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Pinto LMC Me Bot
Pinto LMC Me Bot
Pinto LMC Me Bot
Botucatu-SP
Fevereiro, 2017
Adequação do método de destilação criogênica a vácuo para análise isotópica de
amostras de urina pela técnica HTC-IRMS
Dissertação apresentada ao
programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia do Instituto de
Biociências de Botucatu da
Universidade Estadual Paulista –
IBB/UNESP, para obtenção do
título de mestre.
Orientador
Botucatu-SP
Fevereiro, 2017
Comissão Examinadora
_____________________________________
Prof. Dr. Vladimir Eliodoro Costa
Centro de Isótopos Estáveis “Prof. Dr. Carlos Ducatti” – IBB/UNESP
Orientador
_____________________________________
Prof. Dr. Marcelo Zacharias Moreira
Laboratório de Ecologia Isotópica – CENA/USP
Membro Titular
______________________________________
Prof. Dr. Gustavo Rocha de Castro
Departamento de Química e Bioquímica – IBB/UNESP
Membro Titular
______________________________________
Prof. Dr. Maria Márcia Pereira Sartori
Departamento de Produção e Melhoramento Vegetal – FCA/UNESP
Membro Suplente
______________________________________
Prof. Dr. Joel Mesa Hormaza
Departamento de Física e Biofísica – IBB/UNESP
Membro Suplente
Ao meu mestre e amigo, Professor Carlos
Ducatti†, um exemplo de dedicação e amor
à ciência e à arte de ensinar.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Mauricio e Elma, e ao meu irmão, Leandro, por todo o carinho, apoio e
Aos meus familiares (avós, tios e primos), por quem possuo grande apreço;
À minha amiga Gabriela, pessoa especial com quem dividi muitas das experiências,
Aos meus amigos da república Grão de Boi que, ao longo dos anos, se tornaram
Aos meus colegas do Centro de Isótopos Estáveis “Prof. Dr. Carlos Ducatti”,
Aos professores Marcelo Zacharias Moreira, Gustavo Rocha de Castro e Maria Márcia
Enfim, a todos os seres de bem que enviaram boas vibrações para o desenvolvimento
dessa pesquisa.
SUMÁRIO
1. RESUMO............................................................................................................ 07
2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 12
3.5. HTC-IRMS.................................................................................................. 20
5. RESULTADOS .................................................................................................. 34
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 39
8. CONCLUSÃO.................................................................................................... 43
9. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 43
1. RESUMO
desenvolvido no Centro de Isótopos Estáveis “Prof. Dr. Carlos Ducatti”, visou adequar
da água duplamente marcada, para determinar a necessidade energética (em kcal d-1) de
adequado para extrair 1,5 mL de água de amostras de urina, sem causar fracionamento
isotópico, em 32min e 32s; além disso, mostraram que alguns cuidados, como o
devem ser adotados visando atenuar o efeito de memória. Concluímos que a utilização
7
ÍNDICE DE TABELAS
............................................................................................................................... 15
8
ÍNDICE DE FIGURAS
temperatura............................................................................................................ 20
ºC) ......................................................................................................................... 25
necessário para destilar 99% do conteúdo de água foi t = 32,54 min. .................. 36
9
Figura 13. Comparação dos valores de enriquecimento relativo isotópico
padrão. ................................................................................................................... 38
AE – Água enriquecida;
AT – Água de torneira;
10
kH – Taxa de troca de deutério;
QR – Quociente respiratório;
11
2. INTRODUÇÃO
2010).
corporal total do indivíduo para avaliar seu gasto energético total (IAEA, 2009).
possui variadas técnicas de análise da razão isotópica da água, entre as quais, as mais
Spectrometry) (IAEA, 2009). A IRMS é a técnica mais versátil para análise de isótopos
equipamento de IRMS, e.g. preparo por redução por zinco ou preparo por equilíbrio
(IAEA, 2009). Além disso, o preparo pode ser feito on-line, onde os gases são gerados
no próprio sistema de IRMS de fluxo contínuo, e.g. redução por cromo ou pelo método
de “pirólise”.
12
Porém, as amostras obtidas na metodologia de água duplamente marcada são,
água pura da urina (PIPER et al., 2014). Esse tratamento evita que moléculas
área de hidrologia, é a destilação criogênica a vácuo, que pode ser adaptado à extração
água, que a tornam uma molécula de fácil adsorção (MORSE et al., 1993).
poucas manipulações nas amostras antes de serem analisadas. Porém, ainda não há
destilação criogênica a vácuo para extrair a água de amostras de urina para análises de
razão isotópica de água duplamente marcada por HTC-IRMS. Além disso, determinar
13
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
do modelo atômico proposto por Niels Bohr em 1913, que é o mais aproximado do
modelo quântico mecânico, porém, mais simples (TIPLER & LLEWELLYN, 2010). O
A massa atômica (A) é a soma das quantidades de prótons (Z) e nêutrons (N), ou
isótopos: são átomos que apresentam o mesmo número de prótons e diferentes números
estáveis – que não emitem radiação (SHARP, 2007). A notação usual para o isótopo de
isótopos ocorrem naturalmente. A abundância dos isótopos estáveis destes pode ser
14
Tabela 1. Abundâncias naturais dos isótopos estáveis dos elementos C, H, O e N.
Elemento químico Isótopo estável Abundância (átomos %)
1
H 99,9844
Hidrogênio 2
H (deutério) 0,0156
12
C 98,8890
Carbono 13
C 1,1110
14
N 99,6340
Nitrogênio 15
N 0,3660
16
O 99,7628
17
Oxigênio O 0,0372
18
O 0,2000
inocuidade, fato que permite a aplicação em grupos de risco, como idosos e recém-
nascidos (IAEA, 2009). Além das análises de abundância natural, surgiram aplicações
2006).
15
segundo, utilizaram água enriquecida com os isótopos pesados de hidrogênio e oxigênio
(2H e 18O, respectivamente) para calcular a produção de CO2 em ratos (LIFSON et al.,
1955).
Então, em meados da década de 1970, com o avanço tecnológico foi possível retomar as
pesquisas utilizando isótopos estáveis como traçadores metabólicos in vivo (WOLFE &
CHINKES, 2005). A partir disso, surgiram inúmeros estudos com água duplamente
marcada. Primeiro com animais (NAGY, 1980; WILLIAMS & NAGY, 1984;
SPEAKMAN & RACEY, 1988) e, logo em seguida, com humanos (PRENTICE, 1985;
SCHOELLER, 1988). Sua utilização se estendeu até os dias de hoje (PIPER et al.,
dose única de água marcada com 2H e 18O e, então, determinar a cinética de eliminação
dos isótopos estáveis dos dois elementos à medida que suas concentrações se
enriquecida se equilibra rapidamente com a água corporal. Além disso, pelo fato de o
2006).
16
enquanto o oxigênio é eliminado, também, na forma de CO2 respiratório (IDECG
corporal está em constante equilíbrio com o CO2 respiratório (LIFSON et al., 1949). Tal
equilíbrio se inicia no ciclo do ácido cítrico, onde há inserção de água nas moléculas
provenientes da glicose para possibilitar a formação de íons H+ e gás CO2 (NELSON &
COX, 2013). Porém, é na corrente sanguínea que a troca atinge seu ápice, onde a água
reage com o CO2 produzido na respiração celular formando ácido carbônico por meio
18
Portanto, a taxa de troca (ou turnover) do O será maior em relação à do 2H
(IDECG WORKING GROUP, 1990; IAEA, 2009). Isso pode ser matematicamente
descrito, considerando um único pool de água corporal, pelas equações (WOLFE &
CHINKES, 2005):
rH 2 O k H N (1)
rH 2 O 2rCO2 kO N (2)
corporal (WOLFE & CHINKES, 2005). Substituindo (1) em (2), é possível obter a taxa
17
k O k H
N
rCO2 (3)
2
18
Portanto, a diferença entre as taxas de eliminação do O e do 2H resulta na
produção de CO2. Porém, para relacionar a produção de CO2 com o gasto energético
equilíbrio entre água e CO2 respiratório, que afeta apenas a concentração relativa de 18O
O cálculo do gasto energético total (GET), em quilocalorias por dia (kcal d-1), é
feito, a partir de rCO2 (L d-1), pela equação de DeWeir (WOLFE & CHINKES, 2005):
rCO2
GET 3,9 1,11 rCO2 (4)
QR
pela razão entre CO2 produzido e O2 consumido (IOM, 2005), e está relacionado ao
quociente alimentar (BLACK et al., 1986). O valor de QR está usualmente entre 0,85 e
0,86, porém, deve-se considerar um valor representativo da dieta local (IAEA, 2009).
18
3.4. Destilação
al., 2011). Porém, essa prática teve início na área de hidrologia (ORLOWSKI et al.,
criogênica a vácuo (GOEBEL & LASCANO, 2012), por fluxo de hélio (IGNATEV et
1992). A importância dos estudos realizados com tais métodos está em avaliar os
criogênica a vácuo (GUIDOTTI et al., 2013; MOREHEN et al., 2016). Com sua
crescente utilização surgiram diversos aparatos e procedimentos. Porém, nessa área, ela
permanece pouco estudada. Por isso, se faz necessário testar se o método é adequado à
especificamente.
19
3.5. HTC-IRMS
tubo revestido internamente de carbono vitrificado com uma camada externa de óxido
de alumínio (Figura 2). Para a água reagir com o carbono do tubo é necessária uma
20
Figura 2. Esquema do reator de “pirólise”. Adaptado de [DE GROOT, 2009].
“pirólise”, onde se tornam gás hidrogênio (H2) e monóxido de carbono (CO), que serão
são ionizados por uma fonte de elétrons, sendo, em seguida, separados em feixes de íons
pela ação de campos elétrico e magnético de acordo com sua relação carga/massa
carga/massa são determinadas pelas correntes elétricas geradas pelos feixes iônicos.
processadas por software específico para gerar valores de razão isotópica que serão
21
Ra Rstd
A X (a, std ) (5)
Rstd
do padrão internacional Rstd (SHARP, 2007). O valor obtido é multiplicado por mil e
expresso em partes per mil (‰). A normalização dos dados em relação ao padrão, com
hidrogênio e oxigênio são o VSMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) e o SLAP
do pool de água corporal, que serão relacionados com a taxa de produção de CO2
(HORITA & KENDALL, 2004). Quaisquer análises de amostras de água são propensas
a esse tipo de efeito (MORSE et al., 1993), porém, as análises realizadas em reator de
“pirólise” são conhecidas por sofrer de grande efeito de memória (GUIDOTTI et al.,
2013).
Sabe-se que esse efeito não tem origem em uma única entidade, mas é causado
por diversos pools (GUIDOTTI et al., 2013), por isso a dificuldade em lidar com ele.
22
principalmente, alguns cuidados são tomados no protocolo de análises, como a lavagem
4. MATERIAL E MÉTODOS
da água de amostras de urina foi necessário realizar sua validação. Para tanto,
urina.
23
4.2. Método de destilação criogênica a vácuo
em forma de grade, sobre uma bancada móvel (Figura 3). Esse sistema, controlado por
válvulas, possui uma bomba mecânica, uma bomba difusora, duas flautas de vidro (em
paralelo entre si) e um cilindro de gás nitrogênio (N2) ultrapuro (Figura 4), conectados
24
Figura 4. Desenho esquemático do aparato de destilação criogênica a vácuo. 1- Bomba
mecânica; 2- bomba difusora; 3- medidor de pressão “Edwards APG-M-NW16”; 4-
flautas de vidro; 5- cilindro de N2 ultrapuro; 6- balão volumétrico contendo a amostra
não destilada; 7- frasco coletor; 8- nitrogênio líquido (-196 ºC).
dois estágios (Figura 5) que atua no sistema de destilação como bomba de baixo vácuo
(ou pré-vácuo), ou seja, ela começa a operar à pressão atmosférica para produzir no
sistema um vácuo de 10-2 mbar (O’HANLON, 2003). Portanto, acionamos essa bomba
antes do início do processo de destilação, quando as válvulas dos bocais das flautas de
25
Figura 5. Bomba mecânica utilizada na Figura 6. Bomba difusora utilizada na
destilação. destilação.
refrigerada a ar (Figura 6) que é responsável por manter a pressão em 10-2 mbar após o
início do processo de destilação. Essa bomba atua como bomba de alto vácuo, sendo
sucedido pela abertura das válvulas dos bocais que serão utilizados. Em paralelo ao
Flautas de vidro – tubos de vidro com conexões. Cada flauta contém cinco
bocais (Figura 7). Os bocais têm saída dupla para o acoplamento simultâneo, através de
destilação.
26
Figura 7. Flauta de vidro com seus cinco bocais.
fixos nos bocais das flautas de vidro (Figura 8), arranjados de forma que a fase líquida
dentro do tubo coletor, que fica envolto em nitrogênio líquido (Figura 9). Após
27
No processo, a fase líquida da amostra evapora devido à baixa pressão do sistema.
vácuo, para que o gás ultrapuro remova quaisquer impurezas restantes no sistema. Essa
prática evita contaminações que devem refletir na análise das amostras por IRMS
(ORLOWSKI et al., 2013). Essas amostras são, então, colocadas em frascos contendo
tampas com septo (Figura 11), que permitem a entrada da seringa de injeção do sistema
elétrica (μS cm-1), a 25 °C, de seis amostras destiladas de água de torneira (AT) e seis
de água mineral comercial (AM); e seis não destiladas de AT e seis de AM. Para efetuar
28
amostra. Comparamos os valores de condutividade elétrica pelo teste t de Student com
fracionamento isotópico nas amostras. Nesse experimento, a amostra líquida foi inserida
no reator (H2 e CO) foram, então, separados por cromatografia gasosa e introduzidos,
ADVANTAGE”. Foram realizadas oito repetições de análise para cada amostra e as três
primeiras foram descartadas. Comparamos os valores obtidos, em ‰ (Eq. 5), pelo teste t
padrões internacionais (FERRIOLLI, 2006): uma água não enriquecida (δ2H = -109,86
± 5,00 ‰ e δ18O = -7,01 ± 1,00 ‰) e uma água enriquecida (δ2H = 1677,00 ± 5,00 ‰ e
δ18O = 47,97 ± 1,00 ‰). Esses padrões são reanalisados a cada 20 amostras analisadas
no equipamento.
29
contaminação cruzada entre amostras destiladas simultaneamente. Para esse teste,
dez amostras de água de torneira (AT1), dez de água enriquecida (δ18O = 3188,29 ±
87,92 ‰) e, novamente, dez de água de torneira (AT2, da mesma fonte que AT1). Nesse
da mesma fonte, os valores de δ18O obtidos para AT2 devem estar correlacionados com
os obtidos para AT1. Avaliamos essa correlação pelo teste t de Student com intervalo de
confiança de 95%.
que elimina o fracionamento isotópico em amostras de urina. Para tanto, utilizamos dez
amostras de urina não enriquecida de uma paciente inserida em outra pesquisa de nosso
Destilamos 1,5 mL de cada amostra por 10, 15, 20 e 25 min e, então, submetemos as
30
tempo ótimo de destilação para 1,5 mL de urina. O ajuste seguiu conforme a equação
(CRISS, 1999):
de k, o tempo necessário para se destilar 95% e 99% do conteúdo de água. Para tanto,
1
t ln 1 F (7)
kx
306.538). Cada paciente havia ingerido uma dose contendo 2 g/kg de água corporal de
H218O (10,8 atom%) e 0,12 g/kg de água corporal de 2H2O (99,8 atom%). Foram
coletadas 15 amostras, sendo uma pré-dose (basal) e as outras, uma por dia, pelos 14
Submetemos as amostras dos dias 1, 2, 3, 6, 9, 10, 12, 13 e 14 (d1, d2, d3, etc.), e
31
analisamos por HTC-IRMS, analogamente ao Experimento #2. Porém, o total de 200
amostras foi analisado em dois protocolos de rotina diferentes, para verificar o efeito de
reprodutibilidade, ou seja, o desvio padrão entre as repetições será mínimo (HORITA &
KENDALL, 2004).
para evitar o efeito de memória (DE GROOT, 2009). Para tanto, determinamos grupos
turnover dos dois isótopos (kH = 0,080 d-1 e kO = 0,100 d-1) utilizando a Eq. 7 que, nesse
caso, determinou a fração já metabolizada (F) para cada dia de experimento (DUCATTI
et al., 2016).
Assim como no Protocolo #1, oito repetições de análise por amostra foram
calibração, utilizamos a água não enriquecida (δ2H = -109,86 ± 5,00 ‰ e δ18O = -7,01 ±
32
1,00 ‰) a cada vinte amostras analisadas dos grupos G1, G2 e G3. Para o G4,
utilizamos a água enriquecida (δ2H = 1677,00 ± 5,00 ‰ e δ18O = 47,97 ± 1,00 ‰).
A X A X basal
X transf
A
(8)
A X basal
tempo de coleta das amostras (em dias) para avaliar o comportamento da curva de
33
5. RESULTADOS
amostras de água (Tabela 4). Ambos os resultados para as amostras destiladas (AT e
AM) apresentaram uma taxa de redução superior a 85% em relação às amostras não
Tabela 4. Condutividade elétrica das amostras de água não destiladas e destiladas pelo
método de destilação criogênica a vácuo. Apresentados os valores de média e desvio
padrão (N = 6).
AT 78,47 ± 3,31a
AT destilada 9,65 ± 5,53b
AM 119,02 ± 2,84c
AM destilada 11,86 ± 5,28d
AT = água de torneira; AM = água mineral comercial.
(Tabela 5). Ambos os valores de δ2H e δ18O entre as amostras destiladas e não
34
O processo de destilação não causa contaminação cruzada entre amostras
não apresentaram correlação (p < 0,01). Além disso, os valores obtidos estão em
36
Os valores, para ambos os protocolos de análise por HTC-IRMS, de δ2Htransf e
duplamente marcada (Figuras 13a e 13b). Os resultados foram mais espalhados para o
Para o δ2Htransf, o protocolo 2, apesar do ajuste menos preciso (R2 = 0,9608 vs.
exponencial de 1ª ordem (Figura 13a). Na Figura 13b, que mostra o δ18Otransf relativo ao
1.
37
Figura 13. Comparação dos valores de enriquecimento relativo isotópico transformado
de hidrogênio (δ2Htransf; a) e de oxigênio (δ18Otransf; b), em função do tempo, entre
protocolos de análise de amostras de urina por HTC-IRMS (N = 20). Protocolo 1:
ordem de análise igual à ordem cronológica de coleta das amostras; Protocolo 2: ordem
de análise considerou o grau de enriquecimento esperado para as amostras de cada dia.
Valores apresentados em forma de média e desvio padrão.
38
6. DISCUSSÃO
vácuo para preparar amostras de água duplamente marcada para análise isotópica, e
que o método de destilação é adequado à análise isotópica. Além disso, mostraram que,
com preparo de amostras por destilação criogênica a vácuo e uma rotina de análises por
método, de fato, destila as amostras. Além disso, o método de destilação foi aplicado à
análise de amostras de urina e, dessa forma, foi possível avaliar o efeito de memória
produzido na HTC-IRMS.
que o sistema trabalha, não é possível a existência de água líquida (ATKINS & JONES,
2010). Isso ocorre porque, em tais condições, o potencial químico da água líquida se
da água líquida retirarão energia na forma de calor das moléculas internas para elevar a
39
amostras são envolvidos por béqueres contendo água a temperatura ambiente (~ 25 ºC)
durante todo o processo. Essa água troca calor com a amostra, retardando a solidificação
da fase líquida.
maior massa (i.e. H218O) evaporam mais tardiamente (INGRAHAM & SHADEL,
1992).
podendo, ao ser puxada pela bomba mecânica, contaminar outra unidade de destilação.
altamente adsortivas (MORSE et al., 1993). Apesar disso, não há contaminação em uma
40
As propriedades físico-químicas variam de substância para substância, e.g. de
urina para água (VALANIDES, 2000). Tais variações devem influenciar no tempo
necessário para se extrair a fase líquida de determinada substância. Por isso, avaliamos
(Figura 12).
9). O tempo necessário foi estabelecido como o tempo para se destilar 99% do conteúdo
análises diferentes (Figuras 13a e 13b). O Protocolo #1 foi utilizado por ser a ordem
dados (Figuras 13a e 13b). Portanto, sugerimos a utilização de uma rotina de análises
ordem direta.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
envolvendo a extração da água de amostras de urina por outros métodos são necessários
41
para permitir, pela comparação entre os métodos, um melhor entendimento do processo
de extração.
de outra natureza para análise de isótopos estáveis, e.g. análise de vinho ((DUTRA et
al., 2011).
et al., 2013; ORLOWSKI et al., 2013; GOEBEL & LASCANO, 2012). Portanto, o
método pode ser considerado mais seguro, e mais econômico em termos de gasto de
reduzir ainda mais tal efeito. Por exemplo, a utilização de algoritmos matemáticos para
42
8. CONCLUSÃO
da água em amostras de urina para análises de água duplamente marcada por HTC-
9. REFERÊNCIAS
Predict Respiratory Quotients for the Doubly Labelled Water Method of Measuring
Validity of Dietary Assessment Methods in Children when Compared with the Method
of Doubly Labeled Water. J. Am. Deit. Assoc., v. 110, n. 10, p. 1501-1510, 2010.
Elsevier, v. 2, 2009.
43
DUCATTI, C. et al. Modelling and Determination of Metabolic Pools by Stable
Carbon Isotopes in the Avian Duodenal Mucosa and Albumen. J. Anim. Physiol.
Wines by Isotope and Mineral Analysis. Anal. Bioanal. Chem., v. 401, p. 1571-1576,
2011.
from Soil Material for Stable Isotope Analysis of Water. J. Anal. Sci. Methods and
Correction, Calibration and Quality Assurance for δ2H and δ18O Measurements Over
2013.
44
IDECG WORKING GROUP. The Doubly Labelled Water Method for Measuring
Vacuum/Heat Methods for Extracting Soil Water for Stable Isotopic Analysis. J.
Reference Intakes for Energy, Carbohydrates, Fiber, Fat, Protein and Amino
C., 2005.
Techniques, No: 3, In: IAEA Human Health Series. International Atomic Energy
LIFSON, N. et al. The Fate of Utilized Molecular Oxygen and the Source of the
Oxygen of Respiratory Carbon Dioxide, Studies With the Aid of Heavy Oxygen. J.
1955.
45
MOREHEN, J. C. et al. The Assessment of Total Energy Expenditure During a
14-Day In-Season Period of Professional Rugby League Players Using the Doubly
Labeled Water Method. Int. J. Sport Nutr. Exe., v. 26, n. 5, p. 464-472, 2016.
Cause of Memory Effects Associated With the Conversion of H2O to H2 for D/H
Extraction System for Soil and Plant Water Extraction for Isotope Analysis. J. Sens.
46
PRESTON, T. The Measurement of Stable Isotope Natural Abundance Variations.
Production for Accuracy of the Doubly Labelled Water Technique: The Importance of
3, p. 355-364, 2000.
Principles and Practice of Kinetic Analysis. 2ª Ed., John Wiley and Sons Inc., New
Jersey, 2005.
47