BOSQUE 27(2): 126-134, 2006

Control biológico
BOSQUE de Botrytis
27(2): 126-134, 2006 cinerea

Selección de hongos antagonistas para el control biológico

de Botrytis cinerea en viveros forestales en Chile

Screening to antagonistic fungi for Botrytis cinerea

biocontrol in Chilean forest nurseries

Gloria Molina Mercader1, Salomé Zaldúa Flores2, Gastón González Vargas1,

Eugenio Sanfuentes Von Stowasser2*
1 Biocaf Ltda., Camino a Coronel, Concepción.

*Autor de correspondencia: 2 Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Forestales,

Laboratorio de Patología Forestal, Victoria 631, Concepción, esanfuen@udec.cl

SUMMARY

Botrytis cinerea is one of the most important pathogens in Chilean forest nurseries. The disease control has been based on the
use of fungicides; nevertheless, under certain conditions of disease pressure this practice has not been effective, besides its
environmental problems due to its excessive use. The objective of this study was to select antagonistic fungi to B. cinerea, by
means in vitro and nurseries assays, to determine its capacity as biocontrol agents of the «grey mould» disease in forest nurseries.
The antagonistic potentials were obtained from the plants phyloplane, collected from forest nurseries. Seventy one fungi strains
were evaluated in their capacity to reduce in vitro the pathogen colonization and sporulation by bioassays in Eucalyptus leaf discs.
Selected strains were assayed under greenhouse conditions. Pinus radiata and E. globulus plants were sprayed with the pathogen
(1x105 conidias/ml) and later treated with the antagonists (1x 107 conidias/ml), evaluating the disease incidence and severity. In
the in vitro assays, four strains of Trichoderma, three of Clonostachys, four of Penicillium, one of Cladosporium and other eight
unidentified fungi strains did not significantly reduce pathogen colonization and sporulation. In the greenhouses assays, the strain
Clonostachys (A-10) was able to reduce, in both P. radiata and E. globules, the disease incidence and severity. These results
allow concluding that antagonists selected have the potential to B. cinerea control in forest nurseries.

Key words: biological control, Clonostachys, Trichoderma, forest nurseries diseases, Botrytis cinerea.

RESUMEN

Botrytis cinerea es uno de los patógenos más importante en viveros forestales en Chile. El control de la enfermedad se ha basado
en el uso de fungicidas; sin embargo, bajo ciertas condiciones de presión de enfermedad esta medida no ha sido eficaz, sumado
a problemas ambientales debido a su uso excesivo. El objetivo de este estudio fue seleccionar hongos antagonistas a B. cinerea,
mediante ensayos in vitro y de invernadero, y determinar su capacidad como agentes biocontroladores de este hongo en viveros
forestales. Los potenciales antagonistas fueron obtenidos a partir del filoplano de plantas, colectadas desde viveros forestales.
Fueron ensayadas 71 cepas de hongos, evaluadas en su capacidad para reducir la colonización y esporulación del patógeno en
ensayos in vitro, mediante bioensayos en discos de hojas de Eucalyptus globulus. Las cepas seleccionadas fueron ensayadas bajo
condiciones de invernadero. Las plantas de Pinus radiata y E. globulus fueron pulverizadas con el patógeno (1x105 conidias/ml)
y después tratadas con los antagonistas (1x 107 conidias/ml), evaluándose la incidencia y severidad de la enfermedad. En los
ensayos in vitro, cuatro cepas de Trichoderma, tres de Clonostachys, cuatro de Pencillium, una de Cladosporium y otras ocho
cepas de hongos no identificados redujeron significativamente la colonización y esporulación del patógeno. En los ensayos en
invernadero, la cepa Clonostachys (A-10) fue capaz de reducir, tanto en P. radiata como en E. globulus la incidencia y severidad
de la enfermedad. Estos resultados permiten concluir el potencial de los antagonistas seleccionados en el control de B. cinerea.

Palabras clave: control biológico, Clonostachys, Trichoderma, enfermedades en viveros forestales, Botrytis cinerea.

INTRODUCCIÓN Chile, donde afecta, preferentemente, a plantas del géne-

ro Eucalyptus. Este patógeno también ha sido descrito
La enfermedad “moho gris”, causada por Botrytis ci- sobre plántulas de Pinus radiata D. Don, durante su vi-
nerea Pers. ex Fr., se presenta en diversos cultivos, in- verización, atacando la porción apical (Butin y Peredo
cluyendo viveros forestales de la V a la X Regiones de 1986). Tanto en P. radiata como en especies de Eucalyp-

126
 BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

tus, B. cinerea constituye un serio problema de pudrición en viveros forestales, donde B. cinerea es el principal
en estaca durante las primeras etapas del establecimiento problema biótico en la producción de plantas de E. glo-
o “estaquillado”. bulus en contenedores.
Los factores que favorecen la infección por B. cine- Debido a los problemas mencionados previamente, y
rea son aquellos que resultan en daño físico producido a a la evidencia de éxito obtenido en otros cultivos en la
la planta (Coley-Smith et al. 1980, Figueredo et al. 2001, aplicación de control biológico, esta investigación se plan-
Sanfuentes y Ferreira 1997), que en el caso particular en teó como objetivo principal seleccionar antagonistas con-
viveros de P. radiata y Eucalyptus spp. en Chile, es es- tra B. cinerea, para ser empleados en el control biológico
pecialmente importante el daño causado por heladas. del “moho gris” en viveros forestales.
Una vez introducido B. cinerea en los cultivos, puede
sobrevivir en sustrato orgánico, hojas muertas caídas en
la superficie de los recipientes y en tejidos de plántulas MÉTODOS
como componente de la biota del filoplano (Sanfuentes y
Ferreira 1997, Sharabani et al. 1999, Pande et al. 2001, Aislamiento de B. cinerea y producción de inóculo. La
Barnes y Shaw 2003). cepa de B. cinerea utilizada en los ensayos fue aislada a
Tradicionalmente el principal método de control de partir de plantas de P. radiata, con síntomas de “moho
B. cinerea ha sido mediante el uso de fungicidas. Aun- gris”, provenientes del Vivero Carlos Douglas, propie-
que estos continúan siendo el soporte del manejo del dad de Forestal Mininco S.A. localizado en la comuna de
“moho gris”, recientes estudios han constatado una me- Yumbel, VIII Región.
nor efectividad en las aplicaciones, producto del abrupto Acículas y tallos de las plantas fueron seccionados en
aumento de los niveles de resistencia del patógeno a fun- trozos y dispuestos dentro de placas Petri, con papel ab-
gicidas benzimidazoles, como también un desarrollo pau- sorbente humedecido en agua destilada estéril (ADE),
latino de resistencia a dicarboximidas, por el uso repeti- conformando una cámara húmeda para estimular la espo-
tivo de estos grupos de fungicidas (Ferreira 1989, Zhang rulación del patógeno.
et al. 1994, Col et al. 1994, Esterio y Auger 1997). Una vez producida la esporulación, se colectaron las
El público evidencia un descontento con residuos de conidias mediante estilete estéril, las que fueron sembra-
fungicidas en el follaje y frutos; asimismo, se percibe das en placas Petri conteniendo agar papa dextrosa (APD),
una animadversión de la población contra la aplicación con100 μg/mL de sulfato de estreptomicina (SE) y repi-
de productos químicos que dañan al hombre y al ambien- cadas hasta obtener cultivos puros. Luego, estos fueron
te. La tendencia gubernamental a legislar restricciones en almacenados en tubos de ensayo con APD inclinado y
el uso de plaguicidas ha incentivado investigaciones orien- mantenidos a 4ºC hasta su uso.
tadas a proporcionar nuevas alternativas de control efec- Para la producción de inóculo, se procedió a repicar
tivos y que disminuyan los residuos de agrotóxicos, in- desde la cepa almacenada a tubos con medio de cultivo
corporando medidas de manejo cultural y biológico APD e incubados a 22 ± 1°C, con fotoperiodo de 12 h,
(Zhang et al. 1994, Elad y Zimand 1991). durante diez días. Las esporas producidas en los cultivos
En este contexto, aparece como una alternativa viable se colectaron con ADE, para luego determinar la concen-
la aplicación de un método biológico, especialmente di- tración de conidias en la suspensión mediante hematoci-
señado como una estrategia dentro del concepto de ma- tómetro, previo a la aplicación.
nejo integrado de enfermedades.
Numerosos estudios realizados en cultivos de albaha- Aislamiento y producción de inóculo de antagonistas. Se
ca, garbanzo, frutilla, frambuesa, uva de mesa y vinífera, realizaron visitas a viveros forestales de la VII y VIII
cebolla, tomate, bulbos de flores, especies de eucaliptos Región, entre los meses de mayo a junio de 2001, reco-
y píceas, han mostrado la efectividad del control biológi- lectándose muestras de plantas de E. globulus y P. radia-
co sobre B. cinerea, y que en algunos casos ha sido ta. Las plantas seleccionadas no presentaban síntomas o
superior que los fungicidas recomendados para el cultivo signos de enfermedades.
(Sanfuentes y Ferreira 1997, Zhang et al. 1994, Esterio y Desde el follaje de estas plantas se procedió a realizar
Auger 1997, Peng y Sutton 1991, Elad et al. 1994, Zhang los aislamientos para obtener las cepas de hongos poten-
et al. 1996, Yu y Sutton 1997, 1999, Swadling y Jeffries ciales antagonistas a B. cinerea, basándose en la metodo-
1995, Cole et al. 2004, Chaves y Wang 2004). logía descrita por Peng y Sutton (1991). En este método,
En Chile, el control biológico de B. cinerea, median- se utilizaron 30 g de hojas de E. globulus y de acículas
te antagonistas específicos, ha sido poco explorado. En- de P. radiata, que fueron seccionadas y colocadas, por
tre los casos operacionales que es posible citar, se en- separado, en matraces de Erlenmeyer con 250 ml de ADE
cuentran la satisfactoria protección de vides, mediante el y 50 μL/L de Tween 20 y mantenida en suspensión, en
producto Trichodex®, elaborado a base del hongo Tri- agitación continua durante 30 min (Sanfuentes y Ferreira
choderma harzianum (T39) (Esterio y Auger 1997). El 1997, Peng y Sutton 1991). Desde la suspensión en agi-
uso de este tipo de “botriticidas” aún no se ha aplicado tación se tomaron alícuotas de 1 mL, procediéndose a

127
BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

realizar diluciones hasta 10-2. De la última, se deposita- Efecto de cepas seleccionadas en la supresión de
ron alícuotas de 0,5 ml, en placas Petri que contenían B. cinerea, aplicados antes y después del patógeno. Las
APD con 100 mg/L de SE, e incubadas durante cinco cepas de Trichoderma A6, A27, A30 y A58 y Clonosta-
días a 22 ± 1°C, en oscuridad (Sanfuentes y Ferreira chys A10, A11 A14 y A32, que presentaron los mayores
1997). niveles de inhibición de B. cinerea en la selección in
Las colonias de hongos obtenidas se repicaron a tu- vitro, fueron ensayadas en dos ocasiones. El primer ensa-
bos con APD inclinado, los que fueron almacenados a yo fue de acuerdo a la metodología descrita previamente
4 ± 1°C hasta su utilización en los ensayos de selección. en el ensayo de selección, y en el segundo ensayo sólo
Para la producción de inóculo, las cepas almacenadas fue modificada la aplicación de B. cinerea, que se realizó
fueron repicadas a placas Petri conteniendo APD e incu- 24 h después de la cepa de antagonista.
badas a 25 ± 1°C durante cinco días. Las esporas produ-
cidas en los cultivos se colectaron con ADE, determinán- Efecto de los antagonistas en el control de B. cinerea
dose la concentración de conidias en la suspensión en ensayos sobre E. globulus en vivero. El ensayo fue
mediante un hematocitómetro. conducido en el invernadero de la empresa Biocaf, ubica-
do en el predio Escuadrón, camino a Coronel, VIII Re-
Selección de antagonistas. La selección de antagonistas gión. Fueron utilizadas plantas de E. globulus proporcio-
fue realizada, en una primera etapa, utilizando ensayos in nadas por Forestal Mininco S.A., las que presentaban
vitro de acuerdo a la metodología descrita por Peng y buen estado sanitario, de 30 cm. de altura y diámetro a la
Sutton (1991) adaptada por Sanfuentes y Ferreira (1997). altura del cuello (DAC) de 0,5 cm.
Discos de hojas de E. globulus tratados previamente con Los tratamientos aplicados fueron las cepas de Tri-
hipoclorito de sodio comercial (10%) fueron dispuestos choderma (A6, A27, A30 y A58) y Clonostachys (A10,
en placas Petri estableciendo una cámara húmeda. A11, A14 y A32), el fungicida fehexamid (Teldor 50%
Sobre los discos fueron aplicados los hongos potencia- WP) en dosis 1 g/L y el control, en que sólo fue aplicado
les antagonistas en una concentración de 107 conidias/mL B. cinerea. El inóculo de los antagonistas y patógeno
y luego de 24 horas se asperjó B. cinerea en concentra- fueron aplicados en concentraciones de 107 y 105 coni-
ción de 105 conidias/mL, adicionada con glucosa 1 g/L. dias/ml en ADE, respectivamente. En la suspensión de
Al día siguiente, los discos de hojas fueron colocados esporas de B. cinerea, se adicionó glucosa (1 g/L) (Elad
en medio de cultivo PCA, que contenía agar (20 g/L), et al. 1994).
paraquat (dicloruro de paraquat) 1 g/L y cloranfenicol El patógeno fue aplicado a la totalidad de las plantas
50 mg/L, siendo incubados durante siete días a 26 ± 1°C. el 15 de septiembre del 2003 y al día siguiente se aplica-
Fueron probadas 71 cepas de hongos, en siete ensa- ron las suspensiones de esporas de los antagonistas se-
yos, debido a la dificultad de evaluarlas simultáneamen- leccionados. Ambas aplicaciones de patógeno y antago-
te. Cada cepa fue evaluada empleando cuatro repeticio- nistas se repitieron quince días después en la misma
nes, y la unidad experimental fue la placa Petri que secuencia. El ensayo en su totalidad duró dos meses.
contenía 10 discos de hojas. El tratamiento testigo sólo El riego por aspersión fue suspendido por 48 h desde
recibió la aplicación de B. cinerea. Adicionalmente, en el día de aplicación del patógeno, regándose sólo al cue-
cada ensayo se incluyeron dos unidades experimentales, llo de la planta, para evitar mojar el follaje. Se registra-
sin tratamiento alguno, para observar la presencia de ron diariamente temperatura y humedad tres veces al día.
microorganismos endófitos.
Para la evaluación del ensayo se confeccionó una Cuadro 1. Escala visual basada en el grado de colonización
escala visual de acuerdo a Peng y Sutton (1991), obte- y esporulación de B. cinerea (GE) en discos de hojas de E.
niéndose un Índice de Esporulación por Tratamiento (IET), globulus.
que consideró la colonización y abundancia de conidió- Visual scale based on B. cinerea colonization and sporulation
foros de B. cinerea en la superficie del disco de hoja de level (GE) in E. globulus leaf disks assays
E. globulus (cuadro 1)
El cálculo de este índice de esporulación por trata- GE Descripción
miento se realizó a través de la siguiente fórmula: 1 Sin presencia de B. cinerea.
N
2 Esporulación menor del 25%.
∑ GE j × n j 3 Esporulación entre 25 y 50%.
j =1 [1] 4 Esporulación mayor del 50%.
IET =
N 5 Esporulación 100%, conidióforos dispersos.
Esporulación 100%, conidióforos se encuentran
Donde IET correspondió al índice de esporulación 6
distribuidos en forma irregular.
por tratamiento, GEj fue el grado de esporulación asigna-
Conidióforos se observan colonizando todo el
do según escala visual, nj la cantidad de discos en el 7
disco en forma abundante y homogénea.
grado y N el número total de discos evaluados.

128
 BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

Cada tratamiento consistió de cuatro repeticiones, y geno. Los fungicidas fueron aplicados en las mismas
la unidad experimental estuvo constituida por 80 plantas ocasiones que los antagonistas. El ensayo tuvo una dura-
(contenidas en una bandeja), las que fueron distribuidas ción total de 45 días.
totalmente al azar dentro del invernadero. Después de la primera aplicación del patógeno y los
Para la evaluación se colectaron seis plantas por ban- antagonistas, en cada oportunidad las plantas se mantu-
deja, 24 plantas por tratamiento, a las cuales se les cortó vieron cubiertas bajo plástico transparente durante 24 h,
la raíz para luego ser colocadas en bolsas transparentes para asegurar el mojamiento foliar y favorecer la germi-
conteniendo algodón estéril embebido en ADE, confor- nación de las esporas del patógeno y antagonistas. Poste-
mando una cámara húmeda que fue mantenida a 22 ± 1ºC, riormente, se mantuvo alta humedad relativa, mediante
durante siete días. Posteriormente, las plantas fueron re- nebulización periódica. Se registró diariamente la hume-
visadas con lupa estereoscópica (x 8), determinando la dad relativa y la temperatura tres veces al día (9, 12 y
presencia de signos del patógeno, en el tallo y follaje, de 17 h).
acuerdo a la siguiente escala elaborada para tal efecto: El ensayo consistió de seis tratamientos; dos cepas de
(1) ausencia de esporulación, (2) esporulación < 12%, Trichoderma (A6 y A27), dos de Clonostachys (A10 y
(3) esporulación > 25% y < 50%, (4) esporulación > 50% A11), el tratamiento fungicida, mediante la aplicación
y (5) 100% de esporulación. En cada tratamiento se intercalada de Switch (cyprodinil), Sumisclex (fludioxo-
obtuvo el índice de esporulación aplicando la fórmula nil + procymidona), en dosis de 3,3 g/L y el tratamiento
IET [1], donde GEj fue el grado de severidad asignado, control, que sólo recibió aplicación del patógeno. Fueron
según la escala visual, nj la cantidad de plantas en el empleadas cuatro repeticiones por tratamiento y la uni-
grado y N el número total de plantas evaluadas por dad experimental estuvo constituida por 96 plantas (ban-
bandeja. deja), las que fueron distribuidas totalmente al azar den-
Se calcularon la incidencia promedio (IP) del patóge- tro del invernadero.
no y el porcentaje utilizando la siguiente fórmula: Se evaluaron incidencia y severidad de la enfermedad
en las 60 plantas centrales de la cada bandeja. Para la
j n
∑ Nj severidad cada planta se dividió en tres tercios, donde se
observó la presencia o ausencia de signos del patógeno,
j =1 [2]
IP =
j
R de acuerdo a escala descrita previamente.
Donde nj corresponde a la cantidad de plantas con
Análisis estadístico. Todos los ensayos siguieron un
presencia de B. cinerea en la repetición, Nj cantidad total
diseño experimental completamente al azar. El análisis
de plantas en la repetición y R cantidad de repeticiones
de los resultados (IET) se realizó mediante la prueba no
por tratamiento.
paramétrica de Kruskal-Wallis con el auxilio del progra-
Los porcentajes de control para cada tratamiento se
ma STATISTICA. Para las comparaciones múltiples se
calcularon de la siguiente forma:
utilizó la prueba de contraste de Kruskal-Wallis con 95%
de confianza.
⎛ IP antagonista ⋅ 100 ⎞
Porcentaje de control = 100 - ⎜ ⎟⎠ [3]
⎝ IP control
RESULTADOS
Efecto de los antagonistas en el control de B. cinerea en
Ensayos in vitro. Selección de antagonistas. De en-
ensayos sobre P. radiata en vivero. El ensayo se realizó
en el invernadero del vivero “Carlos Douglas”, de pro- tre 144 cepas de hongos aisladas desde el filoplano de
piedad de la empresa Forestal Mininco S.A., localizado plantas de P. radiata y E. globulus, fueron evaluadas
en la Comuna de Yumbel, VIII Región. Fueron emplea- 71 cepas, privilegiando para las pruebas de selección
das plantas de P. radiata de 8 meses de edad, de aproxi- aquellas pertenecientes al género Trichoderma y de la
madamente 40 cm de altura y 1 cm de DAC, que presen- especie Clonostachys rosea (= Gliocladium roseum)
taban buen estado sanitario. (cuadro 2). De las cepas ensayadas, 20 (28, 2% del
Los antagonistas fueron asperjados sobre el follaje de total) redujeron significativamente la colonización y
las plantas el 15 de mayo de 2004, a una concentración esporulación de B. cinerea, de las cuales el 60% pre-
de 107 conidios/mL, en tres oportunidades, a intervalos sentó IET menor a 2. Entre las cepas que evidenciaron
de 15 días. Adicionalmente, se realizaron dos aplicacio- mayor efecto inhibitorios sobre la esporulación de
nes 48 h antes que los antagonistas, con B. cinerea a 105 B. cinerea, tres pertenecieron a la especie C. rosea (A10,
conidios/mL, coincidiendo con la primera y segunda apli- A11, A32) con IET entre 1,0 y 1,37, y otras cuatro al
caciones de los antagonistas, con la finalidad de incre- género Trichoderma (A6, A27, A30 y A58) con IET
mentar y homogeneizar la presencia de inóculo del pató- entre 1,0 y 1,9 (cuadro 2).

129
BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

Cuadro 2. Esporulación de B. cinerea (IET) en discos de hojas de E. globulus tratados con 71 cepas de hongos antagonistas.
Botrytis cinerea colonization and sporulation (IET) in E. globulus leaf disks assays treated with antagonists fungi strains.

Ensayos
1 2 3 4 5 6 7
Cepa IET * Cepa IET Cepa IET Cepa IET Cepa IET Cepa IET Cepa IET
A1 1,65 A6 1,00 a A18 5,32 A23 4,80 bc A31 4,25 bcdef A45 3,03 abc A58 1,9 a
A2 4,22 ab A7 1,03 ab A21 5,80 A24 6,30 c A32 1,37 a A46 1,00 a A59 4,4 abc
A3 6,72 b A9 6,83 c A22 6,33 A25 4,53 bc A33 2,35 abc A47 6,22 d A60 6,6 de
A4 6,65 b A10 1,00 a C 6,88 A26 3,03 bc A34 4,17 cdef A48 4,92 cd A61 5,7 cd
A5 1,57 a A11 1,10 ab - - A27 1,37 a A35 5,62 f A49 3,20 bcd A62 6,4 de
C ** 4,73 ab A12 1,57 bc - - A28 1,37 a A36 4,75 ef A50 2,22 abc A63 7,0 e
- - A13 1,57 bc - - A29 1,98 ab A37 3,90 bcdef A51 1,40 ab A64 5,3 bcd
- - A14 1,57 bc - - A30 1,45 a A38 2,47 abcd A52 1,00 a A65 6,3 de
- - A15 1,57 bc - - C 5,3 bc A39 2,90 abcde A53 1,00 a A66 5,9 cde
- - C 4,73 c - - - - A40 4,58 def A54 5,32 cd A67 2,9 ab
- - - - - - - - A41 2,32 ab A55 4,92 cd A68 5,5 bcd
- - - - - - - - A42 2,93 abcde A56 5,10 cd A69 5,9 cde
- - - - - - - - A43 4,80 ef A57 3,10 bcd A70 5,5 bcd
- - - - - - - - A44 5,53 f C 3,3 bcd A71 4,6 abc
- - - - - - - - C 6,3 f - - C 6,7 de
* Índice de esporulación por tratamiento.
** Control, sólo aplicación de B. cinerea.
Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas (P< 0,05).

También se constató que otros tipos de hongos como Cuadro 3. Efecto de los antagonistas seleccionados en la supresión
Cladosporium sp. (A28) y Penicillium spp. (A7, A46, de B. cinerea sobre en discos de hojas de E. globulus, aplicados
A52, A53) presentaron altos niveles de inhibición del antes y después del patógeno.
Antagonist and fungicide effect in B. cinerea suppression
patógeno, con IET entre 1,0 y 1,03. De las restantes ce-
on E. globulus leaf disks assays.
pas que presentaron efecto significativo en la supresión
de B. cinerea (A33, A38, A39, A41, A42, A59, A67 y
Aplicación antagonista*
A71) correspondieron a hongos demateáceos y coelomi-
Tratamiento Antes Después
cetes no identificados, todas con IET mayor a 2,32. Tan-
to las cepas de Cladosporium, Penicillium, como aque- IET Rango IET Rango
llas no identificadas, fueron descartadas de los ensayos Trichoderma (A6) 1,13a 1,0 - 1,5 1,98b 1,8-2,2
de supresión posteriores, por razones que se señalan en Clonostachys (A10) 1,13a 1,0-1,5 1,20a 1,0-1,6
la discusión. Clonostachys (A11) 1,12a 1,0-1,3 1,17a 1,0-1,5
Clonostachys (A14) 1,37a 1,2-1,6 1,20a 1,0-1,6
Efecto de los antagonistas seleccionados en la supresión Trichoderma (A27) 1,38a 1,2-1,6 1,25a 1,0-1,5
de B. cinerea, aplicados antes y después del patógeno. Trichoderma (A30) 1,41a 1,1-1,7 1,88b 1,8-2,0
Todas las cepas de antagonistas redujeron significativa- Clonostachys (A32) 1,19a 1,0-1,7 1,05a 1,0-1,1
mente la esporulación de B. cinerea, presentando resulta- Trichoderma (A58) 1,73b 1,1-2,4 1,90b 1,8-2,0
dos semejantes a los obtenidos en el ensayo de selección B. cinerea 6,35c 5,7-7,0 4,6c 4,5-4,8
in vitro (cuadro 3).
Tanto cuando los antagonistas se aplicaron en forma * Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas
previa al patógeno como posterior, se obtuvo reducción (P < 0,05).
de la esporulación de B. cinerea.
En el primer caso, la esporulación de B. cinerea
(IET) fue cercana a 1 para los tratamientos con las ce- dos en el ensayo de selección, las cepas A6, A10, A11
pas antagonistas A6, A10, A11 y A32 (IET 1,12 a 1,19), y A27 presentaron una leve disminución en la eficien-
indicando que prácticamente se inhibió casi por com- cia en la supresión de la esporulación, contrariamente
pleto la colonización y esporulación del patógeno en las cepas A14, A30, A32 y A58 aumentaron la eficien-
los discos de hojas. En relación a los resultados obteni- cia en control.

130
 BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

En el segundo caso, todos los antagonistas fueron Cuadro 5. Efecto de antagonistas y fungicidas sobre B. cinerea
capaces de reducir la esporulación del patógeno, presen- en plantas de P. radiata, ensayo vivero Carlos Douglas.
tando diferencias significativas con el tratamiento con- Antagonist and fungicide effect against B. cinerea in
trol (cuadro 3). Al igual que en el caso anterior, se verifi- P. radiata plants, Carlos Douglas nursery assay.
có una disminución en la efectividad de algunas cepas en
el control de B. cinerea, con respecto al ensayo de selec- IP
Tratamientos IET Rango
ción, en cambio las cepas de Clonostachys A14 y A32 y B. cinerea(%)***
Trichoderma A27 aumentaron levemente el nivel de con- Switch-Sumisclex 1,07 a* 1,06-1,07 15,8 (77,8)
trol del patógeno. Clonostachys (A10) 1,21 b 1,05-1,30 42,6 (40,3)
Clonostachys (A11) 1,29 bc 1,19-1,36 55,4 (22,3)
Efecto de los antagonistas en el control de B. cinerea en Trichoderma (A27) 1,37 c 1,24-1,54 64,6 (9,4)
ensayos sobre E. globulus en vivero. En el ensayo de an- Trichoderma (A6) 1,43 c 1,34-1,50 71,9 (- 0,8)
tagonistas sobre E. globulus todas las cepas de hongos B. cinerea (**) 1,37 c 1,28-1,51 71,3
antagonistas fueron capaces de controlar B. cinerea (cua- * Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas
dro 4), presentando diferencias significativas con el con- (P < 0,05).
trol. Los mejores resultados se obtuvieron con las cepas ** Sólo aplicación de B. cinerea.
*** Porcentaje de control en relación al tratamiento con B. cinerea.
Clonostachys A10, A11 y Trichoderma A27, todas con
IET ≤ 1,3 y reducción en la incidencia mayor o igual a
85%, verificándose el potencial de estos antagonistas para el trol del patógeno, presentando IET inferior a 1,7 y una
control de B. cinerea, y superando al tratamiento con fungi- reducción de la incidencia entre 75 y 90%.
cida, el cual no tuvo efecto sobre el patógeno (cuadro 4).
Se observó esporulación sobre el tallo de las plantas Efecto de los antagonistas en el control de B. cinerea
tanto de los antagonistas como del patógeno, y en hojas en ensayos sobre P. radiata en vivero. En el ensayo de
sólo se constató esporulación de los antagonistas. Además, antagonistas sobre P. radiata la aplicación de los fungi-
se detectó ocasionalmente la presencia en las hojas de cidas redujo significativamente el índice de esporula-
otros hongos, como Pestalotiopsis spp. y Penicillium spp. ción de B. cinerea (IET 1,07), obteniendo un nivel de
Estos resultados son comparables con los obtenidos control de 77,8%. Clonostachys A10, también fue ca-
en los ensayos in vitro, referentes a la efectividad de los paz de controlar el (IET 1,21), aunque el resultado fue
antagonistas en la supresión de la esporulación de
inferior al tratamiento con fungicidas. Las cepas de Tri-
B. cinerea. En este ensayo, los antagonistas A6, A10,
choderma A6 y A27 y Clonostachys A11 no tuvieron
A11, A14, A27, A30 y A32 fueron eficientes en el con-
efecto en la reducción del patógeno, con una incidencia
que fluctuó entre 55,4% y 71,9% (cuadro 5).
Cuadro 4. Efecto de los antagonistas y fungicidas sobre B. cinerea,
En relación a la severidad, expresada como propor-
en plantas de E. globulus, en ensayo de invernadero Biocaf. ción del tejido foliar con esporulación de B. cinerea, las
Antagonist and fungicide effect against B. cinerea on tendencias fueron semejantes a los resultados de inci-
E. globulus plants, Biocaf nursery assay. dencia, sólo detectándose una reducción significativa
en la severidad con la aplicación de fungicidas y Clo-
IP nostachys A10, en relación al control (cuadro 6). Espe-
Tratamiento IET Rango
B. cinerea (%)*** cíficamente, se observaron diferencias significativas en
Trichoderma (A6) 1,7 a* 1,3-2,2 20,8 (75) el tercio superior de la planta sólo en el caso del fungi-
Clonostachys (A10) 1,3 a 1,0-1,7 12,5 (85) cida y Clonostachys A10. En el tercio medio, los anta-
Clonostachys (A11) 1,3 a 1,0-1,7 8,3 (90) gonistas Clonostachys A10 y A11 presentaron diferen-
Clonostachys (A14) 1,5 a 1,3-2,0 16,7 (80) cias significativas con el control, aunque fueron
Trichoderma (A27) 1,2 a 1,0-1,7 8,3 (90) inferiores al fungicida. En el tercio inferior, todos pre-
Trichoderma (A30) 1,5 a 1,2-2,0 20,8 (75) sentan diferencia significativa con el control y los anta-
Clonostachys (A32) 1,4 a 1,3-1,7 12,5 (85) gonistas Clonostachys A10 y Trichoderma A27 tuvie-
Trichoderma (A58) 2,0 b 1,7-2,5 45,8 (45) ron un efecto semejante al fungicida.
Teldor 50% WP 4,7 c 4,5-4,8 75,0 (10) Los resultados obtenidos en los ensayos fueron se-
B. cinerea (**) 4,8 c 4,8-4,8 83,3 mejantes a los obtenidos en los ensayos de selección in
vitro, referente a la efectividad de los antagonistas en la
* Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas supresión de la esporulación del patógeno, en donde los
(P < 0,05)
** Sólo aplicación de B. cinerea (control). antagonistas A10 y A11 fueron los más consistentes en
*** Porcentaje de control en relación al tratamiento con B. cinerea el control del patógeno.

131
BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

Cuadro 6. Índice de esporulación de B. cinerea (SE), en tercio superior, medio e inferior en plantas de
P. radiata, ensayo vivero Carlos Douglas.
Botrytis cinerea sporulation index (SE), in third up, middle and lower P. radiata plants, Carlos Douglas
nursery assay.

Esporulación de B. cinerea
Tratamientos Superior Medio Inferior
IET Rango IET Rango IET Rango
Switch-Sumisclex 1,10 a* 1,07-1,15 1,05 a 1,02-1,08 1,05 a 1,05-1,08
Clonostachys (A10) 1,40 b 1,10-1,72 1,16 b 1,05-1,31 1,07 a 1,00-1,16
Clonostachys (A11) 1,54 c 1,42-1,67 1,17 b 1,08-1,33 1,16 b 1,02-1,25
Trichoderma (A27) 1,69 c 1,41-1,91 1,30 c 1,08-1,56 1,11 a 1,08-1,16
Trichoderma (A6) 1,66 c 1,52-1,88 1,41 c 1,35-1,45 1,21 b 1,11-1,32
Control (**) 1,55 c 1,42-1,83 1,25 c 1,12-1,40 1,32 c 1,28-1,38

* Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas (P < 0,05).

** Sólo aplicación de B. cinerea.

DISCUSIÓN Eucalyptus (Ferreira 1989) y algunas coníferas (Smith et

al. 1992). En cuanto a cepas de Penicillium que mostra-
Desde el filoplano de plantas de E. globulus y ron eficiencia en el control in vitro contra B. cinerea,
P. radiata en vivero, fue obtenido un total 144 cepas de algunas especies pueden ocasionar importantes proble-
hongos, de las cuales cerca del 50% fueron ensayadas mas en poscosecha, provocando pérdidas por pudrición
contra B. cinerea. De estas el 26,8% presentó los mayo- en frutas y bulbos (Elad et al. 1994, Smith et al. 1992,
res niveles de control, con esporulación del patógeno Sutton y Peng 1993). Debido a que estos hongos son
menor a 25% (IET ≤ 2), seleccionándose ocho cepas, potenciales patógenos en otros cultivos, fueron descarta-
pertenecientes a los géneros Clonostachys y Trichoder- dos para los ensayos siguientes, a pesar de los buenos
ma (cuadro 2), que incluyen especies ampliamente cita- niveles de control alcanzados.
das como antagonistas para el control de B. cinerea (San- Las cepas antagonistas Trichoderma (A6, A27, A30,
fuentes y Ferreira 1997, Peng y Sutton 1991, Swadling y A58) y Clonostachys (A10, A11, A14 y A30) fueron
Jeffries 1995, Elad et al. 1996). capaces de reducir la esporulación de B. cinerea, en to-
Los hongos potenciales antagonistas fueron aislados dos los ensayos de selección in vitro. Los resultados fue-
desde tallos y hojas de E. globulus y acículas de P. ra- ron comparables a los obtenidos por Peng y Sutton (1991),
diata, para aumentar la probabilidad de obtener cepas Köhl et al. (1994) y Zhang et al. (1994) en ensayos
compatibles con el huésped y de esta forma incrementar similares, con niveles de supresión del patógeno para
la posibilidad de éxito en el biocontrol de B. cinerea. En cepas de estos géneros entre 53 y 75%, indicando el
este sentido, se ha planteado que el lugar más apropiado potencial de los hongos ensayados para reducir la enfer-
para la obtención de antagonistas es el propio hospedero medad en condiciones de campo.
o del mismo ambiente donde será utilizado (Peng y En el ensayo realizado in vitro, que consideró previa
Sutton 1991, Bettiol 1991). Peng y Sutton (1991), Elad aplicación del patógeno (24 h antes), se ratificó la efec-
et al. (1996) y Sanfuentes y Ferreira (1997) utilizaron un tividad de los agentes en el control de B. cinerea (cua-
método semejante en la selección de antagonistas y cons- dro 3). Los antagonistas al reducir la colonización y es-
tataron la existencia de microorganismos en el filoplano porulación del patógeno en estas condiciones permiten
de diversas plantas, capaces de competir con B. cinerea, predecir que estos hongos poseen una rápida germina-
obteniendo elevados niveles de control. ción e inician la actividad antagónica oportunamente (Su-
Entre las cepas de hongos que ejercieron control so- tton y Peng 1993).
bre B. cinerea (IET < 2), algunas poseen antecedentes de La aplicación de este método in vitro de selección de
ser patógenos sobre especies vegetales. Cladosporium spp. antagonistas a B. cinerea ha proporcionado una confiable
es un hongo común en el aire y que se ha detectado sobre indicación de la actividad de supresión de los organis-
especies frutales y ornamentales, produciendo manchas mos en condiciones de campo (Peng y Sutton 1991), lo
foliares, o como hiperparásito sobre tumores ocasionados que fue confirmado con los ensayos realizados en vive-
en las plantas por otros patógenos (Ferreira 1989, Elad ros forestales en esta investigación.
1996, Smith et al. 1992). Pestalotiopsis es conocido como En el ensayo realizado con E. globulus en vivero, la
patógeno débil, que afecta a hospederos debilitados, el presencia de Clonostachys y Trichoderma sobre la super-
que ha sido observado en vivero provocando daño sobre ficie foliar de las plantas confirma que ambos hongos

132
 BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

son capaces de permanecer por un tiempo determinado y De acuerdo a los dos ensayos de vivero, el control
competir con otros microorganismos habitantes naturales químico, si bien es cierto es una buena alternativa, no fue
del filoplano, atributo importante para la efectividad de completamente eficiente, ya que en ambos casos existió
antagonistas para el control de B. cinerea. La capacidad una incidencia del patógeno no aceptable para la empre-
de los antagonistas de permanecer viables durante perío- sa (cuadros 4 y 5).
dos secos, y colonizar el sustrato rápidamente, es carac- En el ensayo en E. globulus, las cepas de Clonosta-
terística de un antagonista adaptado al nicho de un tejido chys y Trichoderma fueron más efectivas que el fungici-
necrótico (Köhl et al. 1994, Zhang et al. 1994). da aplicado. Este comportamiento no ocurrió en el ensa-
En este ensayo, las cepas de Clonostachys y Tricho- yo en P. radiata, donde los fungicidas sistémicos
derma redujeron la incidencia del patógeno entre 45-90% cyprodinil+fludioxonil (Switch) y procymidona (Sumis-
y superando la eficiencia del fungicida. Peng y Sutton clex) fueron superiores a los antagonistas. Estos productos
(1991, 1993) obtuvieron resultados semejantes en ensa- son eficientes para controlar B. cinerea durante los proce-
yos de campo, donde T. viride y C. rosea fueron capaces sos de germinación de conidias en la superficie de las
de suprimir B. cinerea, superando a los fungicidas, al- hojas, penetración y colonización, pero su efecto es res-
canzando incluso 100% de control con la aplicación de tringido en tejidos necrosados de la planta (Cabral y Ca-
C. rosea. Los resultados obtenidos en E. globulus (cua- bral 1995). Los resultados variables obtenidos con los fun-
dro 5), referente a la superioridad de los antagonistas con gicidas auguran algunas de las ventajas que presenta el
respecto al fungicida, ha sido verificada en otras investi- control biológico sobre el químico. Por otro lado, el efecto
gaciones y es considerado una evidencia para un even- de los antagonistas sobre B. cinerea puede ser directo,
tual desarrollo comercial del producto. Köhl et al. (1994), creciendo sobre él, incluso después de la formación de
aplicando Daconil M (clorothalonil + maneb), detectaron estructuras reproductivas y de protección, inhibiendo la
que este fungicida no fue capaz de disminuir la esporula- actividad del patógeno, como también estimulando res-
ción del patógeno. Swadling y Jeffries (1995), utilizando puestas de resistencia en la planta (Elad et al. 1998).
cepas de Trichoderma sp., fueron tan efectivos como el Los resultados de este estudio demuestran que la apli-
fungicida diclofluanid, en el control del patógeno en fru- cación de cepas de antagonistas seleccionadas, especial-
tillas. Peng y Sutton (1990) citado por Zhang et al. (1996) mente de Clonostachys, tienen efecto en el control de
determinaron que cepas de C. rosea y T. viride fueron B. cinerea, y proporcionaron antecedentes en relación a
más efectivos que el fungicida Captan en la reducción de la relativa capacidad de estas cepas en la supresión del
la pudrición de tomates y habas, tanto en ensayos de patógeno, tanto in vitro como en los ensayos in vivo.
laboratorio como de invernadero.
En P. radiata, la cepa de Clonostachys A10 redujo
significativamente la incidencia y la severidad del “moho AGRADECIMIENTOS
gris”, aunque logrando un nivel de control que puede
considerarse sólo como moderado (40,3%). Este resulta- A la empresa Forestal Mininco S.A. por el financia-
do, no completamente satisfactorio, puede ser explicado miento para desarrollar esta investigación y las facilidades
en parte por el efecto de ciertos factores como: ambien- otorgadas por personal del vivero “Carlos Douglas”. A la
tes extremadamente favorables para el desarrollo de la empresa Biocaf por facilitar su infraestructura para ensayos.
enfermedad, alta población del patógeno (105 conidias/ml)
y, además, de algunos daños en la región apical de las
plantas. De esta forma, al aumentar la cantidad del anta- REFERENCIAS
gonista en relación a la población natural del patógeno,
mayor periodicidad de las aplicaciones y determinar el Barnes S, M Shaw. 2003. Infection of Commercial Hybrid Primu-
momento oportuno de establecer los antagonistas, es po- la Seed by Botrytis cinerea and Latent Disease Spread
sible aumentar las posibilidades de un control exitoso. Through the Plants. Phytopathology 93(5):573-578.
No es posible realizar mayores comparaciones entre Bettiol W. 1991. Seleção de microrganismos antagõnicos a fito-
los resultados obtenidos en los ensayos de invernadero, patógenos. In Bettiol W ed. Controle Biológico de Do-
ya que existieron diferencias metodológicas entre estos. enças de plantas. Brasilia, Brasil. EMBRAPA-CNPDA.
Sin embargo, el mayor periodo de tiempo comprendido 388 p.
Butin H, H Peredo. 1986. Hongos parásitos en coníferas de
entre la aplicación del patógeno y de los antagonistas
América del Sur con especial referencia a Chile. Berlin-
(48 h), en el caso del ensayo en P. radiata, pudiera ser
Stuttgart, Alemania. Biblioteca Mycológica. 100 p.
un factor que determinó el menor efecto de los antago- Cabral S, J Cabral. 1995. The fungistatic and fungicidal activi-
nistas en el control de la enfermedad. Es conocido que ty of vinclozolin against Botrytis cinerea. Mycological
la germinación de las conidias de B. cinerea es muy Research 99(9):1041-1046.
rápida, bajo condiciones ideales de temperatura y hu- Chaves N, A Wang. 2004. Combate del Moho Gris (Botrytis
medad, al igual que la penetración e infección (Peng y cinerea) de la Fresa mediante Gliocladium roseum. Agro-
Sutton 1991, 1993). nomía Costarricense 28(2):73-85.

133
BOSQUE 27(2): 126-134, 2006
Control biológico de Botrytis cinerea

Cole M., T Wiechel, M Warren, R Holmes. 2004. Ensuring tion of Botrytis cinerea on Dead Lily leaves Exposed to
Optimal Quality Through Management Strategies For Field Conditions, DLO Research Institute for plant Pro-
Botrytis cinerea. Department of Primary Industries. Mo- tection. Phytopathology 84(4):393-401.
nash University. Australian Government. 66 p. Pande S, G Singh, J Narayana, M Bakr, P Chaurasia, S Joshi,
Coley-Smith J, K Verhoeff, W. Jarvis. 1980. The biology of C Johansen, S Singh, J Kumar, M Rahman y C Gowda.
Botrytis. London, England. Academic Press. 318 p. 2001. Integrated Management of Botrytis Gray Mold of
Elad Y, B Kirshner, N Yehuda, A Sztejberg. 1998. manage- Chickpea. India: International Crops Research Institute
ment of powdery mildew and gray mold of cucumber by for the Semi-Arid Tropics. 32 p.
Trichoderma harzianum T 39 and Ampelomyces quisqua- Peng G, J Sutton. 1991. Evaluation of microorganisms for bio-
lis. BioControl 43:241-245. control of Botrytis cinerea in Strawberry. Can. J. Plant
Elad Y, G Zimand. 1991. Experience in integrated chemical– Path. 13:247-257.
biological control of grey mould (Botrytis cinerea). Contri- Sanfuentes E, F Ferreira. 1997 Avaliação de fungos para bio-
bution from the Agricultural Research Organization. Agri- controle de Botrytis cinerea em viveiros suspensos de
culture Volcanic Center. Bet Dagan, Israel 3274:195-199. eucalipto. Revista Árvore 21(1):147-153.
Elad Y, J Köhl, N Fokkema. 1994. Control of infection and Sharabani D, D Shtienberg, Y Elad, A. Dinoor. 1999. Epidemio-
sporulation of Botrytis cinerea on bean and tomato by logy of Botrytis cinerea in Sweet Basil and Implications
saprophytic bacteria and fungi. European J. Plant Path. for Disease Management. Plant Disease. 83(6):554-560.
100:315-336. Smith I, J Dunez, D Phillips, R Lelliott, S Archer. 1992. Ma-
Elad Y, N Malanthrakis, A Dik. 1996. Biological control of nual de Enfermedades de las Plantas. Madrid, España.
Botrytis - incited diseases and powdery mildews in green- Ediciones Mundi-Prensa. 671 p.
house crops. Crop Protection 15(3):229-240. Sutton J, G Peng. 1993. Biocontrol of Botrytis cinerea in straw-
Elad Y. 1996. Microbial Suppression of infection by foliar berry leaves. Phytopathology 83:615-621.
plant pathogens. The European Foundation for Plant Pa- Swadling I, P Jeffries. 1995. Isolation of Microbial Antago-
thology Working Group on Biological Control. Bulletin nists for Biocontrol Of Grey Mould Disease Of Strawbe-
OILB/SROP 16(11):3-7. rries. Biocontrol Science and Technology 6:125-136.
Esterio M, J Auger. 1997. Botrytis: nuevas estrategias de con- Yu H, J Sutton. 1997. Morphological development and interac-
trol cultural, biológico y químico en uva de mesa. Santia- tions of Gliocladium roseum and Botrytis cinerea in ras-
go, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias pberry. Can. J. Plant Path. 19:237-246.
Agrarias y Forestales, Departamento de Sanidad Vegetal. Yu H, J Sutton. 1999. Density dynamic of Gliocladium roseum
125 p. in relation to biological control of Botrytis cinerea in red
Ferreira F. 1989. Patología Florestal. Principias Doenças Flo- raspberry. Can. J. Plant Path. 21:23-32.
restais no Brasil. Viçosa, Brasil. Sociedade de Investi- Zhang P, J Sutton W Tan, A Hopkins. 1996. Gliocladium ro-
gações Florestais. 570 p. seum reduces physiological changes associated with in-
Figueredo A, C García, A Grigoletti. 2001. Doenças do euca- fection of black spruce seedlings by Botrytis cinerea. Can.
lipto no sul do Brasil: identificação e controle. 18 p. J. Plant Path. 18:7-13.
(Circular Técnica Nº 45 Embrapa). Zhang P, J Sutton, A Hopkins. 1994. Evaluation of microorga-
Köhl J, W Molhoek, C Van Der Plas, N Fokkema. 1994. Effect nisms for biocontrol of Botrytis cinerea in container- grown
of Ulocladium atrum and other Antagonists on Sporula- black spruce seedlings. Can. J. For. Res. 24:1312-1316.

Recibido: 05.09.05
Aceptado: 31.07.06

134