medigraphic Artemisa
Revista Odontológica Mexicana
Vol. 10, Núm. 2
Facultad de Odontología
Junio 2006
pp 63-68
TRABAJO ORIGINAL
Evaluación in vitro de la citotoxicidad de tres selladores endodóncicos
sobre fibroblastos de ratón de la línea celular L929
Magnolia Peralta Pérez,* Eileen Uribe Querol,§ Raúl Luis García Aranda,II G Gutiérrez Opsina¶
RESUMEN
ABSTRACT
Los selladores endodóncicos pueden causar citotoxicidad en los
tejidos periapicales después de un tratamiento de conductos. En
general, las pruebas de biocompatibilidad in vitro realizadas a los
selladores evalúan su citotoxicidad cuando éstos ya endurecieron, lo que limita la evaluación de sus efectos durante la aplicación aguda; condición observada en la clínica. En el presente trabajo se evaluó la citotoxicidad de tres selladores: AH-Plus,
RoekoSealAutomix® (RSA) y Roth Root utilizando un dispositivo
que permite evaluar los efectos de los selladores durante su fase
de polimerización. Cultivos de fibroblastos murinos fueron expuestos a los distintos selladores durante 6, 12, 24, 36, 48 y 72
horas. Después de cada periodo de tiempo se evaluó la morfología celular por microscopia de luz y la viabilidad mediante la prueba de exclusión del azul tripano. La morfología de fibroblastos expuestos al RSA no se altera. Sin embargo, al exponerlos a los
otros dos selladores la mayor parte de los fibroblastos se despegan después de las primeras 6 horas. El ensayo de viabilidad
muestra que el número de fibroblastos fue muy parecido entre el
grupo control y el grupo expuesto a RSA a lo largo del curso temporal. En contraste, la muerte de fibroblastos es evidente desde
las primeras 6 horas de exposición al AH-Plus y al Roth Root.
En conclusión, debido a que el RSA no mostró citotoxicidad, parece que los selladores con base de silicona constituyen la primera
elección para el tratamiento de conductos.
Endodotic sealers may cause periapical tissue cytotoxicyty following root canal treatments. In general, in vitro biocompatibility
tests evaluate the cytotoxicity of sealers long after they have
hardened. Hence, in this study we evaluated the acute effects of
three sealers: AH-Plus, RoekoSealAutomix ® (RSA) y RothRoot using a pore membrane system where the sealers are
placed on top just after mixing. Mouse fibroblast cultures were
exposed for 6, 12, 24, 36, 48 y 72 hours to the sealers described above. After each period, the morphology and viability of
fibroblasts were evaluated. There were no differences in morphology between cells exposed to RSA and control conditions.
Fibroblasts exposed to the other two sealers detached from the
culture dish, lost their flame-like morphology and appeared
rounded. The number of cells in cultures exposed to RSA was
similar to that of the control cultures. In contrast, fibroblast exposed to the other two sealers died after 6 hours of culture. In
conclusion, because RSA essentially showed no cytotoxicyty, it
appears that silicon-based sealers are the best options for treating root canals.
Palabras clave: Cultivo celular, azul trípano, Roth Root, AH-Plus, RoekoSealAutomix®.
Key words: Cell culture, tripan blue, Roth Root, AH-Plus, RoekoSealAutomix®.
INTRODUCCIÓN
En el tratamiento odontológico, la terapia de conductos radiculares (i.e., endodoncia) es uno de los
procedimientos más empleados para conservar los
dientes que en otro caso se perderían. La endodoncia
tiene como objetivo eliminar el tejido pulpar (para detener el dolor) y las bacterias (para evitar que invadan
los tejidos periapicales) del conducto. Además, permite ampliar el conducto, desde la región apical hasta la
coronal para obtener una cavidad de forma cónica limpia y de fácil obturación.1,2
La obturación es el relleno tridimensional de todo el
conducto radicular. Este relleno se coloca lo más cercano al límite de la unión cemento-dentinaria. Los materiales que se usan para la obturación son esencial-
mente la gutapercha, que tiene biotolerancia comprobada3,4 y los selladores.
Los selladores son sustancias que idealmente facilitan la obtención de un sellado hermético.1 Se clasifi-
*
Alumna de la Especialidad de Endodoncia de la División de
Estudios de Posgrado e Investigación de la Facultad de
Odontología de la UNAM.
Profesora de Biología Celular y Molecular de la División de
Estudios de Posgrado e Investigación de la Facultad de
Odontología de la UNAM.
Profesor de la Especialidad de Endodoncia de la División de
Estudios de Posgrado e Investigación de la Facultad de
Odontología de la UNAM.
Investigador Titular A del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM.
edigraphic.com
§
II
¶
Peralta PM y cols. Evaluación in vitro de la citotoxicidad de tres selladores endodóncicos
64
can por sus constituyentes en tres :rop
grupos
odarobale
principales:
FDP
1) con base de óxido de zinc-eugenol (ZnOE), 2) plásticos (e.g.,resinas epóxicas,
VC ed AS, siliconas)
cidemihparG
y 3) aquéllos
cuyo componente principal es el hidróxido de calcio.1,5
arap
Debido al estrecho contacto entre los
selladores y
los tejidos perirradiculares, y a que se sabe que se liacidémoiB
arutaretiL
:cihpargideM
beran sus
subproductos
a través
del foramen apical
antes y después de su endurecimiento, es necesario
sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
conocer el grado de citotoxicidad que presentan. En la
especificación #41-1982 de la American National Standards Institute/American Dental Association (ANSI/
ADA)6 sobre la biocompatibilidad de materiales dentales, se establecen los parámetros necesarios para que
los especialistas comparen y elijan sus materiales
dentales. La toxicidad de un material se determina en
general, utilizando un sistema de tres pasos. Primero
se evalúa su citotoxicidad in vitro. El segundo paso
es la implantación subcutánea o intraósea del material
para evaluar la reacción tisular local. El tercer paso
consiste en evaluar la reacción in vivo entre el tejido y
el sellador, en animales y en humanos.7,8 Las pruebas
in vitro son el primer paso para establecer la biocompatibilidad. En estas pruebas se emplean preferentemente fibroblastos de líneas celulares tumorales9,10 y
se estudian los efectos tóxicos de los selladores a largo plazo; es decir, con los selladores endurecidos.
Consideramos que es de innegable importancia conocer los efectos agudos de los selladores. En este
trabajo se cultivaron fibroblastos de la línea celular
L929 y se expusieron a tres diferentes selladores: AHPlus, RoekoSeal Automix (RSA) y Roth Root. Los
selladores se colocaron utilizando un sistema que evita el contacto directo del sellador con el cultivo y permite evaluar los efectos citotóxicos de manera más
aproximada a las condiciones utilizadas en clínica.
tos
fue resuspendido en 5 mL de medio fresco. Se
sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
sembraron
200 µL de esta suspensión y los cultivos
cihpargidemedodabor
fueron mantenidos en un incubador (NuaireTM) a 37°C
y 5% de CO2.
Para los experimentos, los fibroblastos se sembraron a una concentración de 30,000 fibroblastos/pozo
en cajas de cultivo de 24 pozos (Conring, New York,
NY) en un volumen final de 300 µL de medio. Los cultivos se incubaron toda la noche para permitir que los
fibroblastos se adhirieran a los pozos. Los selladores
fueron colocados en los cultivos 24 horas después.
Todos los experimentos se realizaron entre la resiembra 3 y la 16.
Preparación y colocación de los selladores
Los selladores RoekoSeal Automix (RSA), AHPlus (DENTSPLY, DeTrey) y Roth Root (Roth Internacional) fueron mezclados según las instrucciones
del fabricante. Posteriormente se colocó una gota en
la parte central de insertos (dispositivos de plástico
con membranas porosas de 0.4 µm Millicell Millipore;
Figura 1).
Los insertos fueron colocados en los cultivos y fueron retirados pasadas 6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas de
exposición a los selladores.
Todos los procedimientos se realizaron bajo condiciones estériles.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo celular
Para el cultivo celular se emplearon fibroblastos de
ratón de la línea celular L929. Los fibroblastos fueron
cultivados en medio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM; GIBCO, Grand Island, NY; suplementado con:
10% de suero fetal bovino (GIBCO), 8mM de L-glutamina (GIBCO) y penicilina/estreptomicina (50,000 unidades/mL 50,000 µg/mL respectivamente; GIBCO).
Los cultivos entre 80-90% de confluencia fueron
despegados con 5 mL de tripsina/EDTA (150 µM/318 µM;
GIBCO) durante 5 minutos. La tripsina fue neutralizada con un volumen igual de medio fresco. La suspensión celular fue centrifugada 2 minutos a 1,500 rpm; el
sobrenadante fue desechado y el botón de fibroblas-
edigraphic.com
Figura 1. Colocación de insertos de plástico en cajas de
cultivo de 24 pozos.
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MG
65
prueba de exclusión del azul trípano. El azul trípano
es un colorante supravital que se incorpora a las células muertas.
Los fibroblastos de cada condición experimental
fueron despegados con 200 µL de tripsina/EDTA por
pozo, neutralizada con medio fresco, centrifugados a
14,000 rpm durante un minuto y resuspendidos nuevamente en 200 µL de medio. En cada caso se tomaron
100 µL de muestra, 250 µL de azul trípano al 0.4%
(Sigma, St. Louis, MO, USA) y 150 µL de solución balanceada de sales de Hank´s (HBSS; GIBCO, Grand
Island, NY). Las suspensiones celulares se contaron
en hemocitómetros. El conteo se realizó según el protocolo antes descrito11 con un microscopio de luz
Morfología
Los cultivos fueron observados en un microscopio
esteroscópico (NikonTM) con un objetivo de proyección
de 16X. Se tomaron fotografías de los cultivos al momento de colocar los insertos (hora cero), y después de
cada uno de los tiempos y tratamientos usados. Se
evaluó la morfología celular y su adhesión en cada una
de las condiciones experimentales ensayadas.
Viabilidad celular
Un método ampliamente empleado para discernir
entre una célula viva y una muerta es el denominado
Hora 0
6 horas
72 horas
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
edigraphic.com
j)
k)
l)
Figura 2. Fotografías que muestran la morfología de los fibroblastos controles (a, b, c) y expuestos
a RSA (d, e, f), AH-Plus (g, h, i)
y Roth Root (j, k, l) a la hora 0, a
las 6 y a las 72 horas. Los fibroblastos tratados con RSA muestran una morfología normal, mientras que los tratados con los otros
dos selladores presentan una
morfología redondeada desde las
primeras 6 horas. Escala 30 µm.
Peralta PM y cols. Evaluación in vitro de la citotoxicidad de tres selladores endodóncicos
66
(NikonTM) a un aumento de 10x. Brevemente, se contabilizaron las células usando un contador manual en
cada una de las cuatro esquinas y en el cuadro central del hemocitómetro. El número de células por mililitro se determinó usando la siguiente fórmula.
Células/mL = Promedio del conteo por cuadro x factor
de dilución x 104
Total de células = Células/mL x volumen total original
de suspensión celular
Donde 104 es el volumen del factor de corrección
para el hemocitómetro: cada cámara es 1 x 1 mm y la
profundidad es 0.1 mm.
Estadística
Se determinaron las diferencias significativas entre
los grupos y los cursos temporales mediante un análisis de varianza y una prueba post hoc.
lento siendo esta diferencia significativa hasta las 72
horas (p < 0.001; Cuadro I). En contraste, los fibroblastos expuestos a AH-Plus y Roth Root no muestran indicios de crecimiento (p < 0.001 vs control desde las 6 horas; Cuadro I).
Viabilidad celular
La viabilidad que muestran los fibroblastos expuestos a RSA es comparable con la del grupo control hasta las 48 horas. Sin embargo, a las 72 horas
el número de fibroblastos vivos es menor (p < 0.001;
Figura 3). Esto no implica necesariamente que
haya muerte celular, sino más bien una detención
del crecimiento.
En el caso de los fibroblastos expuestos a AH-Plus
y Roth Root, se observa una disminución muy significativa en el número de fibroblastos vivos desde las primeras horas de incubación (p < 0.001 vs control desde las
6 horas; Figura 3).
RESULTADOS
Muerte celular
Morfología
Los fibroblastos control se adhieren al plato y adquieren una forma ahusada que se mantiene a lo largo
del curso temporal (desde las 6 y hasta las 72 horas).
La morfología de los fibroblastos en los cultivos expuestos a RSA es también ahusada y se conserva a
lo largo del tiempo (Figura 2). La mayor parte de los fibroblastos que fueron expuestos al AH-Plus y al Roth
Root perdieron su morfología desde las primeras 6 horas de exposición, se redondearon y despegaron del
pozo. Los fibroblastos que sobrevivieron se veían aún
adheridos al pozo pero su morfología era redondeada
(Figura 2).
Al cuantificar el número de fibroblastos muertos se
observó que el patrón de muerte a lo largo de las 72 horas es muy similar entre el grupo control y el expuesto
a RSA. En ambos grupos la cantidad de fibroblastos
muertos incrementa con el tiempo pero no existen diferencias significativas (Figura 4). Debe enfatizarse el hecho de que el número de fibroblastos muertos no excede del 15% en ambos grupos experimentales.
El conteo de fibroblastos muertos en aquellos cultivos expuestos AH-Plus y Roth-Root no se pudo realizar ya que estos selladores destruyen a las células.
DISCUSIÓN
En el presente estudio fueron evaluados tres selladores de conductos radiculares in vitro. Los materia-
Crecimiento celular
La curva crecimiento de los fibroblastos cultivados
en condiciones control muestra aumentos del 28%
para las 6 horas, del 40% para las 12, del 140% para
las 24 que llegan hasta un 316% para las 72 horas
(Cuadro I). Esto sugiere que los fibroblastos están dividiéndose sin llegar aún a la fase estacionaria de su
crecimiento.
Al comparar los porcentajes de crecimiento obtenidos con los diferentes selladores observamos que el
crecimiento de los fibroblastos tratados con RSA es
muy parecido al del grupo control hasta las doce horas. A partir de las 24 horas, sin embargo, el crecimiento celular en estos cultivos parece hacerse más
Cuadro I. Incremento en el número de fibroblastos, con
respecto a la hora 0, cultivados en condiciones control o
expuestos a RSA, AH-Plus o Roth-Root.
Control
RSA
28%
40%
140%
100%
260%
316%
28%
30%
82%
66%
160%
134%
edigraphic.com
6
12
24
36
48
72
horas
horas
horas
horas
horas
horas
AH-Plus Roth-Root
6.0%
2.6%
0.8%
0.0%
0.0%
0.0%
20.6%
6.0%
9.0%
3.0%
0.3%
0.0%
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MG
67
les usados fueron selladores a base de óxido de zinc
y eugenol (Roth-Root), resina epóxica (AH-Plus) y silicona (RSA).
Existen numerosos estudios in vitro que reportan la
citotoxicidad de materiales a base de óxido de zinc y
eugenol. Rappaport HM y cols, así como Nakamura H
y cols.12,13 reportaron que la citotoxicidad de estos selladores puede ser causada principalmente por el eu-
Viabilidad celular
250000
No. de células vivas
200000
150000
100000
50000
0
0
6
Control
12
24
36
Tiempo (h)
48
Ah-Plus
RSA
72
Roth
Figura 3. Gráfica que muestra el número de fibroblastos
vivos en los diferentes grupos experimentales a lo largo
del tiempo.
Muerte celular
60000
No. de células muertas
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
6
12
24
36
48
edigraphic.com
72
Tiempo (h)
Control
genol. Con respecto a la citotoxicidad AH-Plus se
ha demostrado que la muerte es causada por la liberación de formaldehído. 14 En todos estos estudios se
han utilizado los cementos ya endurecidos. En concordancia con lo reportado previamente12,14 nuestros
resultados muestran que los selladores AH-Plus y
Roth Root son citotóxicos para los fibroblastos.
El grado de citotoxicidad observado en nuestro estudio es mayor que el reportado en las investigaciones
previas. Esto pudiera deberse a la diferente forma utilizada para condicionar el medio con los selladores.15 En
algunos casos se emplean factores de dilución de los
selladores para lograr concentraciones parecidas a las
usadas en clínica, pero también usan selladores ya endurecidos. En otros casos se utilizan medios condicionados de los selladores y se prueba su citotoxicidad
sobre las células.16,17 En nuestro caso, se usó un sistema que permite evaluar los efectos de los selladores
desde que se mezclan y a lo largo de su endurecimiento. El tiempo de endurecimiento es un factor muy importante para evaluar la citotoxicidad, ya que los componentes que se pueden liberar al medio durante este
proceso parecen ser los más tóxicos [Roth-Roth (8
días) AH-Plus (8 horas) RSA (30 minutos)]. En el
caso del RSA el tiempo de endurecimiento es muy rápido y probablemente esto ayude a que no se liberen
componentes tóxicos por largo tiempo.
El RSA ha sido ampliamente estudiado en cuanto a
sus características físicas pero no en cuanto a su citotoxicidad. Se sugiere que debido a su rápida polimerización las sustancias de liberación secundarias son
mínimas y que su excelente sellado se debe a la expansión que sufre y no una contracción como otros y
por ello no es diluido.18,19 Gencoglu N, Turkmen C y
Ahiskali R20 lo compararon con el cemento de Grossman, en obturaciones con condensación lateral, y hallaron que el RSA sella significativamente mejor que el
Grossman. Genera una buena adhesión a la dentina y
a la gutapercha, y en conectivo de rata genera tejido
granulomatoso. En nuestro estudio el RSA no muestra
características tóxicas dado que el grado de muerte
celular observado no es diferente al del grupo control.
En cuanto al crecimiento celular sí existen diferencias
con respecto al control. Este hecho puede explicarse
por un efecto sobre el ciclo celular, haciendo más largo el periodo de división celular de los fibroblastos o
porque los fibroblastos presenten un envejecimiento
prematuro. En cualquiera de los casos se necesitarían
hacer estudios que lo comprobaran.
En conclusión debido a que el RSA no mostró citotoxicidad, parece que los selladores con base de silicona constituyen la primera elección para el tratamiento de conductos.
RSA
Figura 4. Gráfica que muestra la muerte de los fibroblastos control y el grupo experimental del RSA a lo largo del
tiempo.
Peralta PM y cols. Evaluación in vitro de la citotoxicidad de tres selladores endodóncicos
68
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Dr. Higinio Arzate y a
Eduardo Martínez por su apoyo académico y técnico.
El proyecto se realizó con apoyo financiero obtenido
del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(38615N) y de la Dirección General de Asuntos del
Personal Académico (UNAM, PAPIIT IN203702).
11.
12.
13.
14.
REFERENCIAS
15.
1.
Schwarze T, Leeyhausen G, Geurtsen W. Long-term cytocompatibility of various endodontic sealers using a new root
canal model. J Endodon 2002; 28 (11): 749-753.
2. Pertot WJ, Stephan G, Tardieu C, Proust JP. Comparison of
the intraosseous biocompatibility of Dyract and Super EBA.
J Endodon 1997; 23: 315-9.
3. Nyguen TN. Obturation of root canal system. In Pathways of
the pulp. 5th ed. (eds. S. Cohen and Burns) C.V. Mosby Co.
St. Louis, MO. USA. 1991: 193.
4. Sjogren U, Sundqvist G, Nair PN. Tissue reaction to guttapercha particles of various sizes when implanted subcutaneously in guinea pigs. Eur J Oral Sci 1995; 103: 313-321.
5. Kamran E. Safavi DMD, Larz SW, Spangberg DDS, Ney S,
Costa George Sapounas DDS. An in vitro Method for Longitudinal Evaluation of Toxicity of Endodontic Sealers.
1989; 15: 484-6.
6. ANSI/ADA Specification 41 for biological evaluation of dental
materials. Approved January 4, 1982.
7. Osario RM, Fet A, Vertucci F, Shawley AL. Cytotoxicity of
endodontic materials. J Endodon 1998; 24: 91.
8. Vajrabhaya L, Sithisarn P. Multilayer and monolayer cell cultures in a cytotoxicity assay of root canal sealers. Int Endod
J 1997; 30: 141-4.
9. Huang FM, Tai KW, Chou MY, Chang YC. Cytotoxicity of resin-, zinc oxide-eugenol-, and calcium hydroxide- based root
canal sealers on human periodontal ligament cells and permanent V79 cells. Int Endod J 2002; 35: 153-168.
10. Koulaouzidou EA, Papazisis KT, Beltes P, Geromichalos
GD, Kortsaris AH. Cytotoxicity of three resin-based root ca-
16.
17.
18.
19.
20.
nal sealers: an in vitro evaluation. Endod Dent Traumatol
1998; 14: 182-185.
Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2: Assessment of
Cell Toxicity. Basic Protocol 1: Tripan Blue Uptake to Assess Viability.
Rappaport HM, Lilly GE, Kapsimalis P. Toxicity of endodontic filling materials. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol 1964;
8: 785-802.
Nakamura H, Matsumoto Y, Hirano S et al. Study on the
cytotoxicity of root canal filling materials. J Endodon 1986;
12: 156-160.
Cohen B, Pagnillo MK et al. An in vitro Study of the Cytotoxicity of Two Root Canal Sealers. J Endodon 2000; 26(4):
228-229.
Molina-Guarneros JA, García-Cuéllar G, Martínez-Valenzuela A, García-Mondragón MJ, Llamosas-Hernández E,
García-Aranda RL, Arzate H. Effects of six endodontic cements on the cells of the murine immune system in vitro.
Proc West Pharmacol Soc 1998; 41: 47-50.
Nasim GA, Mahnaz H, Zahra SB, Fazel S. In vitro cytotoxicity of a new epoxy resin root canal sealer. J Endodon 2000;
26(8): 462-465.
Schwarze T, Leyhausen G, Geurtsen W. Long-Term cytocompatibility of various endodontic sealers using a new root
canal model. J Endodon 2002; 28(11): 749-753.
Dartar MO, Yilmaz, Kalayci A, Zaímoglu L. A comparison of
the in vitro cytotoxicity of two root canal sealers. J Oral Rehab 2003; 30: 426-429.
Min-Kai W, Tigos E, Wesselink PR. An 18-month longitudinal
study on a new silicon-based sealer, RSA RoekoSeal: A
leakage study in vitro. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol
2002; 94: 499-502.
Gencoglu N, Turkmen C, Ahiskali R. A new silicon-based
root canal sealer (Roekoseal-Automix). J Oral Rehabil 2003;
30(70): 753-7.
Dirección para correspondencia:
Raúl Luis García Aranda
Coordinador del Área Clínica del Programa
de Maestría y Doctorado en Ciencias Médicas,
Odontológicas y de la Salud, UNAM
Tel: 5523-0115
Correo electrónico: rlga@servidor.unam.mx
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