Ciclul celular (ciclul de diviziune

celulară) = seria de evenimente care au loc în

celulă și care conduc la diviziunea și replicarea
ei.

Prin diviziune celulară, celula părinte se

împarte în celule - fiice.

asigură continuitatea reprezentanților

unei specii;
se adigură creșterea și dezvoltarea unui
organism;
se asigură repararea țesuturilor
afectate, şi reînnoirea celor îmbătrânite;
se asigură menținerea genomului
original al celulei.
 Momentul declanşării sau inhibării diviziunilor
este determinat de anumiţi factori:

 factori stimulatori: temperatură, hrană, substanţe

activatoare, starea de sănătate a celulelor;

 factori inhibitori: lumina, radiaţiile, frigul şi unele

substanţe chimice inhibitoare, care blochează
sinteza de ADN.
 Ciclul celular al eucariotelor se compune din:
 Interfază
 Diviziunea celulară propriu-zisă:
▪ Cariochineză = diviziunea nucleului
▪ Citochineză = diviziunea citoplasmei, organitelor
celulare și a membranei celulare
 După particularităţile de desfăşurare şi celulele care
rezultă în urma diviziunii, există două modalități de
cariochineză:
 Mitoza prezentă numai în celulele somatice =
procesul de diviziune celulară prin care celula-mamă
se divide în două celule-fiice identice din punct de
vedere genetic .
 cromozomii din nucleul celulei-mame se împart în două
seturi indentice în nucleii celulelor-fiice.

 Meioza prezentă numai în celulele sexuale = procesul

de diviziune celulară prin care celula-mamă se divide
în patru celule-fiice – acestea au însă numai jumătate
din numărul de cromozomi ai celulei-mamă.
 Majoritatea celulelor își asigură diviziunea celulară și distribuirea materialului
genetic în celulele fiice printr-un proces denumit mitoză.
 Este un proces complex și extrem de bine organizat, etapizat, trecerea la etapa
următoare fiind dependentă de finalizarea celei precedente.
 Mitoza reprezintă faza M a ciclului mitotic.
 reprezintă circa 10% din ciclul celular.
 Procesul mitotic este divizat în
mod convențional în 4 etape
majore:

 Profaza
 Metafaza
 Anafaza
 Telofaza

 Între 2 diviziuni mitotice,

celula se găsește în perioada
denumită interfază.
 Perioada de acumulare a produşilor
care vor fi folosiţi în diviziune.
 Interfaza se distinge printr-o intensă
activitate de sinteză, tradusă prin
creșterea cantității de ARN, creșterea
cantității de proteine enzimatice și
neenzimatice și prin replicarea
cromozomilor.
 Durata ei și a fiecăreia dintre etapele ei
variază în funcție de tipul celulei – cele
mai multe celule petrec în interfază
circa 20 de ore, adică aproximativ 90%
din timpul total al diviziunii celulare.
 Cz sunt alungiți, filamentoşi, formând
cromatina.
 Faza G1, (faza presintetică sau de creștere),
durează de la faza M precedentă până la
începutul sintezei ADN – la o celulă umană cu
diviziune rapidă (la fiecare 24 de ore) această
fază durează 9 ore, iar dacă nu urmează
diviziunea, celula rămâne în această fază:

 se sintetizează diverse enzime, ARNm,

proteine citoplasmatice, în special cele
necesare pentru replicarea ADN;

 Sfârşitul acestei faze este reprezentat de

începutul sintezei histonelor, atingând
maximum în faza S

 Cz sunt monocromatidici

 Neuronii, celula musculară se opresc în faza

G1
 Faza S (de sinteză) începe odată
cu sinteza ADN și se termină
atunci când toți cromozomii s-au
replicat (bicromatidici).

 Prin acest proces se dublează

cantitatea de ADN din celulă.

 Faza G2 (postsintetică) durează

până la începutul mitozei și se
caracterizează prin producerea
de microtubuli.
 Faza G0 (faza de odihnă) este
caracteristică numai celulelor inactive sau
îmbătrânite.
 Celulele neproliferative (care nu se
înmulțesc) trec din starea G1 în starea G0
(inactivă) și pot rămâne așa perioade lungi
de timp sau chiar nedefinit.
 Este o caracteristică comună a celulelor
înalt diferențiate.
 Îmbătrânirea celulară este starea care
apare ca răspuns la alterarea sau
degradarea ADN, care ar face progeniturile
neviabile – este adesea o alternativă
biochimică la autodistrugerea lor prin
apoptoză.
 Este relativ scurtă și constă în cariochineză
(diviziunea nucleului) şi citochineză.

 A fost împărțită în mai multe faze secvențiale

distincte, numite:
 profază
 metafază
 anafază
 telofază
 etapa în care cromatina se condensează în
cromozom sub forma unor filamente fine
care, pe măsura avansării stadiului, se
scurtează și se îngroașă devenind intens
colorabile
 materialul genetic a fost duplicat în faza
precedentă, cromozomii fiind bicromatidici,
cromatidele fiind atașate prin centromer;
 centrozomul se replică independent, iar cei
doi centrozomi rezultați sunt împinși la
extremități opuse ale celulei;
 cei 2 centrioli, componenți ai centrozomului
vor fi orientați perpendicular unul pe celălalt.
 la sfârșitul profazei, membrana nucleară se
rupe, dispar nucleolii iar microtubulii din
centrozomi încep să se organizeze sub forma
fusului de diviziune și să captureze
cromozomii.
 precede
metafaza
 se caracterizează
prin cromozomi
formați din 2
cromatide, mai
scurți și mai
îngroșați decât în
profază, dar mai
lungi și mai
subțiri decât în
metafază.
 Dispare complet
membrana
nucleară și
începe formarea
fusului mitotic.
 Cromozomii se prezintă mult
mai condensați decât în
prometafază (MAXIM), cu
morfologia caracteristică,
fiind formați fiecare din 2
cromatide, unite într-un
singur punct denumit
centromer.
 Cromozomii se dispun pe linia
ecuatorială a celulei (placa
ecuatorială sau metafazică)
 cromozomii sunt dispuși într-
un singur plan perpendicular
pe axa longitudinală a fusului
de diviziune;
 Aranjamentul spațial:

 Cz de talie mare tind să ocupe

poziții la periferia plăcii
metafazice, aî doar regiunile
centromerice se găsesc în cadrul
fusului mitotic, brațele lungi
găsindu-se în citoplasmă.

 Cz mici tind să ocupe arealul

central al plăcii metafazice.

 Ordonarea neîntâmplătoare a cz
metafazici în placa ecuatorială a
fost demonstrată la mai multe
specii (om, hamster, iepure).

 Cz sexului sunt situați la periferie.

 La sfârșitul metafazei și
începutul anafazei începe
clivarea longitudinală a
centromerului prin care cz
devin monocromatidici.

 Factori cu efect mutagen

nesepararea cromatidelor,
soldată cu apariția
anomaliilor numerice.
 Se produce clivarea
completă a centromerilor
 Cromozomii
monocromatidici încep să
migreze către polii opuși ai
celulei cu o viteză de 0,2-
0,5 µm/minut.
 Fibrele fusului de care sunt
atașați centromerii
cromozomilor
monocromatidici sunt cele
care tractează cromozomii
spre polii celulei în
diviziune.
 Etapa în care care cromozomii
ajung la polii celulei.
 Cromozomii se despiralizează,
se alungesc și, treptat, pierd
structura vizibilă.
 Un șanț la mijlocul celulei asigură
și diviziunea citoplasmei,
constituind citodiereza sau
citochineza.
 Fiecare celulă fiică nou formată
își reface membrana nucleară,
iar nucleolul sau nucleolii reapar
sub forma unor sfere mici,
dense.
 Durata mitozei:
 Variază de la o categorie de celule la alta (câteva zeci de minute –
câteva zeci de ore), fiind dependentă de specie, vârstă,
temperatură

 Mitoza este asistată de :

 substanțe mitogene (eritropoetina, factori de creștere, hormoni)
 Factori tisulari inhibitori ai diviziunii celulare (peptide,
glicoproteine)

 Celulele se divid la anumite intervale de timp , fiecărui țesut

fiindu-i specific un indice mitotic (rată mitotică) – proporția
de celule aflate în diviziune , din numărul total de celule.
 Asigură constanța numerică și informațională a cromozomilor în
succesiunea generațiilor de celule.
 Conservă în modul cel mai rigid informația ereditară (prin
mecanismul de biosinteză a cromatidelor surori).
 Asigură creșterea și dezvoltarea organismelor pluricelulare.
 Prin mecanismele specifice procesului de diferențiere celulară, în
perioada embrionară și prin reglajul genetic, permite formarea de
țesuturi și organe cu funcții specifice, în procesul de ontogeneză.
 Orice modificare a structurii cantitative și calitative a cz, sub
acțiunea factorilor mutageni fizici, chimici sau biologici va avea
consecințe negative asupra diverselor țesuturi și organe, cu
modificări pregnante ale sintezei diverşilor compuşi biologici la
nivel celular.
 Studiul cromozomilor este realizat în cele mai
bune condiții în timpul prometafazei și
metafazei mitotice, când cromozomii ating
un maxim de condensare și spiralizare,
permițând o bună individualizare a lor.

 Se utilizează probe de țesuturi cu celule care

pot fi prelucrate în acest sens.
 La adulți sau nou-născuți, se recoltează:
 probe de sânge

 În timpul gestației, se recoltează:

 lichid amniotic prin amniocenteză (conține celule epidermice
fetale)
 un fragment de placentă - chorionic villi sampling test (CVS).

 La animale se recoltează:
 țesut în care celulele se găsesc în diviziune continuă (măduva
osoasă femurală sau sternală)
 țesut mai ușor accesibil, cu toate că celulele acestuia sunt mature și
nu se mai divid (sângele periferic). În acest caz celulele trebuie
stimulate artificial să intre în mitoză.

 Cariotipul vizează leucocitele care se divid în mod activ (mitoza).

 Pentru analiza cromozomială, probele trebuie să
conțină celule în diviziune (sau în mitoză).

 În sânge, leucocitele se divid activ.

 celulele adulte sunt tratate cu substanțe chimice ca

fitohemaglutinina (PHA) pentru inducerea mitozei

 Majoritatea celulelor fetale se divid activ.

 Separarea celulelor în diviziune se face cu substanțe

chimice.
 Pentru a avea un număr suficient de celule în
diviziune, acestea sunt cultivate pe medii
speciale de cultură.

 Mediile conțin substanțe chimice și hormoni care

permit diviziunea și multiplicarea celulară.

 Procesul de “cultivare” a celulelor poate dura 3-4

zile pentru leucocite și o săptămână pentru
celulele fetale
 Blocarea diviziunii celulelor în stadiul de metafază (inhibarea formării
fusului mitotic sau dezorganizarea lui în cazul în care a fost format)
 Se adaugă colcemid sol. Stock (1mg/ml) în recipientele cu cultură
celulară (direct, fără înlocuirea mediului cu unul proaspăt) astfel încât
concentrația finală de colcemid să fie 0.1 mg/ml (la 10ml mediu – 1ml sol.
stock).
 Se incubează culturile celulare cu colcemid timp de 1 - 4 ore la incubator
(370C).
 Nu există un timp standard de incubare . Se consideră că pentru celulele
cu diviziune rapidă, 1 oră este suficientă, iar pentru cele cu diviziune
lentă, 4 ore.

 Incubarea îndelungată cu colcemid poate produce cz defectuoși, iar

incubarea prea scurtă, obținerea unui număr mic de celule mitotice.
 Se tratează celulele cu tripsină - EDTA. Când celulele încep să se
detașeze de substrat se bate ușor recipientul și se pipetează cu grijă
pentru obținerea unei suspensii celulare.

 Suspensia celulară se introduce într-un tub de centrifugă de 15 ml .

▪ Nu se îndepărtează mediul de cultură deoarece poate conține celule mitotice în
suspensie.
▪ Colcemid oprește celulele în mitoză (rotunde și slab atașate de substrat).

 Se centrifughează suspensia celulară la 800 rpm , 5 min.

 Se îndepărtează supernatantul, dar nu în totalitate.

 Se reface suspensia celulară din depozit prin agitarea viguroasă a

tubului.
 Provocarea turgescenței nucleilor - șocul hipotonic
– împiedică aglomerarea cromozomilor și
asigurarea dispersiei lor separate, obținându-se
cromozomi bine individualizați, nesuprapuși.

 Se adaugă 5 ml KCl 75mM în timp ce tubul se

agită ușor

 Se incubează 8 - 15 min.
 Coagularea constituienților, densificarea și conservarea

 Se adugă 5 ml soluție de fixare proaspăt preparată (3:1 metanol : acid

acetic glacial) pe pereții tubului. Se agită uşor.
▪ 1. Soluția fixatoare trebuie adăugată picătură cu picătură sub agitație
permanentă.
▪ 2. Nu se centrifughează înainte de fixare (celulele pot forma depozite insolubile ).

 Se centrifughează la 1000 rpm 5 min.

 Se îndepărtează supernatantul.

 Se resuspendă depozitul celular în 10 ml soluție fixatoare - etapa de

spălare (se repetă de 4-5 ori).
▪ Celulele resuspendate în 200 ml de soluție fixatoare pot fi depozitate la -20 C o
săptămână.
 Dacă celulele au fost depozitate la -20 C, se repetă spălarea de 2 ori. Celulele
se resuspendă în 200 ml de soluție fixatoare .
 Se spală lama cu soluție fixatoare și se usucă.

 Se așează lama în poziție orizontală.

 Suspensia celulară se etalează pe lamă (1-2 picături).

 Se usucă lama.

 Se analizează aspectul metafazic la microscop. Dacă densitatea celulară este

bună, se pregătesc mai multe lame.

▪ Dacă densitatea este mare se mai diluează suspensia.

▪ Dacă densitatea este mică se centrifughează și se resuspendă într-un volum mai mic.
 Colchicinizarea animalului – se injectează 0,01 ml/gcorp
din soluția 0,04% colchicină pe cale intraperitoneală.

 După 1 oră și 20 minute se sacrifică șoarecele, se izolează

femurele și se secționează epifizele.

 Șocul hipotonic - se introduce un ac subțire în canalul

medular al femurului și se spală substanța medulară într-o
eprubetă de centrifugă, întrebuințând 2-3 ml soluție
hipotonă de clorură de potasiu 0,55% caldă (370C).
 Se lasă eprubeta la termostat la 370C timp de 15-20 minute
 Se centrifughează 5 minute la 500 turații/minut.
 Fixarea cromozomilor - soluție fixatoare formată din 3
părți alcool metilic și 1 parte acid acetic glacial.
 Se lasă pentru fixare 45 minute la frigider
 Se centrifughează din nou 5 minute la 800 turații/minut
 Se refixează cu același fixator.

 Etalarea se face pe lame curate, bine degresate, ținute în

apă distilată rece, cu cuburi de gheață, pe care se depun
câteva picături din suspensia celulară. Apoi, lamele se
lasă să se usuce la temperatura camerei.
 Colorarea
 Preparatele astfel obținute se observă la microscopul
optic obișnuit, cu obiectivul de imersie.
 Se recoltează în mod steril sânge venos pe heparină, substanță utilizată
ca anticoagulant.
 6-8 picături de sânge se introduc în tubul de cultură special (cu o
compoziție chimică bine stabilită, care să asigure supraviețuirea și
multiplicarea celulelor: Henks, McCoy) care conține 5-6 ml mediu, 10%
ser fetal de vițel și 2-3 picături fitohemaglutinină (provoacă mitoza
limfocitelor).
 Tuburile bine închise cu dopuri atoxice se incubează la 370C, timp de 72h.
 Cu 2 ore înainte de încheierea timpului de incubație, se adaugă 0,1 ml
colchicină 0,04%, în fiecare tub.
 După 2 ore se centrifughează 3 minute la 800 turații/minut și se înlătură
supernatantul.
 Urmează șocul hipotonic, fixarea, etalarea și colorarea după tehnicile
descrise mai sus.
 Cromozomii nu se colorează în mod obișnuit.
 Pentru diferențierea cromozomilor se utilizează o baie cu
soluție Giemsa diluată (2 picături la 1 ml apă distilată),
timp de 20-30 minute soluție Giemsa aplicată pe lamă.

 Colorantul prezintă afinitate pentru regiunile bogate în perechi

de tipul Adenină (A) şi Timină (T), producând o bandă
întunecată.

 Astfel colorați, cromozomii apar ca o succesiune de benzi

întunecate și luminoase.

 Fiecare cz are un desen specific care permite citogeneticienilor
să deosebească un cz de altul.
 Prima dată se utilizează o protează pentru a
digera proteinele

 Reagentul Giemsa :
 Aminophenothiazine (basic)
 Eosin (acidic)

 Produce benzi luminoase și întunecate

 Aspectul benzilor se modifică în funcție de stadiul
mitozei
BENZI LUMINOASE BENZI ÎNTUNECATE

 Bogate în GC  Bogate în AT

 Majoritatea genelor sunt în  Reprezintă regiuni de ADN

benzile luminoase condensat

 Reprezintă regiuni de ADN  Conțin puține gene

mai despiralizat permițând
o transcripție mai ușoară
 Cromozomii colorați pe lamă sunt analizați la
microscop și sunt fotografiați.
 Prima etapă este numărarea cz.
 Majoritatatea oamenilor au 46 cromozomi.
 Bolnavii cu sindrom Down au 47 cz.
 Este posibilă prezența unui număr mai mare sau
mi mic de cz.

 Stabilirea numărului de cz poate diagnostica
sindroamele Down, Turners, Kleinfelters
 Clasificarea cz după:
 Mărime
 Poziția centromerului
 Localizarea și mărimea benzilor G.

 Cromozomii perechi sunt numerotați de la cel

mai mare (numărul 1) la cel mai mic (numărul
22).
 Sunt 22 perechi autozomi.
 2 cz sexuali
▪ 2 X la femele
▪ X șiY la masculi.
 Structura cromozomilor specifici poate stabili
lipsa sau adiția unor segmente, precum și
unele anormalii structurale ca:
 Translocații
 Deleții
 Duplicații
 2 brațe separate printr-o constricție denumită
centromer

 Metacentric: centromer la centerul cz

 Submetacentric: centromer ușor depărtat de
centru
 Foarte submetacentric: centromer la jumătatea
distanței dintre centru și capătul cz
 Acrocentric: centromer foarte apropiat de capăt
 Telocentric: centromer la capăt
 Femelă normală  46, XX
 Mascul normal  46, XY

 Prezența telomerelor, a centromerului și a

benzilor reper
 Secțiunea cz între 2 benzi reper - regiune

 Regiunile sunt numerotate 1,2,3 în ambele direcții

de la centromer

 Benzile dintr-o regiune sunt numerotate după

aceeași regulă

 Exemplu: prima bandă din regiunea 2 a

brațului p din cz #1 - 1p21
 14
 q
 3
 2
 Pot exista sub-benzi
 Se numerotează cu zecimale

 Exemplu: 14q32.3
 sub-banda 3
 Banda 2
 Regiunea 3
 Brațul q
 Cz 14
 Aberații cromozomale numerice
gonozomale

 45, X  45 cz , 1 cz X

 47, XXY  45 cz, 2 cz X , 1 cz Y

 Aberații cromozomale numerice autozomale
 Se utilizează semnele + sau –
 Înainte de simbol pentru a indica cz în plus sau în minus
 După un simbol pentru a indica segmente de cz în plus sau
în minus

 47, XY, +21  cariotip mascul cu un cz în plus la

perechea 21
 46,XX, 1q+  cariotip femel cu 46 cz și o creștere în
lungime a brațului lung a cz 1
 Dacă există încertitudini:
 45, XY, -?8
▪ 45 cz
▪ XY este mascul
▪ Lipsa unui cz, probabil din perechea #8

 Nu există o nomenclatură specială pentru

inversii, deleții, translocații, inserții
 Bandarea C-colorează heterocromatina constitutivă
▪ Regiuni ale cz extrem de condensate cu ADN înalt repetitiv
 Utilizată pentru determinarea prezenței sau absenței
centromerului, precum și studiul anormalităților regiunii
centromerice
 Colorația argentică pentru organizatorii
nucleolari

 ADN-ul care codează pentru ARNr, apare în copii

multiple pe brațele scurte ale cz acrocentrici

 Colorația presupune depozitarea colorantului la

nivelul regiunilor active ale organizatorilor
nucleolari (NORs)
 FISH - Fluorescence In Situ Hybridization

 Presupune hibridarea precisă a sondelor de

ADNmc la secvențele țintă complementare
 Pot fi detectate la microscopul UV utilizând
marcajul cu un fluorofor
 Este utilizată pentru a identifica dacă:
 o genă specifică este prezentă (sau în duplicat)
 Este în regiunea corectă a cz corect
 Aceeași idee ca și FISH, dar se utilizează o
mixtură a mai multor sonde marcate cu
fluorofori

 Folosită pentru:
 Enumerarea cz
 Identificarea rearanjărilor structurale
cromozomale
 Trisomia 21 iprezența a 3
cromozomi 21
 Cz extra produce
caracteristicile specifice
pacienților cu Down
 Fenotip aparte
 Suferă într-o anumită
măsură de retard, mediu sau
moderat
 Pot învăța să citească, să
scrie, să socotească și să se
descurce cu asistență minimă
 Alții sunt dependenți de
îngrijire
 Afecțiuni
cardiace,
pierderea
auzului, etc
 Rata de
supraviețuire
este mai mare
ca în anii 50’-60’
 Cei care
supraviețuiesc
pot dezvolta
Alzheimer
 Prezența a 3 cz 13 - sindromul
Patau
 Doar 5% dintre copii
supraviețuiesc în primul an
 Marea majoritate a gravidelor
cu Trisomia 13 avortează

 Retard mental sever

 Cap mic
 Degete extra
 Buza sau palatul despicat
 Probleme respiratorii
 seizures
 Prezența a 3 cz 18

 Doar 10% dintre copii

supraviețuiesc în
primul an
 Majoritatea copiilor
care supraviețuiesc sunt
fete.
 Marea majoritate a
gravidelor cu Trisomia
18 avortează
 Probleme
respiratorii,
dificultate în a se
hrăni, seizures.
 Afectare cardiacă
severă

 Retard mental sever.

 Sunt subponderali,
facies caracteristic,
țin pumnii strânși
 Un individ 47, XXY este mascul 􀁺
 are 47 cz
 Afectează 1 mascul din 1000
 Majoritatea sunt mai înalți decât media, pot
prezenta depozite adipoase (coapse sau piept)
 Pilozitate scăzută
 Retard mental sau inteligență normală
 Infertili
▪ 2% dintre bărbații infertili au Klinefelter Syndrome

 Deoarece caracteristicile nu sunt evidente, mulți

rămân nediagnosticați
 Un individ cu genotip 45, X este fenotipic femeie
 45 cz - monosomie X – singura cunoscută ca fiind compatibilă cu viața
 Afectează 1 din 5000 fete nounăscute
 Cele mai frecvente si caracteristice simptome pe care le prezinta pacientele cu sindrom
Turner sunt:
- Statura mica: apare la 95% din paciente. Pana in jurul varstei de 10- 11 ani aceasta statura
mica nu se observa, fetele crescand corespunzator varstei, insa dupa aceasta varsta, inaltimea
ramane cu 50% mai mica decat ar trebuie pentru varsta persoanei respective;
- Malformatii dentare;
- Malformatii ale unghiilor: unghiile sunt hiperconvexe si hipoplastice;
- Nevi cutanati;
- Malformatii oculare: strabism, cataracta, incapacitatea discernerii culorilor rosu si verde;
- Otita medie foarte frecventa, datorata cel mai probabil drenajului anatomic deficitar al
urechii medii;
- Pierderea auzului:
- Dislocatie de sold;

- Scolioza: apare la 10% dintre paciente;
- Hemoragii gastrointestinale: se datoreaza malformatiilor vasculare. Pacientele
au un risc crescut de a dezvolta colita ulcerativa
- Hipertensiune arteriala: cauzata de malformatii vasculare importante, cum ar fi
coarctatia de aorta sau anomalii renale;
- Hipotiroidism: apare la 10- 30% dintre pacienti si este asociat cu marirea in
volum a glandei tiroide;
- Limfedem al mainilor si picioarelor: apare la orice varsta;
- Torace latit, mameloane distantate;
- Urechi jos implantate;
- Par jos implantat (la nivelul cefei);
- Sterilitate;
- Gonade nedezvoltate, semne de insuficienta ovariana: sani nedezvoltati pana la
varsta de 12 ani, ciclu menstrual absent dupa varsta de 14 ani;
- Amenoree (absenta ciclurilor menstruale);
- Obezitate, diabet zaharat;
- Anomalii osoase ale degetelor (apar foarte scurte, nu sunt complet dezvoltate);
- Osteoporoza;
- Malformatii viscerale.