Practica Manual Biotecnologia
Practica Manual Biotecnologia
Practica Manual Biotecnologia
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
2014
MANUAL DE PRÁCTICAS
[http://planetabeta.com/aprendiendo-cuidar-ambiente]
1er Revisión
EVALUACIÓN
INICIO DE PRÁCTICA:
FINAL DE PRÁCTICA:
2. Al final del semestre se entregará una libreta con las bitácoras y/o las hojas
engargoladas y se anexarán sus reportes de cada práctica.
INDICE
PRÁCTICA Página
6
Práctica 1. Extracción de ADN genómico de suelo
Dra. Estela Flores Gómez
14
Práctica 2. RAPD
Dra. Margarita Ivonne Garrido Gutiérrez
18
Práctica 3. Degradación de fenoles.
Dra. Elvia Inés García Peña
25
Práctica 4. PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES (Biogás)
33
Práctica 5. Producción de bioetanol
Dra. Elvia Inés García Peña
39
Práctica 6. Determinación del Kla por el método del sulfito
M. en c. Jessica Batalla Mayoral
47
Práctica 7. Biodisel
M. en C. Flor Selene Villalobos
Práctica 1
Por otro lado, la Ingeniería Genética (IG) es una herramienta que trabaja
básicamente con ácidos nucleicos. Su análisis, manipulación o clonaje requieren
poder disponer de una cantidad adecuada de material y en estado suficientemente
puro para su utilización con garantías; en general, se podría definir como un
conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y
expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en
organismos diferentes al de origen. El ADN que combina fragmentos de
organismos diferentes se denomina ADN recombinante. Así, es posible no sólo
obtener proteínas recombinantes de interés sino también mejorar cultivos y
animales. Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva
característica se denominan organismos genéticamente modificados (OGM) o
transgénicos. A su vez, la IG es lo que caracteriza a la biotecnología moderna que
implementa estas técnicas en la producción de bienes y servicios útiles para el ser
humano, el ambiente y la industria.
II. Objetivos
Objetivo General
Objetivos Específicos
- Un cuadrito de parafilm
- 300-400 mg de suelo.
- Guantes
EQUIPO
- Microcentrífuga
- Espectrofotómetro
- Celdas de cuarzo.
- Cámara de Electroforesis
- Campana de extracción
REACTIVOS
- Cloroformo:Octanol (24:1)
- Fenol:Cloroformo (1:1)
- Isopropanol frío
- EtOH
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. acético glacial, Na 2EDTA pH 8.0)
-Rojo Texas.
- RNAsa (10mg/ml)
IV. METODOLOGIA
Nota: Se recomienda distribuir el suelo a lo largo del tubo antes de añadir el buffer,
para evitar el aglutinamiento del suelo en el fondo del tubo.
OJO: debajo de 15°C el complejo CTAB/ADN puede precipitar, por lo tanto evitar
esta condición.
11. Remover el ADN precipitado con una varilla de vidrio en forma de gancho o
bien centrifugar para obtener la pastilla de ADN.
13. Añadir 1 vol de fenol:cloroformo en relación 1:1. Centrifugar los tubos a 3200
rpm durante 10 min.
14. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo estéril de 2 ml. Extraer el
ADN con 1 ml (1X volumen TE original) de cloroformo:octanol. Centrifugar la
muestra 10 min a 3000-3200 rpm.
Lavados de la pastilla
22. Adicionar 0.3 a 0.5 ml de TE al tubo eppendorf hasta que se disuelva la pastilla
de ADN. Tapar el tubo y dejar toda la noche disolver el ADN a TA. Almacenar las
muestras a 4 °C.
10
1000
3.5 Realizar Regresión Lineal para el Cálculo aproximado del PM (pares de bases,
pb)
11
sustituir la distancia a la banda del DNAg y sacar el antilogaritmo del valor Y para
tener el PM en pb.
Obtención de ADN
Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)
Espectrofotometría (Concentración y pureza del ADN)
3. ¿Qué otra aplicación podrías obtener del estudio del ADNg obtenido en ésta
práctica?
4. ¿Existen otros colorantes además del Rojo Texas para hacer visible el ADN en
el gel de agarosa?
6. ¿Por qué se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su
pureza?
12
VII. Conclusiones
VIII. REFERENCIAS
- www.cuadernosdebiotecnologia.ar Cuaderno No 4
13
Práctica 2
I. Introducción
II. Objetivo
Objetivo General
14
Objetivos específicos
Materiales
Reactivos Tabla 1.
Equipo
Termociclador
Cámara de lectroforesis
IV. Metodología
15
Tabla 3. Secuencia de los iniciadores para el RAPD con DNA de suelo contaminado
Iniciador Secuencia 5´ a 3´
70-31 GCCCCTCTTG
70-34 GGACCGCTAG
70-35 CATGTCCGCC
70-37 CTATCGCCGC
70-40 CGCAGACCTC
SP GCGTCGAATTAAGCCACA
Tabla 4. Programa para el termociclador para la técnica de RAPD con DNA de suelos
contaminados
Ciclos Tiempo (segundos) Temperatura (°C)
1 60 94
3 ciclos 30 94
30 35
90 72
38 15 94
30 35
90 72
1 150 72
1 ∞ 4
16
VII. Conclusiones
VIII. REFERENCIAS
http://www.ucla.edu.ve/bioagro/Rev13(3)/1.%20Uso%20de%20la%20t
%C3%A9cnica.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml
http://www.encuentros.uma.es/encuentros49/marcadores.html
17
Práctica 3
I. Introducción
18
bioacumulables dentro del medio ambiente pudiendo llegar a ser un peligro público
[26].
19
compuestos tóxicos debido a que crecen más rápidamente que los anaerobios y
transforman generalmente los compuestos orgánicos a compuestos inorgánicos
(CO2, H2O).
Las células inmovilizadas han sido bien definidas como células que son atrapadas,
asociadas a una matriz insoluble. Mattiasson [33] discutió varios métodos de
inmovilización: pares covalentes, adsorción, atrapamiento en una red de polímero
tridimensional, confinamiento en una emulsión liquido-liquido, y atrapamiento con
una membrana semipermeable. Bajo algunas condiciones, las células
inmovilizadas, tienen ventajas sobre las células libres y enzimas inmovilizadas. El
uso de células inmovilizadas permite la operación de bioreactores a flujos que son
independientes de la velocidad de crecimiento de los microorganismos empleados
[39]. La estabilidad catalítica puede ser mas grande por las células inmovilizadas
que por las células libres, y algunos microorganismos inmovilizados son tolerantes
a las altas concentraciones de compuestos tóxicos en comparación con las células
libres [19, 29]
20
Un gran número de los estudios en la degradación del fenol se han realizado con
cepas puras de bacterias, principalmente del género de las Pseudomonas.
[1.21.51] Un gran número de levaduras y hongos filamentosos tienen una
capacidad que degradar fenol. Entre los tipos de levaduras, la Candida tropicalis
ha sido la más estudiada. C. tropicalis es una levadura hidrocarbonoclastica capaz
de degradar el fenol, derivados del fenol y compuestos alifáticos, en
concentraciones relativamente altas (<3,000 ppm). [11,43] Sin embargo, como en
muchos otros microorganismos, el fenol inhibe el crecimiento de la C. tropicalis y
pueden también causar lisis.[43]
Existen también algunos estudios llevados a cabo con cultivos mixtos. Morsen y
Rehm [36] estudiaron un cultivo mixto de Psuedomonas putida y Cryptococcus
elinovii para degradar fenol. Oh et al.[38] reportan un cultivo mixto de una bacteria
conocida y un lodo para el tratamiento de aguas residuales. También, Wiesel et al.
[50] usaron 5 tipos de bacterias para tratar hidrocarburos aromáticos policíclicos.
En estos estudios varias interacciones entre estos microorganismos pudieron ser
analizadas
21
II. Objetivos.
Objetivo General
Objetivos Específicos
Materiales
Equipo
Centrífuga
Espectrofotómetro
22
Celdas plásticas
IV. Metodología
Técnicas analíticas
Los compuestos fenólicos seran analizados con una previa filtración a través de un
filtro de membrana de celulosa de 0.45 µm con el fin de capturar material
biológico para que no exista interferencia en las lecturas por espectrofotometría
usando espectrofotómetro UV Beckman DU 650 y UNICO. La absorbancia sera
medida a una longitud de onda de 254 nm.
23
Biomasa
VII. Conclusiones
VIII. REFERENCIAS
24
Tesis
http://dgsa.uaeh.edu.mx:8080/bibliotecadigital/bitstream/231104/361/1/Biode
gradacion%20de%20fenol.pdf
http://www.ingenieroambiental.com/4014/diazve.pdf
Práctica 4
I.INTRODUCCIÓN
25
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
En gran parte del mundo, la leña (o carbón vegetal) que se obtiene a partir de la
madera sigue siendo el principal biocombustible empleado para la cocina, la
calefacción y la luz. Esta fuente de energía es un recurso renovable si se obtiene a
partir de bosques convenientemente reforestados. Asimismo, muchos vehículos
utilizan biocombustibles a base de metanol y etanol mezclado con gasolina. Se
puede obtener etanol a partir de la caña de azúcar, de la remolacha o el maíz. En
algunos países como la India y la China producen biogás a partir de la
fermentación natural de desechos orgánicos (excrementos de animales y residuos
vegetales).
La obtención de biocombustibles
Según la naturaleza de la biomasa y el tipo de combustible deseado, se pueden
utilizar diferentes métodos para obtener biocombustibles: procesos mecánicos
(astillado, trituración, compactación), termoquímicos (combustión, pirolisis y
gasificación), biotecnológicos (micro bacterianos o enzimáticos) y extractivos. En
la siguiente tabla se presenta una síntesis de estos principales procesos de
transformación y de los biocombustibles derivados, así como las aplicaciones más
frecuentes en cada uno de ellos. Cada uno de estos procesos se inicia con la
biomasa vegetal que se forma a partir del proceso de fotosíntesis, con el aporte de
la energía solar que captan y transforman estos organismos.
Mecánicos
Termoquímicos Biotecnológicos Extractivos
Astillado Pirolisis Gasificación Fermentaci Digestión Extracción
Técnicas ón anaerobia físico-
Trituración química
Compactació
n
Briquetas Hidrocarburo
s
Aserrín
26
Industria Industria
química química
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
El Biogás
Casi tres mil millones de personas en el mundo emplean todavía la leña como
fuente de energía para calentar agua y cocinar, lo que provoca, entre otros
efectos, la pérdida de millones de hectáreas de bosques tropicales y zonas
arboladas.
En respuesta a esta situación surgen otras alternativas para obtener energía, entre
ellas, la producción de biogás a partir de la fermentación de la materia orgánica.
Para la obtención de biogás se puede utilizar como materia prima la excreta
animal, la cachaza de la caña de azúcar, los residuales de mataderos, destilerías y
fábricas de levadura, la pulpa y la cáscara del café, así como la materia seca
vegetal.
27
Fuente: http://www.cubasolar.cu/biblioteca/energia/Energia22/HTML/articulo04.htm
28
II. Objetivos
Objetivo General
Objetivo específicos
III. Materiales
Materiales
Inóculos
Equipo
Incubadora a 37 °C
29
Campana de extracción.
Propósito de la actividad
30
Desarrollo
31
VII. Conclusiones
32
VIII. REFERENCIAS
PRACTICA 5
PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE COMPUESTOS
LIGNOCELULÓSICOS.
I. INTRODUCCIÓN
33
Los autotransportes cubren gran parte del consumo de energéticos derivados del
petróleo. Los alcoholes han sido utilizados como combustibles a partir de la crisis
del petróleo en los 70’s, por lo que diversos países implementaron programas
para el desarrollo de nuevos combustibles a partir de materias primas económicas,
accesibles y renovables. Así, desde 1980 el etanol es usado como un combustible
alterno en diferentes países. Existen tres métodos principales para la producción
de etanol (Morrison & Boyd, 1983). Estos son: (a) hidratación de alcanos
provenientes del cracking del petróleo; (b) hidrólisis quimica de compuestos
celulósicos ya sea en medios ácidos o básicos; y (c) Fermentación de
34
35
II. OBJETIVOS
General
Específicos
1
Cuando se trata de compuestos lignocelululósicos, se consideran los equivalentes de glucosa de acuerdo al
número de monómeros contenidos en el polímero.
36
37
VII. Conclusiones
VIII. REFERENCIAS
- Gong, C.; Chen, L; Flickinger, M; et al. 1981. Production of Ethanol from D-Xylose by
Using D-Xylose Isomerase and Yeasts. Applied and Environmental Microbiology. 14 (2): 430-
436.
- Alterthumb, F and Ingram, L. 1989. Efficient Ethanol Production from Glucose, Lactose,
and Xylose by Recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 55 (8):
1943-1948.
- Himmel, M. and Sheehan, J. 1999. Improved Cellulases for Bioethanol Production.
Biotechnology Center for Fuels and Chemicals.
38
Práctica 6
I. INTRODUCCIÓN
Velocidad de agitación
Tipo y número de agitadores
Flujo de gas
39
Condiciones de operación
Propiedades fisicoquímicas del cultivo
Parámetros geométricos del biorreactor
Presencia de oxígeno consumido por las células
40
41
NO2=KL (CL-Ci)
NO2=kLa (CL-C*)
NO2=QO2 .X
X=Concentración celular
42
Esta ecuación relaciona la capacidad de transferencia del reactor (Kla) con las
velocidades específicas de crecimiento que se pueden alcanzar en su interior.
dC/dt=Kla (C*-C)
43
Este método está basado sobre la reacción del sulfito de sodio, un agente
reductor, con el oxígeno disuelto para producir sulfato en la presencia de un
catalizador (usualmente un catión divalente de Cu++op Co++, la ecuación puede
ser expresada de la siguiente manera:
44
II. Objetivos
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Analizar el método para determinación del Kla por el método del sulfito.
Analizar y discutir los métodos indirectos y directos que se utilizan en la
determinación del Kla.
Estimar el Kla por el método del sulfitoII.
III.MATERIAL Y REACTIVOS
Soluciones:
EQUIPO
- Agitadora orbital
- Bureta
- Soporte Universal
45
IV. METODOLOGIA
1. Una vez que los matraces contengan la solución de sulfito (50 y 100 mL según
corresponda en cada uno), se inicia la agitación/aireación a 100 rpm y a 200 rpm.
Se permite la saturación. Detener la agitación/aireación, y tomar una muestra de 1
ml.
46
VI. REFERENCIAS
Cooper C.M., Fermstrom G.A., Millar S.A. 1944. Performance of agitated gas-liquid
contactors. Industrial and Engineering Chemistry. 36:504-509.
Kensy F., Zimmermann H.F., Knabben I., Anderlei T., Trauthwein H., Dingerdissen
U., Büchs Jochen. 2005. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates:
determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time
measurement during microbial growth. Biotechnology and Bioengineering. 89: 698-
708.
47
Práctica 7. “BIODISEL”
I. Introducción
Es un líquido con tonalidad variable que puede ir desde un color amarillo claro
hasta oscuro. Capaz de mezclarse con el diesel de origen fósil ya que tiene una
viscosidad similar y con ello se reducen las emisiones de contaminantes de los
vehículos automotores. La mezcla del biodiesel se denota normalmente por “BXX”
donde “XX” representa el porcentaje de biodiesel que contienen la mezcla. Por
ejemplo: B20 es una mezcla de 20 % biodiesel y 80 % diesel, mientras que B5
está conformado por 5 % biodiesel y 95 % de diesel o bien B100 % formado por
solo biodiesel.
48
mono y di-glicéridos sin reaccionar por completo, ácidos grasos libresy trazas de
métales provenientes del catalizador(Feb 2006).
II. Objetivos
III. Material
Reactivos
NaOH(catalizador)
Metanol al 99 %
IV. Metodología
Medir 200 ml de metanol con una probeta, añadirlo con ayuda de un embudo a la
botella de plástico PET.
Añadir con ayuda de embudo 3.5 g de hidróxido de sodio (NaOH) mezclar con
cuidado.
Calentar la botella y agitar por 1 min 5 veces en intervalos de 5 min (el NaOH se
disuelve en el metanol formando metóxido de sodio).
Preparación de la reacción
49
VII. Conclusiones
VIII. REFERENCIAS
http://www.conae.gob.mx/work/sites/CONAE/resources/LocalContent/466/2/biodiesel.pdf
http://www.corpoica.org.co/sitioweb/Documento/JatrophaContrataciones/CURSO-BIODIESEL.pdf
http://www.olade.org/sites/default/files/CIDA/IICA/Manual_Biocombustibles_ARPEL_IICA.pdf
http://www.olade.org/sites/default/files/CIDA/Biocomustibles/Otros/Proceso%20de%20Produccion%20de
%20Biodiesel%20(Modelo%20de%20Peru).pdf
50