimiento de las plantas de soja

inoculadas con las cepas de Bradyrhizobium japonicum USDA 110, USDA
110/CC41 (mutante defectiva en nitrato reductasa) y Per3.64. Sin embargo, tuvo
un impacto negativo diferencial en la nodulación en relación al número o el peso
de los nódulos. El comportamiento de la capacidad desnitrificante de la cepa sal-
vaje Bradyrhizobium japonicum USDA110 no resultó ser suficiente para mejorar
la fijación biológica del nitrógeno en presencia del nitrato.
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-328-
Aspectos bioquímicos, fisiológicos y agronómicos
de la producción de fitohormonas por Azospirillum sp.
Biochemical, physiological and agronomic topics in the

phytohormone production by Azospirillum sp.
Fabricio Cassán, Diego Rivera Botia, Daniela Torres y Romina Molina
Resumen
El análisis funcional de la producción de fitohormonas y su regulación en

plantas superiores ha resurgido en los últimos 10 años debido a los espectaculares
avances en la integración de los modelos de estudo bioquímicos, fisiológicos y
moleculares. Sin embargo, las plantas no se encuentran solas en la naturaleza y
por lo general están colonizadas o influenciadas directamente o indirectamente
por los microorganismos del suelo o de la rizósfera, tal como las rizobacterias, de
las que muchas poseen capacidad de producir compuestos del tipo fitohormonas.
Esta revisión presenta información relacionada con la biosíntesis, metabolismo,
regulación, papel fisiológico, así como del impacto agronómico de las fitohormo-
nas producidas por los miembros del género Azospirillum, considerado uno de los
modelos de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal más estudiados en
todo el mundo en los últimos cincuenta años. En este capítulo, se incluye infor-
mación exhaustiva sobre las fitohormonas auxinas, giberelinas, citoquininas, eti-
leno y ácido abscísico, así como de ciertas poliaminas y el óxido nítrico,
considerados reguladores del crecimiento vegetal. Para ello, abordaremos su es-
tudio desde la biosíntesis y su metabolismo, tanto en condiciones de cultivo quí-
micamente definido, como durante la interacción planta-bacteria en un contexto
agronómico.
Palabras clave: auxinas, gibelerinas, citoquininas, ácido abscísico, etileno, ino-

culantes.
Laboratorio de Fisiología Vegetal y de la Interacción planta-microorganismo. Universidad Nacional

de Río Cuarto, CP 5800, Córdoba, Argentina. e-mail: fcassan@exa.unrc.edu.ar
-329-
Azospirillum sp. como rizobacteria modelo de promoción

de crecimiento vegetal
Este género es capaz de colonizar más de cien especies de plantas y mejorar

significativamente su crecimiento, desarrollo y productividad en condiciones agro-
nómicas (Bashan y de-Bashan, 2010). Uno de los principales mecanismos propues-
tos para explicar el efecto de la promoción de crecimiento en las plantas inoculadas,
se ha relacionado con su habilidad para producir y metabolizar varias fitohormonas,
así como otras moléculas reguladoras del crecimiento vegetal (Tien et al., 1979).
Como punto de partida para esta revisión, podemos mencionar que nuestro interés
en el género Azospirillum sp. como modelo de estudio, se debe fundamentalmente
a que: (a) un número considerable de moléculas han sido identificadas en cultivos
de esa bacteria que podrían ser potencialmente responsables de la modificación de
crecimiento y de la arquitectura de la planta; (b) se han identificado los genes res-
ponsables de la síntesis y regulación de estos compuestos reguladores; (c) las res-
puestas de crecimiento de las plantas inoculadas han sido correlacionadas con niveles
similares de fitohormonas en medio de cultivo, rizósfera o en tejidos de plantas co-
lonizadas, (d) se ha demostrado que la respuesta de las plantas a la aplicación exó-
gena de fitohormonas imita la inoculación y (d) hay evidencia de que las bacterias
mutantes con mayor o menor producción de diferentes fitohormonas, tienen respec-
tivamente efectos mayores o menores sobre el equilibrio hormonal de la planta y
sobre su crecimiento y desarrollo en numerosas condiciones experimentales.
Producción de fitohormonas por Azospirillum sp.
Uno de los principales mecanismos propuestos para explicar la “hipótesis

aditiva“ propuesta por Bashan y de-Bashan (2010), se relaciona con la habilidad
bacteriana para producir o metabolizar fitohormonas (Tien et al., 1979; Okon y La-
bandera Gonzales, 1994) que junto con otros mecanismos, actúan de manera aditiva
sobre el efecto de promoción del crecimiento. En la actualidad, sabemos que Azos-
pirillum sp. se ha correlacionado ampliamente con la producción de varios grupos
hormonales, tales como auxinas (Prinsen et al., 1993); citocininas (CKs), (Tien et
al., 1979); giberelinas (GAs), (Bottini et al. 1989); etileno (Et), (Strzelczyk et al.,
1994); ácido abscísico (ABA), (Cohen et al. 2008) y otros reguladores del creci-
miento vegetal, como óxido nítrico (NO), (Creus et al., 2005) y ciertas poliaminas,
como cadaverina (Cassán et al., 2009a). Las siguientes secciones contienen infor-
mación exhaustiva sobre la biosíntesis, metabolismo, regulación, función fisiológica
e impacto agronómico de aquellos compuestos producidos por Azospirillum sp. tanto
en medio de cultivo químicamente definido como en la interacción planta-microor-
ganismo.
-330-
Aspectos bioquímicos, fisiológicos y agronómicos de la producción de fitohormonas ...
Auxinas
Los miembros del género Azospirillum han proporcionado un excelente mo-

delo experimental para investigar y comprender el papel fisiológico y molecular de
auxinas sobre el crecimiento microbiano, y durante la interacción rizobacteria-planta.
Varias moléculas de origen natural del tipo auxinas han sido descritas como pro-
ductos del metabolismo bacteriano en cultivos de Azospirillum sp. (veáse Figura 1).
Además del AIA (producido típicamente entre 5 y 25 μg.ml-1 de acuerdo con las
condiciones de cultivo y la cepa), el ácido indol-3-butírico (AIB) (Martínez-Morales
et al., 2003) y el ácido fenilacético (AFA) (Somers et al., 2005), considerados sensu
stricto como auxinas verdaderas, otros compuestos indólicos (precursores y/o cata-
bolitos) se han identificado en sobrenadantes en Azospirillum sp. tal como el ácido
indol-3-láctico (AIL) (Crozier et al., 1988), la indol-3-acetamida (IAM) (Hartmann
et al. 1983), el indol-3-acetaldehído (Costacurta et al., 1994), el indol-3-etanol, indol-
3-metanol (Crozier et al., 1988), la triptamina (TAM) o el antranilato, así como otros
compuestos indólicos no caracterizados (Hartmann et al. 1983). La función fisioló-
gica de tales moléculas aún es desconocida, aunque muchos de ellos podrían servir
como precursores o formas de almacenamiento de AIA. La Figura 1 presenta un de-
talle las denominadas auxinas verdaderas, precursores y otros metabolitos propuestos
para el género Azospirillum.
Figura 1. Estructura química de las auxinas verdaderas (A), precursores (C) y otros metabolitos in-
termediarios (B) propuestos para el género Azospirillum. Tomado de Cassán et al. (2013) en prensa.
-331-
Azospirillum sp. y biosíntesis de AIA

Hasta la fecha, al menos cinco vías de síntesis de AIA se han propuesto para
este género microbiano, de las que cuatro son dependientes de triptofano (Trp):
indol-piruvato [IPyA], indol acetamida [IAM], triptamina [TAM] e indol aceto-
nitrilo [IAN] y una vía sería independiente de este aminoácido (Prinsen et al.,
1993; Carreño-López et al., 2000). La Figura 2 presenta un detalle las diferentes
rutas de síntesis de AIA propuestas para el género Azospirillum.
Figura 2. Vías propuestas para la biosíntesis de ácido indol-3-acético (AIA) en Azospirillum sp. Lí-
neas de puntos representan pasos hipotéticos. Tomado de Cassán et al. (2013) en prensa.
Factores ambientales que regulan la biosíntesis de AIA

Los factores ambientales que afectan la síntesis de AIA en Azospirillum sp.
son ampliamente diversos, por lo que en esta revisión sólo mencionaremos aquellos
relacionados con el estrés ambiental y su señalización en plantas superiores (Spaepen
et al., 2007). El primer grupo incluiremos el estrés por acidificación, el estrés os-
mótico y el nutricional (debido a la limitación de la fuente de carbono); mientras
que en el segundo grupo incluiremos a los efectores químicos y otras moléculas pro-
ducidas por plantas superiores durante la generación de una condición de estrés.
Sobre el primer grupo, la producción de AIA aumentó en virtud de la limitación de
carbono en el medio, durante la reducción de la tasa de crecimiento y el pH ácido
(Ona et al., 2003, 2005). Curiosamente, la limitación de carbono y la reducción de
la tasa de crecimiento están relacionadas con el estado fisiológico de las bacterias,
en la fase de crecimiento estacionario. Por ello, si bien el AIA es producido durante
todas las etapas de crecimiento, aumenta significativamente en la fase estacionaria
-332-
(Malhotra y Srivastava, 2009). El pH ácido aumenta la expresión génica ipdC en A.

brasilense, seguido de un aumento posterior en la producción de AIA (Vande Broek
et al. 2005). Usando una fusión de traducción ipdC-gusA, Vande Broek et al. (2005)
demostraron que la expresión del gen ipdC es inducida principalmente durante la
fase de crecimiento estacionario, coincidiendo con la acumulación de la hormona
en el medio. Sobre el segundo grupo, recientemente, Cassán et al. (2011) observaron
en cultivos en fase exponencial de A. brasilense Sp245 y Az39, un incremento en la
producción de AIA por estrés osmótico, ácido abscísico (ABA) y ciertos efectores
de hongos fitopatógenos adicionados en el medio de cultivo. En contraste, el estrés
oxidativo (H2O2), salinidad (NaCl), metil jasmonato (MeJA) o ciertos efectores de
bacterias fitopatógenas, así como de algunos L-aminoácidos, redujeron la acumu-
lación de AIA en el medio.
En otro trabajo, el metabolito secundario 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG)
producido por P. fluorescens F113 fue propuesto como una señal ambiental capaz
de inducir la expresión de ciertos genes implicados en la promoción del creci-
miento vegetal en A. brasilense Sp245 (Combes-Meynet et al., 2011). Los autores
demostraron que tanto la expresión del gen ipdC como la producción de AIA au-
mentaron de manera significativa por la adición de DAPG en el medio de cultivo.
Los resultados resumidos en esta sección sugieren que Azospirillum sp. ten-
dría la capacidad de percibir señales fisiológicas producidas (y percibidas) por las
plantas superiores en condiciones de estrés ambiental, y modificar así su metabo-
lismo para coordinar una respuesta con la planta.
Efectos fisiológicos de auxinas exógenas sobre Azospirillum sp.

Van Puyvelde et al. (2011) realizaron un análisis de microarreglos (micro-
arrays) para el estudio de los efectos generales de AIA en el transcriptoma de A.
brasilense Sp245 (wt) y en una mutante deficiente en la bisíntesis de AIA (ipdC-
), ambas cultivadas en ausencia y presencia de AIA exógeno. Basados en la mul-
titud de cambios observados por la comparación de los diferentes transcriptomas,
los autores concluyeron que el AIA sería una molécula involucrada en la señali-
zación de A. brasilense, permitiendo que la bacteria se adapte a la rizósfera me-
diante el cambio de su arsenal de proteínas de transporte y proteínas de superficie
celular.
Efectos de auxinas producidas por Azospirillum sp. sobre la simbiosis rizo-

bio-leguminosas
La mayoría de los miembros de la orden Rhizobiales inducen la formación
de nódulos en las raíces de leguminosas y estas estructuras proveen a la planta
con nitrógeno (Bergersen, 1971). Durante más de 70 años, desde que Thiman
-333-
(1936) propuso que las auxinas juegan un papel importante en la ontogenia (for-
mación y desarrollo) del nódulo en la simbiosis rizobio-leguminosas, muchos es-
tudios han indicado que los cambios en la concentración de esta fitohormona o su
balance con CK son un prerrequisito para la organogénesis del nódulo (Mathesius
et al. 1997). Las siguientes referencias son consideradas un buen ejemplo de esta
afirmación: la inoculación de plántulas de frijol común con A. brasilense aumentó
la producción de flavonoides en raíces de plantas y una mayor capacidad para in-
ducir la expresión de genes nod en Rhizobium, en comparación con plántulas no
inoculadas (Burdman et al., 1996). En muchos rizobios, la expresión de genes nod
y la síntesis de los factores Nod, así como el AIA, son provocados por los flavo-
noides producidos por la planta (véase Cooper, 2007). Los efectos positivos de A.
brasilense Cd sobre el crecimiento de poroto, organogénesis del nódulo, produc-
ción de flavonoides y lipoquitooligosacáridos fueron evaluados en un sistema de
cultivo hidropónico por Dardanelli et al. (2008). Otros reportes han demostrado
la respuesta beneficiosa sobre la fijación biológica de nitrógeno de la co-inocula-
ción de Rhizobium y Azospirillum en leguminosas, no sólo a nivel molecular o
morfología de la raíz y nódulos, sino también en la funcionalidad de nódulos,
como el aumento de la actividad de la nitrogenasa en simbiosomas (Yahalom et
al., 1990). La co-inoculación de Ensifer meliloti (productor ineficiente de AIA)
con A. brasilense (productor eficiente de AIA) sobre semillas de alfalfa aumentó
significativamente el número de nódulos en la raíz primaria. El aumento fue co-
rrelacionado con el número de azospirillos obtenidos en el medio de cultivo du-
rante la fermentación. Esta respuesta sólo fue imitada por la adición exógena de
AIA (Schmidt et al. 1988). La evidencia directa del papel y efectos de promoción
de AIA en los estudios de co-inoculación de A. brasilense y R. etli en poroto
común también fue proporcionado por Remans et al. (2008a, b) por el uso de la
mutante ipdC knock-out de A. brasilense.
Efectos de auxinas producidas por Azospirillum sp. en no-leguminosas

El crecimiento radicular, es quizás el parámetro más notable que cambia
durante la interacción PGPR-no leguminosas. El rápido establecimiento de las
plántulas en un sustrato se debería a la promoción del crecimiento radical que po-
dría ser considerado una clara ventaja para la planta, porque aumentaría la absor-
ción de agua y nutrientes. Simultáneamente, Tien et al. (1979) y Hubbell et al.
(1979) demostraron que la aplicación exógena de AIA, GA3 y cinetina (K) en
mijo perla (Pearl millet) y sorgo producían los mismos cambios en la morfología
de la raíz que las plántulas inoculadas con A. brasilense. En otros ensayos, Kolb
y Martin (1985) encontraron que la inoculación de Beta vulgaris sp. con A. bra-
silense aumentó el número de raíces laterales y este efecto fue correlacionado con
-334-
los altos niveles de AIA bacteriano presentes en el medio de cultivo, que solo fue-
ron igualados por la aplicación exógena de concentraciones similares de AIA.
Kucey (1988) encontró que la inoculación de trigo con A. brasilense simuló el
efecto del tratamiento con AIA y GA3 exógeno en relación con el patrón de cre-
cimiento de tallos y raíces. También en las plantas de trigo, Zimmer et al. (1988)
probaron que la adición exógena de AIA y nitrato fueron total o parcialmente sus-
tituidas por la inoculación con A. brasilense. Falik et al. (1989) inocularon plán-
tulas de maíz (Zea mays L.) con A. brasilense Cd y evaluaron la concentración de
AIA e IBA (tanto en las formas libres y conjugadas) en tejidos de la raíz por cro-
matografía líquida-gaseosa (GLC) y cromatografía de gas-masas acoplada a es-
pectrometría de masas (GC-MS). Ellos encontraron que los niveles libres de AIA
y de IBA fueron superiores en los tratamientos inoculados en comparación con
las raíces no inoculadas. Barbieri et al. (1988) demostraron que la inoculación con
una cepa de tipo salvaje de A. brasilense (productor de AIA) aumentó el número
y la longitud de las raíces laterales de trigo. En contraste, la inoculación con un
mutante con menor producción de AIA, no modificó el desarrollo de la raíz. Bothe
et al. (1992) demostraron que la inoculación de plantas de trigo con A. brasilense
aumentó significativamente la formación de raíces laterales y aumentó el peso
seco de la raíz, así como la formación de pelos radicales; mientras que la aplica-
ción exógena de AIA aumentó significativamente el peso seco de la raíz, pero no
tuvo ningún efecto sobre la formación de las raíces laterales. Tanto Dobbelaere et
al. (1999), como Spaepen et al. (2008) presentaron evidencia concluyente sobre
el papel de AIA y su efecto fitoestimulador por la inoculación con Azospirillum
sp. mediante el uso de cepas salvajes y deficientes en la biosíntesis de AIA, así
como de tratamientos exógenos con la hormona. Ellos demostraron que la inocu-
lación resulta en una clara disminución de la longitud de la raíz de gramíneas,
pero con un aumento en la longitud y densidad de los pelos radicales presentes,
con un consecuente aumento del volumen del órgano.
Giberelinas
Bottini et al. (1989) fueron los primeros en confirmar la capacidad de Azos-

pirillum sp. para producir giberelinas en medio de cultivo químicamente definido.
Ellos reportaron la producción de GA1 y GA3 en un medio de cultivo libre de ni-
trógeno de A. lipoferum Op33 por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría
de masas (GC-MS). Resultados similares fueron reportados en A. brasilense Cd por
Janzen et al. (1992) y en A. lipoferum AZm5 y A. brasilense VS9 por Esquivel-Cote
et al. (2010). Adicionalmente, ha sido reportada la producción de precursores inac-
tivos de giberelinas como GA19 y GA9 en medio químicamente definido de A. li-
-335-
poferum Op33 (Piccoli y Bottini, 1996), lo que sugiere la existencia de diferentes

vías de síntesis en la bacteria. La primera vía presumiblemente incluiría una 13α-
hidroxilación GA1 de un precursor común seguido de su conversión a GA19, más
tarde a GA20 y finalmente la 3ß-hidroxilación de GA4 a GA1. Por otro lado, la se-
gunda vía se iniciaría con el metabolismo del precursor común a GA9 y simultáne-
amente la 3ß-hidroxilación a GA4, y finalmente la 13α-hidroxilación de GA3. Estas
vías fueron confirmadas en reportes posteriores para A. lipoferum Op33 mediante
el uso de un medio mínimo suplementado con precursores deuterados GA20 y GA9
y su posterior identificación como GA1 y GA3 mediante GC-MS (Piccoli y Bottini,
1994a; Piccoli et al. 1996). Por otro lado, A. lipoferum Op33 puede producir GA20
y GA5 (Piccoli y Bottini, 1996) lo que sugiriere la existencia de una segunda vía de
13α-hidroxilación para el metabolismo de GA20 a GA5 y la 3ß-hidroxilación a GA3.
Sin embargo, esta vía no se ha confirmado de manera inequívoca. Similares expe-
rimentos fueron desarrollados por Piccoli et al. (1997) para evaluar la capacidad de
A. lipoferum USDA5b de hidrolizar conjugados de giberelinas con glucosa (GA20-
glucosil éster y GA20-13-O-glucósido) y metabolizar estas formas libres a moléculas
biológicamente activas, como GA1. La producción de GAs, su metabolismo e hi-
drólisis de conjugados por parte de bacterias del género Azospirillum fue resumido
por Bottini et al. (2004).
Biosíntesis y metabolismo de giberelinas por Azospirillum sp. in planta

La mayoría de los resultados de estos trabajos fueron obtenidos utilizando
mutantes enanos de ciertas gramíneas, de acuerdo con Murakami, (1968) y Koba-
yashi et al. (1989). Plántulas enanas de maíz (Phinney y Spray, 1988) y arroz (Mu-
rakami, 1972) fueron inoculadas con A. brasilense o A. lipoferum en presencia o
ausencia de retardantes de crecimiento (inhibidores de la biosíntesis de giberelinas)
(Rademacher, 2000), con el objetivo de evaluar la reversión del enanismo debido a
inoculación y a la biosíntesis o el metabolismo bacteriano de giberelinas. Lucangelli
y Bottini (1997) fueron los primeros en presentar evidencia sobre el género Azospi-
rillum sp. y su capacidad de producir giberelinas activas in planta. Ellos reportaron
la reversión del enanismo genético de mutantes enanas de maíz y arroz por la ino-
culación con A. lipoferum USA5b y A. brasilense Cd o mediante la adición exógena
de GA3. Posteriormente, Cassán et al. (2001c) presentaron evidencia sobre la capa-
cidad endofítica de Azospirillum sp. para metabolizar precursores inactivos de gi-
berelinas mediante la reversión de enanismo del arroz y la identificación de
[17,17-2H2]-GA1 por GC-MS en raíces y brotes de tejidos tratados con [17,17-2H2]-
GA20. Estos resultados confirmaron la capacidad de Azospirillum sp. para producir
GA1 de GA20 a través de la vía de 3ß-hidroxilación. En condiciones experimentales
similares, Cassán et al. (2001a) demostraron la capacidad de Azospirillum sp. para
-336-
hidroxilar [17,17-2H2]-GA9 a [17,17-2H2]-GA3 confirmando la existencia de una

segunda ruta de síntesis en esta bacteria. La inoculación de mutantes de arroz pre-
viamente tratados con el precursor temprano [17,17-2H2]-GA12 también determinó
la reversión del enanismo. Este resultado pudo ser explicado por la capacidad bac-
teriana de metabolizar un precursor temprano, como 2H2-GA12 a una forma bioló-
gicamente activa, como 2H2-GA1 o 2H2-GA3. En cuanto al metabolismo de
conjugados, se observó que Azospirillum sp. puede revertir enanismo genético en
las plántulas de arroz inoculadas y tratadas con [17,17-2H2]-GA20-glucosil éster o
[17,17-2H2]-GA20-glucosil éter. En estas plántulas, fue observada una complemen-
tación fenotípica en base a la capacidad bacteriana para hidrolizar GA20-glucosil
éster o GA20-glucosil éter a GA20 y metabolizar este precursor a la forma activa
GA1 por medio de enzimas del tipo 3ß-hidroxilasas (Cassán et al., 2001b). La Figura
2 muestra las vía de síntesis de giberelinas propuestas para el género Azospirillum
sp. La Figura 3 presenta un detalle las diferentes rutas de síntesis de GAs propuestas
para el género Azospirillum.
Figura 3. Vías propuestas para la síntesis de formas activas de giberelinas en Azospirillum sp. Líneas
de puntos representan pasos hipotéticos y moléculas indicadas con una estrella han sido inequívo-
camente identificadas en cultivos puros de la bacteria. Tomado de Cassán et al. (2013) en prensa.
-337-
Papel fisiológico del GAs producidas por Azospirillum sp.

Existe una extensa lista de publicaciones relacionadas con los efectos de la
inoculación de Azospirillum sp. sobre el crecimiento y las primeras etapas de des-
arrollo de las plantas, tal como fue presentado por Bashan y de-Bashan (2010) y
no haremos una descripción detallada de los mismos en este trabajo. De manera
de resumir esta información, podemos decir que los cambios más comunes en el
fenotipo de la planta debidos a la inoculación con Azospirillum sp. son: (1) au-
mento de crecimiento radical; (2) aumento de la tasa de germinación y (3) creci-
miento acelerado de las estructuras primarias de las plántulas o semillas
inoculadas. El primer cambio fenotípico se ajusta, como hemos visto previamente,
al concepto de la producción bacteriana de auxinas; mientras que el segundo y el
tercer cambio fenotípico coincidirían más con la producción bacteriana de gibe-
relinas o de la interacción de estas moléculas con otros reguladores.
Citoquininas
Barea et al. (1976) encontraron que al menos el 90% de las bacterias aisla-
das de la rizósfera de cultivos de interés agrícola, eran capaces de producir com-
puestos del tipo-CK en medio de cultivo. Tien et al. (1979), utilizando diferentes
tipos de cromatografía (HPLC y TLC) y un bioensayo de inoculación en el mijo
perla (Pearl millet) fueron los primeros en demostrar la capacidad de A. brasilense
para producir moléculas de tipo-CK; sin embargo, en este trabajo, los compuestos
parcialmente purificados no fueron caracterizados completamente debido a la baja
resolución de los métodos analíticos empleados en ese momento. Ellos informaron
que la inoculación provocaba cambios significativos en la morfología de la raíz
mediante el aumento del número de raíces laterales y la densidad de pelos radicales
eran similares a los obtenidos por la aplicación exógena de CKs. Resultados si-
milares fueron encontrados por Muralidhara y Rai (1986) en A. lipoferum. Hore-
mans et al. (1986) modificaron el procedimiento analítico y pudieron demostrar
que A. brasilense produce isopentenil adenina (iP), isopentenil adenina ribósido
(iPR), y zeatina (Z) en medio de cultivo químicamente definido. La referencia
más significativa de la producción de CK por Azospirillum sp. fue publicada por
Strzelczyk et al. (1994), utilizando un medio de cultivo suplementado con dife-
rentes fuentes de C. Ellos informaron la producción de isopentenil adenina (iP),
isopentenil adenina ribósido (iPR), trans-zeatina ribósido (trans-Z) y zeatina (Z)
en tres cepas de Azospirillum sp. aisladas del esporocarpo de los hongos ectomi-
corrícicos Rhizopogon vinicolor, Laccaria laccata y Hebeloma crustuliniforme;
sin embargo, sólo pudieron confirmar la producción de iPR en una de las tres
cepas por cromatografía gaseosa (GC). Recientemente, fue informada la produc-
-338-
ción de trans-zeatina por A. lipoferum AZm5 creciendo en medio definido NFb

suplementado con NH4Cl (Esquivel-Cote et al. 2010). Un caso interesante de si-
nergismo se ha descrito para un cultivo mixto de A. brasilense y Arthrobacter gia-
comelloi mostrando un mayor contenido de CK, comparado a los encontrados en
cultivos individuales de cada microorganismo (Cacciari et al., 1989). La Figura 4
presenta un detalle de algunas CK propuestas para el género Azospirillum, así
como de otras formas sintéticas.
Figura 4. Estructura de citoquininas identificadas y reportadas en Azospirillum sp. (A) y de ciertas

moléculas sintéticas (B) con actividad biológica en los tejidos de las plantas. Tomado de Cassán et
al. (2013) en prensa.
Etileno
Existe poca información relacionada con la producción de Et por PGPR y su

efecto sobre el crecimiento de plantas. Primrose y Dilworth (1976) determinaron la
capacidad de las bacterias de vida libre Azotobacter sp. y Bacillus sp. para producir
Et en medio químicamente definido. Azospirillum sp. produce Et en medios con
malato, succinato o piruvato como fuente de carbono, solo cuando la L-metionina
-339-
es agregada como precursor, alcanzando una producción máxima de 0,17 μmoles.

g peso seco-1 (Strzelczyk et al., 1994). No sólo la producción bacteriana de Et puede
modificar el crecimiento y desarrollo de las plantas o su “estado” hormonal, ya que
otras hormonas (por ejemplo, AIA) o ciertas enzimas bacterianas relacionadas con
el metabolismo del gas (por ejemplo, ACC deaminasa) pueden alterar los niveles
de Et en las plantas inoculadas. En tal sentido, plántulas de tomate inoculadas con
A. brasilense FT326 (con alta producción de AIA) demostraron una correlación po-
sitiva entre la concentración de AIA, el número y longitud de raíces y la producción
de Et en la planta (hasta 10 veces mayor que los controles debido al aumento de la
actividad de ACC sintasa) (Krumpholz et al. 2006). Esto indicaría que el aumento
de Et en la planta es al menos en parte, debido a la comunicación “cross-talk” entre
las rutas de la bacteria para producir AIA y la biosíntesis de Et en la planta, tal como
propuso previamente Rahman et al. (2002). La capacidad de algunas rizobacterias
para promover el crecimiento ha sido correlacionada con la expresión de una enzima,
la ACC deaminasa (Glick, 1995). Esta enzima puede metabolizar el precursor de
etileno [ACC] en amoníaco y alfa-cetobutirato, evitando la acumulación de Et y sus
efectos inhibitorios sobre el desarrollo de las plantas. A pesar de que Azospirillum
sp. promueve el crecimiento vegetal, la expresión del gen de la ACC deaminasa ob-
tenido de Enterobacter cloacae en A. brasilense resultó en una mejora significativa
del crecimiento de las plantas inoculadas (Holguín y Glick, 2001). El gen de la ACC
deaminasa, llamado acdS fue detectado en algunas cepas de Azospirillum que ade-
más presentaron la actividad de la enzima (acdS1+) en condiciones de cultivo in
vitro (Blaha et al., 2006). Recientemente, Esquivel-Cote et al. (2010) informaron
que A. lipoferum AZm5 expresando la actividad ACC deaminasa mejora el creci-
miento temprano de tomate.
Ácido Abscísico
El ABA es producido por plantas superiores, algas, hongos y bacterias (Ze-

evaart, 1999); sin embargo, sólo hay unos pocos informes relacionados con la pro-
ducción de esta molécula por Azospirillum sp. en medio de cultivo químicamente
definido o en plantas inoculadas. Kolb y Martin (1985) fueron los primeros en re-
portar la producción de ABA por A. brasilense Ft326 en medio de cultivo definido.
Sin embargo, la identificación fue lograda mediante radio-inmunoensayo, una téc-
nica de baja sensibilidad comparada a la espectrometría de masa, la que se utiliza
más comúnmente en la actualidad. En reportes recientes, Perrig et al. (2007) in-
formaron la capacidad de A. brasilense Az39 y Cd para producir 75,0 y 6,5 ng
ABA ml-1 en medio químicamente definido, respectivamente. En este trabajo, el
ABA fue identificado por cromatografía de gases-espectrometría de masas. Esta
-340-
molécula también fue caracterizada en el sobrenadante de A. brasilense Sp245

por GC-EIMS, cultivando al microorganismo en medio de cultivo químicamente
definido o medio suplementados con NaCl (para generar una condición moderada
de estrés). Así, A. brasilense Sp245 produjo altas cantidades de ABA cuando fue
agregado el NaCl al medio de cultivo (235 ng.ml-1), en comparación con el control
sin adición de la sal (73 ng.ml-1). La inoculación de A. thaliana con A. brasilense
Sp245 aumentó dos veces el contenido de ABA de la planta (3,52 ng.g-1 FW)
(Cohen et al. 2008). En trabajos posteriores, con un enfoque agronómico, se eva-
luaron los efectos de la inoculación de A. lipoferum USDA 59b en plantas de maíz
tratadas con inhibidores de la síntesis de ABA y GAs (fluridona y prohexadiona-
Ca, respectivamente) bajo condiciones de sequía. La reducción de ABA por fluo-
ridona disminuyó el crecimiento de las plantas cultivadas en condiciones normales
de riego, de una manera similar al estrés por sequía, pero la inoculación con Azos-
pirillum sp. revirtió completamente este efecto. El contenido relativo de agua de
plantas tratadas con fluridona y estresadas por sequía fue significativamente menor
y este efecto fue neutralizado por la inoculación de Azospirillum sp., lo que sugiere
que tanto el ABA como GAs contribuirían con la reducción de estrés hídrico en
plantas de maíz inoculadas (Cohen et al., 2009).
Funciones fisiológicas del ácido abscísico en Azospirillum sp.

En suelos restrictivos (por ejemplo: suelos con estrés salino o sequía), el ABA
de origen bacteriano podría contribuir en la regulación de la homeostasis de la planta
y la respuesta general al estrés. Se trata de una línea de investigación emergente que
se focaliza particularmente en el grupo de las rizobacterias reguladoras de la home-
sotasis de las plantas en condiciones de estrés abiótico, o como fueron acuñadas
PSHR del inglés, Plant stress-homeoregulating rizobacteria (Cassán et al., 2009).
Otros compuestos reguladores del crecimiento de plantas
Poliaminas
La producción de putrescina (Put), espermidina (Spd) y espermina (Spm)
fue reportada por Thuler et al. (2003a) en cultivos químicamente definidos de
Azospirillum sp. aislados de raíces de mandioca. En un segundo reporte, Thuler
et al. (2003b) informaron la producción de Put y Spd en medio químicamente de-
finido de Beijerinckia derxii ICB-10 (ATCC 33962), aislada de la sabana brasileña.
La producción de cadaverina (Cad) y otras poliaminas fueron reportadas en primer
lugar por Hamana et al. (1988 y 1990) para un amplio grupo de α-proteobacterias
pertenecientes a la orden Rhizobiales, pero recientemente propuesto para Azospi-
rillum brasilense por Cassán et al. (2009a). Resultados similares fueron reportados
-341-
por Goris et al. (1998) en un grupo extenso de cepas que pertenecen al así llamado
Pseudomonas rRNA grupo I (pseudomonas auténticas) y Azotobacteraceae (fija-
dores de nitrógeno de vida libre). Todas las cepas evaluadas mostraron capacidad
de producir Put, Spd y Cad, aunque para algunas pseudomonas auténticas, no pudo
ser identificada Cad.
Papel fisiológico de poliaminas producidas por Azospirillum sp.

La diamina Cad ha sido correlacionada con la promoción de crecimiento
de las raíces (Gamarnik y Frydman, 1991; Niemi et al. 2001) o mitigación de
estrés osmótico (Aziz et al., 1997; Liu et al., 2000) en las plantas. Cassán et al.
(2009a) evaluaron la capacidad de A. brasilense Az39 para producir Cad en medio
químicamente definido y como endófitos de plántulas de arroz. Ellos correlacio-
naron esta capacidad con la promoción de crecimiento de las raíces o mitigación
de estrés osmótico en condiciones de cultivo hidropónico y proponen la produc-
ción de Cad como un nuevo mecanismo bacteriano implicado en la promoción
del crecimiento vegetal y/o en la regulación de la respuesta de la planta al estrés
osmótico.
Óxido Nítrico
A. brasilense Sp245 (Creus et al. 2005) y Az39 (datos no publicados) pro-
dujeron NO en condiciones de cultivo anaeróbico o aeróbico. El último probable-
mente puede lograrse por múltiples vías, tales como una desnitrificación aeróbica
y nitrificación heterótrofa. El NO es producido durante las fases de crecimiento
media y final logarítmica (Molina-Favero et al. 2007; 2008). La producción de
NO en A. brasilense Sp245 induce cambios morfológicos en las raíces de tomate
independientemente de la capacidad bacteriana completa para sintetizar AIA. Un
mutante deficiente en la vía de síntesis de AIA induce los mismos cambios fisio-
lógicos (ligeramente menores) sobre el desarrollo de raíces que la cepa tipo salvaje
(Molina-Favero et al., 2008). Este fenómeno puede ocurrir por la producción bac-
teriana de NO y sería de gran interés en aquellos sistemas deficientes en la bio-
síntesis de AIA.
Conclusiones y perspectivas
La producción de fitohormonas en rizobacterias ha sido un tema de inves-

tigación de gran interés durante las últimas décadas, inicialmente en microorga-
nismos patógenos (por ejemplo A. tumefaciens) y más tarde en PGPR. A pesar de
ello, podemos decir que sabemos relativamente poco acerca de fitohormonas en
rizobacterias, en comparación con lo que se ha desentrañado en el caso de las plan-
-342-
tas superiores. En tal sentido, en muchos casos debemos confiar en los modelos
de síntesis obtenidos de plantas superiores para comprender la biosíntesis en ri-
zobacterias. Un prerrequisito para estimar la importancia de la producción de fi-
tohormonas bacteriana en la promoción del crecimiento vegetal se basa en contar
con la herramienta adecuada, en este caso, mutantes con impedimento en la bio-
síntesis de algunos de estos compuestos. Por ejemplo, un mutante knock-out en
un gen clave de la biosíntesis del ácido indol-3-acético. En tal sentido, solo en el
caso de las auxinas y en particular para el AIA, la funcionalidad fisiológica y mo-
lecular ha sido descripta de manera exquisita, tanto en condiciones de cultivo quí-
micamente definido, como en la interacción planta-microorganismo. En el caso
de las giberelinas y particularmente para el caso del ácido giberélico y la GA1, el
modelo está un poco más avanzado y ha sido descripto de manera bioquímica y
con una interpretación fisiológica, pero no se encuentra definido desde un punto
de vista molecular. Por último, para CKs, ABA, Et, poliaminas y NO, la capacidad
de varios microorganismos para producir tales compuestos en cultivos ha sido
confirmada y ocasionalmente en ensayos de inoculación; sin embrago, no se ha
logrado establecer un modelo funcional mas acabado que explique parte del efecto
de la inoculación durante la interacción planta-microorganismo. La integración
de ambos sistemas, tanto el modelo microbiano, como el vegetal, desde un punto
de vista fisiológico y particularmente hormonal, podría ser el comienzo de una
mejor comprensión de la interacción planta-microorganismo dentro de un nuevo
sistema de estudio denominado “fisiología de la interacción planta-microorga-
nismo”.
Agradecimientos
La revisión fue escrita en el marco bilateral FWO-Vlaanderen-MINCyT

proyecto de investigación (VS.011.11N) concedida a FC y JV. FC investigador
del Consejo Nacional de Investigaciones Científico-Tecnológicas (CONICET) y
Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC) Un agradecimiento especial a Yoav
Bashan (CIBNOR) y Cecilia Creus (INTA-UNMdP) por proporcionar información
para completar el modelo fitohormonal de Azospirillum sp.
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Estudio de Azospirillum como tecnología aplicable
en los cultivos de trigo y maíz
Study of Azospirillum as an applicable technology

in wheat and corn crops
García, Julia E.a*, Mariana L. Puentea, Guillermo A. Maronicheab, Ale-

jandro Perticaria
Resumen
Los efectos de la inoculación con bacterias promotoras en cereales son am-

pliamente estudiados en todo el mundo e incluso también en Argentina, aunque
es limitado el número de ensayos a campo utilizando diferentes cepas y en parti-
cular de las cepas bacterianas presentes nuestro país. En Argentina con la infor-
mación disponible, se considera a la cepa de Azospirillum brasilense Az39 como
la de mejor performance y recomendada para la fabricación de inoculantes para
maíz y trigo. La búsqueda de nuevas cepas que presenten características promo-
toras del crecimiento vegetal superiores a la Az39 es un desafío permanente, tanto
para el cultivo de trigo como maíz. Es por ello, que en nuestro laboratorio se llevan
a cabo continuos estudios de aislamientos, selección e identificación de nuevas
cepas de Azospirillum spp. con potencial para ser aplicadas en estos cultivos. En
este capítulo se presentan los resultados de ensayos de selección de cepas, tanto
bajo condiciones controladas como a campo.
Palabras clave: Azopirillum, trigo, maíz.
Introducción
El crecimiento de las plantas en los suelos agrícolas se ve influenciado por

muchos factores bióticos y abióticos. El suelo proporciona a las plantas soporte
físico y elementos minerales. El área del suelo influenciado por las raíces de las
plantas se la conoce como rizosfera y en ella se encuentran un gran número de es-
a
Laboratorio de Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal, IMYZA, INTA Castelar, Buenos.
Aires, Argentina. e-mail: jgarcia@cnia.inta.gov.ar
b
CONICET, Argentina.
-351-
pecies de microorganismos que pueden ejercer sobre las plantas efectos positivos,
neutros o deletéreos (Whipps, 2001). Los microorganismos neutros establecen
una interacción inocua sobre las plantas huésped (Beattie, 2006). Los deletéreos
influyen de manera negativa sobre el crecimiento y la fisiología de las plantas. En
contraposición a estos microorganismos están los que influyen sobre las plantas
de manera positiva, pudiendo ejercer su efecto de manera directa o indirecta. La
estimulación directa se produce por diversos mecanismos como la fijación bio-
lógica de nitrógeno, la producción de fitohormonas como auxinas, citocininas y
giberelinas, la solubilización de fósforo y hierro, la producción de sideróforos y
enzimas y la inducción a la resistencia sistémica, mientras que la estimulación in-
directa básicamente está relacionada con el control biológico, incluyendo produc-
ción de antibióticos, la quelación de Fe disponible en la rizosfera, la síntesis de
enzimas extracelulares y la competencia por nichos dentro de la rizosfera (Zahir
et al., 2004;. Van Loon, 2007; Bashan y de Bashan, 2010). Estos microorganismos
son también llamados PGPR (de las siglas en inglés Plant Growth Promotion Rhi-
zobacteria), y se los utilizan comúnmente como inoculantes para mejorar el crec-
imiento y rendimiento de los cultivos agrícolas. Dentro de los PGPR están los
microorganismos que se asocian con las raíces de las plantas de manera extrace-
lular (ePGPR) y los que lo hacen de manera intracelular (iPGPR) (Martínez-Vi-
veros et al., 2010). Dentro de los ePGPR se encuentran los géneros Agrobacterium,
Arthobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter,
Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous, Pseudomonas y Se-
rratia. Los iPGPR incluyen los endófitos Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhi-
zobium, Mesorhizobium y Rhizobium y las especies de Frankia (Bhattacharyya y
Jha, 2012). Dentro del grupo de los ePGPR, el género Azospirillum es uno de los
más estudiados y empleados para la formulación de inoculantes en el mundo (Hun-
gria et al., 2010). La respuesta de diversos cultivos a la inoculación con Azospiri-
llum ha sido ampliamente estudiada tanto en experimentos en condiciones
controladas como a campo. En la mayoría de los estudios realizados en condicio-
nes controladas, la promoción de crecimiento por parte de Azospirillum fue clara-
mente demostrada (Dobbelaere , 2001; Walsh et al., 2001, Dobbelaere y Okon
2007; Cassán y García de Salamone, 2008; Díaz-Zorita y Fernandez-Canigia,
2009; Spaepen et al., 2009) y se evidenció a través de cambios en diferentes pa-
rámetros de crecimiento como: i) incremento en peso seco total, concentración de
nitrógeno en follaje y grano, número total de espigas, espigas fértiles, y mazorcas;
ii) floración y aparición de espigas más temprana; iii) incremento en el número
de espigas y granos por espiga; iv) plantas más altas e incremento en el tamaño
de la hoja y v) tasas de germinación más altas (Bouton et al., 1979; Bouton y Zu-
berer, 1979; Bandani y Döberreiner, 1980; Albrecht et al., 1981; O’hara et al,.
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et al., 2000; Saubidet et al., 2002; Ozturk et al., 2003). Sin embargo, el efecto más
remarcable de Azospirillum lo produce en el sistema radicular (Fages, 1994). Se
ha observado que la inoculación produce un incremento en el desarrollo del sis-
tema de raíces, tanto en longitud como en volumen a través de una mayor proli-
feración de pelos radiculares, mayor elongación de la raíz primaria y el incremento
en el número y largo de raíces laterales (Okon y Kapulnik, 1986).
En los ensayos a campo generalmente los efectos son menos evidentes y
muchas veces se ven incrementados parámetros de crecimiento en la etapa vege-
tativa que pueden o no afectar el rendimiento a cosecha. Según Dobbelaere y Okon
(2007) basándose en varias revisiones realizadas sobre los resultados de experi-
mentos a campo con Azospirillum en diversos cultivos (Rao et al., 1983; Watanabe
y Lin, 1984; Bashan y Levanony, 1990; Sumner, 1990; Fages 1994; Okon y La-
bandera-Gonzalez, 1994; Fulchieri y Frion, 1994) la respuesta a la inoculación
sobre el rendimiento osciló entre el 10 y el 30%. En trigo, Caballero et al. (1992)
observaron incrementos en el rendimiento desde 23 hasta 63%. Los efectos de la
inoculación en cereales con bacterias promotoras son ampliamente estudiados en
todo el mundo (Albrecht et al., 1981; Reynders y Vlassak 1982; Rennie et al.,
1983; Kloepper et al., 1988; Caballero Mellado et al., 1992; Okon y Labandera-
González, 1994), así como también en Argentina (García de Salamone et al., 1996;
Rodríguez-Cáceres et al., 1996; Creus et al., 2004; Díaz-Zorita y Fernandez-Ca-
nigia, 2009; Puente et al., 2009), sin embargo, es muy importante contar con un
mayor número de ensayos a campo utilizando las cepas bacterianas presentes nues-
tro país.
Ensayos de selección de cepas
Luego de haber realizado ensayos a campo en el cultivo de trigo, en donde

se probaron cepas pertenecientes a la Colección BPCV (WDCM31), IMYZA,
INTA se concluyó que la cepa de Azospirillum brasilense Az39 fue la que presentó
mejor rendimiento, produciendo un incremento del 20% con respecto al control
no inoculado (Puente et al., 2005). Esta cepa fue aislada de rizósfera de trigo en
Marcos Juárez, Córdoba. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en nuestros
ensayos y la información previa disponible (Rodríguez-Cáceres et al., 2003) se
consideró a la cepa Az39, como la de mejor performance y recomendada para la
fabricación de inoculantes para maíz y trigo en la República Argentina (Cassán et
al., 2008).
-353-
A partir de ese conocimiento se desarrolló a escala piloto un inoculante a

base de Az39 con características satisfactorias para uso comercial, sin embargo,
la búsqueda de nuevas cepas que presenten características promotoras del creci-
miento vegetal superiores a la Az39 es un desafío permanente, tanto para el cultivo
de trigo como maíz. Es por ello, que llevamos a cabo continuos estudios de aisla-
mientos, selección e identificación de cepas de Azospirillum spp. con potencial
para ser aplicadas en estos cultivos.
Para la selección de nuevas cepas se realizaron ensayos en condiciones con-
troladas evaluando el efecto de la inoculación de nuevos aislamientos en etapas
tempranas del cultivo, y posteriormente las cepas con mejor performance fueron
estudiadas a campo e identificadas molecularmente.
En trigo, los ensayos de selección, en donde se evaluaron diversos aisla-
mientos y cepas de la colección BPCV, indicaron que el aislamiento denominado
Az73 produjo incrementos significativos respecto al testigo similares a la Az39
tanto en parte aérea como en radicular (Puente et al., 2008 a). Posteriormente, con
el objeto de evaluar este nuevo aislamiento a campo y comparar su comporta-
miento con la cepa recomendada Az39 bajo condiciones de campo, se realizó un
ensayo en el predio experimental del INTA Castelar en la campaña 2009-2010
(Figura 1).
Figura 1. Ensayo de comparación de cepas en el cultivo de trigo en el campo experimental del

IMYZA, INTA Castelar, campaña 2009-2010.
Para evaluar la interacción de la inoculación con la fertilización, el estudio
se realizó bajo diferentes niveles de fertilización. El cultivar utilizado fue Baguette
11. El ensayo se realizó con un diseño en bloques completos al azar con arreglo
factorial A*B con 5 repeticiones. El factor A consistió en tres niveles de fertiliza-
ción (0, 50% y 100%) siendo 100% la tasa de fertilización óptima según el análisis
del suelo. El factor B representó tres niveles de inoculación (no inoculado, inocu-
-354-
lado con la cepa Az39 e inoculado con el aislamiento 73). El inoculante para ambas
cepas fue preparado en medio líquido de Sadasivan y Neyra (1985) y el título ajus-
tado a 1x109 UFC mL-1. La dosis de inoculación sobre semilla fue de 10 mL kg-1.
Durante el crecimiento vegetativo se evaluó el peso seco y peso fresco de las plan-
tas en dos momentos: inicio y fin de macollaje. Posteriormente, en madurez fisio-
lógica se determinó el rendimiento en grano y sus componentes: número de
espiguillas/espigas, número de granos/espiga, número de granos/espiguilla, gra-
nos/m2 y peso de mil granos. Se realizó un ANOVA y las medias fueron analizadas
por medio del test DGC.
Los resultados de los muestreos en etapas vegetativas indican que en inicio
de macollaje no hubo efecto de fertilización, como tampoco de inoculación. En el
segundo muestreo realizado en el fin del macollaje se observó respuesta al nivel
alto de fertilización tanto en peso fresco como en peso seco. En relación a la ino-
culación, en peso fresco (Figura 2) sólo se observó efecto bajo niveles de fertili-
zación media (50%) tanto en las plantas inoculadas con la cepa Az39 como con la
cepa 73.
Figura 2. Peso fresco de plantas de trigo a fin de macollaje según tratamientos de fertilización (0,
50 y 100) y de inoculación (0, Az39, aislamiento 73) ensayo Castelar, campaña 2009-2010. Las
barras en los gráficos representan el error estándar y las letras distintas indican diferencias signifi-
cativas (p≤0.05).
Los resultados de peso seco (Figura 3) indican que con niveles del 50% de
fertilización únicamente cuando fue combinado con el aislamiento 73 se obtuvo
el mismo peso seco que el tratamiento fertilizado con el 100% de la dosis óptima.
-355-
Figura 3. Peso seco de plantas de trigo a fin de macollaje según tratamientos de fertilización (0,
50 y 100) y de inoculación (0, Az39, aislamiento 73), ensayo Castelar, campaña 2009-2010. Las
barras en los gráficos representan el error estándar y las letras distintas indican diferencias signifi-
cativas (p≤0.05).
En cuanto al rendimiento en grano (Figura 4) y sus componentes, solo fue

significativo el efecto de la fertilización. No hubo efecto significativo de la ino-
culación para ninguno de los parámetros evaluados, sin embargo, los rendimientos
en grano fueron superiores con niveles medios y altos de fertilización cuando se
lo combinaron con la inoculación. El incremento respecto al testigo logrado con
la cepa Az39 fue de 5,9% y de 6,1% y con el aislamiento 73 de 3,6% y 1,5%,
según estaban fertilizados con el 50% o el 100% de la dosis óptima, respectiva-
mente.
Figura 4. Rendimiento de trigo según tratamientos de fertilización e inoculación, ensayo Castelar,

campaña 2009-2010. Las barras en los gráficos representan el error estándar.
-356-
En el cultivo de maíz el nuevo aislamiento 73 fue comparado con la Az39

en ensayos a campo en la campaña 2010-2011 en diversas localidades: San Anto-
nio de Areco, Barrow y Balcarce. Al igual que para trigo, el inoculante para los
ensayos en maíz fue preparado en medio líquido de Sadasivan y Neyra (1985) y
el título ajustado a 1x109 UFC mL-1. La inoculación fue en semilla a razón de 12
mL kg-1. Los datos fueron analizados por medio de ANOVA y un test de Tukey.
En San Antonio de Areco (Figura 5a), las cepas no presentaron diferencias
significativas entre ellas y se logró un incremento respecto al testigo de 11,2% y
3,7% cuando se inoculó con la cepa 73 y la Az39, respectivamente. En Barrow
(Figura 5b), ambas cepas tampoco presentaron diferencias significativas al com-
pararla entre ellas, sin embargo, en esta localidad la cepa Az39 presentó los ma-
yores rendimientos y se obtuvo un incremento significativo respecto al testigo de
5,6%, mientras que con la cepa 73 el incremento fue de 1,7%.
Figura 5. Rendimiento en grano del cultivo de maíz según tratamientos de inoculación en San An-
tonio de Areco (a) y en Barrow (b) en la campaña 2010-2011. Las barras en los gráficos represen-
tan el error estándar y las letras distintas indican diferencias significativas (p≤0.05).
En Balcarce, la inoculación produjo incrementos del rendimiento en grano

de 8 y 10% según se utilizó la cepa Az39 o el aislamiento 73, respectivamente. Si
bien estos incrementos no fueron estadísticamente significativos, en términos ab-
solutos representaron un incremento respecto al testigo de 1400 kg/ha promedio
de las dos cepas (Figura 6a).
-357-
Figura 6. Rendimiento en grano (a) y número de espigas (b) del cultivo de maíz según tratamien-
tos de inoculación en Balcarce, campaña 2010-2011. Las barras en los gráficos representan el
error estándar y las letras distintas indican diferencias significativas (p≤0.05).
Cuando se analizaron los componentes de rendimiento se observó que el

número de espigas fue un 15% superior en los tratamientos inoculados, promedio
de las dos cepas, aunque este incremento no fue significativo (Figura 6b). El peso
de mil no presentó diferencias entre tratamientos.
Como conclusión de estos ensayos podemos afirmar que los efectos de pro-
moción pudieron observarse desde etapas tempranas del cultivo y condujeron a
una mejora general del mismo. Mayor crecimiento radicular, mejor logro del stand
de plantas, mayor acumulación de materia seca en estados vegetativos son algunos
ejemplos de los beneficios que pueden obtenerse con las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal. Es importante mencionar que el potencial de estos beneficios
se expresará en condiciones productivas favorables, ya que el mejoramiento en
etapas tempranas permitirá aumentar la eficiencia en el uso de los recursos dispo-
nibles, que podrá o no verse reflejados en los rendimientos.
El nuevo aislamiento evaluado presentó muy buena performance en algunos
de los ensayos a campo, sin embargo, resulta importante continuar con la carac-
terización de su capacidad promotora a través del análisis de producción de hor-
monas, fijación de nitrógeno, producción de sideróforos, entre otros.
Identificación molecular
El aislamiento 73 fue obtenido a partir de suelo de la provincia de Chaco

de un campo cuya rotación había sido trigo-algodón. Se realizó una genotipifica-
ción molecular del aislamiento 73 amplificando por PCR, y secuenciando, un frag-
-358-
mento del ADNr 16S. La secuencia obtenida fue inicialmente comparada en bases
de datos públicas, observándose identidades de hasta 99% con secuencias de cepas
anotadas como A. brasilense. Sin embargo, al realizar un análisis filogenético del
aislamiento 73 con secuencias de cepas de las especies que integran el género
Azospirillum de acuerdo a las más actuales revisiones de sistemática procariota
(Euzéby ,1997), se observó que en el árbol resultante el aislamiento 73 se separó
de la rama que contiene a las cepas de A. brasilense (Figura 7), agrupándose con
la especie A. formosense sp. nov. Esta especie fue propuesta por Lin et al. (2012)
a partir de una cepa proveniente de Yunlin (Taiwan) que, al igual que el aislamiento
73, fue aislada de suelo agrícola. En el caso de la cepa Az39, ésta se ubicó en la
rama que contiene a las A. brasilense, confirmándose su pertenencia a esta especie.
Si bien el análisis filogenético sugiere que el aislamiento 73 es una cepa de A. for-
mosense sp. nov., esto deberá ser corroborado mediante un análisis molecular más
profundo y estudios bioquímicos y metabólicos.
Figura 7. Análisis filogenético del aislamiento 73. Un fragmento del ADNr 16S del aislamiento 73
fue secuenciado y utilizado para realizar un alineamiento múltiple con secuencias de cepas de cada
una de las especies pertenecientes al género Azospirillum y un posterior análisis filogenético con el
software MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011) empleando el método “Maximum Likelyhood” y el mo-
delo de sustitución Tamura-Nei. Se utilizó a Rhodospirillum centenum como grupo externo para en-
raizar el árbol. En la Figura se muestra un árbol consenso obtenido por la prueba de Bootstrap con
1000 repeticiones. A la derecha de cada cepa se indica el nombre de colección y el número de acceso
GenBank de la secuencia ADNr 16S correspondiente (subrayado).
-359-
Ensayos complementarios
Para complementar los ensayos a campo, en nuestro laboratorio realizamos

estudios de compatibilidad de la práctica de inoculación con las prácticas habi-
tualmente utilizadas en el sistema productivo, como son el uso de tratamientos
químicos para semillas y la fertilización. En trigo, los ensayos de compatibilidad
de la inoculación se realizaron con diferentes funguicidas (Diaz Zorita et al., 2004)
y se observó que los recuentos de bacterias sobre semillas decrecieron luego de
2h cuando se lo mezcló con tebuconazole. Además, se evaluó la compatibilidad
en función del momento de inoculación (García et al., 2011) y se observó que
existió compatibilidad con los fungicidas evaluados cuando se anticipó 30 días la
inoculación. Para determinar la compatibilidad con fertilizantes se evaluó el efecto
del fertilizante sobre la sobrevivencia del Azospirillum aplicando distintos fertili-
zantes químicos directamente sobre el caldo (Puente et al., 2008 b). En estos en-
sayos se observó que en los tratamientos en donde el inoculo se lo mezcló con
MAP o DAP no existió mortalidad de azospirilos respecto al testigo, mientras que
el caldo mezclado con urea y MAP no presentó recuento a partir de la hora pos
inoculación.
En maíz se evaluó el efecto del tratamiento fúngico-insecticida (Fludioxonil
+ Metalaxil y Clothianidin) que presentaban originalmente las semillas sobre la
supervivencia de Azospirillum. Para ello, se realizaron recuentos de la bacteria re-
cuperada de semillas inoculadas en diferentes momentos. Los tiempos evaluados
fueron inmediatamente después de la inoculación (tiempo 0), a las 4 y a las 24 h
pos inoculación. Un grupo de semillas fueron exhaustivamente lavadas con agua
corriente para eliminar el tratamiento químico que presentaban, otro grupo fue
dejado como se encontraban originalmente tratadas. Además, como control se re-
alizó recuento sobre semillas sin inocular tanto lavadas como con tratamiento quí-
mico. Para cada uno de los tratamientos del ensayo se utilizaron grupos de 100
semillas, las cuales fueron colocadas en frascos con 100 mL de solución fisiológica
y se agitaron por 15 minutos. Luego, se procedió a hacer las diluciones sucesivas
en tubos de ensayo con 9 mL con solución fisiológica. Se sembraron 100 µL de
cada una de las diluciones en medio RC por duplicado. Luego de 4 días de incu-
bación en estufa a 28°C, se procedió a contar las colonias de Azospirillum. Los
resultados demostraron que el tratamiento químico de las semillas (fúngico/insec-
ticida) causó un efecto negativo sobre la supervivencia de Azospirillum sobre las
semillas a partir de las 4 h pos inoculación (Tabla 1). En las semillas no inoculadas
no se obtuvieron colonias de Azospirillum en ninguno de los dos tratamientos (se-
millas lavadas y con tratamiento químico).
-360-
Tabla 1. Efecto del tratamiento de las semillas sobre la supervivencia de Azospirillum.
Semillas lavadas Semillas con tratamiento

Tiempo (horas)
(UFC/Semilla) (UFC/Semilla)
Tiempo 0 1,9 x 107 1,5 x 107
Tiempo 4 1,3 x 107 820
Tiempo 24 2,6 x 106 0
Este ensayo demuestra que el tratamiento de las semillas químico contra

patógenos y plagas causa una notoria mortandad de Azospirillum, disminuyendo
así las posibilidades de colonización de éstas bacterias a las semillas en germina-
ción.
Agradecimientos
Los ensayos a campo que se presentan en este capítulo fueron realizados

bajo el marco del denominado Proyecto INOCULAR. El mismo es un Convenio
de Asistencia Técnica entre INTA y empresas privadas productoras de inoculantes
y una de sus metas es el estudio y la difusión de los beneficios de los microorga-
nismos promotores del crecimiento vegetal. Agradecemos la colaboración de pro-
fesionales de INTA por llevar a cabo estos ensayos: Ings. Agrs. Fernanda
Covacevich, Fernando Mousegne, Carlos Piccinetti, Natalia Carrasco y Martín
Zamora.
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-366-
Utilización de la rizobacteria Azospirillum para aumentar
el crecimiento vegetal y la sostenibilidad agrícola
Use of the rhizobacterium Azospirillum spp to promote plant growth

and sustainable agriculture
Inés E. García de Salamone.
Resumen
La capacidad productiva de los suelos se asocia directamente con su con-

tenido de materia orgánica, que es la fuente principal de nutrientes para las plantas.
El ciclo de descomposición de carbono orgánico, regula diversos procesos agro-
nómicos que se producen en el suelo y parecen afectar a la productividad. Los mi-
croorganismos son un componente esencial y grande de la biomasa viviente del
suelo. Ellos juegan un papel fundamental en los ciclos biogeoquímicos y tienen
un gran potencial tanto en el uso agrícola y la protección del medio ambiente. Así,
el funcionamiento de cualquier ecosistema terrestre depende en gran medida de
la actividad microbiana del suelo. Se sabe que los sistemas de manejo pueden mo-
dificar la estructura y la biodiversidad de las comunidades microbianas del suelo.
Numerosos trabajos evaluaron en condiciones de campo, el comportamiento de
cepas de Azospirillum aisladas de raíces de trigo y maíz en la Región Pampeana
Argentina. Los resultados compilados en esta revisión están en concordancia con
aquellos obtenidos por otros autores. Toda la información disponible indica que
la inoculación con Azospirillum debe ser favorecida. Sin embargo, la variabilidad
en las capacidades tanto de esta PGPB como de las plantas a las que está dirigida
deben ser ajustadas y potenciadas incluyendo mecanismos alternativos tales como
FBN, producción de fitorreguladores y control de agentes patógenos entre otros,
para mejorar los niveles de respuesta a la inoculación a campo.
Palabras clave: inoculantes microbianos, fijación biológica de nitrógeno, rizo-

bacterias
Cátedra de Microbiología, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Argentina

iMail: garcia@agro.uba.ar
-367-
Biotecnología, inoculantes y sostenibilidad agrícola
Varios microorganismos del suelo tienen propiedades que los hacen ade-
cuados para ser utilizados como herramientas biotecnológicas. Sin embargo, cual-
quier microorganismo del suelo debe mostrar al menos una característica
beneficiosa con el fin de ser considerado para su producción comercial y la con-
siguiente aplicación a campo. Existen distintas alternativas de productos micro-
bianos que pueden ser utilizados. En general, pueden ser clasificados en algunos
de los siguientes tipos: microorganismos fijadores de nitrógeno, agentes de control
de plagas, rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, generalmente llama-
das PGPR por su sigla en ingles (plant gorwth promoting rhizobacteria), y micro-
organismos para la biorremediación. Cualquier cepa específica debe moverse a
través de varios pasos antes de convertirse en un inoculante microbiano. En primer
lugar, el desarrollo de un nuevo producto microbiano para la agricultura o biorre-
mediación comienza con el descubrimiento de un organismo natural útil. Esto sólo
se puede conseguir mediante el establecimiento de objetivos específicos de selec-
ción que deberán ser probados en cada cepa aislada. Una secuencia de experimen-
tos de laboratorio, invernadero y de campo se realiza generalmente con el fin de
reducir el enorme número inicial de los aislamientos obtenidos a un pequeño grupo
de cepas seleccionadas que tienen una combinación de características con poten-
cial comercial. Los programas de detección son generalmente llevados a cabo por
instituciones oficiales o laboratorios universitarios. La mayoría de los aislamientos
de suelo prometedores se han obtenido en los laboratorios de la universidad y
luego se licencia a las empresas privadas para desarrollar formulaciones comer-
ciales. Los inoculantes microbianos para la agricultura deben ser vendidos en una
forma que los agricultores puedan aplicar fácilmente. Los inoculantes líquidos
son los más aceptados debido a que pueden aplicarse fácilmente sobre las semillas
antes de la siembra. En este capítulo, se dedica especial énfasis a un determinado
grupo de los microorganismos del suelo. Estas son las PGPR que suelen estar aso-
ciados con las plantas de interés agrícola y en muchos casos se observan efectos
beneficiosos directos sobre el crecimiento y la nutrición vegetal. Debido a eso,
constituyen una alternativa ecológica y económica para aumentar la producción
de alimentos (Bashan et al., 2004; Caballero Mellado, 2004; Díaz-Zorita y Canigia
Fernández, 2008; Ferraris y Courerot, 2004; Naiman et al., 2009.; Reed y Glick,
2004). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el impacto de las interacciones
entre los cultivos y los microbios del suelo sobre la circulación de nutrientes puede
ser considerable. A este respecto, el aumento en la producción de biomasa vegetal
debido a la inoculación con PGPR puede afectar a la mineralización de nutrientes,
la solubilización del fósforo, la fijación biológica de nitrógeno (FBN) y otros pro-
-368-
Utilización de la rizobacteria Azospirillum para aumentar el crecimiento vegetal ...
cesos biológicos asociados con la dinámica de los nutrientes en el sistema pro-

ductivo. Por lo tanto, se requiere un conocimiento detallado de las interrelaciones
entre los microorganismos añadidos al sistema (inoculantes) y los nativos o natu-
ralizados presentes en el suelo y/o asociados a las plantas de cultivo. Sin embargo,
sabemos muy poco acerca de la influencia de las prácticas de manejo, tales como
la inoculación con PGPR y la fertilización de los cultivos sobre la estructura y
funcionamiento de las comunidades microbianas. Según Wardle (2002), la gene-
ración de información que conecte los procesos que ocurren en la porción aérea
del sistema con aquellos que tienen lugar en la parte subterránea es uno de los
desafíos actuales que enfrenta la investigación agroecológica.
Azospirillum: La PGPR
Existe abundante evidencia en la literatura que indica que el uso de PGPR

puede tener un papel importante en la sostenibilidad del agroecosistema (Antoun
y Prévost 2006). Los inoculantes microbianos de PGPR representan una nueva
tecnología diseñada para mejorar la productividad de los sistemas agrícolas en el
largo plazo. Sin embargo, el uso actual de los microorganismos en la agricultura
se mantiene en un nivel bajo, a pesar de la importante inversión y la acumulación
de trabajos científicos (Cartroux, 2007). Los inoculantes de PGPR pueden ser vis-
tos como una tecnología acorde con los principios de la agricultura sostenible, en
comparación con el aumento del uso de pesticidas y fertilizantes. Este enfoque se
lo plantea como una nueva revolución verde y ha sido considerado prioritario en
la agricultura del siglo XXI (Lynch 2007; Gewin 2010).
Varios microorganismos se utilizan en la práctica agrícola, y otros tienen
potencial para su uso futuro (Cassan y García de Salamone 2008, Maddonni et
al., 2004). La mayoría de ellos tienen la capacidad de colonizar y establecer una
relación permanente con las plantas que producen los aumentos de la biomasa,
del crecimiento de la raíz y del rendimiento comercial (Glick, 1995). En este sen-
tido, a principios de los años 80 del siglo XX, la asociación entre la bacteria dia-
zotrófica del género Azospirillum y cultivos de cereales ya había sido considerada
como un fenómeno de gran valor científico y económico. La experimentación
también ha demostrado que un gran número de factores influyen en la respuesta
de la inoculación en condiciones de campo. Actualmente se puede decir que las
bacterias del género Azospirillum son el grupo de PGPR más utilizado desde que
el potencial para aumentar la producción de cultivos en asociaciones con diversos
tipos de plantas fue informado por primera vez por Döbereiner y sus colaboradores
(Baldani et al., 1987). Los efectos positivos sobre crecimiento de las plantas se
evidencian a través de varios mecanismos que incluyen: aumento en la producción
-369-
de raíces, la producción de reguladores de crecimiento y la fijación de nitrógeno

entre otros (García de Salamone et al., 1996; Okon, 1994; Bashan et al., 2004)
El contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y diversos micronutrientes es
mayor en las plantas inoculadas con Azospirillum (Caballero Mellado et al., 1992;
García de Salamone et al., 1996). Los efectos significativos se han observado en
el trigo (Boddey et al., 1986; Caballero Mellado et al, 1992; Naiman et al., 2009),
maíz (Caballero Mellado, 2004; García de Salamone y Döbereiner, 1996), soja
(Bashan et al., 1990) y el arroz (Baldani y Baldani 2005, García de Salamone et
al., 2010), entre otras especies, incluyendo a más de un centenar de cultivos y es-
pecies vegetales de importancia ambiental (Bashan et al., 2004). Una reciente pu-
blicación compila los datos de la experimentación en diferentes países y las
respuestas de inoculación con Azospirillum (Cassan y García de Salamone, 2008).
El análisis de la sostenibilidad y la rentabilidad requiere un conocimiento
detallado de las interrelaciones que existen entre los microorganismos común-
mente añadidos como inoculantes y aquellos dentro del sistema natural (García
de Salamone et al., 2006b.. Naiman et al., 2009). Varios autores han informado
de los efectos de Azospirillum en el desarrollo de la raíz con la consiguiente ventaja
en la absorción de agua y nutrientes (Bashan y Levanony 1990; García de Sala-
mone et al, 1996; Okon, 1994). Sin embargo, la mayor parte de esta información
corresponde a experimentos realizados en condiciones controladas. Por lo tanto,
es necesario analizar los efectos de los inoculantes comerciales y experimentales
con el fin de obtener mejores cosechas y un mejor uso de los recursos ambientales.
Los inoculantes a base de Azospirillum se han combinado con varias PGPR in-
cluyendo cepas de Pseudomonas fluorescens. Estas han sido caracterizadas como
solubilizadoras de fósforo con la capacidad de producir ácidos orgánicos (tales
como ácido oxálico, ácido fumárico y ácido cítrico) y fosfatasas que facilitan la
solubilización de este y otros nutrientes (de Freitas et al., 1997; Rodríguez et al.,
2006). Además, se ha demostrado que algunas cepas de P. fluorescens pueden pro-
ducir y suministrar varias citoquininas en la rizosfera de trigo y rábano (García
de Salamone et al., 2001, 2005). Sin embargo, la mayor cantidad de información
acerca de la actividad de las cepas de Pseudomonas se asocia con los efectos in-
directos, a través del control de los microorganismos patógenos. Esto puede re-
ducir la incidencia de las enfermedades a través de varios mecanismos, incluyendo
el aumento de la capacidad competitiva por los nutrientes disponibles, la produc-
ción de antibióticos, sideróforos y la inducción de resistencia sistémica (Kloepper,
1993).
La información analizada en este capítulo muestra que la inoculación con
PGPR tales como A. brasilense y P. fluorescens puede modificar a las comunida-
des microbianas cultivables de la rizosfera y el crecimiento de plantas en condi-
-370-
ciones de campo. La inoculación con estos dos microorganismos rizosfericos con-

tribuye a la aparición, el desarrollo y la producción de cereales de cultivos tales
como trigo, arroz y maíz (Baldani et al., 2008; García de Salamone et al., 1996;
2010; Naiman et al., 2009). Hay algunas pruebas en condiciones controladas que
muestran que la aplicación Azospirillum no cambia la estructura de las comuni-
dades microbianas asociadas (Herschkovitz et al., 2005). Sin embargo, se ha ob-
servado que hay algunos indicios del efecto de la inoculación con esta PGPR sobre
el índice de diversidad de Shannon-Weaver de las comunidades microbianas aso-
ciadas a la rizosfera de trigo (Naiman et al., 2009) y de arroz (García de Salamone
et al., 2010). Por esto, todavía es necesario comprender mejor las interacciones
microbianas que se producen en el sistema suelo-planta en condiciones de campo
para evaluar el efecto global de esta tecnología de inoculación en el agroecosis-
tema y para lograr la máxima eficiencia (García de Salamone y Monzón de Asco-
negui 2008).
El promedio de dos experimentos de campo ha demostrado que cuatro ino-
culantes comerciales tienen diferente impacto en el rendimiento de trigo en la re-
gión semiárida occidental de la provincia de Buenos Aires (García de Salamone,
2012). Dado que todos estos inoculantes comerciales tenían la misma cepa de A.
brasilense, estas observaciones indican que la interacción entre el cultivo y el ino-
culante no permite confirmar una respuesta promedio con una cepa en particular
cuando se utilizan diferentes formulaciones. Otros ingredientes además de la cepa
de PGPR incluida pueden cambiar la calidad de los inoculantes y en consecuencia
su eficiencia. Todavía se requiere normalización de las metodologías de control
de calidad aunque recientemente ciertos progresos han sido desarrollados (Cassan
et al., 2010).
El análisis combinado de los experimentos descritos en la Tabla 1 muestra
que la inoculación con A. brasilense aumenta el rendimiento de los cultivos de
trigo, maíz y arroz. Además, tanto la partición a grano como la producción de bio-
masa total se puede aumentar a través de la práctica de la inoculación con esta
PGPR. Un ejemplo de este tipo de respuesta a la inoculación fue informado por
Naiman et al, (2009) quienes han observado que, la inoculación con esta PGPR
incrementó la biomasa aérea en un 12%, la biomasa de raíces en un 40% y el ren-
dimiento de grano en un 16%. Aumentos en el rendimiento en grano representan
ganancias importantes para el agricultor y el incremento tanto de la biomasa aérea
y radical puede ayudar a conseguir una mayor sostenibilidad de los agroecosiste-
mas ya que los residuos de la planta aportados podrían ayudar a mantener la ma-
teria orgánica del suelo.
-371-
Tabla 1. Síntesis de ensayos de inoculación

Porcentaje de
Cultivo y Cantidad de
Numero de Geno- Ensayos con
Numero de Fertilización PGPR Inoculantes
tipos ensayados respuesta
Ensayos Evaluados
positiva
Maíz (9) 41 Si Azospirillum 23 93
Trigo (19) 18 Si A.b; P.f 27 89
Arroz (3) 3 No A.b; P.f 4 100
A.b: Azospirillum brasilense y P.f: Pseudomonas fluorescens.
Compilado de García de Salamone et al, 1996, 2006, 2007, 2009, 2010; 2012;
García de Salamone y Monzón de Asconegui 2008; Naiman et al., 2009; Gatica et al., 2009.
El arroz es la tercera mayor cosecha mundial de alimentos. Debido a esto

su cultivo debe formar parte de los programas de agricultura sostenible. Tres ex-
perimentos realizados durante las campañas agrícolas 2006-2007, 2008-2009 y
2009-2010 en la zona arrocera de la provincia de Entre Ríos, en la región NE de
Argentina permitieron la evaluación de la respuesta a inoculación con inoculantes
multicepa de A. brasilense (Tabla 1). En dos de estos casos, se observó el efecto
de A. brasilense en la producción de biomasa y rendimiento de grano (García de
Salamone et al., 2010, Gatica et al., 2009). La biomasa de las plantas control fue
de 7.256 y 15.183 kg ha-1 en macollaje y el llenado del grano, respectivamente.
El tratamiento con A. brasilense incrementó significativamente estos valores en
un 15 y 35% para el macollaje y el 28 y 50% para el llenado del grano. El control
produjo 8370 kg ha-1 de grano y la inoculación aumentó este valor en un 7,5%.
En estos estudios también se analizó la microflora de la rizosfera con capacidad
de fijar nitrógeno, utilizando diversas metodologías. Además se observó un au-
mento del número más probable (NMP) de diazótrofos rizosféricos cultivables
cuando se inocularon las semillas con una mezcla de dos cepas de A. brasilense
(García de Salamone et al., 2010). Sin embargo, este MPN disminuyó entre las
etapas de macollaje y llenado de grano. En el mismo trabajo experimental se ob-
servó que la capacidad de utilizar cuatro fuentes de carbono por las comunidades
microbianas asociadas de la rizosfera de arroz fue diferente entre los tratamientos
en la etapa de llenado de grano. Este análisis utiliza los valores de absorbancia
para varias fuentes de carbono y los perfiles fisiológicos de las comunidades mi-
crobianas que se obtienen a través del análisis de componentes principales (Di
Salvo y García de Salamone, 2012). En este caso, las fuentes carbonadas, ácido
málico, manitol, oxalato de amonio y maltosa mostraron los mayores coeficientes
de correlación de Pearson. Debido a que estas fuentes de carbono están general-
mente presentes en la rizosfera, los cambios observados en su utilización pueden
estar relacionados con cambios en la diversidad fisiológica de comunidades mi-
-372-
crobianas asociadas a la rizosfera de arroz. En el caso del tercer ensayo, se analizó

el efecto de la inoculación combinada de dos PGPR. Estos fueron A. brasilense y
P. fluorescens. En este experimento, se analizó la respuesta a la inoculación de
tres genotipos de arroz que provenían de diferentes programas de mejoramiento
(García de Salamone et al., 2012). Las tasas de respuesta fueron significativamente
diferentes entre ellos. Esto demuestra la interacción significativa entre los geno-
tipos vegetales y las bacterias aplicadas al sistema. Los resultados de este trabajo
indican el alto potencial de la práctica de la inoculación con PGPR para este cul-
tivo y la posibilidad de incrementar su eficiencia a través de los programas de me-
joramiento que tengan en cuenta la asociación planta-bacteria durante su
desarrollo. En este sentido, García de Salamone y Dóbereiner (1996), propusieron
que la utilización con éxito de estas asociaciones bacteria-planta a escala agrícola
puede lograrse a través de los programas de fitomejoramiento que consideran el
enfoque propuesto por Donald (1968) y donde el ideotipo de planta sea aquella
que mejor se asocie con las comunidades microbianas benéficas del suelo. Esta
estrategia podría ayudar a obtener mejores combinaciones de ambos socios para
cualquier entorno agroecológico. Con base en los resultados de varios ensayos,
es posible concluir acerca de la relevancia de la interacción entre genotipos de ve-
getales y cepas PGPR. García de Salamone et al., (1993) analizaron la información
disponible acerca de la respuesta a la inoculación de Azospirillum en asociación
con el maíz y observaron una gran consistencia de los resultados en las diferentes
estaciones de cultivo y las condiciones ambientales. El análisis de la consistencia
reveló importantes aumentos en el rendimiento de grano (p<0,05), debido a la ino-
culación con Azospirillum para todos los experimentos evaluados (García de Sa-
lamone y Monzón de Asconegui, 2008).
Fijación biológica de nitrógeno (FBN)
La fijación biológica se vuelve relevante y puede ser incorporada en deter-

minadas asociaciones PGPR-cereales como fuente relevante de nitrógeno para el
agroecosistema (García de Salamone et al, 1996; Urquiaga et al, 2004). Se ha de-
mostrado que la inoculación con ciertas combinaciones bacteria-planta, tales como
Azospirillum-maíz puede proporcionar nitrógeno proveniente de la FBN en niveles
equivalentes a 100 kg ha-1 de este elemento (García de Salamone et al., 1996).
Este aporte de nitrógeno puede contribuir a la sostenibilidad del agroecosistema,
ya que puede mejorar la calidad de los residuos de la planta y permitir una reduc-
ción en el uso de fertilizantes de nitrógeno. Por otra parte, se observó que la ino-
culación con A. brasilense puede modificar la proporción 15N/14N de plantas de
arroz y de trigo en la etapa de llenado de grano (García de Salamone et al., 2009).
-373-
En el caso del arroz, se podría concluir que la cantidad de nitrógeno derivado de

FBN aumentó cuando se aplicó la inoculación con ciertas cepas de Azospirillum.
En el caso de trigo, las estimaciones se realizaron considerando tres plantas de
malezas que crecieron contemporáneamente con el cultivo y que se utilizaron
como controles no fijadores para estimar la ocurrencia de la fijación de nitrógeno
a través de la técnica de dilución de 15N (Boddey, 1987). Las plantas de trigo mos-
traron diferencias significativas entre los genotipos en los valores de las propor-
ciones 15N/14N. La gran variabilidad en estas proporciones en las plantas de trigo
no inoculados estaría indicando la posibilidad de utilizar estos valores para calcular
la cantidad de nitrógeno derivado de FBN en plantas de trigo inoculadas. La rela-
ción 15N/14N media de las tres plantas de malezas en el experimento de trigo fue
de 8,64 y se utilizó para estimar el porcentaje de N proveniente de la FBN. Se ob-
servó una significativa variabilidad entre los genotipos de la planta como se in-
formó anteriormente con genotipos de maíz (García de Salamone et al., 1996) en
asociación con A. brasilense. Los cálculos indicaron que el rango de porcentaje
promedio de nitrógeno derivado de FBN fue 13-55% para el grupo de genotipos
de trigo analizado. Estos datos indican que la inoculación con A. brasilense puede
producir cambios en la fisiología de las plantas que pueden estar relacionados con
la ocurrencia de FBN. Si bien para aumentar la precisión, es necesario obtener
mejores estimaciones de los valores de las proporciones 15N/14N del suelo (Alves
et al., 2008), esta información brinda evidencias sobre las posibilidades del me-
joramiento para aumentar la eficiencia de la interacción Azospirillum-trigo y en
consecuencia la sostenibilidad del agroecosistema. El número más probable de
microorganismos oxidantes del amonio aumenta cuando las semillas de los culti-
vos de arroz y trigo se inocularon con A. brasilense. Sin embargo, el nitrógeno
potencialmente mineralizable (NPM) mostró diferentes respuestas respecto a la
inoculación de estos dos cultivos (D’Auria et al., 2011). Los valores de NPM para
las plantas de arroz fueron significativamente inferiores en el suelo asociado con
las plantas inoculadas. Lo contrario se observó para el cultivo de trigo, donde, el
NPM del suelo asociado con las plantas de trigo no inoculadas fue 5,3 mg de N-
NH4 kg-1 de suelo, que fue significativamente (p <0,05) inferior a 10,3 mg de N-
NH4 kg-1 de suelo asociado con las plantas inoculadas. A partir de estos datos,
podemos inferir que los cambios de la fisiología de las plantas de arroz y de trigo
producidas por inoculación de A. brasilense podrían favorecer la FBN en estos
cultivos de gramíneas y cambiar la actividad y el número de los microorganismos
asociados al ciclo del N.
-374-
Síntesis y perspectivas
Los resultados incluidos aquí demuestran la capacidad de A. brasilense para

modificar la ecofisiología de cultivos como el trigo, el maíz y el arroz en condi-
ciones de campo. Sin embargo, la información disponible indicaría que la inter-
acción ambiente-cepa-planta es relevante para los resultados de la inoculación que
se pueden obtener (García de Salamone y Monzón de Asconegui 2008). Se ob-
servó que la respuesta de la inoculación es variable y las bacterias introducidas
pueden colonizar y permanecer en la rizosfera. El aumento del rendimiento y de
la producción de biomasa tienen relevancia ecológica y deben ser estudiados sis-
temáticamente desde el punto de vista de la ecología microbiana. Además, estos
aspectos deben ser estudiados usando cepas con capacidad de fijar nitrógeno en
asociación con la planta. Esto podría aumentar el nivel de respuesta y mejorar la
eficiencia del uso de los recursos disponibles. La introducción de una determinada
cepa PGPR podría causar cambios en la actividad microbiana de la rizósfera, que
deberían ser estudiados en detalle (García de Salamone y Cassan 2010). Se sabe
que la diversidad microbiana se puede utilizar como un índice de la calidad del
suelo y las condiciones de manejo pueden modificarla (García de Salamone et al.,
2006, 2010). En conexión con esto y debido a que la práctica de la inoculación
con A. brasilense y otras PGPR está siendo utilizada por un número creciente de
agricultores en diversas áreas agrícolas del mundo, es necesario proporcionar co-
nocimientos sobre la ecología microbiana de la rizosfera de los cultivos en condi-
ciones de campo durante su desarrollo y en varias ocasiones luego de la cosecha
de los mismos para determinar si los cambios producidos son temporarios o per-
manentes
Los resultados hasta aquí expuestos son consistentes con los presentados
por Reed y Glick (2004), Bashan et al., (2004), Cassán y García de Salamone
(2008), García de Salamone y Cassan (2010). Toda la información disponible in-
dica que la inoculación con PGPR en general y A.brasilense en particular debe
favorecerse porque conlleva a una agricultura sostenible. Sin embargo, la interac-
ción entre PGPR y la planta debe ser ajustada y mejorada con el fin de incluir me-
canismos alternativos como la FBN, la producción de reguladores de crecimiento
vegetal, el control biológico de patógenos, entre otros, para mejorar los niveles
de respuesta a la inoculación en condiciones de campo.
En resumen, los efectos directos de la utilización de Azospirillum en culti-
vos de cereales ejercen un papel importante en los procesos fundamentales del
ecosistema. El enfoque de estos problemas con los experimentos de campo ofrece
un conjunto de pruebas que ha implicado la interacción del autor en varios equipos
de investigación. Se espera que esta revisión se traduzca en más contribuciones
-375-
que se orienten a conectar procesos que ocurren en la parte aérea con los procesos
edáficos del ecosistema.
Agradecimientos
Todos los trabajos experimentales cuyos resultados se incluyeron en esta

revisión fueron parcialmente financiados por PROSUL/Edital CNPq Nº 40/2005,
ANPCYT, FONCYT-PICT 488 y 1864 y UBACYT AG418 y AG 028. La autora
agradece profundamente la dedicación al trabajo de todos sus estudiantes de grado
y posgrado así como a los colaboradores de investigación que participan con gran
entusiasmo en el campo y en el laboratorio. Un agradecimiento especial para los
agricultores que abrieron sus campos a la experimentación y a las empresas que
proporcionaron los inoculantes de PGPR utilizados en algunos de los experimentos
descritos en este capítulo.
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Aplicación de biofertilizantes formulados con
Azospirillum sp. en especies hortícolas
Application of biofertilizers formulated with

Azospirillum sp. in horticultural crops
Garbi, Marianaa, Federico Vitab,

Enrique Rodríguez Cáceresc, Susana Carlettib
Resumen
La utilización de Azospirillum sp. como biofertilizante resulta de interés

por su capacidad para producir reguladores de crecimiento, antibióticos y sideró-
foros y mejorar la tasa de absorción de agua y nutrientes. En hortalizas, aún es
escasa la información sobre su efecto, aunque se observaron resultados alentadores
en el crecimiento de plántulas y en la productividad de diferentes cultivos. En
plántulas de tomate y lechuga inoculadas con 12 cepas de A. brasilense se aumentó
el peso fresco de planta, longitud total de raíz y área de absorción radical, con
efectos diferenciales según cepa. Respuestas similares se registraron en plántulas
de tomate, lechuga y pimiento cuando se inocularon a la siembra con 2 formula-
ciones compuestas por combinaciones de 3 y 5 cepas. En tomate, la inoculación
con diferentes cepas de A. brasilense produjo frutos de mayor peso, y una tenden-
cia al aumento de rendimiento; mientras que en lechuga y zapallito, se favoreció
el crecimiento de plantas, la precocidad y el rendimiento. También se observaron
efectos favorables sobre la producción y calidad en maíz dulce y frutilla. La in-
corporación de Azospirillum sp. es una práctica promisoria en horticultura, ten-
diente a disminuir el uso de insumos químicos, conduciendo hacia una producción
más sustentable.
Palabras clave: bioestimulantes, hortalizas, PGPR.
a
Depto. de Tecnología, Universidad Nacional de Luján, 6700 Luján, Buenos Aires, Argentina. Correo
electrónico: mariana.garbi@gmail.com.
b
Depto. de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, 6700 Luján, Buenos Aires, Argentina
c
Asesor privado
-383-
Introducción
La horticultura es una actividad intensiva en la que la incorporación de tec-

nología, incluyendo el uso de fitosanitarios y fertilizantes, ha permitido alcanzar
incrementos importantes en los rendimientos y calidad de la producción. Sin em-
bargo, en los últimos años, ha comenzado a observarse una preocupación creciente
por el impacto que el uso excesivo de estos insumos puede producir sobre el medio
ambiente, la inocuidad de los alimentos y la salud de los trabajadores. En este
contexto, los productos biológicos con características bioestimulantes son una he-
rramienta útil para aumentar la fertilidad de los suelos y la provisión de nutrientes
a la planta, con respuestas promisorias sobre el crecimiento, rendimiento y sanidad
(Jee, 2004). Este tipo de biotecnologías se consideran “amigables” para el medio
ambiente en la medida que favorecen una menor necesidad de fertilización quí-
mica, así como una reducción en el uso de pesticidas (Bacilio-Jimenez et al., 2003;
Cassán y García de Salamone, 2008; Olivares et al., 2013). En las especies hortí-
colas aún es escasa la información disponible sobre la respuesta de la planta a este
tipo de formulaciones, aunque existen experiencias en las que se han observado
efectos favorables sobre el crecimiento de la plántula, así como en la productividad
del cultivo (Carletti et al., 2011 a, b; Carletti et al., 2012 a).
Entre las bacterias de aplicación en agricultura se encuentran las del género
Azospirillum (Monzón de Asconegui, 2003; Okon, 2008). Estos microorganismos
están clasificados como PGPR por su capacidad de promover el crecimiento de
las plantas. Los mecanismos por los que pueden producir cambios que favorecen
el crecimiento de las plantas se clasificaron como directos (fijación biológica de
nitrógeno, producción de fitohormonas, solubilización de fosfatos inorgánicos,
producción de sideróforos) e indirectos como el control biológico, por la produc-
ción de metabolitos con acción antibiótica y por la competencia generada por mi-
croorganismos por el espacio en la rizósfera (Glick, 1995; Ongena et al., 2005).
Este microorganismo ha sido estudiado en profundidad en muchos centros de in-
vestigación y universidades en todo el mundo. Si bien se han determinado algunos
mecanismos de acción utilizando mutantes, su efecto promotor presenta bastantes
interrogantes, especialmente relacionados a la determinación de los factores con-
dicionantes de su establecimiento en la rizosfera de las plantas (Fibach-Paldi et
al., 2011). Lo interesante de este microorganismo es que su reproducción es fácil
en condiciones de laboratorio e industriales y se puede lograr un número elevado
de bacterias por mL con medios de cultivo simples y económicos.
Si bien aún no está comprobado fehacientemente, existe un número de bac-
terias por gramo de raíz necesarias para que se produzca un efecto promotor. Se
ha documentado que este valor oscila entre 106 y 107 unidades formadoras de co-
-384-
Aplicación de biofertilizantes formulados con Azospirillum sp. en especies hortícolas
lonias (ufc) por g de raíz colonizada (Hadas y Okon, 1987). Normalmente se pre-
tende que esta cantidad de bacterias pueda estar presente en cada semilla o en cada
g de suelo, pero lo más importante no está relacionado al número de organismos
sino a brindar a la planta las mejores condiciones para lograr que esta población
se establezca y colonice las raíces. El ambiente rizosférico ofrece a los azospirilos
exudados ricos en compuestos orgánicos como ácido málico, succínico, pirúvico,
compuestos aminados, y vitaminas entre otras sustancias, que actúan como estí-
mulos quimiotácticos permitiendo el anclaje de las células a la superficie radicular.
Los factores que afectan la colonización radical son la especie de la planta y la
bacteria, como así también los factores ambientales (Monzón de Asconegui, 2003).
Se ha expresado en muchas oportunidades que las hortalizas se cultivan en
ambientes muy ricos en materia orgánica y bien provistos de nutrientes. Esta si-
tuación hace que los cultivos se desarrollen en ambientes edáficos con una abun-
dante presencia microbiana. Las bacterias adicionadas con los inoculantes deben
sobrevivir y establecerse en las raíces a medida que crezca el sistema radical. Sin
embargo, aún en estas condiciones la inoculación con Azospirillum produjo cam-
bios en las plantas tratadas que llevaron a incrementos en el crecimiento y en los
rendimientos (Puente et al., 2007).
Efecto de la inoculación con A. brasilense sobre la producción

de plantines y los rendimientos
Tomate
El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), denominado más moderna-
mente como Lycopersicon lycopersicum (L.) Fawell, es una especie de origen sub-
tropical perteneciente a la familia Solanaceae. Su centro de origen se encuentra
en la zona de Perú y Ecuador, desde donde se extendió al resto de América y se
introdujo en Europa en el siglo XVI. Es una planta perenne que se cultiva como
anual. Posee un sistema radical amplio, cuya mayor parte se ubica en los primeros
50 cm de suelo, constituido por una raíz principal, gran cantidad de ramificaciones
secundarias y raíces adventicias provenientes de la base del tallo. La planta puede
desarrollarse de forma rastrera, semirrecta o erecta, pudiendo alcanzar una altura
de 10 m en las variedades de crecimiento indeterminado (Maroto Borrego, 1992;
Chamarro Lapuerta, 1995). El consumo de esta hortaliza está ampliamente gene-
ralizado en todo el mundo. En la Argentina es uno de los cultivos hortícolas de
mayor importancia económica, con un consumo de 27 kg.hab-1.año-1, lo que de-
termina un mercado de 1.134.000 t.año-1. Entre las principales zonas productoras
de tomate para consumo en fresco se encuentra la región del noroeste (Salta, Jujuy
y Santiago del Estero) con unas 5500 ha de cultivo, de las que 250 ha se realizan
-385-
bajo invernadero; la provincia de Corrientes con 800 ha de cultivo bajo cubierta;

el cinturón hortícola de Buenos Aires con 1400 ha, predominantemente bajo in-
vernadero; Mar del Plata y Mendoza con 1200 ha y la región patagónica con 200
ha, principalmente a campo. El cultivo de tomate para industria ocupa en promedio
unas 7500 ha ubicadas en Cuyo, el noroeste argentino y Río Negro (Argerich y
Troilo, 2011). El nivel de producción alcanzado por el cultivo es variable según
las zonas de producción y la tecnología utilizada, pudiendo variar entre 18 a 20
t.ha-1 en cultivos a campo sin conducción hasta más de 150 t.ha-1 en cultivos bajo
invernáculo, utilizando híbridos y tecnologías modernas. El aumento en los ren-
dimientos y la mejora en la calidad de los frutos están dados por la incorporación
de insumos como agroquímicos y fertilizantes, pero comienza a observarse una
preocupación creciente por el impacto que el uso excesivo de estos productos pue-
den producir sobre el medio ambiente (Premsekhar y Rajashree, 2009), situación
en la que la incorporación de microorganismos promotores del crecimiento puede
resultar una alternativa de interés.
Alvarez Mitre (2011), trabajando en la etapa de plantinera evaluó la res-
puesta a la inoculación con 12 cepas diferentes de A. brasilense. Las plántulas se
produjeron en bandejas de germinación, con un sustrato en base a turba y la ino-
culación fue realizada a la siembra con 1 x 107 ufc semilla-1. Las cepas ensayadas
fueron Cd, Az39, Sp7, UNLu7, Pl3, Pl 7, Pl45, Pl49, Pl50, Pl59, Pl64, Pl69, uti-
lizando plantas sin inocular como controles. La inoculación influyó positivamente
sobre el sistema radical, destacándose las cepas Pl59, UNLu7, Pl7 y Pl 49 que in-
crementaron la longitud total de la raíz, respecto al control, y a las que se sumó
Pl45 por su efecto sobre el área de absorción (Tabla 1).
Tabla 1. Efectos de la inoculación a la siembra de plántulas de tomate con cepas de A. brasilense
Longitud total de raíz (cm) Área de absorción radical (mg Ca(NO3)2)

Control 19,6 b 17 b
Pl45 25,0 a b 46 a
Az39 25,8 a b 31 a b
Pl64 26,9 a b 27 a b
Cd 27,1 a b 29 a b
Pl69 27,5 a b 22 a b
Pl50 27,7 a b 27 a b
Pl3 30,4 a b 27 a b
Sp7 30,5 a b 28 a b
Pl59 31,3 a 40 a
UNLu7 32,4 a 44 a
Pl7 36,1 a 41 a
Pl49 36,2 a 40 a
Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0,05)
según test de Tukey.
-386-
Trabajando en colaboración con la Estación Experimental de Gorina del

Ministerio de Asuntos Agrarios de la provincia de Buenos Aires se realizaron du-
rante 3 años ensayos con inoculantes experimentales en diversas variedades de
tomate bajo sistema de producción orgánica y/ó con manejo tradicional. La apli-
cación de A. brasilense modificó el peso medio de los frutos obtenidos, según fue
observado en un ensayo con tomate línea Platense, conducido bajo invernadero e
inoculado 15 días después del transplante con 5 x 107 ufc planta-1 con una formu-
lación comercial (cepa Az39) y la formulación experimental M3 (cepas
Az39+Pl64+Pl3), utilizando plantas sin inocular como controles. Las plantas ino-
culadas produjeron frutos significativamente más pesados, y si bien el rendimiento
no fue significativamente modificado por los tratamientos ensayados, las plantas
inoculadas presentaron una tendencia a aumentar su producción, con incrementos
de entre 11% y 16%, respecto al testigo (Tabla 2); tendencia que se mantuvo du-
rante todo el periodo de cosecha (Garbi et al., 2012 a). En condiciones similares
se observó un incremento significativo del 56% (P ≤ 0,05) en el número de tomates
por planta inoculada donde el peso fresco promedio de los tomates fue de 256g,
mientras que el de los controles fue en promedio 201g (Vita et al., 2007). Asi-
mismo, se investigó el efecto del inoculante experimental M3 en un ensayo en
cultivo orgánico de cuatro variedades de tomate “cherry”. En la mayoría de los
cultivares experimentados se observó un efecto beneficioso de la inoculación con
tendencias similares en dos años de experimentación. El número de tomates por
planta se incrementó entre el 17% y el 117% según el cultivar por efecto de la
inoculación. Se detectaron tomates más pesados a causa de la bacterización en
tres variedades, donde el peso del fruto presentó incrementos hasta el 34%. Al
analizar la producción total de tomates por planta se pudo observar en algunos de
los tratamientos inoculados un aumento entre 300 y 600 g (Carletti et al., 2008).
Tabla 2. Respuesta de plantas de tomate Platense inoculadas al transplante con 2 formulaciones
de A. brasilense
Peso medio de fruto (g) Rendimiento (g. planta-1)
Formulación comercial (cepa Az39) 187 a 1238 a
Formulación M3 (cepas Az39, Pl64 y Pl3) 170 a 1128 a
Control sin inocular 142 b 1039 a
Díaz e Iglesias (2002) en la provincia de Corrientes observaron que plantas

de tomate tratadas con A. brasilense alcanzaron mayor altura (11%) respecto al
testigo, diferencia que se mantuvo durante 50 días posteriores al transplante, pre-
sentando también un área foliar (36%) y volumen de raíz significativamente más
elevado.
-387-
La utilización de A. brasilense es una alternativa válida para reducir los

aportes de fertilizantes químicos en tomate. Alfonso et al. (2005) obtuvieron frutos
de pesos equivalentes en plantas inoculadas con Azospirillum sp., fertilizadas con
120 kg N.ha-1 y en plantas sin inocular fertilizadas con 150 kg N.ha-1, con incre-
mentos estadísticamente significativos respecto al testigo sin inocular ni fertilizar.
Además Premsekhar y Rajashree (2009), también reportaron incrementos en el
tamaño de los tomates obtenidos, al evaluar la aplicación de distintos tipos de bio-
fertilizantes en combinación con la fertilización química.
Trabajos más básicos sobre la colonización y fisiología de azospirilos aso-
ciados a raíces de plantas de tomate fueron realizados por investigadores argenti-
nos. Ribaudo (2010) demostró que plantas de tomate reaccionan ante la presencia
de A. brasilense regulando la expresión de un número de genes cuya categoriza-
ción funcional se manifiesta como reacciones de defensa frente a la infección por
patógenos. Sin embargo hay una colonización fructífera por estas bacterias en
forma endofítica relacionada con la producción de etileno (Ribaudo et al., 2006).
Además Creus et al. (2005) demostraron la participación del óxido nitroso (NO)
sobre la formación de raíces laterales en este cultivo.
Lechuga
La lechuga (Lactuca sativa L.) es una planta herbácea de la familia Astera-
ceae El origen de esta especie no se encuentra bien definido, dado que su más se-
guro antecesor Lactuca scariola L. se encuentra en estado silvestre en la mayor
parte de las áreas templadas (Maroto, 1992). Es prácticamente la única hortaliza
que se consume únicamente en fresco, siendo la especie más utilizada en la pre-
paración de ensaladas. En la Argentina, se cultivan unas 9841 ha, lo que representa
el 55% del total de la superficie destinada a hortalizas de hoja, entre las que se
agrupan acelga, espinaca, apio, radicheta y rúcula (Ferratto et al., 2010). El ciclo
de producción del cultivo se extiende de 35 a 120 días, dependiendo del cultivar
y la estación del año (Ferratto, 1996). La planta posee un sistema radical profundo.
En la fracción superior se originan raíces basales que crecen hacia 2 lados opues-
tos, próximas al hipocótilo y en forma horizontal. En la porción más larga, crecen
las raíces laterales, que se desarrollan en profundidad y producen abundantes ra-
mificaciones secundarias, explorando un volumen mayor de suelo, respecto a las
raíces basales que se desarrollan en las capas más superficiales y fértiles (Nicola,
1998). Las hojas, que pueden ser de forma redondeada, lanceolada o espatulaza,
se disponen primero en forma de roseta, y luego se aprietan formando un cogollo
de características diferentes según la variedad (Maroto, 1992). El uso de microor-
ganismos promotores del crecimiento es una práctica promisoria en este cultivo
que requiere buena disponibilidad de nutrición nitrogenada para la formación de
cogollos de buen tamaño y calidad.
-388-
En la obtención de plantines de esta hortaliza se observaron efectos bene-

ficiosos de la inoculación utilizando las mismas 12 cepas que en ensayos de tomate
en plantinera (Alvarez Mitre, 2011), con efectos fundamentalmente visibles sobre
el sistema radical. Según se observa en la Tabla 3, la cepa Sp7 aumentó el peso
fresco y seco radical, la longitud de la raíz más larga y la longitud total de la raíz.
Las cepas Cd y Az39 favorecieron el aumento del peso fresco y seco de la raíz,
mientras que el área de absorción radical fue incrementada fundamentalmente por
las cepas Pl50, Pl69 y Pl64 (Hernández, 2011).
Tabla 3. Efectos de la inoculación a la siembra de plántulas de lechuga con distintas cepas de A.
brasilense
Área de absorción
Peso fresco Peso seco de Longitud de la raíz Longitud total
radical
de raíz (mg) raíz (mg) más larga (cm) de raíz (cm)
(mg Ca(NO3)2)
Testigo 17 a b c 4,3 b c 2,58 c d 4,00 b 8de
Sp7 31 a b c 6,1 a b c d 4,03 a 6,14 a 10 b c d e
Pl50 11 a b 5,3 a b c d 3,68 b c 4,22 b 19 a
Pl64 7ab 2,3 a b 2,78 b c d 3,40 b 14 a b c
UNLu7 22 a b c 5,8 c d 2,72 b c d 4,22 b 9cde
Pl49 16 a b c 8,0 d 2,70 b c d 3,50 b 9cde
Cd 26 a b c 11,0 a b c d 2,67 b c d 4,37 b 9cde
Pl45 15 a b c 7,6 a b c d 2,64 b c d 2,88 b c 11 b c d e
Pl7 12 a b 5,0 a b c d 2,40 c d 3,71 b 9cde
Az39 22 a b c 8,0 a b c d 2,00 c d 4,11 b 6e
Pl69 5a 2,2 a b 1,95 d 1,66 c 15 a b
Pl3 15 a b c 4,1 b c 1,76 d 3,00 b c 12 b c d
Pl59 8ab 1,9 a 1,55 d 2,87 b c 8de
En la Tabla 4 se presentan los resultados obtenidos a partir de un ensayo

realizado con lechuga mantecosa conducida bajo invernadero, en el que se evaluó
el efecto sobre la producción de la inoculación con una formulación comercial
(cepa Az39) y la formulación M3, aplicadas sólo a siembra o a la siembra y trans-
plante (1 x 108 ufc semilla-1 en cada aplicación), comparando su comportamiento
con plantas sin inocular. Se observó que las plantas inoculadas mostraron una ten-
dencia a presentar mayor peso que los testigos, tanto cuando se inocularon sólo a
la siembra, como cuando se realizó una doble inoculación. La formulación co-
mercial produjo diferencias significativas respecto a las plantas sin inocular, lo
que podría deberse a la presencia de sustancias que favorecen la acción de los mi-
croorganismos en la formulación final del producto.
-389-
Tabla 4. Peso medio de plantas de lechuga a cosecha (50 días post-transplante) según tipo de for-
mulación y momento de inoculación
Tratamientos Peso medio de planta (g)

Formulación comercial siembra y transplante 375,10 a
Formulación comercial, sólo a la siembra 371,80 a
Formulación M3, siembra y transplante 357,73 a b
Formulación M3, sólo a siembra 350,75 a b
Control sin inoculación 312,65 b
También en lechuga mantecosa, Carletti et al. (2011 a) compararon el efecto

del momento de inoculación utilizando la formulación M3 aplicada sólo a la siem-
bra, a la siembra y al transplante y sólo al transplante. A la siembra se aplicó 1 ml
(1 x 107 ufc ml-1) de la formulación por semilla, y al transplante se aplicaron 50
ml de la misma formulación a cada planta. Se utilizaron plantas sin inocular como
control. En la Tabla 5 puede observarse que las plantas inoculadas en cualquiera
de los 3 momentos presentaron mayor velocidad de crecimiento, lo que se mani-
festó en el aumento significativo en el número de hojas 30 días después del trans-
plante y en el incremento en el peso fresco de las plantas en el mismo período,
que si bien no resultó estadísticamente significativo respecto al testigo, alcanzó
valores que lo superaron en 40% y 28%, según momento de inoculación.
Tabla 5. Crecimiento y peso medio de plantas de lechuga según momento de inoculación
Nº de hojas 30 días Peso fresco de la planta 30 Peso medio de planta 75

Tratamientos
post-transplante días post-transplante (g) días post-transplante (g)
Formulación M3,
31 a 178,99 a 597,93 a
sólo a la siembra
Formulación M3, a
30 a 190,28 a 573,56 a
siembra y transplante
Formulación M3,
30 a 174,96 a 585,41 a
sólo al transplante
Control sin
26 b 135,37 a 578,60 a
inoculación
según prueba no paramétrica de Kruskal Wallis
Al momento de cosecha, no se observaron diferencias estadísticamente sig-
nificativas entre los tratamientos, posiblemente porque las plantas inoculadas fue-
ron cosechadas en forma simultánea con las controles, sin considerar la mayor
precocidad que las primeras manifestaron durante todo el período de ensayos, que-
dando así enmascarados los resultados en relación a la plantas sin inocular.
-390-
Algunas de las cepas mencionadas previamente se utilizaron en forma com-

binada en dos formulaciones experimentales: la formulación M3 (ya descripta) y
la formulación M5, compuesta por el conjunto de cepas: Az39, Pl3, Pl64, UNLu7
y Cd. En lechuga se realizaron 3 ensayos, en los que las inoculaciones se realizaron
al momento de la siembra, aplicando 1 x 107 ufc semilla-1, en plántulas producidas
en bandejas de germinación, utilizando turba como sustrato. En el ensayo 1 se
comparó el efecto de la aplicación de las formulaciones M3 y M5 respecto a plan-
tas sin inocular (Carletti et al., 2011 b); en el ensayo 2 se aplicó M3, utilizando
como control plantas sin inocular (Carletti et al., 2011 a) y en el ensayo 3, los tra-
tamientos consistieron en la aplicación de M3, una formulación comercial en base
a la cepa Az39 y plantas sin inocular (Carletti et al., 2012 a). En todas las variantes
ensayadas, la inoculación tuvo un efecto favorable sobre el peso fresco de la parte
aérea. En el ensayo 1, ambas formulaciones incrementaron la superficie de absor-
ción y la formulación M5 aumentó también la longitud total de la raíz (Tabla 6).
La similitud observada en la respuesta entre plantas sometidas a uno o más
tratamientos de inoculación permite inferir que las dosis de producto utilizadas
en la inoculación a la siembra fueron adecuadas para garantizar una correcta co-
lonización de la rizósfera e interacción con la raíz, sin efecto adicional por un in-
cremento en la cantidad de microorganismos incorporados. Este mismo
comportamiento explicaría la falta de diferencias significativas observadas por
Garbi et al. (2011) al ensayar, también en lechuga mantecosa, dos dosis de A. bra-
silense cepa Az39 (1 x 107 ufc ml-1 y 1 x 108 ufc ml-1) aplicadas al momento de
transplante
Tabla 6. Peso medio de plantas de lechuga a cosecha según dosis de A. brasilense aplicadas al
transplante
Peso medio de planta a cosecha (g)

A. brasilense cepa Az39 – 1 x 107 ufc.ml-1 630 a
A. brasilense cepa Az39 – 1 x 108 ufc.ml-1 590 a
Control sin inoculación 510 b
Se determinó entonces que como respuesta a la inoculación se producen

aumentos en el peso de la planta de lechuga al momento de la cosecha, según se
comprobó utilizando distintos tipos de formulaciones y momentos de aplicación.
Con respecto a la modificación de la calidad nutricional de las plantas inoculadas
con A. brasilense Sp245, Fasciglione et al. (2011) encontraron aumento del con-
tenido de ácido ascórbico y del rendimiento aún en condiciones de crecimiento
con estrés salino.
-391-
Maíz dulce
El maíz dulce (Zea mays var. saccharata) es una planta de origen americano
perteneciente a la familia Poaceae (ex Gramíneas), siendo la única especie de
esta familia utilizada en la producción hortícola. Presenta raíces subterráneas, que
crecen oblicuamente hacia abajo, y raíces aéreas que se ramifican en el suelo,
cumpliendo funciones de absorción y sostén. El tallo es una caña de entrenudos
largos y las hojas presentan una lámina ancha y plana. Es una planta diclino mo-
noica, con las flores masculinas en panoja y las femeninas en una espiga. El fruto
es un cariopse que se consume al estado de grano lechoso, caracterizado por su
mayor contenido de agua y azúcar que de almidón (Bulnes Mendoza, 2012). En
la Argentina se cultivan unas 14000 ha, ubicadas principalmente en Salta, Jujuy,
Buenos Aires, Santa Fe y Formosa. Según estadísticas del 2010 al 2012, Salta
tiene una participación preponderante en el mercado en los meses de agosto a oc-
tubre, aportando el 43,4% de la producción; mientras que de diciembre a abril un
72 a 98% del ingreso al mercado proviene de Buenos Aires (Baron et al., 2013).
El grupo de investigación en biofertilizantes de la Universidad Nacional de
Luján condujo un ensayo a campo utilizando la variedad “Abasto” INTA de maíz
dulce. Se inocularon las semillas con diferentes cepas de A. brasilense y una mez-
cla de las mismas (formulación M5, ya descripta). El máximo rendimiento se ob-
tuvo con el tratamiento multicepa (M5) que produjo en promedio 3443 kg ha-1,
superando en 882 kg ha-1 al control sin inocular. Algunos tratamientos inoculados
individualmente con cada cepa mostraron un aumento en el número de choclos
(3% al 23%), mayor diámetro del tallo, mazorcas con mayor o igual contenido de
azúcares que el control sin inocular y aumentos en el tenor proteico del grano del
3 al 8 % (Vita et al., 2008).
Semillas de maíz dulce germinadas con preacondicionamiento hídrico e
inoculadas con A. brasilense lograron aumentar la longitud de la raíz y el peso
seco de las mismas (Casanovas et al., 2008). Trabajando con maíz dulce Puente
et al. (2009) lograron incrementar en forma significativa la altura de los plantines.
Así también consiguieron determinar la dosis de A. brasilense Az39 de 7 mL de
inoculante por planta con un título de 1 x 109 ufc mL-1 como la más óptima para
modificar el peso seco aéreo y radicular de los plantines.
Frutilla
La frutilla (Fragaria X ananassa Duchesne) pertenece a la familia Rosa-
ceae. La planta tiene un sistema radical fasciculado, formado por gran cantidad
de raíces que se ubican mayoritariamente en los primeros 25 cm de suelo. El tallo
está formado por un eje corto, denominado “corona” en el que hay numerosas es-
camas foliares. La corona posee yemas axilares de las que salen estolones en los
-392-
que aparecen rosetas de hojas y raíces adventicias, y que pueden a su vez ramifi-
carse formando nuevos estolones. Las hojas aparecen en roseta sobre la corona, y
en sus axilas aparecen las inflorescencias en forma de racimos, cimas bíparas o
unifloras. El fruto es un poliaquenio en el que la parte comestible es el receptáculo
hipertrofiado (Maroto Borrego, 1992). Las frutillas son cultivadas en diferentes
partes del mundo incluyendo áreas tropicales, subtropicales y templadas. La pro-
ducción mundial de frutillas es de 3 millones de toneladas al año y se ha incre-
mentado en las últimas dos décadas. Argentina posee una superficie implantada
de aproximadamente 1000 ha y produce frutillas durante los 12 meses alcanzado
promedios de 21000 toneladas anuales. El 70% de la producción se concentra en
las provincias de Tucumán y Santa Fe, siguiéndoles en importancia Buenos Aires,
Corrientes, Mendoza y provincias del sur del país (EEAOC, 2005). Actualmente,
Tucumán es la principal provincia productora, con una superficie implantada de
aproximadamente 650 ha y una producción promedio de 22750 toneladas al año,
de las que el 70% se congela y exporta (Kirschbaum, 1999; Rodríguez et al., 2009;
Pedraza et al., 2010 a).
En Tucumán el Dr. Bellone y su grupo iniciaron los estudios de la relación
planta-microorganismos en cultivo de frutilla con resultados muy interesantes (Be-
llone y de Bellone, 1995; Bellone et al., 1995). Así, la inoculación con Azospiri-
llum consigue mejores rendimientos de los cultivos de frutilla, reduciendo el uso
de agroquímicos y logrando mayor sustentabilidad en la producción (Kirschbaum,
1999). Salazar et al. (2008, 2011) en Tucumán investigaron cepas locales de Azos-
pirillum aisladas de raíces de frutilla. Inocularon plantines del cv. Camarosa en
forma separada cada cepa, en parcelas experimentales concluyendo que se logra
incrementar el rendimiento en promedio de 80 g por planta. Empleando un sistema
de cultivo orgánico Divizia de Ricci et al. (2008) concluyeron que la producción
de frutilla en un suelo orgánico sin rotación está más asociada al efecto de Azos-
pirillum que a las dosis de los fertilizantes orgánicos usados, por lo cual habría
que profundizar la relación entre dosis de fertilizantes orgánicos y los fijadores
libres de nitrógeno. Pedraza et al. (2010 a) trabajando con distintas cepas de Azos-
pirillum brasilense y varios cultivares de frutilla observaron promoción del cre-
cimiento y encontraron un efecto rizosférico pronunciado que estaba relacionado
con el contenido de azúcares y proteínas.
Pedraza et al. (2010 b) encontraron respuesta positiva a la colonización ri-
zosférica y endofítica por azospirilos trabajando con cepas marcadas con gen de
la proteína fluorescente.
También se observó control biológico en frutillas inoculadas con una cepa
de Azospirillum con capacidad de producción de sideróforos. Se emplearon dife-
rentes test fitopatológicos que caracterizan la resistencia sistémica inducida (RSI)
-393-
concluyendo que la inoculación redujo los síntomas de antracnosis en este cultivo

(Tortora et al., 2012).
Zapallito redondo de tronco

El zapallito redondo de tronco [Cucurbita maxima var. zapallito (Carr.) Mi-
llán], perteneciente a la familia Cucurbitaceae, es originario de América del Sur
y su cultivo es característico de los cinturones verdes y las zonas de producción
de primicias del noroeste y noreste de la Argentina (De Grazia et al., 2004). La
planta presenta ramificación en mata, lo que favorece se cultivo y se caracteriza
por el consumo de los frutos en estado inmaduro, cuando el pericarpio aún es
tierno (Bulnes Mendoza, 2012).
Experiencias desarrolladas con esta especie en el campo experimental de
la Universidad Nacional de Luján (Buenos Aires), demostraron que la inoculación
a la siembra con 1 x 107 ufc planta-1 de una formulación comercial (cepa Az39)
favoreció significativamente el aumento en peso fresco de la planta y el peso seco
de la raíz en determinaciones realizadas 30 días después de la siembra, respecto
al testigo sin inocular; mientras que la aplicación en igual dosis de la formulación
M3 (cepas Az39, Pl64 y Pl3) presentó una respuesta intermedia (Carletti et al.,
2012 b). A cosecha, ambos tratamientos de inoculación alcanzaron rendimientos
significativamente mayores que el testigo (Tabla 7) (Garbi et al., 2012 b).
Tabla 7. Crecimiento y rendimiento en zapallito de tronco inoculados con 2 formulaciones de A.

brasilense
Peso fresco aéreo (g) Peso seco radical (g) Rendimiento (kg planta-1)
Formulación comercial 16,20 a 1,58 a 1,76 a
Formulación M3 14,39 a b 1,28 a b 1,59 a
Control sin inoculación 12,40 b 1,10 b 1,24 b
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas en la columna (p ≤ 0,05)
Otras hortalizas
La inoculación con bacterias PGPR en otras hortalizas está muy poco estudiada,
sin embargo algunas experiencias argentinas aportan datos que servirán para la
continuación de estos estudios biotecnológicos.
En brócoli, Oberti Arnaudo et al. (2008) aplicaron inoculante de Azospirillum y
también de Pseudomonas en plantines. Evaluaron variables de crecimiento (peso
fresco y seco) cada 15 días y de rendimiento, encontrando que todos los trata-
mientos bacterizados superaron al control, resultando muy interesante la coino-
culación de ambos microorganismos.
En la Cátedra de Microbiología Agrícola de la Facultad de Ciencias Agrarias
(UNNE) en Corrientes se han realizado diversos ensayos de inoculación con Azos-
-394-
pirillum empleando especies hortícolas como rabanito, zapallo anquito y pepino

entre otras con resultados variables (Iglesias et al., 2000; Cracogna et al., 2001)
Algunos trabajos de fisiología vegetal fueron realizados por Pereyra et al. (2010)
en Balcarce con pepino. Investigaron la dinámica del crecimiento de las paredes
del hipocótile de plantas control e inoculadas con Azospirillum sp. 245. Las ob-
servaciones efectuadas les permitieron concluir que la inoculación facilitó una
mayor elongación y extensibilidad del hipocótile como índice del inicio de una
promoción del crecimiento vegetal.
En experiencias de la Universidad Nacional de Luján en pimiento, la inoculación
con A. brasilense empleando mezcla de varias cepas en formulaciones menciona-
das precedentemente (M3 y M5) produjo una respuesta similar a la descripta para
lechuga, aumentando también significativamente el peso fresco de la raíz y el peso
total de la planta (Carletti et al., 2011 b).
En espinaca se evaluó el efecto de la biofertilización con A. brasilense Az39 sobre
calidad de las hojas en condiciones de estrés hídrico. Las plantas provenientes de
semillas inoculadas con reducción de riego mostraron valores aceptables de con-
tenido de clorofila a través del índice verde y no difirieron de los tratamientos
control sin estrés hídrico. El número de hojas fue aumentando de 5 a 12 hojas ver-
daderas al momento de la cosecha (Borracci et al., 2011).
Conclusión
La aplicación de biofertilizantes formulados en base a cepas de Azospirillum apa-

rece como una práctica promisoria para incrementar la producción en cultivos hor-
tícolas, contribuyendo a la incorporación de prácticas culturales ambientalmente
más sustentables. Sin embargo, es importante destacar la necesidad de continuar
con investigaciones que corroboren los resultados encontrados, permitan profun-
dizar en las respuestas específicas de cada especie a las diferentes cepas y probar
distintas formas de administración y dosificación.
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-400-
Azospirillum brasilense en el cultivo de frutilla en Tucumán,
Argentina: del laboratorio al campo
Azospirillum brasilense in strawberry crop in Tucuman, Argentina: from

the laboratory to the field
Pedraza, Raúl O.a*, María F. Guerrero Molinaa, Nadia C. Lovaisaa, Paola De-
laporte Quintanaa, Alicia L. Ragoutb, Sergio M. Salazarac, Juan C. Díaz Riccid
Resumen
Azospirillum brasilense es una de las especies más estudiada dentro del

grupo de las bacterias promotoras del crecimiento de las plantas. Posee distintos
mecanismos de acción, directos o indirectos, que le permiten mejorar el desem-
peño agrícola a diferentes cultivos de interés económico, entre ellos, el de frutilla.
En este capítulo de libro se describe la experiencia del uso de A. brasilense en el
cultivo de frutilla en la provincia de Tucumán, Argentina, considerando las etapas
de aislamiento, caracterización microbiológia y molecular de cepas, determinación
de sus aptitudes promotoras del crecimiento vegetal, quimiotáxis hacia exudados
radicales, colonización de la planta, efectos estructurales y bioquímicos de la inter-
acción, protección frente a la enfermedad antracnosis, y evaluación de la interac-
ción en condiciones ambientales controladas y de campo, con énfasis en la
producción de fruta para el último caso.
Palabras clave: Azospirillum brasilense, Fragaria ananassa, promoción del cre-

cimiento.
a
Facultad de Agronomía y Zootecnia, Universidad Nacional de Tucumán. Av. Kirchner 1900. (4000)
San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.
b
PROIMI-CONICET. Av. Belgrano y Pje. Caseros, San Miguel de Tucumán, (4000), Argentina.
c
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Estación Experimental Agropecuaria Famaillá.
Ruta Provincial 301, km 32. (4132) Famaillá. Tucumán, Argentina.
d
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. UNT. INSIBIO CCT–CONICET Tucumán. Chaca-
buco 461, (4000) San Miguel de Tucumán, Argentina.
*rpedraza@herrera.unt.edu.ar
-401-
Introducción
Las bacterias promotoras de crecimiento en plantas (PGPB, su sigla en in-

glés: Plant Growth Promoting Bacteria) constituyen un grupo de diferentes gé-
neros bacterianos con capacidad de incrementar el crecimiento y productividad
vegetal. Entre los géneros más conocidos figuran Rhizobium, Pseudomonas, Azo-
tobacter, Herbaspirillum, Burkholderia, y Azospirillum (Bashan y de Bashan,
2010). Las PGPB pueden clasificarse en dos grupos: (i) las que promueven el cre-
cimiento de las plantas mediante distintos mecanismos (e.g., fijación de nitrógeno,
solubilización de fosfatos, producción de hormonas y sideróforos, actividad ACC
desaminasa, etc.) que afectan directamente el metabolismo de las plantas, mejo-
rando el desarrollo radicular (mayor absorción de agua y minerales), modificando
las actividades enzimáticas de las plantas, o “ayudando” a otros microorganismos
benéficos para que actúen de mejor manera sobre las ellas (Bashan y de Bashan,
2010); y (ii) las PGPB con capacidad de control biológico, que promueven el cre-
cimiento de las plantas al inhibir o suprimir a los fitopatógenos (Tortora et al.,
2011a; 2011b). Las PGPB son promisorias en los enfoques biotecnológicos ten-
dientes a lograr una adecuada provisión de nutrientes a las plantas, reduciendo los
efectos ambientales negativos de los fertilizantes (Antoun y Presvost, 2006). La
promoción del crecimiento en planta por algunas PGPB ha sido asociada, en al-
gunos casos, con la solubilización e incremento de la captación de fosfatos (Gya-
neshwar et al., 2002); en otros casos, con la absorción de nitratos y fijación
biológica del nitrógeno atmosférico (Bashan y de Bashan, 2010), y también con
la producción de auxinas, como el ácido indol acético (AIA), provocando un im-
portante aumento de la superficie radicular, permitiendo que éstas exploren un
mayor volumen de suelo para captar agua y nutrientes.
En este capítulo de libro se describe la experiencia del uso de A. brasilense
en el cultivo de frutilla en la provincia de Tucumán, Argentina, considerando las
etapas de aislamiento, caracterización microbiológia y molecular de cepas, deter-
minación de sus aptitudes promotoras del crecimiento vegetal, quimiotáxis hacia
exudados radicales, colonización de la planta, efectos estructurales y bioquímicos
de la interacción, protección frente a la enfermedad antracnosis, y evaluación de
la interacción en condiciones ambientales controladas y de campo, con énfasis en
la producción de fruta para el último caso. En la Figura 1 se presenta la estrategia
metodológica que resume lo presentado en éste capítulo.
-402-
Azospirillum brasilense en el cultivo de frutilla en Tucumán, Argentina: del laboratorio al campo
Figura 1. Estrategia metodológica en el estudio de Azospirillum brasilense en frutilla
El cultivo de frutilla
De la producción mundial de frutas finas, el 62% corresponde a frutillas

superando en la actualidad, según estadísticas de la FAO actualizadas hasta 2010,
los 5 millones de toneladas en un área cultivada de 254.027 ha, concentrándose el
80% en diez países. Estados Unidos se encuentra como principal productor con
una producción de 1.292.780 t, en segundo lugar Turquía con una producción de
299.940 t y en el tercer puesto España con una producción anual de 275.300 t (©
FAO dirección de Estadística, 2010). Sin embargo, en los últimos años ha surgido
con gran fuerza la producción de frutilla en la República Popular China, donde
existen estimaciones aún no recogidas por FAO que señalan una producción de
2.000.000 de toneladas por año en una superficie cultivada de 117.000 ha (Kirs-
chbaum et al., 2013).
En 2010 la frutilla experimentó bajas en la superficie y producción mundial
del orden de 5.800 ha y 255.000 t, respectivamente. Esta caída, equivalente a la
producción de Sudamérica, puede ser atribuible a adversidades climáticas y al
efecto de la crisis económica mundial registrada en años previos (Kirschbaum et
al., 2013).
-403-
Argentina cuenta actualmente con 1.660 ha de cultivo que producen anual-

mente 40.000 t/año de frutilla, que se distribuyen entre Tucumán, Santa Fe, Buenos
Aires, Corrientes, Mendoza, Jujuy, Entre Ríos, Río Negro y Salta, siendo Buenos
Aires, Santa Fe y Tucumán las principales provincias productoras. Esta amplia
distribución hace que el consumidor se abastezca de frutos frescos prácticamente
durante todo el año (Fernández-Lozano, 2008), mientras que en las provincias de
mayor producción la misma es invernal, con cosechas periódicas de junio a no-
viembre (Kirschbaum y Mamana, 2008). La exportación argentina de frutilla con-
gelada tiene como destinos principales a EEUU y Brasil (Rodríguez y Pérez, 2013)
y este tipo de frutilla se produce principalmente en Tucumán, mientras que Buenos
Aires y Santa Fe tienen un menor aporte. Respecto a la frutilla como fruta fresca
el principal destino para exportación es Francia (Rodríguez y Pérez, 2013). De
manera general, entre el 50% y el 70% de la producción se industrializa como
congelado y procesado en la industria de dulces y lácteos, mientras que el resto
se destina a consumo en fresco.
El género Azospirillum
Las bacterias del género Azospirillum son de forma vibroide, Gram nega-
tivas, quimioorganótrofas aerobias no fermentativas, pertenecientes al orden α-
proteobacteria. Se encuentran presentes en diversos ambientes y plantas,
incluyendo no solo a las de importancia agronómica como cereales, caña de azúcar
y forrajes, sino también a frutales y florales.
El género Azospirillum se ubica dentro del grupo de las denominadas
PGPB. Estas bacterias colonizan el rizoplano, encontrándose en gran número sobre
raíces laterales y también cerca de la caliptra, lugares normalmente preferenciales
debido a que exudan más fuentes de carbono que otras áreas de la raíz por ser re-
giones de activo crecimiento. Azospirillum presenta una quimiotaxis específica
de cada cepa (Bacilio Jimenez et al., 2003; Pedraza et al., 2010a), la cual proba-
blemente refleja la adaptación de la bacteria a las condiciones nutricionales de la
planta, pudiendo jugar un papel importante en el establecimiento en la rizósfera
del hospedante (Reinhold et al., 1985).
Se han descripto 15 especies dentro del género Azospirillum, pero en tér-
minos de fisiología y genética los más estudiados son A. lipoferum y A. brasilense,
descriptos por Tarrand et al. (1978). Ambos son abundantes, principalmente en
aéreas tropicales, encontrándose no sólo en plantas de interés agronómico, sino
ecológico. Además, las especies de Azospirillum han sido asociadas con condi-
ciones extremas de temperatura o contaminación. La tercera especie, A. amazo-
nense, fue aislada y descripta en el año 1983 de plantas forrajeras de la región del
-404-
Amazona, aunque también está asociada con arroz, maíz y rizosfera de sorgo y
otros pastos en el centro-sur de Brasil (Magalhães et al., 1983; Reis Jr. et al., 2006).
En Pakistán se aisló la especie A. halopraeferans del pasto kallar (Leptochloa
fusca) bajo condiciones de salinidad, la cual parece ser especifica de dicho pasto
(Reinhold et al., 1987). Otra especie descripta es A. irakense, aislada en Iraq de
plantas de arroz (Khammas et al., 1989). Posteriormente, en 1997 se transfirió la
especie Conglomeromonas largomobilis al género Azospirillum, tras ser estudiada
analizando la secuencia 16S del ADNr, pasando a llamarse A. largimobile (Sly y
Stackebrandt, 1999). En el año 2001 se describió A. dobereinerae en honor a la
científica Johanna Döbereiner, quien inició los estudios de este género en Brasil
(Eckert et al., 2001). En China fueron aisladas y descriptas dos nuevas especies:
A. oryzae, a partir de plantas de arroz cultivado en suelo inundado (Xie y Yokota,
2005), y A. melinis, a partir de raíces y tallos estériles de Melinis minutiflora Beauv
(Peng et al., 2006). En el año 2007 se aislaron A. canadense (Mehnaz et al. 2007a)
y A. zeae en Ontario, Canadá (Mehnaz et al., 2007 b), a partir de la rizósfera de
maíz. Más tarde fue aislado A. rugosum a partir de suelo contaminado con aceite
en Taiwán; su nombre se debe a la forma rugosa que adquieren las colonias (Young
et al., 2008). En 2009, dos nuevas especies fueron descriptas: A. palatum aislada
a partir de suelo en China; según su descipción se caracteriza por no fijar nitró-
geno, no producir índoles, y no reducir nitratos ni nitritos (Zhou et al., 2009), y A.
picis en Taiwán; en esta especie no se observó producción de indoles (Lin et al.,
2009). Últimamente, una nueva especie ha sido propuesta, A. thiophilum, aislada
a aguas sulfurosas en Rusia (Lavrinenko et al., 2010).
Los mecanismos por los cuales Azospirillum influye en el crecimiento de
las planta, son versátiles, incluyendo la fijación de N2, producción de hormonas
(principalmente auxinas), incrementando la absorción de nutrientes por la planta,
confiriendo resistencia a condiciones de estrés ambiental, solubilización de fos-
fatos, producción de vitaminas, sideróforos y actividad como agente biocontrol
(Dobbelaere et al., 2003; Bashan y de Bashan, 2010; Rodríguez et al., 2004).
Aislamiento y caracterización de cepas de Azospirillum en Tucumán
La colonización rizosférica por las distintas especies de Azospirillum ha de-

mostrado que pueden estimular el crecimiento de diferentes especies vegetales; sin
embargo, las bases que explican dicha estimulación no son completamente claras.
La principal hipótesis sobre la capacidad promotora del crecimiento yace la produc-
ción de hormonas, tales como los ácidos indol-3-acético e indol butírico, que per-
miten mejorar el crecimiento de raíces, absorción de agua y nutrientes, que en
muchos casos dan como resultado un mayor rendimiento productivo en las plantas
-405-
(Bashan y de Bashan, 2010). Inicialmente se propuso que la capacidad fijadora de

nitrógeno en Azospirillum era el principal mecanismo de promoción del crecimiento,
pero luego se tornó en algo controversial. La producción de sideróforos es otra ca-
racterística que puede contribuir a su prolifereación en ambientes pobres en hierro
de tejidos hospederos. A pesar de ser abundante la literatura de la interacción de
Azospirillum en cultivos industriales, con el consecuente aislamiento y caracteriza-
ción de cepas a partir de plantas de maíz, trigo, arroz, caña de azúcar, etc., la infor-
mación es limitada sobre su presencia en cultivos fruti-hortícolas. En el caso
particular del cultivo de frutilla, se aislaron y caracterizaron 20 cepas asociadas a
distintos tejidos de frutilla en la provincia de Tucumán, Argentina (Pedraza et al.,
2007). El medio de cultivo utilizado fue el NFb semisólido sin nitrógeno, que per-
mitió obtener aislamientos bacterianos a partir de la superficie de raíces no desin-
fectadas y de tejidos internos de raíz y primer estolón de la variedad ‘Camarosa’.
Los aislamientos bacterianos fueron todos Gram-negativos, móviles y en
forma de letra S al ser observados por microscopia de contraste de fase. Las co-
lonias crecidas en medio NFb sólido suplementado con extracto de levadura y el
colorante rojo congo mostraron una consistencia seca, color rojo, con forma re-
dondeada y bordes irregulares. El uso de distintas fuentes carbonadas fue positivo
para glicerol, D-fructosa, succinato de sodio, lactato de sodio y ácido málico. De
acuerdo con esos resultados y comparándolos con los de cepas de referencia, los
aislamientos de frutilla corresponderían putativamente a la especie A. brasilense.
Esto fue validado mediante la amplificación por PCR del gen 16 ADNr, restricción
con AluI, comparando con las cepas Sp7 y Sp245 de A. brasilense como controles
positivos y A. lipoferum Sp59, A. amazonense Y1, A. irakense y A. halopraeferens
para diferenciar con las dos primeras. Como resultado, los patrones de restricción
de los 20 aislamientos locales coincidieron con los de A. brasilense. Posterior-
mente, por secuenciamiento del gen 16S ADNr también se confirmó la especie A.
brasilense y la cepa REC3 fue depositada en el cepario de EMBRAPA Agrobio-
logía, Río de Janeiro, Brasil.
Las características promotoras del crecimiento vegetal evaluadas en los 20
aislamientos fueron la fijación de nitrógeno por reducción de acetileno a etileno
y amplificación por PCR de un fragmento de 710 pb del gen nifD; producción de
índoles totales por método colorimétrico utilizando el reactivo de Salkowski, en
presencia y ausencia de triptófano como precursor de índoles; y producción de si-
deróforos mediante la técnica universal del cromo azurol sulfonato. Todas estas
determinaciones fueron positivas, con valores distintos entre cada aislamiento, y
en muchos casos, asociados a su procedencia: de superficie radical o tejidos in-
ternos de raíz y estolón. Este trabajo constituyó el primer informe de la presencia
natural de A. brasilense en plantas de frutilla (Pedraza et al., 2007).
-406-
Quimiotaxis y efectos de la colonización de A. brasilense en plantas

de frutilla
La motilidad bacteriana le provee una ventaja de supervivencia en distintos

ambientes, permitiendole responder a condiciones benéficas o negativas y com-
petir exitosamente con otros microorganismos. Azospirillum brasilense posee un
flagelo polar en todas las condiciones de cultivo y sintetiza flagelos laterales
cuando crece en medio semisólido (Hall y Krieg 1983). Los flagelos de Azospiri-
llum son organelas de locomoción capaces de propulsar a las bacterias en líquidos
(swimming) y a través de ambientes viscosos o sobre superficies (swarming). Adi-
cionalmente, estas organelas juegan un papel importante en la adhesión a sustratos
y en la formación de biopelículas contribuyendo a la interacción con la planta
(Croes et al. 1993).
Debido a su motilidad, ciertas cepas de Azospirillum presentan quimiotáxis
positiva hacia diferentes sustancias atrayentes como azucares, aminoácidos, ácidos
orgánicos (Reinhold et al. 1985; Zhulin y Armitage 1992) y exudados radiculares
(Bacilio-Jiménez et al. 2003; Pedraza et al 2010a). Esta motilidad es importante
porque permite a las bacterias acceder a un hábitat más apropiado y tornarse más
competitivo respecto a otros microorganismos en el suelo. También se observó
que el movimiento del tipo “swimming” juega un papel importante en la coloni-
zación y que en los ambientes naturales la humedad del suelo es un factor limitante
en la migración de A. brasilense a las raíces (Bashan 1986).
Otro factor que incidiría en la colonización rizosférica es la aerotaxis. En
la rizosfera sería ventajoso responder positivamente a cualquier compuesto que
aumente la tasa metabólica, como ácidos orgánicos y oxígeno. Las concentracio-
nes bajas de oxígeno, típicas de la rizosfera, parecen ser el principal estímulo que
atrae a las bacterias hacia las raíces de las plantas. Por ello, la aerotaxis en la ri-
zosfera también otorgaría una ventaja real a la bacteria en su búsqueda de nutrien-
tes y en la competencia con otros microorganismos (Zhulin y Armitage 1993).
La respuesta quimiotactica positiva de diferentes cepas de A. brasilense
hacia los exudados radiculares de tres variedades de frutilla (Fragaria ananassa
var. ‘Milsei‘, ‘Selva‘ y ‘Camarosa‘) fue confirmada mediante la visualización de
halos formados en el medio de cultivo (Pedraza et al. 2010). Los resultados mos-
traron que los factores: variedad, factor de dilución e interacción cepa bacteriana-
variedad de frutilla, fueron estadísticamente significativos (p<0,05), indicando
que la respuesta quimiotáctica de cada cepa de A. brasilense es dependiente de la
variedad de frutilla.
También se evaluaron los efectos del tiempo de colección de los exudados
radiculares de las diferentes variedades de frutilla en la respuesta quimiotáctica
-407-
de A.brasilense. En todos los casos, se observó una mayor respuesta positiva con
los exudados radiculares colectados a los 7 y 14 días de crecimiento vegetal. Aún
más, las bacterias endofíticas, aisladas de raíces estériles, mostraron una mejor
respuesta quimiotáctica presentando áreas de halos mayores a 200 mm2. La mejor
respuesta quimiotáctica se observó con la cepa A. brasilense REC3 y exudados
de la variedad ‘Camarosa‘ tomados a los 7 y 14 días de crecimiento vegetal (Pe-
draza et al. 2010).
A partir de los resultados obtenidos en placas de agarosa, se seleccionaron
tres cepas bacterianas (REC3, RLC3 y Sp7) para cuantificar la repuesta quimio-
táctica por el método de capilaridad y determinar su Rchem (índice de quimiotá-
xis). Nuevamente la cepa REC3 fue la que mostró una mayor actividad
quimiotáctica con exudados de las tres variedades de plantas tomados a los 7 días
de crecimiento. Los valores más altos fueron obtenidos con la variedad ‘Cama-
rosa‘ (11,98 ± 2,39), seguido de las variedades ‘Milsei’ (6,33 ± 0,59) y ‘Selva’
(3,11 ± 0,45). Estos resultados concordaron con los valores obtenidos por el mé-
todo de placas (Pedraza et al. 2010).
Los resultados obtenidos por ambos métodos, capilaridad y placas de aga-
rosa, fueron similares y confirmaron que la actividad quimiotáctica depende de la
cepas bacterianas, de la variedad de frutilla y del tiempo de recolección de los
exudados radiculares (Pedraza et al. 2010).
La motilidad y la quimiotáxis son procesos activos involucrados en la eficiente
colonización de Azospirillum (Bashan y Holguin 1994). Estos son muy importantes
considerando que la colonización bacteriana de al menos una parte del sistema radi-
cular es requerida para que Azospirillum ejerza sus efectos benéficos cuando es apli-
cado como biofertilizante o fitoestimulador (Okon y Vanderleyeden 1997).
Las bacterias del género Azospirillum son comúnmente denominadas como
rizobacteria, presentando diferencias especie-específicas respecto al modo de co-
lonización radicular. Estas colonizan principalmente la superficie radicular, sin
embargo algunas cepas son capaces de colonizar los tejidos vegetales internos
como bacterias endofíticas que invaden los tejidos vivos de la planta sin causar
síntomas visibles de infección ni efectos negativos en el huésped (Schulz y Boyle
2006). Recientemente se demostró también la colonización endofítica de los es-
tolones de plantas de frutilla cuyas raíces fueron inoculadas, indicando que la co-
lonización de Azospirillum en estas plantas va más allá de la rizosfera
(Guerrero-Molina et al. 2010b, 2012).
Los estudios ultraestructurales de la localización de Azospirillum en la su-
perficie radicular revelaron que este puede ser hallado en todo el sistema radicular
inoculado, pero se concentra principalmente en la zona de elongación y de pelos
radiculares, en el ápice, en la base de los pelos radicales y en algunos casos en la
punta de los pelos radiculares (Okon y Vanderleyden 1997).
-408-
La adhesión de Azospirillum a las raíces de las plantas es esencial para una

eficiente asociación con la planta huésped, si bien existe suficiente evidencia que
indica que los polisacáridos extracelulares y las proteínas están involucrados en
el proceso de colonización radicular, el mecanismo preciso de colonización per-
manece sin ser dilucidado completamente (Vanbleu y Vanderleyden 2003).
La colonización endofítica y rizoférica de raíces de frutilla por Azospirillum
brasilense se estudió usando microscopía de fluorescencia y microscopía electró-
nica de barrido y de transmisión (MEB y MET; Guerrero-Molina et al. 2010a,
2012). Para la observación por MEB y MET, se inocularon plantas de frutilla con
la cepa salvaje A. brasilense REC3 y se utilizó una cepa transconjugate REC3::gfp
para los análisis por microscopía de fluorescencia (Guerrero-Molina et al. 2010a).
Las observaciones de raíces inoculadas de frutilla realizadas mediante MEB
mostraron que las bacterias se adhieren firmemente a la superficie radicular me-
diante una red de material fibrilar producido por las bacterias (Guerrero-Molina
et al. 2012). Se sabe que dicha red permite a las bacterias anclarse a las raíces para
tener un mejor acceso a los exudados radiculares, y recíprocamente, permite a la
planta tomar las sustancias bacterianas excretadas antes de que sean tomadas por
otros microorganismos (Vanbleu y Vanderleyden 2003). Adicionalmente, provee
protección a las bacterias contra las fuerzas físicas externas aplicadas a la raíz,
como el lavado y la agitación (Bashan et al. 1991). Las conexiones fibrilares ob-
servadas sobre A. brasilense REC3 y PEC5 (Winik et al. 2009; Guerrero-Molina
et al. 2010a) fueron similares a aquellas presentadas por A. brasilense Cd sobre
raíces de maíz (Bashan et al. 1986) y partículas de arena (Bashan et al., 1991). Si
bien este material participa tanto en la adsorción de las células bacterianas a su-
perficies bióticas como abióticas, aún su composición química es materia de dis-
cusión. Muchos estudios afirman que los compuestos involucrados en la
agregación de Azospirillum son de naturaleza proteica (Burdman et al. 1999).
Mientras que otros autores afirman que son polisacáridos extracelulares los que
participan en el proceso de adhesión a la superficie radicular (Michiels et al. 1990;
Burdman et al. 1998). Por otro lado, además de las conexiones de naturaleza fi-
brilar, las células bacterianas fueron también encontradas en asociación con ma-
terial de naturaleza granular que se acumulaba en la superficie de la raíz de plantas
de frutilla; estas quizás corresponden a rizodeposiciones que participan en la aso-
ciación planta-bacteria (Winik et al. 2009; Guerrero-Molina et al. 2010a).
En el caso particular de la cepa A. brasilense REC3, aislada en Tucumán,
ésta presentó tres patrones de adsorción a la superficie radicular de frutilla: células
individuales dispersas en forma aleatoria, pequeños agregados bacterianos y for-
mación de biopelícula (Winik et al., 2009; Guerrero- Molina et al., 2010a).
También se confirmó mediante MET y microscopía de fluorescencia la co-
lonización radicular endofítica de las cepas aisladas de frutilla. Fue posible ob-
-409-
servar por ambos métodos la colonización de los tejidos internos de raíces de fru-
tilla en comparación con plantas control, sin bacterias asociadas (Guerrero-Molina
et al., 2012). Además de confirmar la colonización endofítica, la microscopía de
fluorescencia permitió localizar a A. brasilense en los espacios intercelulares del
cortex apical en raíces de frutilla (Guerrero-Molina et al., 2010a).
Promoción del crecimiento de frutilla en fitotrón y en campo
El efecto estimulador ejercido por Azospirillum en las plantas se ha atribuido a

varios mecanismos, incluyendo la secreción de fitohormonas (e.g., auxinas y giberelinas),
la fijación biológica de nitrógeno, y una mejor de absorción de minerales por las plantas
(Bashan et al., 2004). Sin embargo, la respuesta a la inoculación de plantas con Azospir-
illum no siempre ha tenido éxito, y los factores que afectan la respuesta de los cultivos no
se conocen del todo (Okon y Labandera-González 1994; Bashan y Holguin 1997). La
respuesta a la inoculación con Azospirillum en la productividad de distintos cul-
tivos ha sido ampliamente descripta, sobre todo en cereales. En el caso particular
de frutilla, en Tucumán se realizaron ensayos de inoculación tanto en condiciones
ambientales controladas (fitotrón) como en el campo con el propósito de evaluar
el efecto promotor ejercido por A. brasilense.
Para estudiar el efecto promotor de crecimiento vegetal de Azospirillum
brasilense en plantas de frutilla en condiciones controladas de fitotrón, se utiliza-
ron 3 cepas aisladas de frutilla: RLC1, REC3 y PEC5, seleccionadas en base a sus
características de fijar nitrógeno atmosférico, producir índoles y sideróforos (Pe-
draza et al., 2007; 2010). Las mismas fueron evaluadas en 3 variedades de frutilla
(Fragaria ananassa Duch): ‘Milsei’, ‘Selva’ y ‘Camarosa’. Las plantas se obtu-
vieron del banco de germoplasma activo de frutilla de la Universidad Nacional
de Tucumán a partir de cultivo in vitro para garantizar que estén sanas y libres de
microorganismos. Las mismas fueron aclimatadas en fitotrón hasta llegar a los 3
meses de edad. Se consideraron 10 plantas de cada variedad, las cuales se inocu-
laron con las diferentes cepas de A. brasilense por inmersión de las raíces durante
30 minutos en una suspensión bacteriana de aproximadamente 106 ufc ml-1. El
control del ensayo fueron plantas sin inoculación bacteriana. Las plantas fueron
colocadas en macetas con sustrato estéril (2 humus:1 perlome) y llevadas a un fi-
totrón, bajo condiciones controladas de temperatura (28°C), humedad (70%) y fo-
toperíodo (16 h; 2500 lux) donde permanecieron 54 días. Las mismas fueron
regadas cada 2-3 días con 50 ml de agua destilada estéril por maceta. Los pará-
metros evaluados fueron: longitud radicular, peso seco de raíces y área radicular.
Los valores obtenidos para el parámetro longitud radicular estuvieron entre
13,6 y19,4 cm en la variedad ‘Milsei’, siendo el tratamiento con PEC5 el de mayor
-410-
valor y RLC1 el de menor valor, incluso con respecto al control. En la variedad

Selva se observó que todas las cepas inoculadas incrementaron la longitud radi-
cular y en ‘Camarosa’ los resultados fueron similares a los obtenidos en ‘Milsei’.
Respecto al peso seco, los mejores resultados se observaron en ‘Milsei’ cuando
se inoculó con PEC5; en ‘Selva’ y ‘Camarosa’ cuando se inoculó con REC3.
En cuanto al área radicular, los valores promedios oscilaron entre 0,1 a 0,9
mg de Ca(NO3)2 adsorbido por las raíces de cada planta; el valor más alto se re-
gistró en la variedad ‘Milsei’ inoculada con PEC5 y el más bajo en ‘Milsei’ con
RLC1. En las variedades ‘Selva’ y ‘Camarosa‘ la respuesta fue similar a la obser-
vada en el parámetro longitud radicular.
En términos generales hemos observado que las diferentes cepas de A. bra-
silense produjeron un efecto positivo en la promoción del crecimiento en plantas
de frutilla, expresado en longitud radicular, área radicular y peso radicular , en los
cuales existe una alta correlación en la combinación entre la variedad de frutilla
y la cepa bacteriana utilizada. Como dato adicional, las mejores respuestas a la
inoculación bacteriana se observaron con cepas aisladas de tejidos internos de ra-
íces y estolones de frutilla (REC3 y PEC5), mientras que en algunos casos se ob-
servó inhibición del efecto promotor del crecimiento con la cepa aislada de la
superficie radicular (RLC1) (Pedraza et al., 2010).
En cuanto a la evaluación del efecto promotor del crecimiento con condi-
ciones de campo, el objetivo fue evaluar el rendimiento frutal de plantas de frutilla
inoculadas con A. brasilense, utilizando las cepas RLC1 y REC3 bajo condiciones
típicas de cultivo comercial en el campo.
El estudio se realizó durante las campañas 2006 al 2009 y se llevó a cabo
en un predio de la Estación Experimental de INTA Famaillá, Tucumán. Se armaron
bordos de plástico negro de 40 cm de alto, 50 cm de ancho y 1,25 m de largo. En
el mismo se colocaron 2 hileras de plantas de frutilla var. ‘Camarosa‘. En todas
las campañas se realizó una fertilización base de 200 kg ha-1 de 15-15-15 (N-P-
K). Los tratamientos consistieron en plantas inoculadas con las diferentes cepas
de A. brasilense y plantas control sin inocular. La inoculación se realizó por in-
mersión de las raíces de cada planta durante 30 minutos en una suspensión bacte-
riana de aproximadamente 106 ufc ml-1; las raíces de las plantas control fueron
sumergidas en agua el mismo tiempo. El diseño experimental fue de bloques com-
pletos al azar con 3 repeticiones de 30 plantas cada uno.
En los resultados se observó un incremento promedio de fruta por planta
de 8,5%, comprendido en el rango de 3,4% a 13,6%, respecto del control sin ino-
cular con Azospirillum. Estas variaciones estuvieron condicionadas no solo a la
cepa bacteriana asociada con frutilla sino también a las condiciones ambientales
(e.g., temperatura, humedad) en las distintas campañas.
-411-
También se observó que, independientemente de los tratamientos, hubo una

tendencia a la disminución del rendimiento frutal en el tiempo; es decir, el mayor
rendimiento se obtuvo en 2006 y luego disminuyó hasta 2009. Esto puede deberse
al hecho de que los ensayos se realizaron siempre en el mismo lote, donde proba-
blemente la actividad y la población microbiana nativa estarían jugando un papel
importante en las condiciones nutricionales del suelo, que podrían explicar en
parte la disminución de los rendimientos debido al desgaste de ese lote (Salazar
et al., 2012).
Azospirillum como agente de biocontrol en frutilla
Para evaluar la actividad de Azospirillum como agente de biocontrol en fru-

tilla, se realizaron experimentos de inoculación con la bacteria, el patógeno y la
interacción de ambos. En las plantas inoculadas solamente con Azospirillum se
observó la activación de distintos mecanismos involucrados en la defensa, eva-
luados en distintos tiempos posteriores a la inoculación con A. brasilense REC3:
0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-inoculación (hpi). El ensayo se realizó con
la variedad ‘Camarosa‘ cultivada en condiciones hidropónicas (Guerrero-Molina
et al., 2013). La inoculación con A. brasilense REC3 desencadenó en las plantas
un estado de alerta denominado “priming” que se puso de manifiesto mediante la
estimulación de deposiciones de calosa y engrosamiento de la pared celular en las
hojas de frutilla, aumento del contenido de compuestos fenólicos totales en hojas
y raíces a partir de las 12 hpi y la ausencia de un estallido oxidativo. No se observó
acumulación de especies reactivas del oxígeno (H2O2, O2−) en ninguno de los
tiempos evaluados. Por otro lado, se observó una disminución en los niveles de
compuestos fenólicos de pared y el contenido de peróxidos de lípidos durante las
primeras hpi (Guerrero-Molina et al., 2013). Cabe destacar que estos mecanismos
están altamente regulados y pueden ser complementarios durante el estableci-
miento del estado de “priming”, el cual permitiría sensibilizar a las plantas y lograr
una respuesta de amplio espectro contra patógenos e insectos herbívoros (Conrath
et al., 2006, Pieterse et al., 2009).
También se estudiaron algunas moléculas señales expresadas en frutilla tales
como: ácido salicílico (AS), ácido indol-3-acético (AIA) y etileno (ET). Su cuan-
tificación se realizó por técnicas cromatográficas, y la expresión de genes de fru-
tilla involucrados en su síntesis y transducción de señal se evaluó mediante PCR
en tiempo real (qRT-PCR). Debido a que REC3 es capaz de sintetizar índoles, se
observó un aumento de AIA en las plantas inoculadas respecto a los controles no
inoculados en todos los tiempos evaluados. Asimismo, se observó un aumento en
el contenido de AS, que coincidió con el aumento de la expresión de la proteína
-412-
PR1 (pathogenesis related) involucrada en la vía de defensa del tipo SAR (sistemic
adquired resistance) (Tortora et al., 2012).
El biocontrol constituye uno de los mecanismos indirectos de promoción
del crecimiento vegetal; consiste en disminuir o prevenir los efectos deletéreos
producidos por los microorganismos patógenos de plantas mediante la síntesis de
compuestos antibióticos y/o fungicidas (Schippers et al., 1987). En este sentido,
se comprobó que la cepa REC3 de Azospirillum brasilense es capaz de inducir
una respuesta sistémica contra el agente causal de la antracnosis en frutilla, Co-
lletotrichum acutatum M11. La cepa REC3 redujo los síntomas de antracnosis en
plantas infectadas con el hongo, y este efecto fue mayor a medida que aumentaba
el tiempo entre la inoculación bacteriana y la infección con el hongo. Los estudios
bioquímicos y transcripcionales revelaron que hubo una acumulación transitoria
de AS y la inducción de genes relacionados a la defensa al mismo tiempo post-
inoculación (e.g. quitinasas, glucanasas y receptores de etileno). Además, se de-
mostró que este efecto de biocontrol ejercido sobre C. acutatum está directamente
relacionado con modificaciones estructurales a nivel de la pared celular de las
hojas como consecuencia de la acumulación de calosa y el aumento de compuestos
fenólicos solubles totales (Tortora et al., 2012). Por lo tanto, puedo verificarse que
A. brasilense REC3 es capaz de conferir una repuesta sistémica a las plantas de
frutilla contra C. acutatum M11 mediante la activación directa de mecanismos de
defensa y también mediante el “priming” de las mismas para desencadenar una
respuesta más fuerte y rápida contra otras posibles infecciones por patógenos de
suelo (Guerrero-Molina et al., 2013; Tortora et al., 2012). De esta forma, en el
caso particular del cultivo de frutilla, Azospirillum no solo constituye un promotor
del crecimiento vegetal, sino también un agente de biocontrol.
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Efectos de la co-inoculación de Rhizobium
con bacterias del género Azospirillum en leguminosas
de interés agronómico
Effects of the co-inoculation with Rhizobium and bacteria

of the genus Azospirillum in legumes of agronomic interest
Puente, Mariana L.a,b*, Julia E Garcíaa, Alejandro Perticaria, Fabricio Cassánc

y Susana Carlettid
Resumen
La co-inoculación es la inoculación combinada de diferentes géneros o es-

pecies de bacterias seleccionadas que interaccionan de manera sinérgica sobre la
planta. La interacción microbiana más estudiada de Azospirillum implica al rizo-
bio. El beneficio obtenido por las leguminosas al ser co-inoculadas con bacterias
del género Azospirillum se debe a un efecto estimulante provocado por las hor-
monas excretadas por esta rizobacteria. En este capítulo se revisaron diversos re-
portes que indican los efectos positivos de la interacción Azospirillum-rizobio. Sin
embargo, resulta imprescindible para optimizar la técnica de inoculación definir
cómo interactúan ambos géneros y determinar las concentraciones óptimas de
cada uno de los microorganismos. Es por ello que en el laboratorio de Bacterias
Promotoras del Crecimiento Vegetal, IMYZA, INTA Castelar, se evaluó el efecto
de la co-inoculación de Bradyrhizobium japonicum E109 y A. brasilense Az39
sobre el cultivo de soja con el objetivo de determinar la dosis óptima de cada mi-
croorganismo, y explicar los posibles mecanismos de promoción de Azospirillum.
Se incluyó la cepa Sp245 (ipdC-) para estudiar si el efecto de promoción es debido
a la producción de auxinas por parte de Azospirillum ya que está modificada ge-
néticamente con disminución en la producción de AIA.
Palabras clave: Co-inoculación, Azospirillum, Leguminosas

a
Laboratorio de Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal, IMYZA, INTA Castelar, Buenos
Aires, Argentina.
b*
Alumna del Doctorado en Ciencias Aplicadas de la Universidad Nacional de Luján, Buenos Aires,
Argentina. mpuente@cnia.inta.gov.ar
c
Laboratorio de Fisiología Vegetal y de la Interacción Planta-Microorganismo. Universidad Nacional
de Río Cuarto, Córdoba, Argentina.
d
Departamento Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Buenos Aires, Argentina.
-419-
Introducción
A lo largo de la historia, las leguminosas se han utilizado para el suministro

de alimentos, medicinas, forraje y combustibles, entre otros (Howieson et al.,
2008). Más del 60% de la producción de leguminosas de grano es soja. Sin em-
bargo, en América del Sur y África otras leguminosas de grano son de vital im-
portancia para la alimentación y para la producción de pequeños agricultores
(Werner y Newton, 2005).
El crecimiento de las plantas está íntimamente ligado a los nutrientes pre-
sentes en el suelo y condicionado a la existencia de una amplia gama de microor-
ganismos que actúan desde la rizosfera favoreciendo la nutrición y la salud de las
plantas. Los nutrientes necesarios para un buen desarrollo deben estar en forma
equilibrada y suficiente, sin embargo, la mayor parte de estos recursos se encuentra
en forma no disponible en el suelo y para que puedan ser utilizados por las plantas
deben incorporarse a ciertos procesos químicos y biológicos (Chen, 2006). Ade-
más, para la obtención de altos rendimientos de los cultivos, se requiere de una
alta provisión de nitrógeno durante todo el ciclo de producción.
Las leguminosas (Fabaceae) son capaces de establecer una relación sim-
biótica con muchos miembros del Orden Rhizobiales, comúnmente llamados ri-
zobios, induciendo a la formación de estructuras nodulares que, a través de un
proceso de origen biológico denominado fijación biológica de nitrógeno (FBN),
proporcionan a la planta toda o parte del nitrógeno requerido (Chen, 2006; Rivas
et al., 2009). La fijación simbiótica de nitrógeno por los rizobios en las legumi-
nosas tiene un impacto profundo en la agricultura y la actividad humana. La fija-
ción global de nitrógeno derivada desde el cultivo se estima en hasta 40 millones
de toneladas anuales, que proporcionan alrededor del 20% del nitrógeno disponi-
ble en la agricultura y suelos (Crews y People, 2004). La evolución, la biología y
la genética de la simbiosis leguminosa-rizobios se ha examinado de forma ex-
haustiva (Simms y Taylor 2002; Lodwig y Poole 2003).
Adicionalmente, se ha determinado que ciertas cepas pertenecientes a di-
ferentes géneros de este Orden serían capaces de producir compuestos reguladores
del crecimiento del tipo ácido indol acético, ácido giberélico y citocininas (Dey
et al., 2004; Boiero et al., 2007), moléculas involucradas íntimamente con la re-
gulación de la ontogenia de nódulos en leguminosas (Hirsch et al., 1997). A fines
de los 70 se produjeron dos grandes avances en la tecnología de la inoculación de
plantas: (i) se determinó que bacterias del género Azospirillum mejoran el creci-
miento de especies de no-leguminosas (Döbereiner y Day, 1976), y (ii) se descu-
brieron agentes de control biológico, principalmente de las especies Pseudomonas
fluorescens y P. putida, que comenzaron a ser intensamente investigados (Kloep-
-420-
Efectos de la co-inoculación de Rhizobium con bacterias del género Azospirillum ...
per y Schroth, 1981; Défago et al., 1992; Glick, 1995). Cuando estas bacterias o
las de vida libre se consideran benéficas para el crecimiento de las plantas se las
denomina rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal o PGPR (del inglés,
Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Kloepper y Schroth, 1978). Sin embargo,
esta capacidad puede ser considerada también en otros organismos distintos a los
procariotas tal como hongos micorríticos o incluso en microorganismos de origen
no rizosférico. Entre las bacterias que actúan como PGPR se encuentran los gé-
neros Aeromonas, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Arthobacter, Bacillus,
Clostridium, Enterobacter, Gluconacetobacter, Klebsiella, Pseudomonas y Se-
rratia (Gupta et al., 2003; Shishido et al., 1996; de Freitas et al., 1997; Arndt et
al., 1998; Pan et al., 1999; Bertand et al., 2001; Hamaouri et al., 2001; Nanda-
Kumar et al., 2001; Mirza et al., 2001; Kokalis-Burelle et al., 2002; Preeti et al.,
2002; Babalola et al., 2003; Bonaterra et al., 2003; Cezon et al., 2003; Esitken et
al., 2003; Garica et al., 2003; Khalid et al., 2003; Munir et al., 2003; Murphy et
al., 2003; Dey et al., 2004; Jaizme-Vega et al., 2004; Joo et al., 2004; Raj et al.,
2004; Tripathi et al., 2005). Entre estas bacterias promotoras, el género Pseudo-
monas y Bacillus spp. son los que presentan mayor distribución geográfica y junto
al género Azospirillum son los más estudiados.
El género Azospirillum está conformado por bacterias diazotróficas de vida
libre con capacidad de colonizar los tejidos internos y externos de las raíces (Bas-
han y Levanony, 1990). Este es uno de los géneros más estudiados por su capaci-
dad de mejorar el crecimiento y desarrollo así como el rendimiento de numerosas
especies cultivables (Dardanelli et al., 2008). Presenta una amplia distribución ge-
ográfica alrededor del mundo y ha sido aislada de la superficie de la raíz de una
amplia variedad de plantas y de su rizosfera (Steenhoudt y Vanderleyden, 2000).
Tarrand et al. (1978) fueron los primeros que describieron el género Azospirillum
con dos especies, A. lipoferum y A. brasilense y en la actualidad, se han descripto
al menos 16 especies del género Azospirillum (Vezyri et al., 2013).
Mecanismos de promoción ejercidos por Azospirillum

En un principio los investigadores creyeron que los efectos de promoción
por parte de esta bacteria se debían a la fijación biológica de nitrógeno, sin em-
bargo, este mecanismo de promoción ha tenido una menor significancia agronó-
mica (Dobbelaere y Okon, 2007). Estudios posteriores demostraron que los efectos
positivos ejercidos por Azospirillum derivaban en cambios morfológicos y fisio-
lógicos de las plantas inoculadas que mejoraban la toma de agua y minerales. Esta
respuesta estaría relacionada con la capacidad que poseen estos microorganismos
para producir o metabolizar compuestos del tipo fitohormonas, tales como ácido
indol acético; citocininas (Tien et al., 1979); giberelinas (Bottini et al., 1989) y
-421-
etileno (Strzelczyk et al., 1994), así como de otras moléculas reguladoras del cre-
cimiento vegetal, tales como el ácido abscícico (Perrig et al., 2007) y la diamina
cadaverina (Cassán et al., 2009). Basándose en datos publicados, Dobbelaere y
Okon (2007) indican que la inoculación con Azospirillum produjo incrementos
significativos a cosecha en un rango de 5-30% en alrededor de 60-70% de los ex-
perimentos. Los mayores incrementos producidos por la inoculación fueron ob-
servados principalmente en suelos livianos con niveles intermedios de fertilización
y regímenes de lluvia (Okon y Labandera-González, 1994). Si bien hay una amplia
cantidad de estudios que demuestran los beneficios que se obtienen en los cultivos
cuando son inoculados con Azospirillum, su uso a nivel extensivo presenta varia-
bilidad en las respuestas debido a la interacción con factores de manejo (fertiliza-
ción, genotipo del cultivo, etc.), de ambiente (tipo de suelo, etc.) y a las complejas
interacciones entre los sistemas planta-bacteria-ambiente (Díaz-Zorita y Fernán-
dez-Canigia, 2009).
Co-inoculación de leguminosas
La co-inoculación se define como la inoculación combinada de diferentes
géneros o especies de bacterias seleccionadas que interaccionan de manera sinér-
gica sobre la planta. Los efectos beneficiosos de la co-inoculación PGPR-rizobio
son dependientes de la cepa PGPR utilizada. Ciertas cepas de PGPR mejoran la
nodulación en leguminosas por afectar el intercambio de señales entre las plantas
y los rizobios. Estas cepas producen análogos de moléculas señal y/o estimulan a
la planta para producir más moléculas (Parmar y Dadarwal, 1999). Otro modo de
acción posible es mediante la alteración del metabolito secundario y/o la genera-
ción de antibiosis en la rizosfera. De esta manera se elimina la competencia de
los rizobios con los microorganismos perjudiciales (van Loon y Bakker, 2003).
La interacción microbiana más estudiada de Azospirillum implica al rizobio. El
beneficio obtenido por las leguminosas al ser co-inoculadas con bacterias del gé-
nero Azospirillum se debe a un efecto estimulante provocado por las hormonas
excretadas por esta rizobacteria. Estas hormonas del tipo auxinas (AIA) inducen
a la formación de un mayor número de células epidérmicas que se diferencian en
pelos radiculares convirtiéndose en sitios de infección adicionales para la coloni-
zación de rizobios (Yahalom et al., 1987; Schmidt et al., 1988). Sin embargo, los
mecanismos básicos involucrados en esta actividad sinérgica no se conocen por
completo, y sigue siendo un desafío. Al hacer una revisión de los ensayos en donde
se utilizó la técnica de co-inoculación, se pueden observar diversos resultados y
efectos en diferentes parámetros de crecimiento. Algunos ensayos realizados de-
mostraron que la co-inoculación Azospirillum-rizobio produjo aumentos en la fi-
jación de nitrógeno, en el número de nódulos, y en el rendimiento (Iruthayathas
-422-
et al., 1983; Rai, 1983; Sarig et al., 1986). En otros ensayos se ha observado que
la inoculación produjo una aparición de nódulos más temprana y un comienzo
más temprano de la actividad de fijación de nitrógeno (González y Lluch, 1992;
Burdmann et al., 1997; Okon y Vanderleyden, 1997; Groppa et al., 1998. Galal
(1997) demostró que la co-inoculación en semillas de soja con A. brasilense y
Bradyrhizobium japonicum presentó mejoras en la materia seca en plantas de 60
días, en el porcentaje de nitrógeno y en el nitrógeno asimilado comparando con
la inoculación con B. japonicum solamente, atribuyendo esto a las sustancias del
tipo fitohormonas liberadas por Azospirillum. Otros autores también encontraron
que la producción bacteriana de reguladores de crecimiento vegetal por parte de
Azospirillum modificó la morfología vegetal, la tasa respiratoria de las raíces, la
captación de agua y nutrientes minerales por la planta huésped y el contenido de
leghemoglobina en los nódulos (Burdman et al. 1997; Groppa et al. 1998; Rodelas
et al. 1999). Molla et al. (2001), encontraron que la aplicación de Azospirillum
solo o co-inoculado con B. japonicum en raíces de soja incrementó el peso seco,
el volumen radicular y la biomasa aérea.
Cassán et al. (2009) observaron que la co-inoculación con B. japonicum
E109 y A. brasilense Az39 modificó la capacidad de la semilla de soja para ger-
minar y el crecimiento aéreo y radical comparado con el control sin inocular. Adi-
cionalmente, bajo condiciones limitadas de agua y de nitrógeno Burdmann et al.
(1997) demostraron que la inoculación combinada de B. japonicum y Azospirillum
spp. incrementó los rendimientos de las leguminosas.
Okon y Vanderleyden (1997) observaron que la promoción de crecimiento
luego de inocular con A. brasilense es mayormente causado por la biosíntesis y
secreción de AIA producido por esta bacteria. Se ha demostrado que ciertas con-
centraciones de AIA exógeno pueden inhibir la germinación y el crecimiento ra-
dicular (Lambrecht et al., 2000). Sin embargo, se ha demostrado que esta hormona
está relacionada con la nodulación (Boiero et al., 2007).
La aplicación de Azospirillum spp. representa una nueva alternativa ten-
diente a mejorar la productividad a largo plazo del sistema agropecuario y puede
considerarse como una tecnología alineada con principios de agricultura susten-
table. Su uso permitiría reducir las elevadas cantidades de fertilizantes que gene-
ralmente se aplican sin detrimento de la producción, y con ello disminuir tanto el
costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la
contaminación (Okon y Labandera Gonzalez 1994; Fuentes-Ramirez y Caballero-
Mellado, 2005; Castro-Sowinski et al., 2007).
-423-
Ensayos de co-inoculación en soja

Diversos reportes sobre la interacción Azospirillum-rizobio indican que es
imprescindible definir cómo interactúan ambos géneros y determinar las concen-
traciones óptimas de cada uno de los microorganismos para optimizar la técnica
de inoculación.
Es por ello que en el laboratorio de Bacterias Promotoras del Crecimiento
Vegetal, IMYZA, INTA Castelar, se evaluó el efecto de la co-inoculación de B.
japonicum (E109) y A. brasilense (Az39) sobre el cultivo de soja con el objetivo
de determinar la dosis óptima de cada microorganismo, y explicar los posibles
mecanismos de promoción de Azospirillum. En nuestros experimentos se utiliza-
ron la cepa E109 de B. japonicum y dos cepas de A. brasilense [Az39 y Sp245
(ipdC-) que está modificada genéticamente con disminución en la producción de
AIA]. Con esta cepa se pretende estudiar si el efecto de promoción es debido a la
producción de auxinas por parte de Azospirillum. Los tratamientos fueron combi-
naciones de concentraciones bacterianas: co-inoculación de B. japonicum (105,
107 y 109 ufc·mL-1·semilla) + Az39 (105, 107 y 109 ufc·mL-1·semilla); B. japonicum
(105, 107 y 109 ufc·mL-1·semilla) + Sp245-ipdC- (105, 107 y 109 ufc·mL-1·semilla);
con sus correspondientes tratamientos inoculados sólo con B. japonicum (105, 107
y 109 ufc·mL-1·semilla). Se sembraron 2 semillas por maceta plástica, utilizando
vermiculita estéril como sustrato y se regaron con solución nutritiva de Hoagland
(Hoagland y Arnon, 1950). Las plantas permanecieron durante 45 días con un fo-
toperiodo de 16 h de luz (30°C) y 8 h de oscuridad (20°C). Se realizaron muestreos
a los 20 y 45 días después de la siembra (dds). En ambos muestreos se contaron
los nódulos, y se determinó peso fresco y seco de los mismos, se determinó altura,
peso fresco y seco de planta, se estimó el área de la superficie radicular a través
del método de Carley y Watson (1966), y se evaluó la longitud total de cada sis-
tema radical mediante el método de la cuadrícula (Giovannetti y Mosse, 1980).
Con el fin de caracterizar la producción de fitohormonas por parte de los micro-
organismos utilizados en este trabajo, se realizaron las determinaciones de auxinas
(AIA), giberelinas (GA3) y citocininas (Z) para las cepas de B. japonicum E109
y A. brasilense Az39 (cepa salvaje) y A. brasilense Sp245 (ipdC-) en diferentes
momentos o fases de la curva de crecimiento sigmoide. Para ello, se realizaron
muestreos de los cultivos bacterianos en tres fases de la curva de crecimiento: fase
lag, exponencial y estacionaria. Las muestras de cultivo fueron inyectadas y ana-
lizadas utilizando un equipo de cromatografía líquida (HPLC) de la firma Agilent,
serie 1100. La identificación y cuantificación se realizó a través de la comparación
de los tiempos de retención y concentraciones de las moléculas puras de cada uno
de los compuestos evaluados. Los ensayos de inoculación fueron realizados utili-
zando un diseño en bloques al azar con 8 repeticiones. Los datos fueron analizados
-424-
con el paquete estadístico INFOSTAT, y las medias fueron analizadas empleando

el test de Tukey (α=0.05).
A los 20 dds se pudieron observar respuestas positivas según la concentra-
ción de Bradyrhizobium (tratamientos) utilizada, sin embargo, no hubo interacción
entre tratamientos y subtratamientos (concentraciones de Az39 y Sp245 ipdC-)
con un p≤0.05. En las variables correspondientes a la nodulación los valores fue-
ron significativamente mayores cuando la inoculación se realizó con dosis altas y
medias de Bradyrhizobium (Tabla 1), con excepción de la nodulación en raíces
secundarias en la que no presentó respuesta ningún tratamiento.
Tabla 1. Respuesta observada en los parámetros de nodulación, según las diferentes concentracio-
nes de Bradyrhizobium en plantas de soja de 20 días.
N° de nódulos en N° de nódulos en Peso fresco Peso seco

Tratamientos
raíz principal raíz secundaria total (g) total (g)
E109 105 10,10 b 8,20 a 0,28 b 0,18 b
E109 107 9,88 b 8,46 a 0,43 a 0,34 a
E109 109 13,38 a 7,73 a 0,44 a 0,33 a
Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0.05)
En la altura, peso fresco y seco de la planta, el tratamiento de Bradyrhizo-

bium con mayor concentración (109 ufc·mL-1·semilla) también presentó valores
que fueron significativamente mayores (Tabla 2).
Tabla 2. Respuesta observada en altura, peso fresco y seco de planta, según las diferentes concen-
traciones de Bradyrhizobium en plantas de soja de 20 días.
Tratamientos Altura (cm) Peso fresco (g) Peso seco (g)

E109 105 26,53 b 1,95 b 0,36 b
E109 107 27,57 b 1,65 b 0,38 b
E109 109 35,44 a 2,76 a 0,49 a
Las plantas muestreadas a los 45 días también presentaron una respuesta

significativa cuando se inoculó con Bradyrhizobium en altas concentraciones. En
el muestreo de nódulos sólo hubo diferencia significativa en el peso fresco y seco
(Figura 1).
-425-
Figura 1. Efecto de la inoculación con diferentes concentraciones de Bradyrhizobium ([1] 105; [2]
107 y [3] 109 ufc•semilla-1) sobre A) peso fresco y B) peso seco de nódulos en plantas de soja de
45 días. Las barras en los gráficos representan el error estándar. Letras distintas indican diferen-
cias significativas (p≤0.05).
La altura de las plantas no se vio influenciada por los diferentes tratamientos

y subtratamientos, sin embargo, el peso fresco y seco de planta sí presentaron di-
ferencias significativas. El peso fresco sólo mostró diferencias entre tratamientos
con Bradyrhizobium (Figura 2), mientras que en el peso seco se observó una inter-
acción entre tratamientos y subtratamientos. Todas las concentraciones de los tra-
tamientos co-inoculados con la cepa Sp245 (ipdC-) y el tratamiento co-inoculado
con la dosis media de Az39 (107 ufc·semilla-1) fueron los únicos que presentaron
una respuesta significativa con respecto a la inoculación sólo con Bradyrhizobium
(Figura 3).
Figura 2. Efecto de la inoculación con diferentes concentraciones de Bradyrhizobium ([1] 105

ufc•semilla-1, [2] 107 ufc•semilla-1, [3] 109 ufc•semilla-1) sobre el peso fresco de plantas de soja de
45 días. Las barras en los gráficos representan el error estándar. Letras distintas indican diferen-
cias significativas (p≤0.05).
-426-
Figura 3. Efecto de las diferentes concentraciones de co-inoculación con Az39 y Sp245 (ipdC-) en
los tratamientos con altas concentraciones de Bradyrhizobium sobre el peso seco de plantas de
soja de 45 días. Las barras en los gráficos representan el error estándar. Letras distintas indican di-
ferencias significativas (p≤0.05).
El área superficial y la longitud total radicular a los 20 días mostraron un

efecto de tratamiento, en donde la concentración media de Bradyrhizobium (107
ufc·semilla-1) fue la que presentó mejor respuesta sin ejercer efecto la co-inocula-
ción (Figura 4).
Figura 4. Efecto de la inoculación con diferentes concentraciones de Bradyrhizobium ([1] 105

ufc•semilla-1, [2] 107 ufc•semilla-1, [3] 109 ufc•semilla-1) sobre A) la longitud total radicular y B) el
área de superficie radicular en plantas de soja de 20 días. Las barras en los gráficos representan el
error estándar. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0.05).
A los 45 días después de la siembra se pudo observar un efecto similar al

visto a los 20 dds, en donde el área de superficie radicular presentó diferencias
-427-
significativas cuando las semillas fueron inoculadas con dosis medias de Bradyr-
hizobium sin haber ejercido efecto la co-inoculación. La longitud total radicular
no presentó ninguna respuesta frente a la inoculación con los diferentes microor-
ganismos (Tabla 3).
Tabla 3. Área superficial y longitud total radicular de plantas de soja de 45 días inoculadas con di-
ferentes concentraciones de B. japonicum
Tratamientos (ufc.ml-1) Longitud total radicular (cm) Área superficial [mg Ca(NO3)2]
E109 105 2514,59 a 1,39 b
E109 107 2688,74 a 1,94 a
E109 109 2514,59 a 1,60 b
Los resultados de la determinación de fitohormonas demuestran que la mayor

producción de AIA, giberelina y zeatina (forma natural de la citocinina) se obtiene
en la fase estacionaria de los microorganismos en estudio. La cepa Az39 de A. bra-
silense presentó la mayor producción de AIA debido a la acumulación del metabolito
en el medio de cultivo en la fase estacionaria. Por otro lado el mutante ipdC- de A.
brasilense Sp245 mantuvo un valor mínimo pero detectable de esta molécula, a lo
largo de todo el ciclo de cultivo y de manera constante, por lo que se comprueba la
incapacidad del mutante para producir AIA a partir del precursor L-Trp. En el caso
de B. japonicum E109 se determinó un leve incremento de la concentración de AIA
en fase exponencial con respecto a la fase lag, pero además se observó un descenso
de la misma en la fase estacionaria. Esto se debería a un fenómeno de catabolismo
oxidativo de la molécula por parte de la bacteria. Las concentraciones en B. japonicum
E109 fueron en todos los casos menores a las determinadas para el caso de A. brasi-
lense. Las mayores concentraciones de giberelinas se observaron en los cultivos de
Bradyrhizobium y de la cepa mutante. La cepa que presentó mayor producción de
zeatina fue la mutante ipdC-, seguida de B. japonicum E109 (Tabla 4).
Tabla 4. Determinación de las concentraciones de AIA, GA3 y Z para las diferentes fase lag, ex-
ponencial y estacionaria (105, 107 y 109 ufc•mL-1 respectivamente) de los cultivos de A. brasilense
Az39, Sp245 (ipdC-) y B. japonicum E109.
AIA (ug/ml)] GA3 (ug/ml)] Z (ug/ml)
Az39 lag 3,346 0,000 0,000
Az39 exponencial 5,267 0,133 0,123
Az39 estacionaria 10,843 0,375 0,457
ipdC- lag 3,654 0,000 0,000
ipdC- exponencial 3,672 0,128 0,121
ipdC- estacionaria 3,637 0,402 1,023
E109 lag 1,578 0,000 0,000
E109 exponencial 2,145 0,273 0,210
E109 estacionaria 1,287 0,451 0,890
-428-
Con los resultados expuestos, se puede concluir que en esta etapa del pro-
yecto sólo se observó efecto a la co-inoculación sobre el peso fresco de plantas
de soja de 45 días. Sin embargo, no se puede confirmar que el efecto es debido a
la producción de AIA por parte de la cepa Az39 ya que no hubo diferencias con la
cepa mutante, por lo menos desde el camino de síntesis del indol-3-piruvato des-
carboxilasa. Este camino de síntesis es el más importante para la biosíntesis de
AIA por parte de A. brasilense (Prinsen et al., 1993).
En los demás parámetros evaluados (nodulación en raíz primaria y secun-
daria, peso fresco y peso seco total; altura, peso fresco y seco de planta; área su-
perficial y longitud total radicular) no hubo interacción entre tratamiento y
subtratamiento, sin embargo, se pudo observar un efecto de promoción ejercido
por Bradyrhizobium, variable según las concentraciones utilizadas. Este efecto
observado ya fue citado por Vargas et al. (2010) quienes reportaron que algunas
cepas de rizobios ejercieron diversos efectos de promoción de crecimiento en le-
guminosas y no-leguminosas. Dentro de los mecanismos que los rizobios ejercen
para promover el crecimiento está la producción de compuestos reguladores como
las auxinas, giberelinas, citocininas, etileno, ácido abscisico, alcaloides y fenólicos
(Ferguson y Lessenger, 2006); la solubilización de fosfatos (Rodriguez y Fraga,
1999) y el control biológico de patógenos (Ozkoc y Deleveli, 2001; Chao, 1990;
Hossain y Martensson, 2008).
Todas las variables de nodulación y las correspondientes a la biomasa aérea
(altura, peso fresco y seco) presentaron valores significativamente mayores cuando
las semillas fueron inoculadas con Bradyrhizobium en fase estacionaria (109 ufc·ml-
1
). En esta fase del cultivo las hormonas que se encontraban en mayor concentración
fueron las giberelinas y las citoquininas, pudiendo ser las responsables de la res-
puesta observada ya que Davies (1995) informó que las giberelinas regulan diversos
procesos en el crecimiento y desarrollo de las plantas, tales como la germinación, el
alargamiento caulinar, la floración y la fructificación, mientras Nandwal et al. (1981)
observaron que la adición exógena de citocininas promovía la iniciación del nódulo
e incrementaba el contenido de leghemoglobina. Las citocininas afectan no solo la
división celular sino también la dormición de la semilla, la floración, la fructificación
y la senescencia de la planta (Ferguson y Lesenger 2006).
La superficie y volumen radicular presentaron una respuesta positiva y sig-
nificativa cuando la inoculación fue con dosis medias de Bradyrhizobium, es decir
cuando el microorganismo se encontraba en la fase exponencial y cuyas concen-
traciones hormonales fueron de 2.145,0.273 y 0.210 de µg/ml de AIA, giberelinas
y citocininas, respectivamente. La mayor concentración de AIA puede explicar
esta respuesta en las raíces debido a que esta hormona promueve fundamental-
mente el desarrollo del sistema radicular (Cassán et al., 2009).
-429-
Estos ensayos fueron realizados en el marco del proyecto de tesis de Doctorado

en Ciencias Aplicadas de la Ing. Agr. Mariana Puente, aprobado en la Universi-
dad Nacional de Luján.
Bibliografía
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Biofertilizantes. Desde lo Artesanal hasta la Producción
Industrial. Su aplicación en Argentina
Biofertilizers. From the Craft to Industrial Production. Its

application in Argentina
Rosas, Susanaa*, Marina Neiderhausera , Carlos Betterab y E. Boschc.
Resumen
La interpretación del término biofertilizante es muy amplia, representando mi-

croorganismos, abonos verdes y estiércoles, hasta extractos de plantas. Brevemente,
podemos decir que son productos que contienen microorganismos, que al ser inocu-
lados pueden vivir asociados con las plantas, favoreciendo su nutrición y sanidad.
Cuando la agricultura tiene la necesidad de adoptar medidas conservacionistas, los
microorganismos utilizados como biofertilizantes tienen un papel sustancial.
El desarrollo y uso de los biofertilizantes se contempla como una importante
alternativa para la sustitución parcial o total de los fertilizantes minerales y agro-
químicos. La tecnología relativamente simple de la biofertilización se practica
desde hace siglos y en la mayoría de los casos se reportan respuestas positivas
sobre el rendimiento; sin embargo, esta no ha sido transferida y gran parte de los
productores desconoce el porqué de estos fenómenos, hoy vastamente conocidos.
A los fines de controlar el tipo de microorganismos de los biofertilizantes habi-
tuales, se requiere una mayor vinculación entre la industria y los científicos con
el fin de colaborar en mejorar los sistemas de producción y calidad de los biofer-
tilizantes. Nuestro grupo de Investigación ha formulado recientemente un biofer-
tilizante, utilizando Azospirillum spp y Pseudomonas spp que conduzca a
aumentar la producción y calidad de los productos hortícolas, preservando el me-
dioambiente y salud de los consumidores.
Palabras clave: biofertilizantes, Tecnologías limpias, sustentabilidad agrícola.
a Facultad de Cs Exactas, Fco Qcas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC, 5800,
Río Cuarto, Córdoba, Argentina)
b Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC, 5800, Río Cuarto, Córdoba,
Argentina).
c Facultad de Cs Económicas, Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC, 5800, Río Cuarto, Cór-
doba, Argentina).
*srosas@exa.unrc.edu.ar / rosas.susanabeatriz@gmail.com
-437-
Introducción
Del área total del planeta (510072000 km2), la parte acuática representa el
71 % y la terrestre 29 %; de la parte terrestre, sólo el 13 % se puede utilizar para
la producción agrícola. Los alimentos a nivel global provienen en un 98 % de la
parte terrestre y un 2 % de la acuática.
En los últimos años, la tasa de crecimiento de la producción agrícola se ha
incrementado; existen tres fuentes principales de crecimiento en la producción de
cultivos: aumento de la tierra cultivada, incremento de la frecuencia de las cose-
chas y aumento de los rendimientos. Hay indicios de que podríamos estar llegando
al límite de las posibilidades para las tres fuentes (FAO, 2002).
Entre los años sesenta y noventa, la tierra de cultivo en el mundo sólo creció
11% mientras que la población mundial casi se duplicó. Como resultado, la tierra
de cultivo per cápita disminuyó 40 %, pasando de 0,43 ha a sólo 0,26 ha.
No obstante, a lo largo de este mismo período, los niveles de nutrición me-
joraron considerablemente y disminuyó el precio de los alimentos. La explicación
es que el crecimiento de la productividad redujo la cantidad de tierra necesaria
para producir la misma cantidad de alimentos en un 56 %.
Esta reducción, facilitada por el aumento del rendimiento e intensidad de cul-
tivos, compensó sobradamente la disminución de superficie per cápita (Figura 1).
Figura 1. (a) se muestra la producción proyectada y la necesidad teórica y en b) el aumento de la

densidad poblacional para el 2020. FAO 1996
Sin embargo, en las últimas décadas se ha tomado conciencia del agota-

miento de los recursos naturales debido a la explotación desmesurada de los mis-
mos. En el ámbito agrícola, el objetivo es lograr altos rendimientos por unidad de
superficie para satisfacer la creciente demanda de alimentos, sin considerar la sos-
tenibilidad de la producción (viabilidad técnica, rentabilidad económica y sin con-
-438-
Biofertilizantes. Desde lo Artesanal hasta la Producción Industrial. Su aplicación en Argentina
taminación). Los éxitos de esta estrategia han sido importantes, pero es una agri-
cultura energéticamente muy ineficiente y altamente contaminante, la cual ha oca-
sionado la pérdida de la diversidad biológica, disminución de los recursos
forestales, erosión del suelo, cambios climáticos, etc. Esta situación ha disminuido
la superficie apropiada para la agricultura, causando graves problemas ecológicos,
económicos y sociales. Por tal motivo, es necesario encontrar soluciones de pro-
ducción adecuadas. Las nuevas tecnologías deben estar orientadas a mantener la
sostenibilidad del sistema mediante la explotación racional de los recursos natu-
rales y aplicación de medidas convenientes para preservar el ambiente.
Uno de los requerimientos más importantes es el mantenimiento de la fer-
tilidad del suelo.
Tradicionalmente, la deficiencia de nutrientes, especialmente N, es corre-
gida a través de la adición de fertilizantes. Sin embargo, los altos costos limitan
su uso, sobre todo en los países en desarrollo, donde la necesidad de incrementar
la producción de alimentos es más urgente. Por otro lado, se estima que los cultivos
absorben entre un 20 a 40% del fertilizante aplicado, el resto se pierde por diversos
mecanismos, generando cuantiosas pérdidas económicas y contaminación am-
biental, tal como la eutrofización de cuerpos de agua, lluvia ácida, destrucción de
la capa de ozono y el incremento del efecto de invernadero (Duxbury, 1994). La
baja rentabilidad de la actividad agrícola impulsa la investigación para desarrollar
nuevos insumos, con el fin de proveer innovaciones tecnológicas que tiendan a
maximizar el ingreso. Bajo estas condiciones, se presenta la alternativa de utilizar
tecnologías compatibles con la actividad microbiológica para favorecer la nutri-
ción de las plantas.
Evolución de las prácticas agrícolas
Barbecho
Se denomina “barbecho” a la técnica por la cual la tierra se deja sin sembrar
durante uno ó varios ciclos vegetativos, con el propósito de recuperar y almacenar
materia orgánica y humedad, además de evitar patógenos, esperando a que sus
ciclos terminen, sin poder volver a renovarse, debido a la falta de hospederos dis-
ponibles. Cuando la tierra se deja en barbecho, ésta se deja descansar por uno o
varios años. Antes de volverse a cultivar, generalmente se hace limpieza de ésta
quitándole las malas hierbas, espinos, y malezas; entonces se dice que se “barbe-
chea”, es decir, se labra disponiéndola para que esté lista para la siembra. Es una
técnica muy usada en la rotación de cultivos por algunos agricultores para que
naturalmente se pueda restaurar el equilibrio del suelo. Ésta técnica ya se usaba
desde la antigüedad. En la Biblia se hacen múltiples referencias a ella, por ejemplo
-439-
en Jeremías 4:3 y Oseas 10:12, donde se demuestra que era usada desde tiempos
bíblicos en el Medio Oriente por el pueblo agrícola judeocristiano al que se le en-
señaba a arar la tierra rompiéndola con barbecho y retirar los espinos de la misma.
Asimismo, en regiones amazónicas y andinas se utilizaba como parte del trabajo
agrícola para dejar “descansar” la tierra y que no se sobreexplotara. En Europa
empezó a ser habitual en la Edad Media, en donde las tierras de labranza se cul-
tivaban con una periodicidad en la que se alternaba el descanso y cultivo, haciendo
que en épocas de descanso se trabajara con el arado practicando el barbecho. El
barbecho supone un proceso agrícola para permitir que las cualidades del suelo
no se desgasten. Existen dos tipos de barbecho: labrado (aquel en el que se quitan
las malas hierbas) y sin labrar. Dentro de los barbechos labrados se encuentran el
barbecho labrado químico, en el cual se eliminan lasmalezas ó malas hierbas por
medio de herbicidas y el barbecho labrado mecánico que tiene más efectividad,
ya que es tratado con implementos que aceleran el proceso de descomposición al
enterrar las hierbas, por ejemplo el arado con disco.
El advenimiento de nuevas técnicas de producción agrícola ha llevado que
el término barbecho se desdoble según sea la referencia de significado perseguida,
perdiéndose en parte el primer significado. Así se irá dejando de hablar de barbe-
cho como período para la recuperación de nutrientes gracias al empleo masivo
de fertilizantes; en tanto que se comenzará a hablar de “barbecho químico” para
referirse al uso masivo de pesticidas para combatir a los agentes patógenos previo
a la siembra como también combatir malezas (Manual de Barbecho Químico).
Fertilizantes
Se sabe que el hombre comenzó a cultivar las tierras desde hace miles de
años, pero la historia de la fertilización se inició cuando los agricultores primitivos
descubrieron que determinados suelos dejaban de producir rendimientos acepta-
bles si se cultivaban continuamente, y que al añadir estiércol o residuos vegetales
se restauraba la fertilidad. El origen de la industria mundial de fertilizantes se ini-
ció a mediados del siglo XIX, periodo en el que se empezaron a comercializar
diversos tipos de fertilizantes. El importante incremento de la población mundial
en los últimos años viene exigiendo un constante reto a la agricultura para pro-
porcionar un mayor número de alimentos, tanto en cantidad como en calidad.
Desde el inicio del siglo XIX, la población mundial se ha incrementado un 550
por cien, habiendo pasado de 1000 millones a 6500 millones en la actualidad, con
unas previsiones de que se alcancen entre nueve y diez millones de habitantes en
el año 2050.
La imperiosa necesidad de aumentar la producción ante la demanda mundial
de alimentos genera una nueva agricultura, donde la tierra ya no se deja “en des-
-440-
canso” sino que a la cosecha le sigue un nuevo período de siembra. Surge así el
advenimiento de los agroquímicos.
Existen dos grandes grupos de agroquímicos: pesticidas y herbicidas, utili-
zados en el control de plagas y el control de malezas, y los fertilizantes y aditivos,
aplicados para maximizar los rendimientos de cosecha y mejorar la calidad eda-
fológica. Ambos grupos pueden producir la contaminación de suelos y aguas su-
perficiales y subterráneas y causar también la intoxicación de seres vivos, incluido
el hombre, según la Asociación Argentina de Médicos por el Medio Ambiente
(AAMMA).
Es indudable que en los últimos tiempos, y en especial desde los años no-
venta, la Argentina ha incrementado notablemente el consumo de ciertos agroquí-
micos, relacionados directamente con un marcado avance hacia la
agriculturización (sojización) y pampeanización (exportación del modelo pampe-
ano hacia otras ecorregiones como el Chaco y el NOA) y una intensificación de
prácticamente todo el paquete tecnológico aplicado al sector.
Los fertilizantes se utilizan para aportarle los nutrientes que le hacen falta
a los suelos, que luego de su utilización en varios procesos de cosechas, sin un
descanso para su recuperación, no logran hacerlo de manera óptimamente para
seguir en el proceso de cultivo de las plantas y provoca un bajo rendimiento en
las cosechas. Es así que existen diferentes tipos de fertilizantes utilizados para
este fin. De índices muy alejados del elevado consumo de agroquímicos, como
los de Estados Unidos o la Unión Europea, Argentina los elevó notoriamente y
pasó de ser un país de relativamente bajo consumo de agroquímicos y fertilizantes,
a uno mucho más orientado hacia esta línea.
En la actualidad, el índice de riesgo relativo, vinculado al consumo de agro-
químicos en toda la Región Pampeana, se ha incrementado grandemente. El país
pasó de consumir menos de un millón de litros (dosis comercial) del herbicida
glifosato a poco más de 180 millones en la última campaña.
En el norte, la respuesta ambiental ha sido la aparición de malezas resis-
tentes como el Sorgo de Alepo. Como la maleza no puede ser controlada, se lo
hace nuevamente con “viejos” herbicidas, como el 2,4 D, el paraquat, MSMA
y otros, de capacidad tóxica mucho más elevada que el primero (Pengue, 2008).
El crecimiento y el uso de la tierra en áreas cercanas a las poblaciones obligaría a
que se comience a controlar más los productos utilizados, sus volúmenes, las ro-
taciones, las combinaciones, los coadyuvantes, la deriva (químicos llevados por
el viento) sobre la población, cuyas consecuencias están sólo pobre y parcialmente
estudiadas.
En 2005 se puso en marcha un proyecto denominado “La problemática de
los agroquímicos y sus envases, su incidencia en la salud de los trabajadores, la
-441-
población expuesta y el ambiente” (aprobado por Resolución MSyA N° 1221/04).

La iniciativa se arraiga en el programa de Becas Multicéntricas “Ramón Carrillo-
Arturo Oñativia” que otorga la Comisión Nacional de Programas de Investigación
Sanitaria (CONAPRIS) del Ministerio de Salud y Ambiente de la Nación. El pro-
yecto pertenece a la Unidad de Investigación y Desarrollo Ambiental de la cartera
Ambiente nacional, que encargó la coordinación a la Asociación Argentina de Mé-
dicos por el Medio Ambiente (AAMMA). La asistencia epidemiológica estuvo a
cargo de un grupo de expertos del Instituto Nacional “Emilio Coni” de Santa Fe.
Se relevaron las regiones del país que son más afectadas por el uso de agro-
químicos y que están en directa relación con los principales centros agrícolas:
Jujuy - Salta (noroeste); Misiones - Corrientes (noreste); La Rioja - Catamarca
(noroeste); Neuquén - Río Negro (sur); Entre Ríos - centro y sur de Santa Fe (li-
toral); norte de Santa Fe-Chaco-Santiago del Estero (al norte); La Pampa -Buenos
Aires (centro).
El estudio partió de una certeza: que los agroquímicos utilizados en el con-
trol de plagas y los fertilizantes y aditivos destinados a maximizar los rendimientos
de cosecha y mejorar la calidad edafológica poseen una marcada incidencia am-
biental. Que son capaces de producir contaminación en suelos y aguas tanto su-
perficiales como subterráneas, con riesgo de intoxicación de seres vivos, incluido
el hombre. Que en el campo, la familia frecuentemente está expuesta a los efectos
de agroquímicos, por causas ambientales y laborales, porque todos colaboran en
las tareas y, así, la exposición “comienza a edades muy tempranas, desde la misma
concepción”. Y que los aplicadores suelen tener escasos recursos, poca capacita-
ción y desconocen sus potenciales perjuicios.
Los resultados demuestran una realidad determinante en cuanto al manejo
inadecuado e indiscriminado de plaguicidas, como también la falta de protección
del personal aplicador y su familia, en algunas regiones en forma más compro-
metida que en otras.
Microbiología y Agricultura
La importancia que tienen los microorganismos en la naturaleza y en sus

relaciones con el hombre es cada día más evidente. Cuando la agricultura tiene la
necesidad de adoptar medidas conservacionistas, los microorganismos utilizados
como biofertilizantes tienen un papel sustancial.
El desarrollo y uso de los biofertilizantes se contempla como una importante
alternativa para la sustitución parcial o total de los fertilizantes minerales.
Los beneficios que presenta el uso de microorganismos en la agricultura
son múltiples; estimulan la germinación de las semillas y el enraizamiento por la
-442-
producción de reguladores del crecimiento, vitaminas y otras sustancias, incre-

mentan el suministro de los nutrimentos por su acción sobre los ciclos biogeoquí-
micos, tales como la fijación de N2, la solubilización de elementos minerales o la
mineralización de compuestos orgánicos mejorando la estructura del suelo por su
contribución a la formación de agregados estables, desarrollan fenómenos de an-
tagonismo microbio-microbio, eliminan productos xenobióticos tales como pes-
ticidas, herbicidas y fungicidas, incrementan la resistencia al estrés tanto biótico
como abiótico (Glick, 1995, Bowen y Rovira, 1999, Kloepper et al, 1980; Sarma
et al, 2000; Rosas, y . Correa, 2003; Rosas, 2005).
Los biofertilizantes
La interpretación del término biofertilizante es muy amplia, representando

desde microorganismos, abonos verdes y estiércoles, hasta extractos de plantas.
De manera sintetizada, podemos decir que son productos que contienen microor-
ganismos, que al ser inoculados pueden vivir asociados ó en simbiosis con las
plantas y le ayudan a su nutrición y protección (Vessey, 2003). Estos microorga-
nismos se encuentran de forma natural en el suelo y abarcan diversos grupos; sin
embargo, su población es afectada por el manejo de suelo y uso excesivo de agro-
químicos (Caballero-Mellado et al., 1992; Grageda-Cabrera et al., 2003).
Aunque no se conocía la existencia de las bacterias, hasta que en 1683 von
Leewenhoek las describió, su utilización para estimular el crecimiento de las plan-
tas se remonta siglos atrás. Teofrasto (287 a.C.) y Virgilio (30 a.C.) sugerían mez-
clar el suelo donde se habían cultivado leguminosas con suelo donde no se habían
cultivado, para remediar sus defectos y adicionarle fuerza (Tisdale y Nelson,
1975).
Desde el siglo XVIII se inocularon hongos en plántulas de encino para in-
crementar la producción de trufas, que son hongos que tienen alto valor económico
por su enorme importancia gastronómica. Las trufas eran colocadas en los “caje-
tes” donde las plántulas de los encinos eran sembradas. Esto ocurrió mucho antes
de que en 1885 se acuñara el vocablo “micorriza” (Smith y Read, 1997).
A finales del siglo XIX, la práctica de mezclar suelo con semillas, se con-
virtió en un método recomendado para inocular leguminosas en Estados Unidos;
poco después, la empresa Nitragín registró la primer patente para inocular plantas
con bacterias del género Rhizobium spp. En las décadas de 1930 y 1940, la ino-
culación con bacterias rizosféricas asociativas con cepas de los géneros Azoto-
bacter y Bacillus fue utilizada a gran escala en Rusia y Europa del Este.
Sin embargo, estas prácticas no tuvieron éxito y fueron abandonadas du-
rante la Segunda Guerra Mundial (Barea et al., 2005; Bashan, 2008). Todo apun-
-443-
taba que el futuro de los biofertilizantes era promisorio en el desarrollo de la agri-

cultura del siglo XX. Sin embargo, la asombrosa industrialización y urbanización
que surgió después de 1945, demandó una gran cantidad de materias primas y ali-
mentos. Es aquí donde la demanda de los fertilizantes, que son capaces de generar
una rápida respuesta productiva, tuvieron su extensa utilización (Duxbury, 1994).
Aunque por casi 100 años se han producido comercialmente inoculantes a
base de Rhizobium spp., con las crisis energéticas en la década de 1970, el estudio
de los biofertilizantes avanzó rápidamente en algunos países europeos y asiáticos;
sin embargo, el avance fue menor en México y países latinoamericanos (Okon y
Labandera-González, 1994). Actualmente, existe una gran variedad de biofertili-
zantes con diversas funciones y formulado para cada tipo de cultivo.
Tipos y modos de acción de biofertilizantes. Hongos

El término micorriza fue creado por el botánico alemán Albert Bernard
Frank en 1885, y procede del griego mykos que significa hongo y del latín rhiza
que significa raíz, definiendo así la asociación simbiótica entre el micelio de un
hongo y las raíces de un vegetal. De entre las diversas asociaciones benéficas
planta-microorganismo, la micorrícica es la que se encuentra más ampliamente
extendida sobre la superficie terrestre, alrededor del 90% de las plantas terrestres
la forman (Smith y Read, 1997),también es la más antigua, se han encontrado fó-
siles con ca.4.0 x 108 años (Simon et al., 1993).
Los medios por los cuales las micorrizas pueden mejorar el estado nutri-
cional de las plantas son incremento del volumen de exploración de las raíces, ya
que las hifas del hongo actúan como una extensión, facilitando la captación de
agua y nutrientes como P, N, K y Ca, incrementan la tolerancia a los cambios de
temperatura y acidez extrema del suelo causadas por la presencia de Al, Mg y S,
y proveen protección contra ciertos patógenos, entre otros efectos. Es por ello que
a las micorrizas se les reconoce un gran potencial en el contexto de la agricultura
sostenible.
Por otro lado, el hongo del género Trichoderma, habitante común en la ri-
zósfera, tiene varios mecanismos a través de los cuales influye en el desarrollo de
las plantas tales como la producción de reguladores de crecimiento, la solubiliza-
ción y absorción de P, Cu, Fe, Zn, y Mn, y capacidad antagónica contra ciertos
hongos fitopatógenos de plantas de interés agrícola (Gravel et al., 2007; Osman
et al., 2010).
Tipos y modos de acción de biofertilizantes. Bacterias promotoras del

crecimiento vegetal
Las bacterias que habitan la rizósfera y son beneficiosas para las plantas se
-444-
denominan rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) (Kloepper

et al., 1980). Estas bacterias pertenecen a varios generos como Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter,
Burkholderia, Bacillus y Serratia (Kloepper et al., 1989; Okon y Labandera-Gon-
zalez, 1994; Glick, 1995; Joseph et al., 2007).
Durante las dos últimas décadas aumentó notoriamente el uso de las
PGPR´s en agricultura en varias partes del mundo. Así, se ha informado repetida-
mente sobre incrementos significativos en el crecimiento y el rendimiento de cul-
tivos agronomicamente importantes en respuesta a la inoculacion con PGPR a
base de Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium (Sessitsch et al., 2002); Azos-
pirillum (Caballero-Mellado et al., 1992; Okon y Labandera-González, 1994);
Azotobacter(Somers et al., 2004), Pseudomonas (Gravel et al., 2007, Rosas et al,
2009, Carlier et al, 2008), microorganismos solubilizadores de fosfato (Lugtenberg
y Kamilova, 2009, Rosas et al, 2009) y Trichoderma (Gravel et al., 2007), para
mejorar la nutrición de las plantas y la producción agrícola, estando este item muy
bien documentado.
El uso de biofertilizantes es una alternativa viable y sumamente importante
para lograr un desarrollo agrícola ecológicamente sostenible, ya que permite una
producción a bajo costo, no contamina el ambiente y mantiene la conservación
del suelo desde el punto de vista de fertilidad y biodiversidad contrario al efecto
producido por los agroquímicos.
En la agricultura nacional, en cultivos intensivos se sigue utilizando la ca-
pacidad de algunos microorganismos para aumentar la disponibilidad de nutrientes
y control de patógenos, a través de la fermentación de los residuos orgánicos me-
diante el desarrollo de compost y utilización de lombrices para su descomposición.
Sin embargo, este sistema, prácticamente artesanal y propio de cada productor no
puede extrapolarse a las prácticas culturales extensivas. El advenimiento de for-
mulaciones definidas, en soporte estéril implica que la calidad sanitaria del pro-
ducto está garantizada y, por lo tanto, el inoculante mismo no sea vector de
transporte de agentes patógenos que puedan afectar los cultivares donde se aplique.
En Argentina, la producción de conocimiento científico tecnológico se inició tem-
pranamente con los primeros estudios de producción de inoculantes en fermenta-
dores y sus ensayos a campo, siendo los organismos pioneros locales el Centro de
Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI) del CO-
NICET y el Instituto de Microbiología y Zoología Agropecuaria (IMyZA) del
INTA Castelar. En 1969, se publicó en la revista Soil Science el trabajo “Cultivo
de Rhizobium meliloti”, donde se describen los primeros desarrollos que se reali-
zaban en la sección Biotecnología del Departamento de Tecnología Química de
la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP. Este Grupo de trabajo dio origen al
-445-
CINDEFI. Actualmente se cuenta en nuestro país con una veintena de empresas

productoras de inoculantes y adhesivos según catálogo de empresas actualizado
al 2010 de BIOTECSUR.
El estudio de las interacciones entre diversos microorganismos de distinta
naturaleza es base fundamental para el desarrollo de biofertilizantes mixtos. Estas
investigaciones revisten mayor complejidad y se deben valorar la pertinencia de
las mezclas para optimizar este tipo de biofertilizantes.
Actualmente estamos en las etapas finales de elaboración de un formulado
mixto en base a Pseudomonas spp y Azospirillum spp para aplicación hortícola y
extensible a otros cultivos, con la finalidad de aumentar la producción en base a
movilización de nutrientes, producción de fitohormonas y mejorar la sanidad por
la producción de antifúngicos
Los ensayos en invernáculo realizados en acelga (Beta vulgaris L)arrojan
diferencias significativas cuando se utiliza el formulado mixto en parámetros tales
como peso fresco parte aérea, superficie parte aérea y longitud radical respecto al
control (Rosas, 2011)
Normativa y fiscalización de biofertilizantes en Argentina
La inscripción y normatización de fertilizantes biológicos en Argentina fue

reglamentada originalmente por la Resolución N° 1131 del 29/12/1988 de la Se-
cretaría de Agricultura y Pesca (SAGyP) donde se establecían las características
que deben reunir los fertilizantes biológicos. Dicha normativa fue modificada y
derogada posteriormente por la Resolución N° 310-94 de la SAGyP encuadrada
en la previsión del artículo 16 de la Ley Nacional N° 20466. Con ello se procedió
a “la inscripción de las firmas elaboradoras, fraccionadoras, importadoras o dis-
tribuidoras de fertilizantes biológicos”. Los requisitos previos para la concesión
de registro y comercialización de inoculantes incluyen, además de la presentación
de formularios “ad hoc” solicitando la “Inscripción del producto”, el envío de in-
formación y provisión de material según: 1) indicaciones de uso del producto; 2)
tres (3) muestras del producto a ser habilitado: 3) semillas de la especie para la
cual es específico y 4) identificación de cepas incluyendo la determinación por
reacción PCR en caso de ser importado. El Organismo Responsable constituye el
Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria (SENASA) a través de la Dirección
de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios y de la Coordinación
General de Agroquímicos y Biológicos. La normativa específica sobre el trámite
de habilitación y control de calidad de inoculantes comercializados está regulada
por la Ley 20.466; el Decreto 4.830/73; el Decreto 1624/80; la Resolución SAG
66/73; y las Resoluciones SAGYP 310/94, 410/94 y 422/04. A través de los mis-
-446-
mos se establece la competencia del laboratorio del SENASA como organismo

oficial para el control de calidad y al mismo tiempo se establecen los medios mí-
nimos requeridos para la realización de dicho control por parte de los organismos
privados, los cuales constan como anexo de la Resolución N° 310/94. También
en el Artículo 2° de dicha Resolución, y como norma general de habilitación se
consigna que “Todo producto nuevo, de elaboración nacional o de importación,
que no cuente con antecedentes en el país en cualquiera de sus 3 (tres) compo-
nentes: 1) principio activo (microorganismo); 2) soporte, diluyente, “carrier” o
vehículo y 3) tecnología d fabricación propia, deberá someterse a tres (3) años de
ensayos a campo en tres (3) zonas ecológicas distintas, con no menos de cuatro
(4) cultivares por zona y con interpretación estadística”. Tales ensayos son con-
trolados por personal del SENASA.
Asimismo, existen protocolos consensuados para los Ensayos de Eficiencia,
los cuales constan de 1- Antecedentes del producto; 2- Objetivos y Parámetros del
ensayo; 3- Materiales y Métodos; 4- Presentación de Resultados mediante Cuadros
y Gráficos Comparativos de Rendimientos, Costos y Análisis Estadístico y 5- Con-
clusiones, en forma breve y concisa
Perspectivas
El uso a gran escala de los biofertilizantes en cualquier sistema de produc-

ción agrícola traería grandes beneficios sin ejercer un impacto perjudicial sobre
el ambiente.
A corto y mediano plazo, la investigación deberá enfocarse en el desarrollo
de inoculantes de mejor calidad y más económicos (Díaz-Franco y Mayek-Pérez,
2008). En términos generales, se puede decir que los biofertilizantes tienen un
costo para el productor de sólo 10% del costo de la fertilización química, y en la
mayoría de los casos no debe representar más del 2% a 3% del costo de producción
del cultivo.
Además, es necesario desarrollar “tecnologías de punta” in situ, con las
condiciones locales, ya que las desarrolladas en otros países y aplicadas a nuestros
suelos, son causa potencial de desequilibrio ecológico. Finalmente, es necesario
mencionar que el control de calidad es una herramienta necesaria para mejorar el
mercado de los inoculantes. Asimismo, se requiere de mayor vinculación entre la
industria y los científicos con el fin de colaborar en el desarrollo de estas tecno-
logías.
Lo que natura non da, salamanca non presta
-447-
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Bacterias asociadas a la cutícula de insectos
y su rol como antagonistas de hongos patógenos
utilizados en control biológico
Bacteria associated with insects’ cuticle and their role as

antagonists of fungal pathogens used in biological control
Toledo*, Andrea V., Pedro A. Balatti
Resumen
La cutícula de los insectos constituye un reservorio de microorganismos

que pueden estar involucrados directa o indirectamente en la vida del hospedador.
Este exoesqueleto conforma un microambiente donde residen y proliferan tanto
hongos como bacterias. Dentro de estas últimas un gran porcentaje está confor-
mado por bacilos Gram positivos formadores de esporas, los cuales establecen re-
laciones de competencia y/o antagonismo con el resto de los microorganismos allí
presentes. Son estas interacciones las que, por ejemplo, afectan la supervivencia
de los insectos plaga de los cultivos, cuando involucran la competencia por un re-
curso o la inhibición de la germinación y desarrollo de los hongos entomopatóge-
nos que son utilizados como agentes de control biológico. Dentro de los hongos
entomopatógenos más utilizados dentro de un manejo integrado de las plagas se
destacan Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. La importancia de los
mismos radica en su rápido desarrollo, fácil producción masiva y practicidad en
la forma de aplicarlos. En vista del impacto de estos microorganismos en el control
de insectos plaga alrededor del mundo, en este trabajo se describen los resultados
de nuestras investigaciones acerca de la diversidad bioquímica y molecular de la
microbiota bacteriana aislada de la superficie corporal de Dalbulus maidis y Del-
phacodes kuscheli y su capacidad antagonista in vitro, sobre aislamientos de B.
bassiana y M. anisopliae.
Palabras clave: Antagonismo, Bacillus, hongos entomopatógenos.
Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,

Universidad Nacional de La Plata (UNLP), 1900 La Plata, Pcia. Buenos Aires, Argentina.
* andytoledo75@yahoo.com.ar
-451-
Introducción
La eficacia de las esporas de los hongos patógenos al infectar a los insectos

hospedadores depende de la habilidad de permanecer viables por un período de
tiempo apropiado para ejercer su rol. Dicha viabilidad, se encuentra influenciada
por factores intrínsecos, como ser el tamaño, forma, composición y organización
interna, y la estructura de la pared de la espora, así como también por factores ex-
trínsecos, los cuales incluyen la temperatura, irradiación y disponibilidad de agua,
así como también la influencia de los microorganismos.
Para evaluar la potencialidad de un hongo como agente de control biológico
de una población de insectos plaga es necesario conocer la influencia de todos
estos factores a los fines de potenciar su uso. Aunque hay excepciones, se conoce
que la mayoría de los hongos entomopatógenos se desarrollan óptimamente a tem-
peraturas entre 25 y 35º C, por lo cual el uso efectivo de estos entomopatógenos
dentro de los programas de Manejo Integrado de las Plagas requiere la selección
de aislamientos tolerantes a los rangos de temperatura establecidos en los ecosis-
temas involucrados. En estos microclimas, los agentes de control biológico tam-
bién se encuentran expuestos a la radiación solar, la cual influye en el crecimiento,
el desarrollo y la reproducción, aunque se sabe que las diferentes especies fúngicas
y los distintos aislamientos dentro de una misma especie difieren significativa-
mente en su susceptibilidad. Incluso algunos estudios sugieren que las esporas
pigmentadas son menos susceptibles a la radiación que aquellas hialinas (Singa-
ravelan et al., 2008). Otro factor involucrado es la humedad, la cual puede limitar
sumamente el uso de muchos de los hongos entomopatógenos como biocontrola-
dores, ya que se necesita una alta humedad para que la germinación de las esporas
pueda efectuarse y por consiguiente producir una micosis en el hospedador. Si
bien se conocen casos en los que ciertas especies de hongos entomopatógenos han
infectado a sus hospedadores exitosamente bajo condiciones de sequía, con hu-
medades relativas inferiores al 13% (Fargues et al., 1997), la capacidad de ciertas
especies o aislamientos de operar bajo estas condiciones se atribuye a la presencia
de humedad en los microhábitats donde ellos están activos, como por ejemplo la
superficie abaxial de las hojas o los pliegues membranosos de la superficie cuti-
cular de los insectos (Wraight et al., 2007). De la misma manera, la lluvia juega
un rol importante en la persistencia y transmisión horizontal del patógeno, ya que
al lavar a los cadáveres infectados impide que estos actúen como fuente de inóculo
de la enfermedad. También de manera extrínseca y encuadrada en un marco bio-
lógico, se encuentra la interacción del patógeno con otros microorganismos cir-
cundantes. Se conoce que para algunas interacciones hongo-hospedador la falla
del primero en invadir la cutícula del blanco radica en la presencia de compuestos
-452-
Bacterias asociadas a la cutícula de insectos y su rol como antagonistas...
inhibitorios sobre la superficie cuticular, tales como grupos fenólicos, quinonas,

aldehídos, alcaloides venenosos, ácidos grasos de cadena corta, péptidos catióni-
cos y fluidos involucrados en el proceso de la muda (Smith y Grula 1981; Szafra-
nek et al., 2001; Howard y Lord 2003; James et al., 2003; Lord y Howard, 2004).
Sin embargo existe también un factor importante que es la antibiosis ejercida por
la microbiota que habita de manera casual o permanente la superficie corporal de
las plagas. Esta microbiota conformada por otros hongos y bacterias puede afectar
la germinación y producción de conidios y el desarrollo micelial del entomopató-
geno, por ejemplo por la liberación de compuestos inhibitorios (Hubner, 1958).
Aunque al presente son escasos los estudios referidos a esta temática, se tienen
registros del antagonismo ejercido por bacterias simbiontes de nematodos sobre
el desarrollo y la producción de conidios de los hongos entomopatógenos, Beau-
veria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill, B. brongniartii (Sacc.) Petch, Metarhizium ani-
sopliae (Metschn.) Sorokin e Isaria fumosorosea Wize (Ascomycota:
Hypocreales) (Ansari et al., 2005), así como también del rol defensivo que poseen
las actinobacterias filamentosas, presentes en el integumento de las hormigas cor-
tadoras de hojas, frente a M. anisopliae (Mattoso et al., 2011). En ambos casos se
pone en evidencia la habilidad de estos microorganismos de defender a sus hos-
pedadores frente a posibles infecciones fúngicas y conformar con ellos asociacio-
nes que podrían considerarse mutualistas.
En vista del impacto de los hongos entomopatógenos en el control de in-
sectos plaga alrededor del mundo, en este trabajo se describen los resultados de
nuestras investigaciones acerca de la diversidad bioquímica y molecular de la mi-
crobiota bacteriana aislada de la superficie corporal de Dalbulus maidis (DeLong
& Wolcott) (Hemiptera: Cicadellidae) (Figura 1a) y Delphacodes kuscheli Fennah
(Hemiptera: Delphacidae) (Figura 1d), vectores de patógenos al maíz, y su capa-
cidad antagonista in vitro, sobre aislamientos nativos de B. bassiana (Figuras 1b
y c) y M. anisopliae (Figuras 1 e y f).
-453-
Figura 1. (a): Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae). (b): Conidios de Beauveria bassiana ad-
heridos a la superficie cuticular y a los pelos cuticulares del insecto hospedador. Las flechas indi-
can la formación de los tubos germinativos y los puntos de entrada hacia el hemocele. (c): Micelio
de B. bassiana esporulado surgido a partir de un hospedador infectado. (d): Delphacodes kuscheli
(Hemiptera: Delphacidae). (e): Conidios de Metarhizium anisopliae adheridos a la superficie cuti-
cular y a los pelos cuticulares del insecto hospedador. Las flechas indican la formación de los
tubos germinativos y los puntos de entrada hacia el hemocele. (f): Micelio de M. anisopliae con
formación de esporodoquios (conidios dispuestos en empalizada) surgido a partir de un hospeda-
dor infectado.
-454-
Hongos entomopatógenos
Taxonomía
Los hongos son organismos eucariotas heterotróficos que se nutren por ab-
sorción, que se desarrollan mediante la formación de hifas tubulares ramificadas
y que se reproducen por medio de esporas sexuales y/o asexuales (Kendrick,
2000). Los organismos que responden a estas características conforman un grupo
filogenéticamente diverso, que comprende actualmente dos reinos: Straminipila
(= Stramenopila o Straminopila, = Chromista) y Eumycota (Alexopoulus et al.,
1996; Blackwell y Spatafora, 2004).
Hoy en día se reconocen más de 700 especies de hongos entomopatógenos
representantes de los dos reinos previamente mencionados, siendo la mayoría
miembros de los Eumycota (hongos verdaderos). A diferencia de los Straminipila,
los hongos verdaderos, en su mayoría no producen esporas móviles y sus paredes
celulares están conformadas por quitina (Alexopoulus et al., 1996). La división
Crytridiomycota contiene una única clase Chytridiomycetes (acuática y con es-
poras móviles), cuyo género con especies patógenas de insectos (dípteros) más
estudiado es Coelomomyces. Los entomopatógenos de las divisiones Zygomycota,
Ascomycota y Basidiomycota no forman esporas móviles y son principalmente
terrestres. Dentro de los Zygomycota, la mayoría de las especies entomopatógenas
se encuentran dentro de la clase Zygomycetes, orden Entomophthorales, los cuales
producen hifas cenocíticas donde ocurre alguna septación, esporas sexuales
(zygosporas) y en algunas especies esporas asexuales (azygosporas), ambas con
paredes gruesas y con la capacidad de actuar como estructuras de resistencia. Este
grupo también produce conidios asexuales uni o multinucleados que al germinar
originan conidios secundarios y terciarios. Los géneros más comunes incluyen a
Conidiobolus, Entomophaga, Entomophthora, Erynia, Pandora, Neozygites y Zo-
ophthora.
Unos pocos géneros de hongos entomopatógenos (Cordyceps, Torrubiela
y Ascosphaera) poseen un estado sexual, donde las esporas son producidas dentro
de ascos, y se clasifican dentro de la división Ascomycota. Sin embargo, el resto
de los géneros entomopatógenos más representativos de esta división (Aspergillus,
Aschersonia, Beauveria, Culicinomyces, Fusarium, Gibellula, Hirsutella, Hyme-
nostilbe, Lecanicillium, Metarhizium, Nomuraea, Isaria, Sorosporella y Tolypo-
cladium) parece haber perdido la capacidad de producir un estado sexual. Todas
las formas asexuales (anamorfos) de estos hongos producen esporas llamadas co-
nidios y debido a que el estado sexual (teleomorfo) de la mayoría de las especies
es desconocido, todos ellos han sido colocados tradicionalmente en la clase
Hyphomycetes dentro de la división Deuteromycota. Sin embargo, estas no son
-455-
categorías taxonómicas monofiléticas, por lo cual hoy en día han sido abandonadas
y reemplazadas por la clasificación en la clase Sordariomycetes, orden Hypocre-
ales, familia Clavicipitaceae (Hodge, 2003).
Ciclo de infección en el hospedador

El ciclo de infección generalizado de un hongo en un insecto hospedador y
el consecuente desarrollo de una micosis, comienzan con la adhesión de los pro-
págulos infectivos (conidios) a la cutícula (Figuras 1 b y e), la cual depende de
una interacción molecular entre la superficie del conidio y la capa de cera de la
misma (Boucias y Pendland, 1983). A la adhesión sobreviene la germinación sobre
esta superficie, dónde en algunos casos se produce la formación de apresorios.
Una vez concluida la penetración a través de la cutícula la cual es efectuada por
la presión ejercida por el tubo germinativo y por la liberación de enzimas, princi-
palmente lipasas, proteasas y quitinasas, se produce la multiplicación del patógeno
en el hemocele y, en ciertas especies fúngicas, la producción de toxinas u otros
metabolitos secundarios con actividad tóxica. A esta serie de eventos sobreviene
la muerte del insecto como resultado de una combinación de factores, entre los
cuales se encuentran el agotamiento de nutrientes, la obstrucción física o invasión
de órganos y la producción de toxinas. Por último, el micelio sale hacia el exterior
atravesando el tegumento o en ciertos casos a través de los órganos de los sentidos
o de los espiráculos, esporula sobre la superficie del cadáver (Figuras 1 c y f) y fi-
nalmente se produce nuevamente la diseminación de los propágulos infectivos.
Bacterias asociadas a la cutícula de insectos
Al presente se cuenta con algunas investigaciones que apuntan a conocer

la microbiota que se aloja en la superficie cuticular de los insectos y a adjudicarles
un rol específico en relación al hospedador. Estudios recientes revelaron la pre-
sencia de varias especies de hongos y bacterias Gram positivas y Gram negativas
sobre la cutícula de dípteros de las familias Psychodidae y Muscidae (De Castro
et al., 2007; Akhoundi et al., 2012) y de himenópteros de la familia Formicidae
(Mattoso et al., 2011). A las bacterias identificadas por Mattoso y colaboradores
se les adjudicó específicamente un rol de defensa de las obreras jóvenes de la co-
lonia, ante el ataque de los hongos entomopatógenos. logramos aislar un total de
155 cepas bacterianas a partir de la superficie corporal de ejemplares adultos de
D. maidis y D. kuscheli. El total de estos microorganismos fue caracterizado mor-
fológicamente mediante observaciones microscópicas, lo cual nos permitió cono-
cer la composición de la población bacteriana presente sobre la superficie corporal
de cada una de las especies de insectos estudiada. En ambos hospedadores se ob-
-456-
servó un marcado predominio de bacilos Gram positivos formadores de esporas,

en relación a bacilos Gram positivos no formadores de esporas, bacilos Gram ne-
gativos y cocos Gram positivos y Gram negativos. Al mismo tiempo, la caracte-
rización morfológica fue complementada con la realización de pruebas
bioquímicas, las cuales incluyeron reacción de catalasa, actividad oxidasa, pro-
ducción de lecitinasa, actividad hemolítica, reducción de nitrato, utilización anae-
róbica de glucosa, utilización de manitol y arabinosa, e hidrólisis de almidón y
gelatina de acuerdo a protocolos estándar. Mediante estas pruebas se identificaron
los microorganismos a nivel de especie, registrando cepas de Bacillus megaterium,
B. mycoides, B. pumilus, B. licheniformis, B. subtilis, B. thuringiensis y B. amy-
loliquefaciens (Toledo et al., 2011). Etas identificaciones fueron confirmadas mo-
lecularmente por medio de la secuenciación del gen 16S, datos que fueron
utilizados para evaluar la diversidad poblacional de la microbiota estudiada (To-
ledo et al., datos no publicados).
Interacciones microbianas a nivel cuticular
Son varias las investigaciones que han tenido como objetivo conocer el rol
que ejercen los microorganismos asociados a los insectos. Estudios efectuados en
años recientes han demostrado que varios microorganismos endosimbiontes (bac-
terias y hongos) poseen la habilidad de defender a sus hospedadores de los ene-
migos naturales como ser parasitoides y hongos entomopatógenos (Oliver et al.,
2003; Scarborough et al., 2005) y conformar con ellos asociaciones que podrían
considerarse mutualistas.
La mayoría de los estudios se han focalizado en las funciones que desem-
peñan los endosimbiontes en la alimentación y en la defensa frente al ataque de
patógenos y parasitoides, pero como mencionamos anteriormente son escasos los
estudios orientados a conocer el rol que cumplen los microorganismos que residen
en la superficie cuticular de los insectos. Por tal motivo, nosotros hemos investi-
gado como se comportan in vitro las bacterias aisladas a partir de los hospedadores,
frente a los hongos entomopatógenos que actúan como agentes de control bioló-
gico de los mismos (Figura 2). Nuestros ensayos demostraron que el 59% de las
cepas aisladas presentaron actividad antagónica frente al crecimiento micelial de
B. bassiana, ejerciendo el 53% de las mismas valores de inhibición del crecimiento
de las colonias fúngicas superiores al 40%. Asimismo hemos realizado ensayos
que han demostrado el efecto antagónico que poseen algunas de las cepas bacte-
rianas aisladas, frente a la germinación de los conidios de B. bassiana y al creci-
miento de las colonias de M. anisopliae (Toledo et al., 2011; Toledo et al., datos
no publicados), constituyendo nuestros estudios los primeros registros de cepas
-457-
bacterianas aisladas a partir de la superficie cuticular de cicadélidos y delfácidos,

capaces de inhibir el desarrollo de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M.
anisopliae.
Se conoce que varias de las especies que conforman el grupo Bacillus sub-
tilis, tales como B. pumilus, B. licheniformis, B subtilis, B. atrophaeus and B. amy-
loliquefaciens secretan antibióticos y compuestos antifúngicos que juegan un rol
crucial en las interacciones microbianas (Thimon et al., 1992; Feignier et al., 1995;
Leifert et al., 1995; Gálvez et al., 1993; Wattiau et al., 2001; Martinari et al., 2002).
Estos organismos son unos de los más utilizados en el control de fitopatógenos, y
comprenden un grupo heterogéneo de bacterias Gram positivas, aeróbicas o anae-
róbicas facultativas, formadoras de endosporas. Estas endosporas son estructuras
termotolerantes que resisten la falta de humedad, la radiación ultravioleta y el
efecto de los solventes orgánicos (Fritze, 2004). Asimismo, bajo ciertas condicio-
nes, éstas pueden sintetizar péptidos que inhiben el desarrollo de otros organismos,
lo cual ha promovido la utilización de aislamientos de Bacillus para controlar pa-
tógenos foliares y de raíces (Backman et al., 1997; Kloepper, 1997; Melo, 1998).
Aunque la actividad biocontroladora de Bacillus parece residir en una va-
riedad de mecanismos, la competencia, la inducción de resistencia sistémica y la
producción de antibióticos constituyen las más importantes (Tomashow y Weller,
1996; Bizani y Brandelli, 2002; Stein, 2005).
Como habitantes de la cutícula de cicadélidos y delfácidos, nosotros en-
contramos más de una especie de Bacillus, todas ellas con la capacidad de inhibir
el desarrollo de los hongos entomopatógenos estudiados.
Los estudios revelaron la prevalencia, en la cutícula de estos insectos, de
bacterias Gram positivas con respecto a las Gram negativas, lo cual probablemente
este relacionado con la capacidad de las primeras de esporular ante condiciones
adversas. Esto probablemente constituya la base para futuros estudios orientados
a conocer los roles biológicos y ecológicos de ambos grupos de bacterias sobre la
superficie corporal de los insectos. Se dejan abiertas muchas preguntas que nece-
sitarán respuestas, como ser la identificación de las bacterias Gram negativas, la
investigación de sus estrategias de supervivencia, y si ellas juegan un rol como
inhibidoras de los hongos y/o de otros organismos presentes en la superficie cuti-
cular.
-458-
Figura 2. (a) y (b): Conidios no germinados de B. bassiana (co) en presencia de bacterias bacili-
formes (ba) presentes sobre la superficie cuticular del insecto hospedador. En la figura b puede
observarse la presencia de tubos germinativos (tg) largos y errantes. (c): B. bassiana control, mos-
trando un crecimiento uniforme del micelio. (d-h): Crecimiento de B. bassiana en presencia de di-
ferentes cepas de Bacillus, mostrando los diferentes grados de antagonismo ejercido por las
mismas.
-459-
Conclusiones
Es evidente que las bacterias presentes en el filoplano y en los suelos cul-
tivados pueden estar presentes en la cutícula de los insectos plaga y de esta manera
constituir un obstáculo en el accionar de los hongos entomopatógenos. Por tal
motivo resulta de fundamental importancia conocer las interacciones que pueden
ocurrir entre estos microorganismos para lograr una adecuada formulación de un
micoinsecticida y mejorar las recomendaciones de uso de B. bassiana y M. ani-
sopliae en un programa de Manejo Integrado de las Plagas
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-463-
Inconvenientes en el desarrollo de la Biodegradación
Inconvenient in the Biodegradation developing
Pucci Graciela Na, Adrián Acuñab y Oscar H Puccia
Resumen
La eliminación de contaminantes orgánicos de suelos por métodos biológi-

cos (biorremediación) es una tecnología que se supone exitosa, de bajo costo y
ampliamente aplicada en contaminación por hidrocarburos del petróleo. A escala
de laboratorio se consiguen tasas de depuración altas en tiempos aceptables, pero
a campo se presentan aspectos diferentes que implican, en muchos casos, limita-
ciones muy importantes y, a veces, fracasos. Por ser una técnica aparentemente
sencilla y sin complicaciones, se toma generalmente con pocos cuidados cuando
se tratan a campo grandes cantidades de suelo contaminado. Esta situación, acom-
pañada de una dirección y operación de landfarming y biopilas por personal es-
casamente capacitado, se traduce en resultados decepcionantes. En el presente
capítulo resumiremos la experiencia de más de 20 años en tareas de biorremedia-
ción en laboratorio y a campo con aciertos, métodos de control, errores y fracasos
que al tenerlos en cuenta permitirían desarrollos exitosos.
Palabras clave: biodegradación, problemas, microbiología
Introducción
Cuando un contaminante como el petróleo o sus derivados es derramado

en el suelo, existen diferentes posibilidades con respecto a su destino. Una de estas
posibilidades es que permanezca en el suelo por largos períodos de tiempo sin ser
modificado, lo que se denomina pasivo ambiental y de los cuales existen muchos
en la zona de explotación de la cuenca del golfo San Jorge. Al estar estos pasivos
ambientales expuestos a diferentes condiciones ambientales, sufren procesos fí-
sico-químicos, como ser fotooxidación, evaporación, etc, o procesos biológicos
no asistidos (Singleton y Sainsbury 2006).
a. Departamento de bioquímica, Centro de estudios en microbiología aplicada (CEIMA), Universi-
dad Nacional de la Patagonia (UNPSJB), 9000 Comodoro Rivadavia, Argentina. Mail granapu@un-
pata.edu.ar - b. Grupo de Estudios Ambientales (GEA), Universidad Tecnológica Nacional - Facultad
Regional Santa Cruz, 9400 Río Gallegos, Argentina.
-465-
La biorremediación (Figura 1) es el proceso mediante el cual los microor-

ganismos presentes en un sitio, producen la transformación o eliminación de un
contaminante (Atlas y Bartha 2002). Esta tecnología suele ser aplicada con el di-
seño de landfarming o biopila. Para que dicho proceso pueda llevarse a cabo, hay
una serie de factores que deben conocerse ya que pueden ser responsables de li-
mitar la eficacia del proceso. Dentro de estos parámetros se destacan:
- La composición de los hidrocarburos contaminantes.

- Las características edafológicas del suelo.
- Las condiciones climáticas de la zona, principalmente temperatura
y humedad.
- La composición en aniones y cationes del suelo (nutientes, sales ,
metales pesados)
Figura 1. Esquema de la biodegradación.
De las técnicas existentes para la recuperación de suelos contaminados con

hidrocarburos, los métodos biológicos son los más económicos y bien vistos por
la comunidad aunque cuentan con el inconveniente de ser muy lentos, 6 a 24
meses, y de tener ciertas necesidades dependientes de las condiciones ambientales
y de la sedimetalogía del suelo (Acuña et al., 2009). Esto conlleva a que mucha
gente quiera realizar esta clase de técnicas sin tener los conocimientos necesarios
-466-
y los recaudos que se necesitan para que los microorganismo realicen su trabajo
de una forma óptima, lo que se traduce en malos resultados.
La Environmental Protection Agency (EPA), (2004) en sus capítulos de
libro es clara y presenta los parámetros generales que permiten arribas a buenos
resultados en bioremediaciones (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros que se deben analizar para las biorremediaciones (EPA, 2004)
Efectivo Necesita corrección Baja efectividad
Temperatura 10°C ≤ °T del suelo ≤ 45°C 10°C > °T del suelo > 45°C
Humedad 40% ≤ Cap ret. H2O ≤ 85% Cap ret. H2O< 40% Cap ret. H2O> 85% *
pH 6≤ pH ≤ 8 6>pH > 8
BAT >1000 UFC g -1 < 1000 UFC g -1
Metales pesados ≤ 2500ppm > 2500ppm
Concentración
del ≤ 50000% 50000ppm
hidrocarburo
* necesita drenaje o agregado de un cobertor.
BAT, bacterias aeróbias totales
El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos, que existe en la na-

turaleza en forma gaseosa, líquida y sólida. Es un derivado de una gran variedad
de compuestos orgánicos, que son transformados durante largos períodos de
tiempo bajo diferentes condiciones geológicas y térmicas (Head et al., 2003). El
petróleo está constituido, principalmente, por carbono e hidrógeno, con una menor
cantidad de oxígeno, azufre y nitrógeno. También posee pequeñas cantidades de
los denominados elementos traza, principalmente níquel y vanadio (Speight,
1991). Los hidrocarburos que contiene pueden ser de cadena corta, hidrocarburos
volátiles, de cadena larga, hidrocarburos no volátiles, conteniendo en total más de
300 compuestos diferentes (Wang et al., 1994). En general, estos se clasifican en
función a su estructura química en hidrocarburos saturados, olefinas, aromáticos,
compuestos polares y asfaltenos (Head et al., 2004). Dependiendo de la estructura
química del contaminante, el proceso de bioremediación es factible de llevar a
cabo y también se puede evaluar de alguna forma los tiempos para cumplir con el
objetivo. Por este motivo es importante la realización de técnicas simples para el
estudio del hidrocarburo contaminante como una extracción por soxhlet y sepa-
ración en columna de silicagel por el método SARA,( Fig 2). El no tener estos co-
nocimientos sobre el contaminante hace que los tiempos de tratamiento se alarguen
o que directamente los métodos de biorremediación no sean los adecuados para
remediar el lugar de estudio.
-467-
Figura 2. Degradabilidad de los hidrocarburos (H).
Por todo lo expuesto, la aplicación de biorremediación en suelos es una

buena técnica, fácil de aplicar y a un costo aceptable. Cuando los sistemas de bio-
rremedianción no funcionan adecuadamente, los siguientes elementos son los que
con frecuencia se encuentran:
- Nunca se caracterizó el contaminante.

- Nunca se analizó el suelo.
- No se realizan seguimientos bimensuales de las pilas o biopilas.
- No se realizan determinaciones de hidrocarburos antes de que el
suelo entre en los repositorios.
- La falta de agregado de agua a los sistemas.
- La falta de rotación de las biopilas generando un compactamiento
del suelo.
- Obviamente nunca se realizaron ensayos de laboratorios para saber
si ese suelo es factible de ser sometido un biotratamiento.
El objetivo de este capítulo de libro es ver los casos en que fracasó la bio-
rremediación de hidrocarburos, evaluar en donde estuvo el error para que esto no
se vuelva a cometer, por lo que se muestran años de supervisión de bioremedia-
ciones realizadas en la Patagonia.
Falta de caracterización del contaminante
Uno de los errores más frecuentes es pensar que todos los hidrocarburos
son factibles de biodegradar. Es común desear biorremediar todo aquello que sea
negro, a veces con grandes piedras mezcladas, suelo muy antiguo en donde el con-
taminante ya se encuentra asfaltizado el cual por su composición rica en hidro-
carburos de alto peso molecular lo hace difícil de biodegradar en 24 meses. Esta
situación puede ser evitada estudiando el contaminante por dos técnicas diferentes.
Una de ellas es su cuantificación por soxhlet y pesada que extrae todos los hidro-
carburos presentes en el suelo. La otra es la utilización de la espectrofotometría
-468-
infraroja con transformada de Fourreir (FTIR) en donde se mide solo los hidro-
carburos de entre C6 y C35, que son el rango de los hidrocarburos factibles de
degradar. En la tabla 2 podemos ver dos ejemplos de pasivos ambientales que se
deseaba llevar a un repositorio para ser tratados por métodos biológicos y que los
mismos ya estaban asfaltizados. En estos casos la biodegradación no es el método
de elección ya que se puede observar que los valores en FTIR son muy inferiores
dado que este método no cuantifica los hidrocarburos de tipo polar, hidrocarburos
que si se cuantifican con soxhlet, por lo que esta contaminación se difícil resolverla
en corto tiempo.
Tabla 2. Porcentajes de hidrocarburos realizados por la técnica de soxhlet y por la determinación
de EPA 418.1 en infrarrojo.
Soxhlet IR
%hidrocarburo %hidrocarburos
Pasivo 1 11,57 0,2955
Pasivo 2 25,27 0,1911
Inoculación de cepas en piletas
Esta antigua experiencia se llevo a cabo cuando se trataron piletas contami-

nadas con hidrocarburos en la zona de la cuenca. Consistió en la inoculación bacte-
rias, Pseudomonas putida, a piletas contaminadas junto con el agregado de grandes
cantidades de nutrientes que terminaron produciendo un proceso de eutroficación.
El agregado de cepas bacterianas tiene el inconvenientes de que estas deben competir
con las bacterias autóctonas del lugar. El agua de la pileta contenía cantidades im-
portantes de sulfato y cloruro (normales en estas piletas dado que en ellas se desecha
agua de formación) trazas de nitrógeno (menos de 1ppm) y no se detectó fosfato.
Los valores de los recuentos bacterianos inicial fue entre 5x105 y 4x107 UFC/mL.
La población bacteriana encontrada fue de tipo mixto con presencia de Pseudomonas
stutzeri, Bacillus y Rhodococcus como predominantes.
A los 10 días de inoculación, se efectuaron nuevamente análisis bacterio-
lógicos y de nutrientes y se constató que la bacteria inoculada,
Pseudomonas putida, no se pudo hallar aún utilizando métodos específicos.
Posteriormente se realizaron nuevas inoculaciones, con agregado de nutrientes,
repitiéndose los mismos resultados pero hallándose más de 50 ppm de nitrógeno
y 48 ppm de fosfato. Al observar el área libre de petróleo en la superficie del agua,
esta presentaba una coloración verdosa (Foto1). Los proveedores de la cepa adju-
dicaban esta coloración a su presencia, pero los análisis microscópicos de la zona
mostraban la presencia de bacterias fotosintéticas (Foto 1). Estos ensayos se repi-
tieron cada 30 días durante 6 meses con los mismos resultados. Este ensayo nos
-469-
demuestra que la inoculación de cepas alóctonas en ambientes agresivos debe ha-

cerse sólo previo ensayos estrictos, dado que la inoculación repetida, en este caso,
llevo a la eutroficación. Si bien la fracción de hidrocarburos alifáticos y aromáticos
disminuyó, esta disminución se debió al aumento de las bacterias autóctonas adap-
tadas a ese ambiente en particular.
Los análisis químicos de parámetros microbiológicos, posteriores a la ino-
culación, mostraron en todos los casos la presencia de fósforo y compuestos ni-
trogenados que normalmente se encuentran ausentes o en cantidades de trazas en
este tipo de piletas. La presencia de estos compuestos produjo una eutroficación
que solo es posible con la presencia de ellos y que se observa como una coloración
versosa (Figura 3). Esta coloración es debida a la presencia de bacterias fotosin-
téticas aerobias.
La concentración de oxigeno disuelto, en todos los casos fue muy baja, si-
tuación que limita mucho la biodegradación.
La cepa de Pseudomonas putida que se inoculó es una bacteria extensa-
mente estudiada en sus capacidades de biodegradación de hidrocarburos y se uti-
liza generalmente en investigaciones de laboratorio. En el presente estudio se ha
constatado que existen problemas en el desarrollo de este microorganismo en las
piletas de tierra que contienen petróleo, que podría deberse a la competencia con
bacterias autóctonas mejor adaptadas a las condiciones de salinidad y ambientales.
A pesar de que Pseudomonas putida no desarrolló, ha habido modificaciones en
la composición del petróleo. Esto se debe a que, con la inoculación de bacterias,
se introduce en la pileta nutrientes nitrogenados y fosfato que permiten el rápido
crecimiento de microorganismos autóctonos degradadores de hidrocarburos, que
desarrollan sin inconvenientes al estar perfectamente adaptados al hábitat en que
se encuentran.
Figura 3. Pileta eutrificada por el agregado abundante de nutrientes para el desarrollo de bacterias
degradadoras de hidrocarburo. Microscopía de la zona eutrificada.
-470-
Caracterización del sitio en donde se realiza la biorremediación
La mayoría de las veces se realizan biotratamientos sin conocer previamente

las características del suelo y/o agua en donde va a llevarse a cabo. Entre las carac-
terísticas más importantes a estudiar son la concentración de nutrientes presentes,
nitrógeno y fósforo, y las concentraciones de sales. En general las biodegradaciones
tienen relaciones de C:N:P entre 100:10:1; 100:0,5:0,1, observándose que en los
suelos patagónicos esta relación es baja (100:0,1:0,01) (Tabla 3).
La deficiencia de nutrientes también afecta negativamente la degradación
de hidrocarburos, aunque existen bacterias fiadoras de nitrógeno y con capacidad
de degradar hidrocarburos (Acuña et al., 2012), los tiempos se alargan bastante
en comparación con sistemas que contienen nutrientes, aunque en algunas situa-
ciones esto es un beneficio ya que, estas condiciones, puede mejorarse la degra-
dación de hidrocarburos poliaromáticos (Acuña et al., 2011).
Tabla 3: Análisis químico de un suelo con tratamiento biológico
TPH 1,75% pH 7,8

HC Alifáticos 18,4% NO2- 3,2 ppm PO4-3 0,2 ppm
HC Aromáticos 32,2% NO3 36 ppm
-
SO4-2584 ppm
HC Polares 49,2% NH4+ 0,35 ppm
Con los datos presentados en la tabla 3, se puede calcular las cantidades ne-
cesarias para una biodegradación, si utilizamos la relación 100:10:1, llegamos a
que el nitrógeno presente es 6,25% del que se necesita y de fósforo 0,6%. Otro
problema que con este análisis se ve, es que el suelo presenta muchos hidrocar-
buros polares y que probablemente se debe realizar una cromatografía gaseosa
para asegurarse que los hidrocarburos alifáticos sean inferiores a hidrocarburos
de cadena de 35 átomos de carbono.
Falta de seguimiento adecuado de los procesos biológicos
Los suelos patagónicos contienen arcillas que se compactan disminuyendo

el oxigeno y la capacidad de biodegradación aeróbica de los hidrocarburos. La
figura 4 muestra una biopila la cual estaba tan compactada, que no se podía tomar
una muestra de forma manual a una profundidad de 1m, motivo por el cual se uti-
lizó una retroexcavadora. En la foto se puede apreciar el compactamiento de la
biopila que tenía una antigüedad de aproximadamente 2 años y con concentracio-
nes de hidrocarburos que no disminuían. En la tabla 4 se encuentran los valores
del análisis físico químico realizado al suelo. Se tomaron las temperaturas de la
-471-
biopila y las mismas se encontraban entre los 13- 15 °C, lo que indica que no hay
un procesos biológico activo ya que las temperaturas de las biopilas son más ele-
vadas (EPA). Además las concentraciones de nutrientes inorgánicos están por de-
bajo de los valores recomendados, si bien el personal a cargo del tratamiento
informó que fueron agregados, estos se consumieron y no se volvieron a agregar.
La cantidad de hidrocarburos presentes y los porcentajes de hidrocarburos alifá-
ticos, aromáticos y polares son factible de degradar por este proceso. Sin embargo
estas biopilas no estaban en funcionamiento debido al mal control del proceso.
Tabla 4: Análisis físico químico de la biopila
Calcio (ppm) 64,13

Humedad (%) 8,64 Magnesio (ppm) 39,87
pH 8,01 Sodio (ppm) 1447,34
Densidad aparente 1,16 Potasio (ppm) 0
Densidad real 2,39 Carbonatos (ppm) 0
Porosidad % 51,8 Bicarbonatos (ppm) 2,23
Cap. retención de agua 43 Sulfatos (ppm) 545,46
CONTENIDO DE HIDROCARBUROS: Cloruros (ppm) 972,3
Totales % 2,94 Hierro (ppm) 1,13
H. alifáticos % 40,64 Amonio (ppm) 0,04
H. aromáticos % 25,84 Nitratos (ppm) 1,82
H polares % 33,52 Nitritos (ppm) 0
Urea (ppm) 6,62
Fosfatos (ppm) 1,18
H. hidrocarburos.
Figura 4.Foto de la toma de muestra en donde se puede observarla compactación de la biopila

-472-
Hemos visto algunos problemas que se presentan en los procesos de bio-

rremediación. Estos son relativamente fáciles de resolver manteniendo el control
de los parámetros más importantes que hemos mencionado. Inicialmente es con-
veniente efectuar todas las determinaciones para la correcta caracterización del
sistema a tratar, y posteriormente lo ideal es realizar un control del proceso cada
30 o 45 días. Tenemos que tener en cuenta que el período de biodegradación es
de aproximadamente 6 meses a dos años. Dependiendo de las condiciones climá-
ticas y ambientales puede extenderse a 2 años o más, en este último caso es con-
veniente semestralmente efectuar los controles propuestos para el inicio
Conclusiones
Los métodos biológicos son muy buenos cuando se aplican correctamente. Para
esto se necesita gente capacitada y que se realicen las determinaciones que co-
rresponden, de otra forma el proceso se alarga hasta incluso es difícil de llegar a
cumplir los objetivos de remediar el suelo contaminado.
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(Ed.). USA. pp. 339-357.
-474-
Cambios físico-químicos y biológicos durante el
compostaje de residuos biodegradables de un
feedlot vacuno
Physico-chemical and biological changes during composting of

beef feedlot biodegradability manure
Sánchez de Pinto, M. Inésa*, Gabriela Vanesa Rodrigueza, María Florencia Fer-

reyra Grassia, Roberto Umbidesa, Alfredo Polob
Resumen
El objetivo del trabajo fue determinar los cambios fisico-químicos y bioló-

gicos durante el compostaje-estabilización, de residuos biodegradables extraídos
de un corral de un feedlot vacuno y evaluar la estabilidad y madurez del compost
obtenido. Durante los 266 días de compostaje-estabilización (en pilas al aire libre
con volteos manuales periódicos), la temperatura máxima alcanzada fue de 71,9‘C
que se mantuvo entre 60-65‘C durante 30 días con 3 volteos, el volumen se redujo
en un 33% a los 3 meses y un 52% a los casi 9 meses, el pH varió de 8,8 a 6,7 y
la conductividad de 3,9 a 5,7 mS cm-1. Los contenidos de MO, COT, AF, NT y N-
NH4+ disminuyeron mientras que los contenidos de N-NO3- y AH aumentaron.
La disminución de los coliformes totales y Salmonella a valores no detectados,
confirman que el proceso de compostaje y posterior estabilización, ha sido exitoso
en la eliminación de gran parte de las sustancias fitotóxicas. La evolución de los
parámetros fisicoquímicos determinados durante los 266 días de compostaje-es-
tabilización probaría que el material se ha ido estabilizando. Los valores de CHS
(0,17%), CHS/NT (0,09), C-CO2 (110 mg de CO2 kg-1 h-1), N-NH4+ /N-NO3-
(0,22), COT/NT (11,6), CAH/CAF (2,97) registrados al final del proceso indica-
rían que el compost obtenido alcanzó la madurez para su utilización agrícola.
.
Palabras clave: Residuo biodegradable, compostaje, composta, madurez
a
Instituto de Ciencias Químicas. Facultad de Agronomía y Agroindustrias-Universidad Nacional de
Santiago del Estero- Av. Belgrano (S) 1912-4200, Santiago del Estero, Argentina Tel:54-385-
4509583. *E-mail: inesdep@unse.edu.ar
b
Instituto de Ciencias Agrarias-CSIC-Madrid-España
-475-
Introducción
El Feedlot es un sistema de engorde intensivo de ganado en corral. Con-

siste, básicamente, en el confinamiento de animales en espacios reducidos (corra-
les) para su engorde, a base de dietas de alta concentración energética y alta
digestibilidad.
Las heces y orina (deyecciones) del animal vacuno componen el estiércol.
Son fuentes de: nutrientes (nitratos, fosfatos, potasio), de materia orgánica que se
degradada en forma aeróbica (liberando CO2) y anaeróbica (liberando CH4 y
gases de azufre) y de otros compuestos (antibióticos, avermectinas, elementos po-
tencialmente tóxicos, etc.), por lo que, la permanencia prolongada de los animales
en espacios reducidos produce efectos negativos en el ambiente en forma puntual
(deyecciones) y en forma general (gases con aumento del efecto invernadero,
transferencia de nutrientes al suelo y aguas, deforestación, generación de olores,
proliferación de moscas, etc) (Gil, 2006).
Según el tipo de ración, la disponibilidad de agua y el clima, la producción
diaria de estiércol estaría entre el 5%-6% del peso corporal del vacuno, que equi-
vale a casi el doble del alimento que ingiere. Un novillo de 400 kg de peso vivo
produciría alrededor de 20 kg a 25 kg diarios de estiércol, dado su porcentaje de
humedad del 80-85%, finalmente serían unos 3 kg diarios de residuo sólido por
animal, en promedio, que se depositarían en el corra (Pordomingo, 2003).
En la Cuidad de Beltrán, departamento Robles, de la provincia de Santiago
del Estero, se encuentra ubicado el Feedlot DON CORRAL tipo hotelería. Cuenta
con 50 corrales de engorde a cielo abierto, un corral de recepción, otro de enfer-
mería y cuatro corrales de adaptación y distribución de animales. La cantidad total
de animales existentes para engorde varía entre 3000 a 8500 según las épocas,
distribuidos entre 100 a 250 animales por corral, con una producción de excre-
mento sólidos diaria entre 300- 750 kg. Con el objetivo de realizar una gestión
sustentable de los excrementos que se generan, en junio el 2012 se comenzó con
la construcción del primer módulo de una planta de compostaje, logrando el com-
postaje de 24Tn de excremento hasta su maduración en un período de 8 a 9 meses.
Varios autores proponen la biotecnología del compostaje como estrategia
de Producción más Limpia por ser una tecnología económicamente viable y efi-
ciente para el tratamiento de los residuos biodegradables (Bolton et al., 2004,
Luebbe et al., 2011, Sánchez de Pinto et al., 2012). El compostaje es un proceso
bioxidativo controlado. Requiere una humedad adecuada y sustratos heterogéneos
en estado sólido. Implica el paso por una etapa termofílica y una producción tem-
poral de fitotoxinas. Los productos del proceso de degradación son: CO2, H2O,
minerales, materia orgánica estabilizada (compost), libre de fitotoxinas y lista para
-476-
Cambios físico-químicos y biológicos durante el compostaje de residuos ...
ser usada en la agricultura sin que provoque efectos adversos (Costas et al., 1990;
Solivia et al., 2008).
Durante el proceso de compostaje, en una primera etapa se desarrolla la mi-
neralización, caracterizada por la degradación de la materia orgánica y el aumento
de los nutrientes asimilables que previamente estaban inmovilizados en forma or-
gánica, en la que, la actividad microbiana es máxima, Abarca la etapa termofílica
con temperaturas superiores a 55°C, posibilitando la reducción del poder germi-
nativo de las semillas contenidas en el material a compostar y la destrucción de la
actividad de los microorganismos patógenos (Lung et al., 2001). En la segunda
etapa el material se va estabilizando, la actividad microbiana está ralentizada y
predominan las reacciones de polimerización y de condensación del producto, ca-
racterizada por el aumento del contenido de los ácidos húmicos y por lo tanto, de
materia orgánica más estabilizada. (Paz et al, 2003, Moreno Casco y Mormeneo
Bernat, 2008).El compostaje es una metodología de tratamiento para desinfectar
y estabilizar materiales para su posterior utilización agrícola. (Parkinson et al.,
1999)
La estabilidad del producto esta relacionada con la degradabilidad micro-
biana de la materia orgánica remanente (a mayor estabilidad, menor degradabili-
dad y actividad microbiana), mientras que la madurez del producto está
determinada por el grado de estabilización de la materia orgánica alcanzado du-
rante el proceso. Un compost maduro debe ser un producto sin sustancias fitotó-
xicas que pueda afectar el crecimiento vegetal (Garcia-Gil et al., 2003).
En Mazzarino et al. (2012), se informa sobre los indicadores para determi-
nar la estabilidad y madurez del compost, que fueron propuestos en diferentes pu-
blicaciones. Se aclara que la diferencia de valores límites para un mismo parámetro
podría ser atribuida a la problemática de la escasa estandarización de las metodo-
logías y a las diferentes características del material compostado. Se destaca que
no existe un único parámetro de madurez que sirva para todo tipo de material ori-
ginal, por lo que se recomienda realizar el análisis de varios parámetros y verificar
que dichos valores límites se mantengan durante la fase de madurez. Para deter-
minar la estabilidad del compost, se aconseja por sencillos y menos costosos, cuan-
tificar la evolución de: temperatura, % carbono soluble en agua (CHS) (<4-17 g
kg-1), relación CHS/N total (<0,3-0,7), disminución de la producción de CO2 a
valores menores de 120 mg C-CO2 kg-1 h-1, y para la madurez se aconseja el con-
tenido de amonio (<400-500mg N-NH4 kg-1), la relación amonio/nitrato (<0,10-
0,3) y el índice de germinación (>80%).
Residuos evaluados
Sólidos biodegradables extraídos de la limpieza de un corral (luego de 2 meses
de engordar 150 vacunos) del establecimiento Hotelería en feedlot Don Corral.
-477-
Tecnología de tratamiento
Compostaje, en pilas al aire libre (1,8-2,0 m de altura), con volteos perió-
dicos para mantener la aireación (semanales hasta finalización etapa termófila y
luego mensuales), control de la humedad (40-50% hasta finalización etapa termó-
fila, 30-40% hasta final) y control de la temperatura (55<TºC<70 durante mas
de15 días –en etapa termófila). En la Figura 1 se muestra la cancha de compostaje
con dos pilas de excremento vacuno en proceso de compostaje.
Figura 1. pilas de excremento vacuno en proceso de compostaje
Variables metodológicas
El pH y conductividad eléctrica (CE) del extracto acuoso en relación
1:2,5 y 1:10 (sólido:líquido), respectivamente; nitrógeno total (NT) por
Kjeldhal; Materia orgánica (MO) calcinación a 550ºC, carbono orgánico
total (COT) y carbono hidrosoluble (CHS) (solución acuosa 1:10) método
de Walkley y Black (oxidación con dicromato de potasio), Nitrato y amonio
por método colorimétrico. El carbono extraíble (CSHT) con Na2P2O7
0,1M a pH=9,8, con posterior separación del carbono precipitado (CAH)
de dicho extracto a pH=2, y del soluble a pH=2 (CAF). Respiración edáfica
(RE), por incubación durante 24 hs determinando el CO2 capturado en
NaOH 0,1 M, titulando con HCl 0,1 M. (Weaver et al, 1994). Coliformes
-478-
totales fueron aislados con Eosina azul de metileno agar (Levine) y la Sal-
monella con Salmonella Shigella agar de Laboratorios Britania, ambos in-
cubados en aerobiosis a 35 ºC, durante 24hs.
Proceso de compostaje y variables evaluadas
Cambio de color y pérdida de peso

Durante los 266 días de procesos de compostaje-estabilización se observó
un cambio gradual del color que fue cambiando de marrón claro a marrón oscuro
casi negro. Varios autores mencionan que el compost maduro presenta colores
desde gris-negro o marrón-negro dependiendo de los materiales que contengan, y
que luego de suficiente tiempo de estabilización alcanza el color marrón oscuro o
negro debido al aumento de grupos cromóforos existentes en las sustancias hú-
micas que se van formando (Paz et al., 2003).
La pérdida total de peso fue de 33% a los 3 meses y del 52% a los casi 9
meses, partiendo de una pila inicial de 7,5 tn de material biodegradable sacado de
un corral. Larney et al, 2000 informan la disminución en peso de 21-30% y en
volumen de 34-55% durante el compostaje de residuos procedentes de feedlot va-
cuno. El impacto de estos cambios es importante en la reducción de residuos a
trasportar. La pérdida de masa, si bien es debida al proceso de compostaje, en este
caso, podría adicionarse a la provocada por los vientos que han esparcido el ma-
terial de las pilas por los alrededores de la planta de compostaje.
Temperatura
La T es uno de los principales parámetros para monitorear el proceso de
compostaje, ya que sus valores están relacionados con las reacciones biológicas
que tiene lugar así como con la capacidad de higienización del proceso, que con-
lleva a la eliminación o disminución notoria de microorganismos patógenos po-
tenciales para el hombre y para cultivos receptores del compost. (Garcia Gil et al,
2003).
Muchos factores, tales como la naturaleza de la materia orgánica que se
composta, la disponibilidad de nutrientes, contenido de humedad, tamaño del ma-
terial a compostar, así como el grado de aireación pueden explicar la intensidad y
los cambios en la Temperatura. (Charest, Beauchamp, 2002)
-479-
Tabla 1. Evolución de la temperatura (parte superior y media de la pila) con el tiempo de com-
postaje
Tiempo(días) 1 14 31 34 39 44 49 52 68 83
T superior (°C) 45,3 71,9 61,0 68,5 68,0 62,4 61,7 52,2 37,5 31,9
T medio (°C) 50,9 60,3 63,1 64,9 63,0 55,2 53,6 49,2 32,6 31,2
En la Tabla 1 se observa que al comienzo del proceso, la temperatura fue

de 45,3-50,9°C y entre los días 14 y 44 la temperatura en ambas partes de la pila
ascendió a valores superiores a los 55°C con valores máximos alcanzados entre
68,5- 71,9°C, lo que indicaría el pasaje de una etapa mesofílica muy corta a una
etapa termofílica que se mantiene durante un cierto tiempo, como consecuencia
de la descomposición por microorganismos de la materia orgánica fácilmente dis-
ponible y de los compuestos nitrogenados (Ros et al., 2006, Zaha et al., 2011).
Después de los 52 días, la temperatura de la pila comenzó a descender hasta al-
canzar valores similares a la temperatura ambiente, indicando disminución de la
actividad microbiana y del avance de la estabilización del producto final.
Detección de microorganismos patógenos

La eliminación o inactivación de microorganismos patógenos durante el
compostaje depende de las condiciones de tiempo-temperatura mantenidas durante
el proceso de compostaje.
En el proceso de compostaje, temperaturas superiores a 55°C maximizan
la higienización, entre 45-55°C maximizan la biodegradación y entre 35-45°C se
maximiza la diversidad microbiana (Tiquia et al 2002). Temperaturas termofílicas
superiores a 55°C mantenidas durante más de 15 días son suficiente para mini-
mizar el contenido de microorganismos patógenos. Temperaturas superiores a 65-
70°C son perjudiciales para diversos microorganismos beneficiosos para el
proceso (Miyatake y Iwabuchi,2005).
Tabla 2. Contenido de coliformes totales y presencia o ausencia de Salmonella en diferentes mate-
riales
Coliformes totales
Materiales Salmonella
(u.f.c. g -1)
Excremento vacuno fresco 1,8x104 Ausencia
Material extraído del corral para compostar 7,5x103 Ausencia
Compost fresco a(40 días de compostaje) 20 Ausencia
Compost maduro (266 días de compostaje) 0 Ausencia
-480-
La efectiva destrucción de microorganismos patógenos durante el proceso

de compostaje fue evaluada sobre la base al contenido de Coliformes totales y la
ausencia de Salmonella. En la Tabla 2 se muestran los cambios en los contenido
de coliformes totales y la ausencia de Salmonella durante el compostaje de los re-
siduos provenientes de la limpieza de un corral vacuno del feedlot (que incluye
excremento vacuno, pelos, restos de alimentos, suelo). Al comienzo del procesos
de compostaje, el número de coliformes totales fuè de 7,5x10 3 UFC g -1 en resi-
duos semihúmedos, registrándose una disminución con el tiempo de compostaje,
a valor nulo a los 266 días. La disminución de coliformes totales fue posiblemente
debido a las altas temperaturas (55-70 °C) generadas durante el proceso y a las
condiciones desfavorables establecidas. (Hanssen et al, 2001). Según Kuhlman,
1990, los coliformes son más resistentes a su inactivación que la Salmonella y por
lo tanto, son buenos indicadores de la presencia o ausencia de organismos pató-
genos. De tres a seis días de compostaje con una temperatura promedio de 55°C
es suficiente para inactivar a la Salmonella spp (Bijlsma et al, 2013)
Para registrar en SENASA, como enmienda Orgánica a un compost de ori-
gen vacuno, el Contenido de Coliformes fecales debe ser menos de UN MIL
(1000) nmp g-1 de peso seco y el de Salmonellas menos de UN (1) nmp 4 g-1 de
peso seco. (SENASA, 2011).
pH y Conductividad eléctrica
Para lograr el máximo crecimiento y actividad de los microorganis-
mos durante el proceso de compostaje aeróbico, el rango de pH entre 6,0-
8,0 es el más favorable. Los cambios del pH con el tiempo de
compostaje-maduración se muestran en la Tabla 3. Al inicio del proceso de
compostaje, se registraron valores superiores a 8, descendiendo a los 45
días a 7,2 posiblemente debido a la formación de ácidos orgánicos durante
la degradación de la materia orgánica fácilmente biodegradable. El posterior
aumento a valores de 8,6 es probablemente debido a la formación de bases
amoniacales procedentes de la biodegradación de compuestos nitrogenados
(proteínas, amino-ácidos, etc), favoreciendo la formación de amoníaco.
(Zaha et al, 2011). Luego de los 196 días desciende a valores próximos a
la neutralidad como resultado de la formación de ácidos húmicos con ca-
pacidad buffer y a la oxidación del amonio por bacterias nitrificantes y pre-
cipitación de carbonato de calcio. (Tognetti et al., 2007, Kahlil et al., 2011).
-481-
Tabla 3. Evolución del pH y la conductividad eléctrica (CE) durante el compostaje

Tiempo(días) 0 7 30 45 75 95 145 173 196 266
pH 8,8 8,7 8,1 7,2 8,6 8,1 8,1 8,1 6,9 6,7
CE(mS.cm-1) 3,9 4,3 3,9 4,2 3,5 4,2 4,2 4,2 5,4 5,7
La conductividad eléctrica (CE) aumentó durante los primeros 45 días de

compostaje (Tabla 3), lo que puede ser atribuido al aumento de la salinidad del
material provocado por la pérdida de masa durante la mineralización de la materia
orgánica. Se observa una disminución a los 75 días, posiblemente debida a la pér-
dida por lixiviación de cationes y aniones solubles durante los riegos periódicos
que recibía la pila. Posteriormente a los 266 días se registró un incremento a 5,7
mS.cm-1, valor más elevado que el recomendado por SENASA, 2011 para su uti-
lización como enmienda orgánica. (Mazzarino et al, 2012).
Materia orgánica y distintas fracciones de carbono

Durante los primeros 5 meses de compostaje los contenidos de COT y de
MO fueron decreciendo, debido a la mineralización de las fracciones más lábiles
de la materia orgánica por acción microbiológica.
La degradación de la MO depende de los microorganismos presentes,
siendo los materiales más fácilmente degradables las azúcares, almidones, prote-
ínas y lípidos, mientras que los menos lábiles son las celulosas, ligninas y otros
polisacáridos de largas cadenas.(Zaha et al., 2011).
En la Tabla 4 se observa que el residuo a tratar posee un alto contenido de
MO y COT los que durante los primeros tres meses de compostaje fueron dismi-
nuyendo gradualmente como consecuencia de la mineralización de la materia or-
gánica por acción de los microorganismos, con liberación de CO2 y H2O. (Costas
et al., 1990). A los 145 días la disminución de la MO y del COT fue del 45-46%.
Similares resultados fueron publicados por Inbar et al., 1993.
Las fracciones de C hidrosoluble (CHS), compuestas por azúcares, polife-
noles, aminoácidos y ácidos fúlvicos solubles, constituyen una fuente de com-
puestos de C fácilmente degradables por microorganismos, los que contribuyen
en el mantenimiento de alto nivel microbiano. (Ros et al., 2006). El contenido de
CHS, ha ido disminuyendo durante el proceso de compostaje alcanzando a los 75
días valores inferiores a 4 g/kg, valor recomendado como indicador de la madurez
del compost (Mazzarino et al, 2012), lo que indicaría que la mayoría de las sus-
tancias anteriormente mencionadas pasaron a formar parte de las sustancias hú-
micas que son más resistentes a la degradación. (Defrieri et al., 2005)
La relación CHS/NT menor que 0,3 fue propuesta por Garcia el at, (1992)
como indicador de la madurez del compost. En la Tabla 4 se observa que dicho
valor fue alcanzado luego de 75 días de compostaje.
-482-
Tabla 4. Variación del contenido de materia orgánica y las distintas fracciones de Carbono con el
tiempo de compostaje y la estabilización de los residuos tratados
C.SHT/
Tiempo COT M.O. M.O./C C.SHT C.AF C.AH C.AH/C CHS CHS/
COT
(días) (%) (%) OT (%) (%) (%) (%) .AF (%) (g/kg) NT
(%)
0 26,9 57 2,1 3,51 2,04 1,47 0,72 0,13 4,9 0,29
7 20,3 44 2,2 2,96 1,66 1,30 0,78 0,15 5,0 0,33
30 18,5 36 2,0 2,86 1,44 1,42 0,98 0,15 6,8 0,57
45 17,2 33 1,9 1,69 1,19 0,5 0,42 0.10 4,6 0,35
75 22,0 40 1,8 2,04 1,39 0,65 0,47 0,09 2,7 0,21
95 18,7 36 1,9 2,20 1,42 0,78 0,55 0,12 2,5 0,19
145 17,05 31 1,8 2,47 1,43 1,04 0,73 0,14 2,6 0,20
173 15,0 30 2,0 2,67 0,86 1,81 2,10 0,18 2,2 0,17
196 14,9 30 2,0 2,56 0,69 1,87 2,71 0,17 1,4 0,11
266 15,1 32 2,1 2,58 0,65 1,93 2,97 0,17 1,7 0,09
En la Tabla 4 se observa que al comienzo del compostaje, el contenido de

ácidos húmicos (CAH) fue menor que el de ácidos fúlvicos (CAF). Durante los
primeros 95 días de compostaje, los contenidos CAH y los CAF han ido disminu-
yendo en un 31% y un 47% respectivamente, lo que según Paz et al, 2003, sería
debido a que los CAF son más susceptibles al ataque de microorganismos por po-
seer menor masa molecular que los CAH. A los 145 días, el contenido de CAH y
la relación CAH/CAF comienzan a aumentar lo que estaría indicando que el pro-
ceso imperante es la humificación, caracterizada por las reacciones de condensa-
ción y polimerización que incrementan el contenido de materia orgánica estable.
La relación CAH/CAF mayor a 1,9 es un indicador de madurez del compost (Maz-
zarino et al., 2012), dicho valor a sido superado a los 173 días de compostaje.
Nitrógeno Total (NT), nitrógeno inorgánico (N-NH4+ y N-NO3-) y COT/NT

La composición en nutrientes en el estiércol recién excretado, como por-
centaje de sólidos totales secos, es aproximadamente de: nitrógeno 3 - 4%; fósforo
1 - 2%; potasio 1,5 - 3%; calcio 0,6%. Las deyecciones contienen nutrientes, ya
que el bovino absorbe en proporción muy poco de lo que ingiere. El 70 a 80% del
nitrógeno consumido se elimina con las excretas. En la materia fecal, como nitró-
geno de proteína bacteriana y proteína directa del alimento. En orina, proviene de
la urea. (Gil, 2006).
La mayor parte del nitrógeno que poseen los residuos orgánicos está unida
a la fracción orgánica como parte de la estructura de las proteínas y péptidos, de
baja disponibilidad. Durante el compostaje el N sufre transformaciones químicas
dadas por reacciones de amonificación, nitrificación y desnitrificación. Al inicio
ocurre la amonificación de los grupos R-NH2 presentes en la materia orgánica.
-483-
El NH3 formado puede seguir distintos procesos, dependiendo de las condiciones

de la pila: puede ser disuelto como amonio e inmovilizado por los microorganis-
mos que lo utilizan como fuente de nitrógeno, si el pH y la temperatura son ele-
vados puede ser volatilizado, y cuando las condiciones de aireación son adecuadas
y la temperatura es menor a 40°C puede ser transformado en nitrato. (Roig y Sán-
chez, 2008). En la etapa termófilica, los microorganismos que intervienen (de ca-
rácter inespecífico) producen un aumento en la transformación de N orgánico a
amonio (Mazzarino et al., 2012).
En la Tabla 5 se observa una disminución del contenido de NT (de 1,7 a
1,3%) en los 45 días de compostaje y posteriormente se mantiene a valores cons-
tantes. La pérdida de NT durante el compostaje es mencionada por varios autores
y está relacionada con la formación de amonio y su volatilización (Thomsen,
2000).
Tabla 5. Evolución de nitrógeno total NT, nitrógeno inorgánico (N-NH4+ y N-NO3- ), COT/NT,
C-CO2 durante el compostaje
Tiempo(días) 0 7 45 75 95 173 196 266
NT (%) 1,7 1,5 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3
N-NH4+
4687,5 4257,0 2519,5 2656,3 2187,5 1835,9 1642,3 1328,2
(mgNH4+/kg)
N-NO3-
191,9 247,5 416,0 520,3 621,1 1256,3 3238,8 6157,7
(mgNO3-/kg)
N-NH4+ /N-NO3- 24,4 17,2 6,1 5,1 3,5 1,5 0,5 0,2
COT/NT 15,8 13,5 13,2 16,9 14,4 11,5 11,4 11,6
C-CO2
522,5 449,2 357,2 419,5 311,8 255,2 156,3 110,0
(mgCO2/kg/h)
N-NO3- /C-CO2 0,37 0,55 1,160 1,24 1,99 4,92 20,72 55,98
C-CO2/ COT
19,4 22,5 20,8 19,1 16,7 17,0 10,5 7,3
(mgC-CO2/gCOT)
El elevado contenido inicial de amonio puede ser debido a la conver-

sión del NT que comenzó en los corrales, ya que el material biodegradable
fue sacado luego de los 2 meses de engorde de 150 vacunos. Si bien el con-
tenido de N-NH4+ ha ido disminuyendo durante los 266 días de proceso
de estabilización-maduración, su contenido final de 1328,2 mgNH4+ kg-1,
-484-
es superior a 500 mgNH4+ kg-1, valor límite aconsejado como indicador de

madurez (en base a la toxicidad de las plantas). Según Parkinson et al.,
2004, aumentar los volteos durante el compostaje incrementa la disminu-
ción del contenido de N-NH4+ .
Altas velocidades de crecimiento del contenido de N-NO3- fueron
registradas luego de 60 días de compostaje, cuando las temperaturas se
vuelven más favorables para las bacterias nitrificantes que requieren tam-
bién de condiciones definidas de pH y humedad. (Tognetti et al., 2007,
Mazzarino et al., 2012). El contenido de nitratos fue aumentando de 191,1
a 6157,7 mgNO3-/kg en los 266 días.
A medida que el proceso de estabilización-maduración avanza el contenido
de nitratos aumenta hasta alcanzar valores superiores al de amonio, por lo que el
valor de la relación N-NH4+ /N-NO3- se hace más pequeño y consecuentemente
es indicativo de un mayor grado de estabilidad del compost o de menor actividad
microbiana. (Benito et al, 2003). Valores límites indicadores de estabilidad y ma-
durez del compost fueron propuestos por Bernal et al, 1998, recomendando un
valor de la relación menor a 0,16, mientras que CCQC 2001 recomienda menor
a 0,3. En la Tabla 5 se observa que la relación N-NH4+ /N-NO3- alcanzó a
los 266 días un valor de 0,2, inferior a 0,3, lo que podría sugerir que el com-
post alcanzó la madurez antes de los 266 días.
La COT/NT es un parámetro importante a considerar cuando se desea com-
postar residuos biodegradables ya que, es un indicador de la probable velocidad
de descomposición de la MO. Los microorganismos utilizan 30 partes de C por
cada N, por lo que una COT/NT inicial de 25-30 sería más favorable para una rá-
pida descomposición de los materiales orgánicos, mientras que, con relaciones
menores a 15 el N podría perderse como amonio. (Kahlil et al, 2011, Sánchez-
Monedero 2001, Goyal et al, 2005. En la Tabla 5 se muestra una COT/NT inicial
de 17,9, que va disminuyendo, se observa un leve incremento a los 75 días y luego
de los 173 días una disminución a valores de 11,6 que se mantiene en el tiempo.
Esta relación ha sido utilizada por distintos investigadores como índice de estabi-
lidad/madurez. Bernal et al., 1998 propone un valor inferior a 20 para esta relación,
mientras que Iglesias-Jimenez y Pérez-Garca (1989) consideran que dicha relación
debe ser inferior a 12 para un compost maduro.
Respiración edáfica
La respiración microbiana es considerada como una segura medida de la
actividad microbiana y es un buen indicador de la velocidad de mineralización de
la materia orgánica así como un buen índice de la evolución del proceso de com-
-485-
postaje y de la madurez del producto final. Un compost no maduro presenta altos

niveles de respiración (alta emisión de CO2) mientras que un compost maduro,
debido a su baja actividad microbiana presenta un bajo nivel de respiración, siendo
el valor de producción de CO2 menor a 120 mg C-CO2 kg-1 h-1 recomendado por
Hue y Liu 1995 para un compost maduro. En la Tabla 5 se observa que los valores
de C-CO2 han ido disminuyendo, alcanzando un valor de 110 mgC-CO2 kg-1 h-1
a los 266 días de compostaje.
Dado que los procesos microbiológicos están fuertemente vinculados con
el contenido de materia orgánica, se determinó la evolución del valor relativo de
la producción de CO2 referido al COT (C-CO2/ COT). En la Tabla 5 se observa
que dicha relación disminuye durante el compostaje, alcanzando un valor de 7,5
mg C-CO2 g-1 COT a los casi 9 meses de proceso. Un valor menor de 5mg C-
CO2 g-1 COT fue propuesto por García et al, 1992 como índice de madurez.
Conclusiones
La evolución de los parámetros fisicoquímicos determinados durante los

266 días de compostaje-estabilización de los residuos sólidos extraídos de un co-
rral de un feedlot vacuno probaría que el material se ha ido estabilizando con au-
sencia de microorganismos patógenos. Los valores de CHS (0,17%), CHS/NT
(0,09), C-CO2 (110 mg de CO2/kg/h,), N-NH4+ /N-NO3- (0,2), COT/NT (11,6),
CAH/CAF (2,97) registrados al final del proceso indicarían que el compost ob-
tenido alcanzó la madurez para su utilización agrícola.
El compostaje de los residuos biodegradables extraídos del corral no sólo
generó un producto más estable, sin sustancias fitotóxicas y más adecuado para
su utilización agrícola sino que además, reduce los problemas ambientales que
generan estos residuos al no ser tratados adecuadamente, favoreciendo la susten-
tabilidad de la gestión.
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Ferreras, Beatriz Bonel, biológica ................................................................. 27
Gustavo Magra, María
Valeria Romagnoli, Marta
Bortolato, María Eugenia
Schiavón
Banegas, Natalia R., Ada S. Análisis de parámetros biológicos y bioquímicos
Albanesi, Raúl O. Pedraza de suelo en sistemas bovinos pastoriles de la Lla-
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Eje Temático. Materia Orgánica del Suelo

Saparrat, Mario C. N., Ale- Microorganismos del suelo y su participación en la
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Balatti lignocelulosa .......................................................... 65
Benintende, María C, Mineralización de Nitrógeno del suelo: potencial

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tencial de mineralización ....................................... 93
Benintende, Silvia M., Incubaciones anaeróbicas para la determinación de

María C. Benintende N mineralizable: su aplicación para establecer ne-
cesidades de fertilización ....................................... 111
Eje Temático. Diversidad en Suelos

Silberman, Juan; Analia Procedimientos microbiológicos modernos apli-
Anriquez, Ada Albanesi, cados al estudio de comunidades microbianas de
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Montero, Fabio A., Microbiología y Bioquímica de suelos cultivados
Marcelo Sagardoy bajo Siembra Directa en Argentina ....................... 145
Moreno María Virginia, Diversidad de hongos en suelos agrícolas .............. 157
María Virginia Bianchinotti
, Luciana Belén Silvestro,
María Belén Vázquez ,
Cristina Merlos Sebastián
Alberto Stenglein
Cabello Marta Biodiversidad de hongos formadores de micorrizas

arbusculares reportada para Argentina ................... 179
Correa, Olga S., Viviana M. Microorganismos nativos para una gestión susten-
Chiocchio, Marcela S. table de los ecosistemas terrestres .......................... 195
Montecchia, Micaela Tosi,
Agustina Fernandez
Di Pardo, Ester Simonetti,
Federico Spagnoletti,
Oksana Sydorenko,
Jimena Vogrig.
Eje Temático. Interacciones microbianas

Brandán de Weht, Celia. I., Interrelaciones microbianas en la rizósfera de plan-
Josefina A. Amigo, Elsa L. tas cultivadas de interés económico en el Noroeste
Ulla Argentino. ............................................................... 215
Eje Temático. Interacciones microbianas con rizobios

López Silvina , Graciela N. Los rizobios que nodulan la soja en sitios con am-
Pastorino, Virginia Martí- bientes nativos y cultivados de la Argentina ......... 237
nez Alcántara, Darío Sal-
vucci, Pedro Alberto Balatti
Althabegoiti, Ma. Julia, Ju- Estudios de la movilidad y distribución de

lieta M. Covelli, Aníbal R. Bradyrhizobium japonicum en el suelo ................. 253
Lodeiro*, Ma. Florencia
López, Silvina L. López
García, Elías J. Mongiar-
dini, Julieta Pérez Giménez,
Juan Ignacio Quelas, Chan-
drasekar B. Rajeswari
Martín Díaz-Zorita Aportes de las moléculas señal producidas por ri-

zobios a la producción de soja ............................... 271
Piccinetti Carlos, Norma Efectos positivos de la inoculación de soja sobre la
Arias, Luis Ventimiglia, nodulación, la FBN y en los parámetros de produc-
Martín Díaz Zorita, León ción del cultivo ....................................................... 283
Murua, Héctor Sanchez,
Gustavo Ferraris, Fernando
Mousegne, Hugo
Fontanetto, Eduardo Sá
Pereira, Julia Capurro, JM
Enrico; Carlos Lopez,
Adolfo Sebastían Carrizo,
Fernando Salvagiotti,
Daniel Collino y Alejandro
Perticari
Lozano Mauricio J., María Aplicación de la tecnología RIVET (Recombina-
Eugenia Salas, José L. tion-based In Vivo Expression Technology) a la ca-
López., Francisco J. racterización molecular de la interacción simbiótica
Albicoro, María Florencia Sinorhizobium meliloti – Medicago spp. ................ 299
Del Papa, Mariano Pistorio
y Antonio Lagares.
Thuar, Alicia Ma , Efectos del nitrato sobre la simbiosis Bradyrhizo-

Carla V. Brunoa , bium japonicum – soja ............................................ 317
Stella M. Castrob
Eje Temático. Interacciones con Azospirillum

Cassán Fabricio, Diego Aspectos bioquímicos, fisiológicos y agronómicos
Rivera Botia, Daniela de la producción de fitohormonas por Azospirillum
Torres, Romina Molina sp. ............................................................................ 329
García, Julia E., Mariana L. Estudio de Azospirillum como tecnología aplicable

Puente, Guillermo A. en los cultivos de trigo y maíz ................................. 351
Maronichea, Alejandro
Perticari
García de Salamone, Utilización de la rizobacteria Azospirillum para

Inés E. aumentar el crecimiento vegetal y la sostenibili-
dad agrícola ........................................................... 367
Garbi, Mariana, Federico Aplicación de biofertilizantes formulados con

Vita, Enrique Rodríguez Azospirillum sp. en especies hortícolas ................. 383
Cáceres, Susana Carletti
Pedraza, Raúl O., María F. Azospirillum brasilense en el cultivo de frutilla en
Guerrero Molina, Nadia C. Tucumán, Argentina: del laboratorio al campo ...... 401
Lovaisa, Paola Delaporte
Quintana, Alicia L. Ragout,
Sergio M. Salazarc, Juan C.
Díaz Riccid
Puente, Mariana L., Julia E Efectos de la co-inoculación de Rhizobium con bac-
García, Alejandro Perticari, terias del género Azospirillum en leguminosas de
Fabricio Cassán, Susana interés agronómico ................................................. 419
Carletti
Eje Temático. Biofertiizantes

Rosas, Susana ., Neider-
a*
Biofertilizantes. Desde lo Artesanal hasta la Pro-
hauser, Ma ., Bettera, Cb., y ducción Industrial. Su aplicación en Argentina ...... 437
Bosch, Ec.
Eje Temático. Relaciones Antagónicas

Toledo, Andrea V., Pedro A. Bacterias asociadas a la cutícula de insectos y su
Balatti rol como antagonistas de hongos patógenos utili-
zados en control biológico ..................................... 451
Eje Temático. Biodegradación

Pucci Graciela N, Acuña Inconvenientes en el desarrollo de la Biodegrada-
Adrian, Oscar H Pucci ción ........................................................................ 465
Sánchez de Pinto, M. Inés, Cambios físico-químicos y biológicos durante el

Gabriela Vanesa Rodriguez, compostaje de residuos biodegradables de un
M. Florencia Ferreyra feedlot vacuno ....................................................... 475
Grassi, Roberto Umbides,
Alfredo Polo.

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Microbiología Agrícola. Un aporte de la Investigación en Argentina, se-

Este libro,“Microbiología Agrícola. Un aporte de la Investigación en Ar-

Ing. Agr. José Manuel Salgado

Soil quality. Biological properties and evaluation in

Albanesi Adaa*, Analia Anriqueza, José A. Dominguez Nuñezb,

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Evaluación de la calidad de suelos

viamente el nivel de análisis y caracterizar el sistema a evaluar, en particular el

Índices de calidad de suelos

puede utilizar una escala de transformación en diferentes clases establecidas de

Indicadores de calidad de suelos

suelo, como en la descomposición de residuos orgánicos, el ciclado de nutrientes,

Indicadores biológicos y bioquímicos

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tificación a nivel de género y especie. Estas técnicas se basan en el análisis de

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Evaluaciones de calidad de suelos en la Región Chaqueña. Actualización al

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Habilitados mediante desmonte parcial mecánico (rolado) con pasturas natu-

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Tratamiento CBM: COT qCO2 RE:COT C:N COP:COT

Los menores valores de COT y COP en el tratamiento rolado y pastoreado

Estudios llevados a cabo en los mismos sitios, mediante técnicas de micro-

Cobertura RE CBM C0 Kc COT COP Nt

Cobertura CBM: COT qCO2 RE:COT C:N COP:COT

b)Ambientes con pluviometría de 650 mm

Tratamientos COT NT COP COA NOA Nan FDA

Tratamientos COP:COT NOP:NT COT:NT COP:NOP

COT COP COA NT NOA NOP Nan FDA

COP:COT NOP:NT COT:NT COP:NOP

Además el aumento de la actividad microbiana resultado de las altas tem-

acumula de manera lenta y continua sobre la superficie del suelo incorporándose

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Las variables pH, NT, COT y conductividad eléctrica (CE) se muestran

sistema de cultivo con incorporación de inoculantes cuando el sitio es de menor

De acuerdo con el análisis se obtuvieron rendimientos mayores en trata-

Calidad de suelos en las áreas agrícolas de secano de la región chaqueña

mentarán las tasas de mineralización de N, U-asa y la actividad nitrificante a ex-

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El análisis estadístico es utilizado como herramienta para detectar la sensi-

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