FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

ÁREA DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA BIOQUÍMICA

GRADO DE BIOTECNOLOGÍA

SESIÓN DE LABORATORIO Nº 2

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

NOMBRE……………………………………………….

GRUPO DE PRÁCTICAS Nº……………………………….

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OBJETIVOS
• Medida de marcadores para las fracciones citosólica y nuclear
• Determinación del grado de enriquecimiento de cada fracción proporcionada
por el procedimiento

Una de las técnicas más utilizadas para obtener los orgánulos que conforman las células es
la rotura de la membrana plasmática y la posterior separación de los componentes
subcelulares mediante centrifugación a diferentes fuerzas gravitatorias.

PROTOCOLO DE SEPARACIÓN DE FRACCIONES SUBCELULARES

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u

homogeneización de la muestra. Esto se logra a través de diferentes procedimientos como la
sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), choque osmótico, o simplemente
moliendo las células en homogeneizadores mecánicos. En esta etapa se rompen muchas
de las membranas de las células, incluyendo la membrana plasmática y el retículo
endoplásmico que queda formando pequeños fragmentos o vesículas que dan origen a la
fracción microsomal. El resto de los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, aparato de
Golgi, lisosomas y peroxisomas) permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas
conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de
la función de cada orgánulo por separado.

La suspensión de células rotas obtenidas se llama lisado u homogeneizado, y es la que se

fracciona en la segunda etapa del proceso. Este consiste en etapas sucesivas de centrifugación
en las que los componentes de la célula se separan en función de su velocidad de
sedimentación y de su diferencia de densidad.

Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del
tubo se obtiene un sedimento o pellet y sobre él una parte líquida llamada sobrenadante.

PROCEDIMIENTO
1.- OBTENCIÓN DE PREPARADOS ENRIQUECIDOS EN FRACCIONES SUBCELULARES

Es importante saber que la etapa de ruptura y homogeneización de la muestra se debe

realizar colocando el tejido a fraccionar y una cantidad de solución tampón que contiene
sacarosa e inhibidores de proteasas. La solución tampón deja los orgánulos en suspensión y
sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador. Además,
todo el proceso debe realizarse en frío (4° C) para evitar una posible degradación de las
estructuras celulares y para conservar intactas las características funcionales del organúlo que
se pretende aislar.
Nota: Con el fin de acortar la sesión de prácticas, esta parte será realizada previamente por el
técnico de laboratorio
Materiales:
- 100 mg de hígado fresco.
- Solución 1 (Sol. 1): Sacarosa 0.33 M, Mg Cl2 3 mM, tampón fosfato 10 mM, pH: 7.4

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 Procedimiento:

100 mg DE HÍGADO + 0,9 ml SOL. 1

HOMOGENEIZAR CON POTTER

PASAR EL HOMOGENEIZADO A OTRO EPPENDORF FILTRÁNDOLO CON GASA

EXTRACTO CRUDO (SOBRENADANTE)

CENTRIFUGAR A 4 ºC, 10 min a 1500 g

SOBRENADANTE PRECIPITADO
CENTRIFUGAR A 4 ºC, 50 min A 14.000 g. (P1) Fracción nuclear

RESUSPENDER EN 0.5 ml
DE SOL 1. Y CONSERVAR
EN HIELO

PRECIPITADO SOBRENADANTE
Fracción mitocondrial (S2) Fracción citosólica (Guardar en hielo)

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Las fracciones que se obtienen por este procedimiento están enriquecidas en ciertos ogánulos, pero
siempre hay cierto grado de contaminación con los demás componentes.
Existen otras modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que
se obtienen con soluciones de sacarosa, polímeros o proteína, lo que permite obtener
preparaciones subcelulares más puras.

2.- IDENTIFICACIÓN DE LAS FRACCIONES SUBCELULARES

Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evalúa mediante el análisis de la forma en

que se distribuyen algunos componentes celulares de localización subcelular conocida en las
diferentes fracciones obtenidas. Estas moléculas son llamadas marcadores de cada una de las
fracciones. Por ejemplo, el ADN es un marcador de la presencia de núcleos, y las enzimas implicadas
en el metabolismo de la glucosa se emplean como marcadores de la fracción citosólica.
De este modo, el análisis de la distribución de los diferentes marcadores en las fracciones
subcelulares obtenidas permite conocer la distribución y pureza relativa de los distintos orgánulos,
y el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fracción.

En esta práctica, el precipitado P1 corresponde a una fracción enriquecida en núcleos mientras que
el sobrenadante S2 contiene fracción citosólica, microsomas y ribosomas.

• Identificación de la fracción nuclear: Para identificar esta fracción vamos a utilizar

como marcador el ADN

Medida de Ácido desoxi-ribonucleico

La desoxi-ribosa en soluciones fuertemente ácidas se deshidrata dando aldehído 5-

hidroxilevulínico. Este aldehído se condensa con la difenilamina dando un compuesto de color azul
el cual absorbe luz a 595 nm.
Esta reacción se puede utilizar para cuantificar ADN en cada fracción, pero previamente se debe
construir una curva de calibración.
Para que la sacarosa presente en la solución de purificación, así como las proteínas no interfieran con
las mediciones, se precipita el ADN y las proteínas con ácido perclórico (PCA).

Tratamiento de las muestras:

- En un tubo eppendorf se agrega 100 µl de la fracción y 1 ml de PCA 0.5M. Pipetear en
cabina de extracción de gases (PCA es corrosivo y comburente)
- Centrifugar durante 5 minutos a 10,000 rpm. Descartar el sobrenadante.
- El precipitado se resuspende en 0.6 ml de PCA 0.5M y se incuba 20 minutos en baño a
70ºC
- Centrifugar 5 minutos a 10,000 rpm y luego conservar el sobrenadante.

Materiales:

- Difenilamina (DFA)

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 BLANCO HOMOGENADO FRACCIÓN P1
CRUDO
DFA 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml
Homogenado --- 0.1 ml ---
crudo
Fracción P1 --- --- 0.1 ml

- Incubar los tubos 10 minutos a 100ºC. Advertencia: el agua está hirviendo; ¡ten
cuidado con el vapor al abrir la tapa!
- Enfriar los tubos en hielo y medir la absorbancia a 595 nm.

Curva de Calibración de ADN:

ADN,microgramos ABSORBANCIA
0.1 0.05
0.25 0.075
0.50 0.115
0.75 0.175
1 0,220
1.25 0,275
1.50 0,320

Representar gráficamente absorbancia frente a cantidad de ADN y extrapolar la absorbancia de las

muestras para el cálculo de su cantidad.
Hay que tener en cuenta que el volumen de las muestras problema empleado en el ensayo es de
100 μl.
Esto es necesario para expresar el resultado como microgramos de ADN/ml de muestra

• Identificación de la fracción citosólica: Para identificar esta fracción vamos a utilizar

como marcador la actividad de la enzima Lactato Deshidrogenasa

Medida de Lactato Deshidrogenasa (LDH)

La enzima LDH es una enzima citosólica que cataliza la siguiente reacción:

LDH
+ +
PIRUVATO + NADH + H L-LACTATO + NAD

El tampón de trabajo contiene piruvato y NADH a concentración saturante. El progreso de la reacción

catalizada por el enzima se sigue midiendo la tasa de desaparición del NADH en el
espectrofotómetro a 340 nm
Materiales:

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 - Tampón de trabajo

pa ra LD H

Procedimiento:

- Ajustar la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm.

- Ajustar a 0 la absorbancia con una cubeta con agua.
- Este enzima cataliza la reacción que comienza al añadir la muestra. Por lo tanto,
la absorbancia de cada cubeta debe medirse a 340 nm, antes y a los 3 minutos de
haber añadido la muestra. El tiempo debe controlarse rigurosamente.

- Pipetear en 2 cubetas de espectrofotometría 1 ml tampón de LDH, medir sus

absorbancias y anotarlas.

- Disparar la reacción con 10 microlitros de cada muestra. Sellar la cubeta con Parafilm y
agitar por inversión. Incubar 3 min a temperatura ambiente y medir la absorbancia de
las 2 cubetas. Anotar sus lecturas.

LDH HOMOGENADO FRACCIÓN

CRUDO S2
Tampón 1 ml 1 ml
Homogenado 10 µl* --
crudo
Fracción S2 -- 10 µl*

*Dilución 1/10= 10 µl de fracción + 90 µl de agua—10 µl para el ensayo. (Las diluciones deben

prepararse de antemano en tubos eppendorf)

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 3.- MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS DE LAS DISTINTAS FRACCIONES

- Medida de proteínas por el método de Bradford.

BLANCO 1 2 3

Agua desionizada 950 µl 940 µl 940 µl 940 µl

Homogenado 10 µl de dil
---- ---- ----
crudo 1/10
10 µl de dil
Fracción P1 ---- ---- ----
1/10
10 µl de dil.
Fracción S2 ---- ---- ----
1/10
Reactivo Bradford 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
*Dilución 1/10= 10 µl de fracción + 90 µl de agua—10 µl para el ensayo. (Las diluciones
deben prepararse de antemano en tubos eppendorf)

- Medir la absorbancia a 595 nm.

Curva de Calibración de Proteínas:

Proteína, μg ABSORBANCIA
1 0.059
2.5 0.155
5 0.296
10 0.600

Representar gráficamente absorbancia frente a cantidad de proteínas y extrapolar la absorbancia

de las muestras para c o n o c e r l a ca n t i d a d .
Ten en cuenta que las fracciones están diluidas 1:10 para el ensayo, por lo que hay que multiplicar
por 10 para conocer la cantidad de proteína que hay en la muestra problema.
Además, los resultados se expresan como concentraciones (microgramos/ml). Por eso tienes que
tener en cuenta también que has empleado 10 microlitros de muestra 1/10.

7
s
4.- RESULTADOS

CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE ADN, PROTEÍNAS Y ACTIVIDAD LDH EN LAS FRACCIONES

Enzyme Activity, LDH (Units) = DAb/time (min) x incubation volume (ml) = μmoles/min
e x light path (cm)

Where:
e340 = 6.22 mM-1cm-1

LIGHT PATH OF CUVETTES USED IS 1 CM

1 UNIT=1 MICROMOL OF SUBSTRATE TRANSFORMED/MIN

A. ADN:

Fracción [DNA] [Protein] [DNA]/ [Protein]

µg/ml (mg/ml) (µg/mg)
Homogenado
crudo
P1
B.- LDH:

Fracción [Enzima] [proteínas] Actividad

(U/ml) (mg/ml) específica
(U/mg proteína)
Homogenado
crudo
S2

Donde:
La concentración d e e n z i m a [ E ] se expresa en Unidades/ por ml de muestra (Homogenado crudo,
S2). 1 U= 1 micromol de sustrato transformado. Min-1

[Enzima] (U/ml) = tener en cuenta el factor de dilución usado

[proteínas] (mg/ml) = tener en cuenta el factor de dilución usado

[ADN] (µg/ml) = tener en cuenta el volumen de muestra usado (100µL)

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Explica los cálculos realizados para obtener los resultados

Notas
Concentraciones deben expresarse como la cantidad de actividad enzimática (Units) o DNA(μg) por ml
y mg de proteína por muestra (Homogeneizado crudo, P1 and S2).

[Enzima] (U/ml): considera el factor de dilución utilizado en el test.

[Protein] (mg/ml): considera el factor de dilución utilizado en el test.

Compara las concentraciones de los 2 marcadores en las condiciones testadas y calcula el factor de
enriquecimiento del procedimiento de obtención de las fracciones citosólica y nuclear.
Factor Enriquecimiento: [ marcador de interés /mg proteína] en fracción P1 y S1/[
marcador de interés /mg proteína] en Homogeneizado

Factor de Enriquecimiento ≤1: El procedimiento no proporciona enriquecimiento

Factor de Enriquecimiento >1: buen procedimiento