O menor objeto visível com um microscópio óptico é determinado pela resolução, limitada pela

difração da luz, que geralmente é de aproximadamente metade do comprimento de onda da luz

utilizada. O contraste, definido pela diferença de intensidade entre o objeto e seu fundo, também
desempenha um papel crucial na visualização desses objetos. Para melhorar o contraste e a
capacidade de visualizar objetos tão pequenos, técnicas como a coloração são frequentemente
empregadas.
Grandezas ópticas:
- Irradiância = Potência radiante/ Área = Energia/ Tempo e área [W/m2] - é a quantidade
de radiação que atinge uma superfície por metro quadrado. O sinônimo é a irradiação.
- Potência radiante (Radiância) = Energia/Tempo: Watt: Joule/segundo [W] - usada para
descrever a quantidade de radiação eletromagnética que passa/emite em uma área.
- Fluência-Dose de luz = Energia/área [J/m2]
- Energia radiante: Joule [J] - energia possuída por ondas eletromagnéticas, como luz
visível, ondas de rádio, raios ultravioleta, etc e pode se propagar no vácuo.
Fontes de luz: Os processos de emissão de luz podem ser divididos em três principais:
1. Incandescência (Emissão Térmica): Ocorre quando um corpo aquecido, como um
filamento de tungstênio em uma lâmpada incandescente, emite luz com um espectro
contínuo dependente da temperatura, conforme descrito pela Lei de Wien e a equação de
Planck.
2. Luminescência (Emissão Espontânea Não Térmica): Envolve a emissão de luz quando a
energia é transferida para átomos ou moléculas de um material, excitando seus elétrons
para níveis de energia mais altos. Quando esses elétrons retornam ao estado fundamental,
liberam fótons, como visto na fluorescência e fosforescência.
3. Emissão Estimulada (Emissão Não Térmica): Ocorre quando um elétron excitado emite
um fóton em resposta à passagem de outro fóton de luz, sendo o princípio subjacente à
operação de um laser.
LASER NO MICROSCÓPIO DE CONFOCAL:
● Diodo: 405 nm picossegundo
● HeNe (Hélio e Neônio) : 543/594/633 nm
● Argônio : 458/488/514 nm
● Ti: Safira: 690-1090nm
Estes lasers são as fontes de luz utilizadas no microscópio para iluminar a amostra e permitir a
visualização das estruturas microscópicas.
O laser, um dispositivo que amplifica luz por meio de emissão estimulada de radiação, opera em
um meio ativo onde ocorre a inversão de população. Neste estado, mais átomos estão em um
estado excitado do que no estado de energia mais baixa da transição eletrônica utilizada no laser.
Essa condição é alcançada através de bombeamento externo, fornecendo energia ao meio ativo,
que pode ser um gás, um cristal ou uma fibra óptica.
A emissão estimulada ocorre quando átomos ou moléculas, já excitados, emitem fótons ao serem
estimulados por fótons de mesma energia. Isso resulta na emissão contínua de fótons idênticos, à
medida que os fótons estimulados interagem com outros átomos excitados.
Existem duas formas principais de bombeio em lasers: o uso de fontes externas para fornecer
energia ao meio ativo e a diferença entre lasers contínuos (CW) e pulsados. Os lasers CW
produzem uma corrente constante de luz com intensidade e comprimento de onda constantes,
úteis para aplicações que requerem um feixe contínuo de luz. Já os lasers pulsados emitem pulsos
curtos de alta intensidade com duração variável, sendo úteis para aplicações que necessitam de
altas potências de pico. Mode-locking permitem que lasers emitam pulsos de luz de duração
muito curta, enquanto os lasers Q-switched são empregados em aplicações que requerem
intensidades elevadas em pulsos de nanossegundos.
Detectores de luz:
Os três dos principais processos de detecção de luz:
● Efeito Fotoelétrico: Nesse processo, fótons de luz incidente atingem um material e
geram elétrons livres, resultando em uma corrente elétrica detectável. Essa corrente
elétrica é proporcional à intensidade da luz incidente.
● Absorção: Este processo envolve a absorção de fótons de luz por moléculas ou
semicondutores. Quando um fóton é absorvido, ele pode excitar elétrons em uma
molécula para um estado de energia mais elevado, criando assim uma corrente elétrica
detectável.
● Efeito Fotoresistivo: Nesse processo, a resistência elétrica de um material muda quando
exposto à luz. Quando a luz incide sobre o material, a resistência elétrica diminui,
permitindo a detecção da presença de luz.
Os detectores de luz no microscópio LSM780 do IFSC incluem:
● Fotomultiplicadora GaAsP : Opera com base no efeito fotoelétrico, contendo um
fotocátodo que emite elétrons quando atingido pela luz, e um sistema de amplificação de
elétrons.
● Fotodiodo (PN): Converte luz em corrente elétrica através de uma junção PN.
● Fotodiodo de avalanche: Sensível a fótons individuais, é usado para contagem de fótons
únicos, operando com base no efeito de avalanche para amplificar o sinal de detecção.
A sensibilidade indica a capacidade de detecção de sinais fracos, a eficiência quântica mostra a
eficácia na conversão de fótons em sinais elétricos e o tempo de resposta indica a velocidade de
detecção do detector.
Flourescência:O diagrama de Jablonski é uma representação esquemática dos estados
eletrônicos de uma molécula e dos processos de transição entre esses estados. No diagrama, os
estados eletrônicos são representados em diferentes níveis de energia ao longo do eixo vertical.
Os estados eletrônicos fundamentais (estado fundamental) e excitados são indicados. As setas no
diagrama representam as transições eletrônicas possíveis entre os diferentes estados eletrônicos.
Isso inclui transições de absorção (de um estado fundamental para um estado excitado) e
transições de emissão (de um estado excitado para um estado fundamental). As moléculas podem
experimentar transições vibracionais e rotacionais dentro de um estado eletrônico. Essas
transições são representadas por curvas ou linhas horizontais dentro de cada estado eletrônico.
● Espectro de Absorção: Quando a molécula absorve fótons de luz, ela é excitada de um
estado fundamental para um estado excitado.
● Espectro de Emissão: Quando a molécula retorna do estado excitado para o estado
fundamental, ela emite fótons de luz.
- A distância internuclear entre os átomos na molécula afeta os estados vibracionais,
determinando as energias vibracionais permitidas.
- Os estados rotacionais são determinados pela rotação da molécula em torno de seu centro de
massa. A energia rotacional depende da massa dos átomos na molécula e da distribuição de sua
massa.
- Aproximação de Born-Oppenheimer: Assume que os núcleos se movem muito mais lentamente
do que os elétrons e, portanto, podem ser considerados fixos durante os cálculos eletrônicos.
- Regra do Espelho: Afirma que o espectro de emissão de uma molécula é geralmente espelhado
em relação ao seu espectro de absorção. Isso significa que as transições eletrônicas que são
fortemente absorvidas também são geralmente fortemente emitidas.
- Regra de Kasha: Esta regra estabelece que a emissão de luz ocorre a partir do estado eletrônico
mais baixo de um conjunto de estados excitados. Isso significa que, após a absorção de um fóton,
a molécula geralmente relaxa para o estado vibracional mais baixo do estado excitado antes de
emitir luz.
- O Stokes-shift refere-se à diferença de energia entre a absorção e a emissão de luz. Geralmente,
a emissão ocorre em comprimentos de onda mais longos (energias menores) do que a absorção,
resultando em uma diferença de energia positiva entre os dois processos. Isso ocorre devido à
dissipação de energia durante os processos de relaxação vibracional e rotacional após a absorção.
Na técnica de fluorescência steady-state (estado estacionário) , a fluorescência é medida em
condições de equilíbrio, onde a intensidade da excitação e a emissão de fluorescência se
estabilizam ao longo do tempo. Isso significa que a intensidade da luz de excitação e a emissão
de fluorescência permanecem constantes durante a observação.
Time-resolved refere-se à capacidade de medir e analisar a fluorescência ao longo do tempo
após a excitação. Isso permite estudar a dinâmica temporal de processos como a fluorescência de
vida curta, transferência de energia entre fluoróforos e etc.
Confocal:
A principal vantagem do microscópio confocal é sua capacidade de produzir imagens
tridimensionais de alta resolução com excelente contraste e profundidade de campo. Isso é
alcançado através da técnica de varredura a laser, onde a excitação e a coleta de luz são feitas
ponto a ponto, permitindo a eliminação de luz fora do ponto focal da amostra. Essa seletividade é
aprimorada pelo pinhole, uma abertura pequena localizada no plano focal conjugado à amostra,
que permite a passagem apenas da luz focalizada, rejeitando a luz dispersa. É essencial em áreas
onde a precisão, resolução e capacidade de visualização tridimensional são críticas para o
entendimento de processos biológicos, estruturais e materiais em escala microscópica.
Objetivas: principais características são: alta resolução espacial permitindo a visualização de
detalhes em amostras; abertura numérica (NA) que é o ângulo que capta luz ; correção de
aberração como aberração esférica, cromática e distorção geométrica; Distância de trabalho:
objetiva seja posicionada o mais próximo possível da amostra, aumentando a eficiência na coleta
de luz e melhorando a resolução.
O óleo de imersão: Aumenta a resolução e a nitidez da imagem observada no microscópio
substituindo o ar entre a objetiva e a amostra por um meio de alto índice de refração.
Filtros: Filtros de Excitação: São colocados no caminho óptico para permitir apenas a
passagem da luz de excitação necessária para excitar as moléculas fluorescentes na amostra. Eles
bloqueiam a luz de outras fontes, reduzindo o ruído de fundo e melhorando o contraste da
imagem. Filtros de Emissão: Colocados no caminho óptico para selecionar apenas a luz emitida
pela fluorescência das moléculas excitadas. Eles bloqueiam a luz de excitação e outras fontes de
luz indesejadas, permitindo a captura seletiva da fluorescência e aumentando a relação
sinal-ruído da imagem. Filtros de Dicróico (ou Filtros Divisores de Feixe): Permitem a
separação das luzes de excitação e emissão. Eles refletem a luz de excitação para a amostra e
permitem a passagem da luz de emissão fluorescente para o detector. Isso evita a sobreposição da
luz de excitação na imagem detectada.
Imagens: As cores falsas em imagens de microscopia são cores atribuídas a elementos ou características
da amostra que não possuem essas cores originalmente. Elas são amplamente usadas em técnicas como
microscopia de fluorescência e contraste de fase para representar dados de maneira mais interpretável
visualmente. Na microscopia de fluorescência, as cores falsas são usadas para destacar diferentes
estruturas ou componentes com base em suas emissões de fluorescência. Da mesma forma, na
microscopia de contraste de fase, as cores falsas são aplicadas para realçar partes da amostra com base em
suas características de contraste.