Trabalho de Conclusão de Curso

PAPEL DAS CÉLULAS-TRONCO NA REGENERAÇÃO ÓSSEA

Priscila Martins

Universidade Federal de Santa Catarina

Curso de Graduação em Odontologia
 Priscila Martins

PAPEL DAS CÉLULAS-TRONCO NA REGENERAÇÃO ÓSSEA

Trabalho apresentado à Universidade Federal de

Santa Catarina como requisito para conclusão
do Curso de Graduação em Odontologia.
Orientadora: Profa. Dra. Mabel Mariela Rodríguez
Cordeiro

Florianópolis
2014
 Priscila Martins

PAPEL DAS CÉLULAS-TRONCO NA REGENERAÇÃO ÓSSEA

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para

obtenção do título de cirurgião-dentista e aprovado em sua forma final pelo
Departamento de Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianópolis, 24 de julho de 2014.

Banca Examinadora:

_________________________________________
Prof.ª Dr.ª Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro
Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina

_________________________________________
Prof.ª Dr.ª Ariadne Cristiane Cabral da Cruz
Membro
Universidade Federal de Santa Catarina

_________________________________________
Prof.ª MSc Isis Carvalho Encarnação
Membro
Universidade Federal de Santa Catarina
Dedico este trabalho à minha família,
meu namorado e amigos.
 AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre proporcionar bênçãos em minha vida, uma das mais
importantes foi o ingresso na odontologia da UFSC.
Aos meus pais, pela minha educação, por todo esforço que fizeram por mim
e pelo amor incondicional.
À minha irmã, pelo exemplo de esforço e dedicação.
Ao meu namorado, pela paciência, carinho e companheirismo.
Aos meus familiares e amigos, que sempre deram força para as conquistas
em minha vida.
À minha dupla, Bárbara Clementina Brandt, por esses anos de amizade,
troca de aprendizado e parceria no cursinho, faculdade, hotel, festas, estudos, como
dupla, enfim pela disposição quando eu precisava.
Às amigas que a faculdade me proporcionou, Fabiula Maísa Paludo,
Marcela Souza Lima, Michelli Cássia dos Santos e Vanessa Lima Lodetti, vocês me
ensinaram muito durante esses anos de faculdade, vou levá-las sempre no coração.
À minha turma 9.2, por sempre lutar pelos nossos objetivos, com certeza
despertaram, em mim, um instinto de luta pelo melhor.
Aos meus mestres, pelos ótimos ensinamentos.
À minha orientadora, Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro, por fazer desta
temerosa etapa de TCC um pouco mais tranquila em vida, por estar sempre disposta
a me ajudar e ensinar.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em
se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem
busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”

(José de Alencar)
 Resumo

A perda dos elementos dentais leva à reabsorção do rebordo alveolar, com

posterior alteração do terço inferior da face e do padrão estético do paciente. As
técnicas de reconstrução com enxerto de osso autógeno apresentam resultados
positivos, com ganho adequado de osso, mas têm como grande desvantagem a
necessidade de um segundo sítio cirúrgico para a doação do tecido ósseo. Algumas
opções para substituir ou repor o tecido ósseo perdido vêm sendo estudadas. Neste
contexto aparecem as células-tronco (CT), que apresentam a capacidade de auto-
renovação e de gerar células diferenciadas de diferentes tipos de tecidos, e, por
isso, demonstram potencial para reparar tecidos lesados ou perdidos. A Engenharia
de Tecidos é uma nova disciplina que abrange os princípios e métodos da biologia e
da engenharia, para desenvolver substitutos para o reparo e a regeneração de
tecidos lesados ou perdidos, e envolve a tríade células, arcabouço (scaffold) e
indutores biológicos. No campo da Odontologia, essa nova abordagem traz a
esperança de regeneração de tecido ósseo e dentário, ligamento periodontal, polpa
e esmalte e, quem sabe, até o desenvolvimento de novos dentes. O rápido avanço
que vem acontecendo na área de engenharia tecidual, a partir do descobrimento e
estudo das células-tronco de origem dental, dos fatores indutores de diferenciação e
dos diversos materiais disponíveis para uso como arcabouços, justifica a realização
deste estudo cujo objetivo foi realizar uma revisão de literatura para verificar o
estado da arte quanto ao uso de células-tronco na regeneração e engenharia de
tecido ósseo. Para isso foi realizado um levantamento bibliográfico de artigos atuais
e livros e artigos clássicos relacionados aos temas células-tronco e regeneração
óssea, entre o ano de 1994 até 2014. A literatura mostra que as CT apresentam
capacidade de autorrenovação e, quando se multiplicam, podem permanecer com
as características de indiferenciação ou se diferenciar em outros tipos celulares.
Dentre Os tipos de CT estão as embrionárias (CTE) e as adultas (CTA), dependendo
da fonte tecidual de onde as mesmas são obtidas. Para vencer as barreiras éticas e
legais do uso de CTE, os pesquisadores têm se voltado cada vez mais para os
estudos utilizando CT de tecidos adultos, tanto no que diz respeito às análises do
perfil gênico/molecular dessas células, quanto à diferenciação celular e perspectivas
de aplicação clínica. Existem diversas fontes de CTA, tais como cordão umbilical,
medula óssea, tecido adiposo, tecidos dentários, entre outras. Mas as fontes
teciduais ideais para a obtenção das CTA são aquelas em que a coleta causa a
menor morbidade possível, porém garantindo quantidade suficiente de células para
isolamento e expansão. Para a aplicação terapêutica das CT, principalmente na área
odontológica, os arcabouços são necessários para, além de fornecer o suporte
mecânico, garantir a interação com as substâncias da matriz extracelular. Para
chegar ao arcabouço ideal muitas propriedades estão sendo estudadas como a
composição química, a carga eletrostática, a textura superficial/rugosidade, a
configuração geométrica, e a modificação biomimética, pois dentro dessas
propriedades existem muitas opções de materiais. Para fechar a tríade da
regeneração óssea, as moléculas indutoras do crescimento e diferenciação celular,
como as BMPs, TGF- β, FGF, IGF, VEGF, PDGF, EGF, PTH / PTHrP e
interleucinas, atuam na cascata de formação do osso estimulando a migração,
mitose, angiogênese e, proliferação e a diferenciação celular. Através desses
mecanismos elas ativam outras moléculas e preparam o meio para a regeneração
óssea, podendo ser adicionadas no momento do implante ou previamente
incorporadas ao arcabouço. O uso do PRP é um protocolo já consolidado há alguns
anos na área da medicina e da odontologia, e utilizado com sucesso em diversas
pesquisas, onde o PRP atua como arcabouço e fornece fatores de crescimento que
aceleram o processo de regeneração óssea. Entretanto, embora diversos materiais
venham sendo estudados ao longo dos anos, ainda não há consenso de qual
arcabouço é o ideal ou o mais indicado, bem como ainda não há definição dos
fatores indutores de diferenciação mais adequados, e a sua concentração e
disponibilização espacial e temporal, para aplicação clínica em casos de
reconstrução e regeneração óssea. Após esta revisão pode-se concluir que a
regeneração óssea com CT é algo possível de acontecer. Alguns estudos nessa
área já obtiveram sucesso, porém mais pesquisas devem ser realizadas,
principalmente na área da odontologia, para o desenvolvimento de protocolos
terapêuticos clínicos seguros e de eficácia previsível.

Palavras-chave: Células-tronco. Regeneração Óssea. Stem Cells. Bone

Regeneration.
 ABSTRACT

Tooth loss leads to alveolar bone resorption, followed by modification of the

inferior third of the face and esthetic pattern of the patient. Techniques for
reconstruction using autogenous bone graft have presented positive outcomes,
showing adequate bone tissue gain, but they have as disadvantage the need of a
secondary surgical site for donation of bone tissue. Therefore, some options have
been proposed to substitute or replace the lost bone. In this context studies have
looked for stem cells, which are cells that show the ability of self-renewing and
differentiation into cell types from different tissues and, therefore, hold potential to
repair damaged or lost tissues. Tissue Engineering is a new discipline that covers the
principles and methods from Biology and Engineering in order to develop substitutes
to repair or regenerate tissues, and involves the triad of cells, scaffolds and
morphogens. In Dentistry, this new approach brings hope to bone and dental tissue
regeneration, as periodontal ligament, dental pulp and enamel, as well as the
possibility of developing new teeth. The rapid progress in this field, from the
discovery and study of stem cells of dental origin, the factors that induce cell
differentiation and the materials available for scaffolding, justifies this study which
aim was to carry out a literature review to verify the state of the art regarding the use
of stem cells in bone regeneration and tissue engineering. For that, it was performed
a literature survey for up-to-date manuscripts as well as books and classical papers
related to stem cells (SCs) and bone regeneration, published from 1994 to 2014.
Literature shows that SCs present the capacity for self-renewal and, when
multiplying, can stay as undifferentiated cells or begin a differentiation process. The
types of SCs are embryonic (ESCs) and adult (ASCs) depending on the tissue
source from where they are obtained. To overcome the ethical and legal barriers for
the use of ESCs, researches have been increasingly turned to study ASCs, regarding
both the genic/molecular profile of these cells and the cell differentiation for clinical
application. There are several tissue sources of SC, as umbilical cord, bone marrow,
adipose tissue, dental tissues, among others, but the ideal sources are those that
cause less morbidity to the patient for their collection, but guarantying enough cell
counts for isolation and expansion. For clinical SC applications, mainly in Dentistry,
scaffolds are necessary in order to, besides serving as mechanical support for the
cells, guarantee their interaction with the extracellular matrix. Several materials have
been studied regarding chemical composition, electrostatic load, texture/roughness
surface, and geometrical configuration, in order to find the ideal scaffold. To complete
the triad of bone regeneration, inductive molecules related to cell growing and
differentiation, such as BMPs, TGF- β, FGF, IGF, VEGF, PDGF, EGF, PTH / PTHrP
and interleukins, act in the cascade of bone forming stimulating cell migration,
proliferation and differentiation, and are involved in angiogenesis and mitosis
processes. Through these mechanisms those growth factors activate other
molecules and prepare the environment to bone regeneration and, therefore, they
may be added at the moment of scaffold implantation or previously incorporated to
the scaffold. The use of platelet-rich plasma (PRP) is a consolidated protocol in the
fields of Medicine and Dentistry, and has been successfully applied in several studies
where the PRP acts as scaffold and provides growth factors that accelerate the bone
regeneration process. However, though several materials have been studied in the
last years, there is yet no consensus regarding the ideal scaffold, or at least the most
indicated, as well as there is no definition about the appropriated inductors, their
concentration, and spatial and temporal delivery and action for clinical application in
cases of reconstruction and regeneration of bone tissue. After this literature review, it
can be concluded that the bone regeneration using SCs is something possible for
future clinical use. Some studies have already showed success; however, more
research is necessary in order to develop safe and predictably effective therapeutic
protocols.
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALP - Fosfatase alcalina

ASC - Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo
BMP - Proteínas ósseas morfogenéticas
BMSC - Células-tronco mesenquimais da medula óssea
CLP - Pacientes com fissura labiopalatina
CLPMDSC - Células-tronco derivadas do músculo orbicular da boca de pacientes
com fissura labiopalatina
CT - Células-tronco
CTA- Células-tronco adultas
CTE - Células-tronco embrionárias
CTM - Células- tronco mesenquimais
DPSC - Células-tronco de polpa de dentes permanentes
EGF - Fator de crescimento epidérmico
FGF - Fator de crescimento de fibroblastos
HA - Hidroxiapatita
HLA - Antígeno Leucocitário Humano
IGF - Fator de crescimento tipo insulina
iPSCs - Células-tronco pluripotentes induzidas
ISCT - International Society for Cellular Therapy (Sociedade Internacional para
Terapia Celular)
MC - Membrana de colágeno
MEC - Matriz extracelular
OOM - Fragmento do músculo orbicular da boca
PAI-1- Inibidor do ativador do plasminogênio
PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas
PDLSC - Células-tronco do ligamento periodontal
PF-4 - Fator plaquetário 4
PRP - Plasma rico em plaquetas
PTH / PTHrP - Hormônio paratireoidiano
qRT-PCR - Reação em cadeia da polimerase em tempo real após conversão pela
transcriptase reversa.
SBP- DPSC – Derivados osteoblásticos de células-tronco da polpa dentária
SHED - Células-tronco da polpa de dentes decíduos esfoliados
TGF- β - Fator de crescimento de transformação beta
VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular
β-TG - Tromboglobulina beta
Sumário
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 18
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 20
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................................. 20
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................................... 20
3 METODOLOGIA................................................................................................................................... 21
4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................................... 22
4.1 Células-tronco ................................................................................................................................. 22
4.2 Arcabouços ...................................................................................................................................... 28
4.3 Moléculas indutoras do crescimento e diferenciação celular ........................................................ 30
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 35
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................................... 39
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1 INTRODUÇÃO

A ideologia de sorriso perfeito faz com que as pessoas se preocupem e

busquem, além dos dentes, os tecidos de suporte, osso e gengiva, que também
foram perdidos (BUSENLECHNER et al., 2005). Com a perda dos elementos dentais
vai ocorrendo reabsorção do rebordo alveolar, que altera o terço inferior da face e
modifica a estética do paciente (SCHMIDLIN; JUNG; SCHUG, 2004).
Outros casos que necessitam de regeneração tecidual são os tratamentos de
defeitos ósseos extensos devido a traumas ou patologias, em especial em cirurgia
crânio-maxilo-facial e ortopédica (CASTRO-SILVA; ZAMBUZZI; GRANJEIRO, 2009),
ou as malformações congênitas, como as fissuras labiais e palatinas (BUENO et al.,
2009).
Segundo Kempen et al. (2010) “o osso é o segundo tecido mais
transplantado, depois do sangue”. As técnicas de reconstrução com enxerto de osso
autógeno, de acordo com a literatura, apresentaram resultados positivos, com ganho
ósseo adequado (MARX, 1994; MISCH et al., 1992). Porém, uma das desvantagens
é a necessidade de uma segunda cirurgia para a doação de osso (MACEDO et al.,
2007).
Conforme Macedo, Macedo, Monteiro (2009) podem-se usar também
enxertos homólogos, osso humano fresco congelado que, na Odontologia, provém
de bancos de tecidos musculoesqueléticos, e é utilizado, com excelentes resultados,
em regenerações ósseas guiadas para tratamento de tumores odontogênicos.
Por causa do crescente número de transplantes ósseos e pelas desvantagens
dos enxertos autógenos nas complicações trans e pós-operatórias como parestesias
temporárias, disestesias, infecções, fratura de crista ilíaca, hemorragias, dores e
desconforto na locomoção (NEO; MATSUHITA; MORITA, 2000), opções para
substituir ou repor o tecido ósseo perdido vêm sendo estudadas.
A esperança de se replicar tecidos adultos, por métodos biológicos, e utilizá-
los na substituição de tecidos lesados está ficando cada vez maior. No campo da
Odontologia, essa esperança recai na regeneração de tecido ósseo e dentário, como
ligamento periodontal, polpa e esmalte e, quem sabe, até desenvolver novos dentes
(THESLEFF; TUMMERS, 2003). Segundo Pignone (2011), estudos com células-
tronco da polpa dentária têm mostrado capacidade de diferenciação em
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odontoblastos, osteoblastos e regeneração do complexo dentino-pulpar e de tecido

ósseo.
As células-tronco (CT) apresentam a capacidade de auto-renovação e de
gerar células diferenciadas de tipos especializados de tecidos (MORRISON; SHAH;
ANDERSON, 1997) e, por isso, apresentam potencial para reparar tecidos lesados
ou perdidos. Podem-se encontrar células-tronco adultas (CTA) em vários tecidos,
como o hematopoiético, a pele, o osso, o epitélio intestinal (FUCHS; SEGRE, 2000;
WATT; HOGAN, 2000) e, também, na polpa dental (GRONTHOS et al., 2000).
Evidências comprovam que CT de tecidos adultos têm o potencial de produzir uma
variedade de tipos celulares (BJORNSON et al, 1999). Segundo Bydlowski et al.
(2009) as células-tronco mesenquimais (CTM) possuem menor capacidade de
diferenciação que as células-tronco embrionárias (CTE), porém elas apresentam
uma maior facilidade de isolamento, capacidade de expansão em cultura e não são
imunogênicas.
Conforme Langer e Vacanti (1993); Persidis (1999) e Chapekar (2000), a
engenharia de tecidos abrange os princípios e métodos da biologia e da engenharia
para desenvolver substitutos para o reparo e a regeneração de tecidos. A
engenharia tecidual envolve a tríade células-tronco, arcabouço (scaffold) e
osteoindutores (RAUH, et al., 2011). Para a engenharia de tecido ósseo, os
materiais osteoindutores estimulam as células indiferenciadas a se diferenciarem em
osteoblastos, que são responsáveis pela formação óssea. São usados como
biomateriais osteoindutores o osso autógeno, fatores de crescimento ósseo e as
proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) (JACQUES et al., 2004; VITAL et al.,
2006).
O rápido avanço que vem acontecendo na área de engenharia tecidual, a
partir do descobrimento e estudo das células-tronco de origem dental, dos fatores
indutores de diferenciação e dos diversos materiais disponíveis para uso como
arcabouços, justifica o objetivo deste estudo que foi realizar uma revisão de literatura
para verificar o estado da arte quanto ao uso de CT na regeneração e engenharia de
tecido ósseo.
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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Realizar uma revisão da literatura sobre regeneração óssea.

2.2 Objetivos Específicos

a) Apresentar o estado da arte sobre o uso de células-tronco pós-natais para

regeneração de tecido ósseo;
b) Identificar os principais tipos de células-tronco utilizados para a regeneração
óssea;
c) Identificar os principais tipos de arcabouços empregados na regeneração tecidual
óssea;
d) Apresentar os fatores de crescimento envolvidos na regeneração e engenharia de
tecido ósseo.
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3 METODOLOGIA

Este estudo foi realizado por meio de um levantamento bibliográfico de artigos

atuais e livros e artigos clássicos relacionados aos temas células-tronco e
regeneração óssea.
Os artigos lidos para esta revisão foram pesquisados nas bases de dados
PubMed, LILACS e SciELO, e também em ferramentas de busca como o Google
Acadêmico.
Os termos pesquisados foram: células-tronco e regeneração óssea e stem
cells and bone regeneration. Foram analisados os artigos que abordavam o tema
células-tronco pós-natais relacionadas à regeneração óssea.
Um levantamento inicial, feito nessas bases de dados e na ferramenta de
busca, resultou em 5.727 artigos. Destes, foram selecionados os artigos mais
recentes, a partir do ano de 1994 até 2014, totalizando 131, incluindo pesquisas,
revisão de literatura, revisão sistemática e casos clínicos nas línguas portuguesa,
inglesa e espanhola.
Os dados necessários para a realização da revisão da literatura foram obtidos
através da leitura dos artigos na íntegra e os dados levantados foram agrupados em
subitens com o objetivo de sistematizar os achados.
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4 REVISÃO DE LITERATURA

“Engenharia tecidual é definida como o campo da ciência que estuda a

restauração funcional e fisiológica de estruturas teciduais deterioradas ou perdas
teciduais decorrentes de doenças como o câncer ou trauma”. (NAKASHIMA; REDDI,
2003). A engenharia tecidual se baseia em três componentes: as células-tronco, o
arcabouço (scaffold), que representa uma matriz extracelular (MEC) e mantém o
contorno do tecido, e as moléculas indutoras do crescimento e diferenciação celular.
(REDDI, 1998).

4.1 Células-tronco

Segundo Morrison, Shah e Anderson (1997) as CT, células fonte ou stem

cells, são células com baixo grau de diferenciação, que têm a capacidade de se
auto-reproduzirem e de gerarem células diferenciadas de tipos especializados de
tecidos. Elas mantêm-se indiferenciadas por longos períodos, tanto in vivo como in
vitro, mas com estímulos específicos podem diferenciar-se em células maduras e
funcionais (ZAGO; COVAS, 2006).
As CT são classificadas segundo sua potencialidade em toti, pluri ou
multipotentes. Totipotentes são as células que podem gerar todos os tipos celulares
embrionários e extra-embrionários, como o zigoto; as pluripotentes têm a
capacidade de gerar todas as células que formam o embrião e são provenientes da
massa interna do blastocisto (CTE); as multipotentes são as células que originam
apenas um subgrupo de linhagens celulares, por exemplo, as CTM e neurais
(SCHWINDT; BARNABÉ; MELLO, 2005).
Segundo Alwattar, Schwarzkopf e Kirsch (2011) de acordo com a fonte, as CT
são classificadas em células-tronco embrionárias (CTE), células-tronco pluripotentes
induzidas (iPSCs) e células-tronco adultas (CTA), frequentemente isso se
correlaciona com sua plasticidade. As CTE são retiradas da massa interna do
blastocisto, cinco dias após fertilização, e podem ser expandidas em cultura junto
com fatores que inibem sua diferenciação. As CTA são estimuladas à diferenciação
na presença de fatores de crescimento ou outros estímulos externos; as CT
hematopoiéticas e mesenquimais são exemplos de CTA (SCHWINDT; BARNABÉ;
MELLO, 2005). Já as iPSCs são células diferenciadas que podem ser
23

reprogramadas geneticamente para um estado semelhante ao embrionário

(TAKAHASHI; YAMANAKA, 2006). Embora as CTE apresentem as melhores
perspectivas de diferenciação, questões éticas e legais estão envolvidas, já que um
embrião é destruído para o isolamento dessas células, além de apresentarem uma
maior dificuldade de controlar o seu crescimento, diferenciação e potencial de
malignidade, o que tem comprometido o seu emprego com vistas à medicina
regenerativa (IVANOVSKI et al., 2006).
Devido às questões éticas e legais relacionadas à obtenção de CTE, os
pesquisadores têm se voltado para a busca de novas fontes de células
indiferenciadas com potencial múltiplo de diferenciação. Deste modo, descobriu-se
que tecidos e órgãos adultos contêm células indiferenciadas que se mantêm em um
estado não-proliferativo, quiescente, durante a maior parte da sua vida, mas que,
quando estimuladas por dano ou remodelação tecidual, entram novamente no ciclo
celular para manter a reserva de células indiferenciadas (capacidade de auto-
renovação), enquanto geram células progenitoras que derivarão uma variedade de
tipos celulares diferentes capazes de renovação, regeneração tecidual e
manutenção da homeostase (multipotencial de diferenciação) (SONG et al., 2006).
As CTA são o foco da maioria das pesquisas com regeneração óssea, pois
representam um “transplante” de células autólogas ou alogênicas, com prévia
manipulação laboratorial (isolamento, purificação e expansão em cultura) (ZAGO;
COVAS, 2004). As CTA têm se mostrado como uma grande promessa para o uso na
região maxilofacial (ZHANG, 2011).
As CTM podem ser obtidas de várias fontes, como medula óssea
(PITTENGER et al., 1999), tecido adiposo (JEON, 2008), membrana sinovial
(WICKHAM et al., 2003), músculo esquelético (JANKOWSKI; DEASY; HUARD,
2002) e dentes (MIURA et al., 2003). Elas podem se diferenciar em osteoblastos,
condrócitos, adipócitos e miócitos (PITTENGER et al., 1999). De acordo com vários
autores, as CTM podem ser uma boa alternativa a outros tipos de células para
reparo e regeneração de osso (NAKAJIMA et al., 2007; MORISHITA et al., 2006;
MINAMIDE et al., 2007; KHOJASTEH; ESLAMINEJAD; NAZARIAN, 2008;
JAFARIAN et al., 2008).
Além da sua boa capacidade de diferenciação osteogênica e da fácil
obtenção a partir de tecidos diferentes, as CTM apresentam propriedade
imunomoduladora, o que é fundamental para a medicina regenerativa. Essa
 24

capacidade de modular as respostas imunes torna-as viáveis para serem utilizadas

em transplantes alogênicos, sem qualquer risco de rejeição imune (UNDALE et al.,
2009).
Para a caracterização das CTM, existe um protocolo mínimo que garante a
indiferenciação e o potencial dessas células. The Mesenchymal and Tissue Stem
Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy (ISCT) propõe
critérios para definir as células como sendo CTM humanas, tanto para uso
laboratorial em investigação científica quanto para estudos pré-clínicos. Primeiro, as
CTM têm que demonstrar capacidade de aderência ao plástico. Segundo, devem
expressar determinados antígenos de superfície: ≥ 95% da população de CTM
devem expressar CD105, CD73 e CD90 e ≤ 2% devem ser negativas para CD45,
CD34, CD14, CD11b ou CD79a ou CD19 e HLA de classe II. Por último, essas
células devem ser capazes de se diferenciar em três linhagens mesenquimais:
osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro. A diferenciação em osteoblastos é
confirmada pela coloração com vermelho de Alizarina ou von Kossa, a diferenciação
de adipócitos pela coloração com óleo vermelho O, e a diferenciação em
condroblastos é verificada pela coloração com azul Alcian ou coloração imuno-
histoquímica para colágeno tipo II (DOMINICI et al., 2006). Estes critérios são para
CTM humanas. Segundo Tropel et al. (2004), a aderência e capacidade de
diferenciação em três linhagens podem ser características de células de outras
espécies, mas a expressão dos citados antígenos de superfície não é
universalmente bem caracterizada e podem não ser detectados em sistemas não-
humanos.
Células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSC, da sigla em inglês
bone marrow stem cells) têm a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos
celulares, como osteoblastos e condrócitos. Estudos mostram que tem se alcançado
sucesso na reparação de defeitos ósseos com BMSC autólogas em vários modelos
animais (JIANG et al., 2009; MANKANI et al., 2006; PETITE et al., 2000; KON et al.,
2000) e, também, conseguiu-se o reparo de defeitos ósseos em humanos,
particularmente na mandíbula, utilizando BMSC autólogas (QUARTO et al., 2001;
WARNKE et al., 2004). Isso mostra que as BMSCs possuem potencial favorável
para a regeneração óssea na região maxilofacial.
As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ASC, do inglês
adipose stem cells), são outras possíveis células geradoras de osso. Elas são mais
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fáceis de obter, têm menor morbidade para o sítio doador e estão disponíveis em
maior quantidade quando comparadas às BMSC (KATZ et al., 2005). Alguns estudos
relataram que o reparo bem sucedido dos defeitos ósseos, pode ser conseguido
através do transplante autólogo de ASC nos locais de defeito ósseo (COWAN et al.,
2004; CONEJERO et al., 2006; YOON et al., 2007). Um caso clínico de 2004 relatou
que a combinação de ASC autólogas e cola de fibrina repararam, com sucesso,
defeitos traumáticos extensos na calota craniana de uma menina de sete anos de
idade (LENDECKEL et al., 2004).
A polpa dental, de origem mesenquimal, é formada por células derivadas da
crista neural que possuem plasticidade e capacidade multipotencial (KERKIS et al.,
2006). A polpa é organizada em quatro camadas sendo, a partir do exterior para o
interior: 1) a mais externa, composta por odontoblastos; 2) a camada chamada de
"zona livre de células"; 3) a denominada "zona rica em células", que contém células
progenitoras que apresentam plasticidade e capacidade pluripotencial; e, 4) a
camada mais interna, que compreende a área vascular e o plexo nervoso
(SINANAN; HUNT; LEWIS, 2004). As células-tronco da polpa de dentes
permanentes (DPSC, do inglês dental pulp stem cells) também têm capacidade de
se diferenciarem em osteoblastos e formar osso in vivo. DPSCs expressam
marcadores ósseos tal como fosfatase alcalina (ALP), colágeno do tipo I, e
osteocalcina, e apresentam-se como uma nova fonte potencial de células para
regeneração óssea em região maxilofacial (GRONTHOS et al., 2000; YAMADA et
al., 2010). As células-tronco da polpa de dentes decíduos esfoliados (SHED, do
inglês stem cells from human exfoliated deciduous teeth) também podem ser uma
alternativa para regeneração óssea craniomaxilofacial (MIURA et al., 2003; SEO et
al., 2008). As células-tronco do ligamento periodontal (PDLSC, do inglês periodontal
ligament stem cells) conseguem adotar fenótipos osteogênicos in vitro. Várias
descobertas sugerem que PDLSC têm muitas propriedades osteoblásticas, como a
atividade da ALP, a absorção de cálcio, a expressão de osteocalcina in vitro e
formação de osso novo in vivo (SEO et al., 2004; KATO et al., 2011; HE et al., 2010).
Papaccio et al. (2006) realizaram um estudo no qual analisaram o efeito da
criopreservação a longo prazo de células-tronco da polpa dentária e de seus
derivados osteoblásticos (SBP-DPSC). Essa informação é importante para averiguar
o potencial dessas CT para o armazenamento em longo prazo e para posterior
utilização em terapia. A polpa dentária foi extraída de dentes de indivíduos adultos
 26

saudáveis, com idades entre 21 e 45 anos e armazenadas em meio de cultura D-

MEM contendo F12 (Invitrogen) com 15% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone,
Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM de L-glutamina, 2 mM de aminoácidos não
essenciais (Invitrogen), 100 unidades/mL de penicilina, e 100 mg/mL de
estreptomicina (Invitrogen), por dois anos. Elas foram classificadas quanto a critérios
morfológicos e antigênicos (primeiro com CD117 e CD34 e, depois, em série para
STRO-1 e flk-1 e também CD44, osteocalcina e RUNX-2). Em análise in vitro, após
dois anos de congelamento, as CT foram recuperadas e foi realizada uma análise
por citometria de fluxo para analisar os antígenos que essas expressavam. As
análises foram positivas para CD117 (c-kit), CD34, STRO-1 e flk-1, e negativas para
CD45. Os resultados da citometria de fluxo mostraram que as intensidades
CD117+/CD34+/STRO-1+/FLK-1+ foram comparáveis às encontradas nos
experimentos prévios utilizando células frescas (LAINO et al., 2005, 2006). A matriz
extracelular (MEC) e os fragmentos de tecidos ósseos produzidos pelas células
criopreservadas foram analisadas e os autores concluíram que, assim como as
amostras de células frescas, as células diferenciadas criopreservadas não foram
positivas para marcadores de CT. Na verdade, tornam-se negativas para CD117 e
CD34, mas ainda mostraram positividade para STRO-1. Elas também foram
negativas para CD14 e CD45, e 100% eram positivas para CD44. Além disso, as
células se diferenciaram em dois citotipos: cerca de 30% eram células progenitoras
endoteliais e os 70% restantes eram células progenitoras osteogênicas. O ensaio
BrDU não revelou diferença significativa na proliferação entre células frescas e
criopreservadas. O ensaio TUNEL foi negativo em células criopreservadas indicando
que não houve morte celular por apoptose. Histoquimicamente, as células
criopreservadas diferenciadas apresentaram positividade importante para ALP e
calceína, o que demonstra que estes são os osteoblastos envolvidos no processo de
ossificação. As células diferenciadas foram positivas para RUNX-2, para
osteocalcina, que é um marcador de osteoblastos de membrana e de tecidos duros,
para osteonectina e para ALP óssea, o que confirma que essas células estão
envolvidas na produção de proteínas e de matriz para a formação de tecido duro.
Adicionalmente, amostras de tecido ósseo obtidas in vitro a partir de osteoblastos
diferenciados e criopreservados foram recuperadas e transplantadas
subcutaneamente no dorso de ratos imunodeprimidos. Quatro semanas após o
transplante, as amostras foram coletadas, processadas e analisadas ao microscópio.
27

Observou-se que o tecido ósseo foi rapidamente remodelado em osso lamelar bem
desenvolvido e osteócitos foram encontrados dentro das lamelas, demonstrando
assim que as amostras de osso obtidas in vitro, a partir de células criopreservadas,
podem ser utilizadas para transplantes in vivo. Os autores concluíram que as SBP-
DPSC podem ser recuperadas com segurança após a criopreservação de longo
prazo; essas células rapidamente recomeçam a proliferar, mostrando altas taxas de
proliferação, correta expressão dos antígenos de superfície, e produção de tecido
ósseo e; essas amostras de osso podem ser facilmente transplantadas in vivo, onde
elas são remodeladas em osso lamelar.
Um estudo de Bueno et al. (2009), com o objetivo de conseguir uma fonte
alternativa de CT com potencial osteogênico e que não gerasse morbidade para o
doador, utilizou um fragmento do músculo orbicular da boca (OOM), que é
descartado nas queiloplastias de pacientes com fissura labiopalatina (CLP), para o
isolamento de CT, denominadas CLPMDSC (Células-tronco derivadas do músculo
orbicular da boca de pacientes com fissura labiopalatina do inglês cleft lip and palate
muscle-derived stem cells). Essas células foram submetidas, in vitro, a diferenciação
miogênica, condrogênica, adipogênica e osteogênica. Foram criados defeitos
cranianos em ratos, o lado direito do defeito continha membrana de colágeno (MC)
com CLPMDSC e o lado esquerdo somente MC. A diferenciação osteogênica foi
confirmada pela deposição de cálcio através de coloração de von Kossa e por um
aumento de c-fos detectada através de qRT-PCR; já as culturas de células não
induzidas não apresentaram depósitos de cálcio. Pelo exame histológico do defeito
craniano, 20 dias após a cirurgia, observou-se no lado direito, tecido ósseo
associado a tecido de granulação. Por outro lado, o sítio esquerdo continha tecido
conjuntivo frouxo com infiltrado inflamatório crônico, associado a restos de
membrana. Trinta dias após a cirurgia, o lado direito obteve uma redução do tecido
de granulação, o osso se encontrava numa fase de maturação avançada, com
alguma formação de lamelas nos animais estudados. No lado esquerdo, observou-
se neoformação óssea precoce apenas na extremidade do defeito craniano. A
amplificação do DNA e a coloração positiva para identificação de núcleos humanos
foram obtidas apenas no lado direito, o que confirma que as CT humanas foram
responsáveis pela formação do novo osso no defeito craniano crítico. Os autores
concluíram que é possível obter CLPMDSC e que estas representam uma fonte não
invasiva para reconstrução óssea.
 28

4.2 Arcabouços

Segundo Nakashima e Reddi (2003) arcabouço é uma estrutura que tem a

função básica de determinar o contorno do tecido. Eles servem de sustentação para
algum material, como por exemplo, as CT (SEONG et al., 2010). A interação entre
as substâncias indutoras do crescimento e diferenciação celular com as CT é
modulada pela MEC (REDDI, 2001).
Alguns biomateriais estão sendo estudados para serem usados como
arcabouços, pois proporcionam o apoio necessário para a proliferação das CT,
possuem arquitetura adequada para combinar com a forma final do osso
recentemente formado e são adequadamente biodegradáveis, de modo a
proporcionar espaço para o tecido recém-formado (HUTMACHER, 2000; SROUJI;
KIZHNER; LIVNE, 2006). Para fabricar o biomaterial ideal para a regeneração óssea
várias características têm sido investigadas, incluindo (1) composição química, (2)
carga eletrostática, (3) textura superficial/rugosidade, (4) configuração geométrica e,
(5) modificação biomimética. A composição química é um fator importante para as
propriedades osteoindutivas e osteocondutivas. Os arcabouços podem ser
fabricados com colágeno, ácido hialurônico, cálcio mineralizado [hidroxiapatita (HA),
fosfato tricálcico, cimento de fosfato de cálcio, entre outros], fibrina, ou os seus
compostos. Também a matriz dos arcabouços pode ser produzida com polímeros
sintéticos, tais como poli-(ácido láctico-co-glicólico), poli-(etileno-glicol), poli-(ε-
caprolactona), e alumina (HENG et al., 2004). Os íons inorgânicos, que são
indispensáveis no processo de formação de osso, podem ser adicionados ao
biomaterial para promover a diferenciação osteogênica das CT. Os minerais cálcio,
magnésio e silicato contendo cerâmica akermanite têm promovido a diferenciação
osteogênica de BMSC, ASC e PDLSC (SUN et al., 2006; LIU et al., 2008; XIA et al.,
2011), comparados com cerâmicas de β-tricálcio.
A textura superficial/rugosidade pode ter efeitos moderados sobre a adesão e
diferenciação osteogênica das CTM (HENG et al., 2004; BINULAL et al., 2010),
enquanto que os seus efeitos de aprimoramento dependem da sensibilidade das
CTM à textura da superfície/rugosidade. Mais importante, a configuração geométrica
do arcabouço pode ter profundos efeitos sobre a proliferação e a diferenciação
osteogênica das CTM. Entre os vários parâmetros geométricos, a forma, a
porosidade e o tamanho têm sido amplamente avaliados para diferenciação
29

osteogênica (FISCHER et al., 2003). Uma menor porosidade estimula a

osteogênese por proliferação celular suprimindo e forçando a agregação de células,
enquanto que os arcabouços com poros maiores tornam-se rapidamente bem
vascularizados favorecendo a osteogênese. Considerando os fatores acima, os
arcabouços com tamanhos de poros e interconexões > 300 mm são recomendados
para regeneração óssea (HUTMACHER et al., 2007).
Modificações biomiméticas dos biomateriais foram fabricadas para replicar
funcionalmente a MEC do tecido ósseo natural. Um arcabouço ideal para
regeneração óssea deve ser projetado com base nos constituintes micro e
macroestruturais da MEC nativa (STEVENS; GEORGE, 2005). Várias estratégias
têm sido investigadas como segue: (1) biomateriais biomiméticos compostos de
constituintes inorgânicos ou orgânicos de ossos naturais, tais como nano HA /
biomateriais compostos de colágeno (WAHL; CZERNUSKA, 2006; FUKUI et al.,
2008), (2) biomateriais carregados com promotores de moléculas de adesão, tais
como a sequência Arg-Gli-Asp, laminina, fibronectina e vitronectina (SROUJI;
KIZHNER; LIVNE, 2006) e (3) biomateriais carregados com citocinas / fatores de
crescimento osteoindutores, incluindo a BMP-2, BMP-7, o IGF-1 e VEGF (SROUJI;
KIZHNER; LIVNE, 2006).
De acordo com Hwang e Choi (2010), os fatores para regeneração óssea
usando engenharia tecidual incluem CTM indiferenciadas, fatores de crescimento e
arcabouço tridimensional (3D). Estudos de engenharia de tecidos ósseos mostraram
a possibilidade de utilização das CTM da polpa dental com uma matriz de suporte
3D. Esses arcabouços são mais utilizados para reconstruções ósseas maiores
(PIGNONE, 2011).
Os biomateriais, além da biocompatibilidade, devem ter capacidade de ajuste
anatômico ao defeito, fornecer suporte mecânico para regenerar e sustentar os
tecidos circundantes e disponibilizar fatores bioativos para auxiliar a regeneração do
tecido (KRETLOW et al., 2009).
Dusse et al. (2008) relataram que, atualmente, o biomaterial injetável mais
usado é o plasma rico em plaquetas (PRP), que acelera o reparo da ferida cirúrgica
e a regeneração óssea, pois possui fatores de crescimento derivados das plaquetas
que apresentam propriedades anti-inflamatórias e regenerativas.
Outros autores relatam o uso de nano-materiais para a regeneração óssea.
Segundo Nuttall e Gimble (2004) existe um aumento no crescimento celular e na
 30

osteodiferenciação em arcabouços nano-estruturados 3D. Para Faghihi e

Eslaminejad (2013) o ponto chave na indução de diferenciação por nano-materiais é
a descontinuidade na sua superfície, o que leva a mudanças na adsorção de
proteínas e à restrição de deposição de MEC pelas células. Isso traz alterações na
morfologia celular (ITO, 1999) e na frequência de sítios disponíveis para a adesão
celular (MCNAMARA et al., 2010). O substrato nano-estruturado biomimético
desempenha um papel importante na diferenciação osteogênica das CTM (FAGHIHI;
ESLAMINEJAD, 2013).
Siegel e Fougere (1995) afirmam que nano-material é qualquer tipo de
partícula, tubo ou fibra que é feito com metais, cerâmicas, polímeros ou compósitos
menores do que 100 nm, em pelo menos uma dimensão. As pesquisas revelam que
as propriedades de superfície dos nano-materiais, como as características químicas,
rigidez, nano-topografia (SHARMA; SNEDEKER, 2010; PARK et al., 2011;
WITKOWSKA-ZIMNY; WROBEL, 2011) e, principalmente, cavidades e ranhuras,
têm grande importância sobre a ligação e diferenciação das células (WOOD, 1988).
A fabricação de uma MEC artificial deve ser feita com a máxima semelhança
microambiental nativa (FAGHIHI; ESLAMINEJAD, 2013). No osso existem vários
tipos de nanofibras de colágeno e HA nanocristalina (PAMULA et al., 2004), onde a
MEC nativa tem uma mistura complexa de poros e nervos de diâmetro de escala
nanométrica (CURTIS; WILKINSON, 2001; FLEMMING et al., 1999). Dalby et al
(2007) mostraram que nanoestruturas circulares aleatórias promovem a
diferenciação dos osteoblastos diretamente das CTM, sem qualquer necessidade de
promoção osteogênica do meio de cultura das células.

4.3 Moléculas indutoras do crescimento e diferenciação celular

A regeneração óssea é um processo complexo regulado por um grande

número de moléculas bioativas, dentre elas (BMPs), fator de crescimento de
transformação Beta (TGF- β), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de
crescimento tipo insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),
fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico
(EGF), hormônio paratireoidiano (PTH / PTHrP ) e interleucinas (KEMPEN et al.,
2010).
31

No osso, as BMPs são sintetizadas pelas células ósseas e armazenadas na

MEC do tecido ósseo (CANALIS; ECONOMIDES; GAZZERRO, 2003). In vitro, BMPs
podem diferenciar as CTM em osteoblastos (CHENG et al., 2003; LUU et al., 2007).
Quando implantadas ectopicamente, as BMPs osteoindutoras podem iniciar a
cascata completa de formação do osso, incluindo a migração das CTM e a sua
diferenciação em osteoblastos. Esta indução óssea ocorre por ossificação
endocondral e intramembranosa, o que resulta na formação de tecido ósseo normal
(WOZNEY, 2002).
TGF- β é um fator de crescimento multifuncional, com ampla atividade
biológica em vários tipos de células, em diferentes tecidos. Possui três isoformas em
seres humanos (TGF- β 1, β 2 e β 3). TGF- β é sintetizado por diferentes tipos de
células e é armazenado como um complexo inativo associado a um peptídeo de
latência na MEC óssea (LAWRENCE, 2001), mas também pode ser encontrado nas
plaquetas. Este fator de crescimento estimula a migração das células
osteoprogenitoras e é um regulador potente da proliferação e da diferenciação
celular, bem como da síntese de MEC. Essas proteínas possuem efeitos
estimulantes e inibitórios sobre a formação óssea, entretanto, em geral, os efeitos
estimulantes sobre a cicatrização e a formação óssea predominam (JANSSENS et
al., 2005). A relação quanto ao reparo do tecido conjuntivo e à regeneração óssea,
deve-se à quimiotaxia e à mitogênese dos osteoblastos, estimulando a deposição de
colágeno para a formação óssea e a cicatrização da ferida, além de inibir a formação
de osteoclastos e, consequentemente, a reabsorção óssea (TÖNZÜM; DEMIRALP,
2003; SYROID et al., 1999 ).
FGFs são considerados potentes reguladores do crescimento celular e da
cicatrização de feridas. No osso, eles são produzidos por diversas células, como os
osteoblastos, os macrófagos e as células endoteliais, e são armazenados na sua
forma ativa na MEC óssea. FGFs atuam de forma autócrina e parácrina como
agente mitogênico em vários tipos celulares. Além disso, estão envolvidos na
angiogênese, na cicatrização de feridas e na diferenciação de células (KEMPEN et
al., 2010).
IGF-I e IGF-II desempenham um papel importante no metabolismo ósseo e
são essenciais para o crescimento do esqueleto e para a manutenção da massa
óssea. São sintetizados por vários tecidos e agem de forma endócrina, parácrina e
 32

autócrina. Apesar dos IGFs serem os fatores de crescimento que as células ósseas
mais produzem e também os que são armazenados em concentração mais elevada
na matriz óssea, ainda não se sabe o seu papel exato na proliferação e na
diferenciação das células ósseas, mas apresentam um efeito anti-apoptótico de
(pré)-osteoblastos e aumentam a síntese da matriz óssea (NIU; ROSEN, 2005). A
administração sistêmica de IGF produz efeitos secundários, tais como hipoglicemia,
hipertensão intracraniana, dor de cabeça, fadiga e dispnéia (GEUSENS; BOONEN,
2002). Como consequência disso, provavelmente o IGF nunca será considerado
para a regeneração óssea, porém constitui um fator importante para a sobrevivência
das células hematopoiéticas, dos fibroblastos e das células do tecido nervoso
(SYROID et al., 1999; JOSEPH, et al., 1996).
O VEGF é considerado um dos principais reguladores da angiogênese
durante a formação óssea (MEINEL et al., 2003), além de induzir o aumento da
permeabilidade capilar. Durante o reparo ósseo, estes novos vasos sanguíneos e
alterações vasculares são importantes para o fornecimento de nutrientes e para o
transporte de macromoléculas. O VEGF é produzido pela maior parte dos tipos de
células e, simultaneamente, a sua expressão pode ser aumentada pela hipóxia ou
por outras citocinas (HANSEN-ALGENSTAEDT et al., 2006).
PDGF é considerado um dos principais reguladores da reparação dos tecidos
em geral (HOLLINGER et al., 2008). Durante a fase inicial de cicatrização de feridas,
as plaquetas são a principal fonte de PDGF. Após injúria e sangramento, as
plaquetas se agregam e liberam grânulos carregados de citocinas que contêm várias
quantidades de PDGF. Este fator de crescimento regula a migração, a proliferação e
a síntese da MEC de uma variedade de células, sendo a primeira proteína presente
na ferida e atuando na revascularização, na síntese de colágeno, na regeneração
óssea e nos mecanismos de mitose e angiogênese, constituindo-se uma fonte para
que outros fatores de crescimento possam atuar (SCHMITZ; HOLLINGER, 2001;
SYROID et al., 1999). Uma substância que também contém PDGF é o PRP ou gel
de plaquetas.
O EGF estimula a angiogênese, a mitogênese e a permeabilidade vascular,
induzindo o crescimento do tecido epitelial, possui também um efeito proliferativo
celular nos fibroblastos periosteais e células endoteliais (TÖNZÜM; DEMIRALP,
2003; HUDSON-GOODMAN; GIRARD; JONES, 1990).
33

As citocinas pertencem a uma família grande e diversa de proteínas que,

historicamente, referem-se aos agentes imunomoduladores como interleucinas,
interferons, fator de necrose de tumoral, entre outros. Embora os seus mecanismos
não sejam bem esclarecidos, tornou-se aparente que várias citocinas estão
envolvidas no metabolismo ósseo e que são capazes de estimular ou inibir a
formação e função dos osteoclastos, dos osteoblastos, e dos seus precursores
celulares (LORENZO; HOROWITZ; CHOI, 2008; NAKASHIMA; TAKAYANAGI, 2008;
TAKAYANAGI, 2007; WEITZMANN; PACIFICI, 2005).
Alguns hormônios administrados sistemicamente também aumentam a
formação de osso, como o PTH e a vitamina D. Para aumentar a formação óssea, o
PTH deve ser administrado de forma intermitente, pois de forma contínua provoca a
doença óssea osteíte fibrosa (LOTINUN; SIBONGA; TURNER, 2002; QIN;
RAGGATT; PARTRIDGE, 2004). Em seres humanos, o PTH já é usado de forma
intermitente para o tratamento de osteoporose, pois aumenta a massa óssea e reduz
o índice de fraturas (NEER et al., 2001). Ainda não se sabe exatamente como ocorre
esse duplo efeito, mas tem-se sugerido que o estímulo para a formação de osso,
induzido por PTH, é devido a um aumento no número de osteoblastos pela ativação
das células de revestimento existentes no osso, que sofrem hipertrofia e retomam a
síntese da matriz. Outro método proposto para o seu efeito é a inibição da apoptose
de osteoblastos (LOTINUN; SIBONGA; TURNER, 2002). Já a vitamina D é um
importante regulador da homeostase mineral óssea. Ela tem um papel importante na
comunicação osteoblasto/osteoclasto, pois estimula a produção do ligante do
receptor ativador do fator nuclear-kB e inibe a apoptose dos osteoblastos
(MONTERO-ODASSO; DUQUE, 2005). Pacientes portadores de osteoporose são
tratados com vitamina D para conseguir um aumento da densidade mineral óssea
(SHEVDE et al., 2002).
Dusse et al. (2008) realizaram uma revisão da literatura sobre o PRP e a sua
aplicação na Odontologia. O gel de plaquetas, constituído essencialmente por PRP,
tem sido utilizado para acelerar o reparo de ferida cirúrgica e a regeneração óssea.
As plaquetas possuem dois tipos de grânulos, os densos, que secretam adenosina
difosfato, adenosina trifosfato, serotonina, cálcio, pirofosfato, P-selectina, fator de
transformação do crescimento β, catecolaminas e guanosina di e tri fosfato; e os
grânulos α, que secretam proteínas denominadas genericamente como fatores de
crescimento derivados das plaquetas, dentre elas os PDGF, TGF-β, IGF, VEGF,
 34

EGF, fibrinogênio, fibronectina, vitronectina, fator V, fator plaquetário 4 (PF-4), β-

tromboglobulina (β-TG), inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1), inibidor de
plasmina e α2-macroglobulina (GERRARD, 1988; KROLL; SCHAFER, 1989). No
caso de uma ferida, as plaquetas agregadas liberam o conteúdo dos seus grânulos,
quais sejam os fatores de crescimento, que promovem a sinalização para que
células mesenquimais e epiteliais cheguem ao local lesado, sofram divisão mitótica,
estimulem a síntese de matriz e colágeno e, com isso promovam a cicatrização mais
rápida e eficiente; outras proteínas derivadas das plaquetas, como fibrina,
fibronectina e vitronectina, também promovem adesão celular e osteocondução
(TÖNZÜM; DEMIRALP, 2003; SCHMITZ; HOLLINGER, 2001; HUDSON-
GOODMAN; GIRARD; JONES, 1990). O PRP é obtido pela centrifugação do sangue
em velocidade baixa, podendo ser utilizado o citrato de sódio como anticoagulante e,
assim, sedimentam-se as hemácias e mantêm-se os leucócitos e as plaquetas em
suspensão no plasma. A gelificação do PRP é feita através da adição de íons cálcio.
É recomendado utilizar sangue autólogo pela possibilidade de transmissão de
doenças pelo sangue de outros doadores (DUSSE et al., 2008).
O uso de diferentes protocolos para a obtenção do PRP pode reduzir o
número de plaquetas e, com isso, não ser efetivo para a neoformação óssea. Na
literatura, vários autores já discursaram sobre a eficiência do PRP (MARX et al.,
1998, ANITUA, 1999, CARLSON e ROACH, 2002). Marx et al. (1998) relataram que
a eficiência dos fatores de crescimento liberados pelas plaquetas ocorre desde o
início da cirurgia, contribuindo para a neoformação óssea desde o primeiro estágio,
determinando a aceleração no reparo dos tecidos e produzindo um tecido ósseo de
maior densidade. Anitua (1999), em um estudo clínico onde foram avaliados vinte
pacientes submetidos à extração dentária prévia à colocação de implantes, verificou
que os alvéolos tratados com PRP apresentaram maior espessura óssea no sentido
vestíbulo-lingual e melhor epitelização que o grupo que não recebeu PRP (grupo
controle). Esse mesmo autor relatou o uso de PRP em outros 250 pacientes com
evidências de sucesso clínico. Carlson e Roach (2002), em um estudo retrospectivo
das publicações sobre PRP em Odontologia, constataram que o uso do PRP obteve
sucesso na maioria dos relatos.
35

5 DISCUSSÃO

Segundo Rocha (2011), na última década, a pesquisa em Odontologia tem

avançado no que diz respeito à engenharia de tecidos, onde tem se buscado novas
abordagens para permitir a regeneração tecidual e, até mesmo, para se formar
tecidos novos. De acordo com Doan et al. (2010), a engenharia tecidual pode
permitir o fornecimento de tecidos para reparos craniofaciais.
Dentro dessa perspectiva, este estudo teve por objetivo realizar uma revisão
da literatura sobre o papel das células-tronco na regeneração óssea. Para isto, foi
realizada uma busca na literatura científica utilizando as palavras-chave “células-
tronco” e “regeneração óssea” e “stem cells” e “bone regeneration”, nas bases de
dados PubMed, LILACS e SciELO. Foram analisados os artigos, do ano de 1994 até
2014, que abordavam o tema células-tronco pós-natais relacionadas à regeneração
óssea, incluindo pesquisas, revisão de literatura, revisão sistemática e casos
clínicos.
A literatura mostra que, em geral, as CT apresentam capacidade de
autorrenovação e, quando se multiplicam, podem permanecer com as características
de indiferenciação ou se diferenciar em outros tipos celulares (SONG et al., 2006).
O uso de CTE envolvem questões éticas e religiosas, pois embriões são
usados para obtenção dessas células, o que levanta o questionamento e as
discussões sobre quando começa a vida; para alguns é após a fecundação,
enquanto que, para outros, a vida inicia a partir da nidação.
Para vencer as barreiras éticas e legais do uso de CTE, os pesquisadores
têm se voltado cada vez mais para os estudos utilizando CT de tecidos adultos,
tanto no que diz respeito às análises do perfil gênico/molecular dessas células,
quanto à diferenciação celular e perspectivas de aplicação clínica. As CTA são
consideradas multipotentes, porém alguns trabalhos indicam que têm a capacidade
de originar células de um tipo específico (SCHWINDT; BARNABÉ; MELLO, 2005),
apontando para o comprometimento celular com o tecido que lhe deu origem.
Segundo Zago e Covas (2004) as CTA são retiradas do próprio paciente e não
devem causar rejeição, porém ainda só se conseguiu a diferenciação em um número
limitado de tipos celulares adultos. Já as embrionárias, podem diferenciar-se em
praticamente todos os tipos de tecidos. Utilizar CTE ou CTA ainda gera dúvidas, pois
 36

cada uma tem as suas vantagens e desvantagens, entretanto, a facilidade de

obtenção e “disponibilidade” de CT adultas ao longo da vida dos indivíduos é
inegável, embora exista a necessidade de mais estudos com CTA para que se
possa entender e controlar o processo de diferenciação celular para fins de
aplicação clínica com segurança.
Existem diversas fontes de CTA, tais como cordão umbilical, medula óssea,
tecido adiposo, membrana sinovial, músculo esquelético, tecidos dentários,
ligamento periodontal, sangue, entre outras. As fontes teciduais ideais para a
obtenção das CTA são aquelas que causam a menor morbidade possível ao
paciente para a sua coleta, porém garantindo quantidade suficiente de células para
isolamento e expansão.
É sabido que a polpa dental, tanto de dentes permanentes como de decíduos,
assim como o ligamento periodontal e a papila apical de dentes imaturos, possuem
CT, porém essa informação ainda não foi totalmente esclarecida para a população
leiga. Esses conhecimentos deveriam ser melhor divulgados, do mesmo modo como
acontece com o cordão umbilical, onde a maioria das pessoas sabe que nele há a
presença de CT e, por isso, acaba procurando informações para o armazenamento
do sangue para uso futuro das CT. Além disso, bancos de CT de dentes esfoliados
ou de dentes permanentes sem comprometimento pulpar e que apresentem
indicação de extração, poderiam ser criados.
Por outro lado, para a aplicação terapêutica das CT, principalmente na área
odontológica, os arcabouços são necessários para, além de fornecer o suporte
mecânico e evitar disseminação das células para fora do local de implantação,
garantir a interação com as substâncias da MEC. Para chegar ao arcabouço ideal
muitas propriedades estão sendo estudadas como a composição química, a carga
eletrostática, a textura superficial/rugosidade, a configuração geométrica, e a
modificação biomimética, pois apresentando essas propriedades existem muitas
opções de materiais. No que diz respeito à regeneração e à engenharia de tecido
ósseo, deve-se procurar um arcabouço que seja o mais parecido possível com a
estrutura do osso para ajudar no processo da regeneração tecidual. Embora
diversos materiais venham sendo estudados ao longo dos anos, ainda não há
consenso de qual arcabouço é o ideal ou o mais indicado para aplicação clínica em
casos de reconstrução e regeneração óssea.
37

Para fechar a tríade da regeneração óssea, as moléculas indutoras do

crescimento e diferenciação celular, como as BMPs, TGF- β, FGF, IGF, VEGF,
PDGF, EGF, PTH / PTHrP e interleucinas, atuam na cascata de formação do osso
estimulando a migração, a proliferação, a diferenciação celular e a angiogênese.
Através desses mecanismos elas ativam outras moléculas e preparam o meio para a
regeneração óssea. Essas moléculas podem ser incorporadas ao arcabouço ou
adicionadas ao mesmo no momento do implante, de modo a estimular as células no
processo de formação de osso. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando as
várias opções de uso dessas moléculas, no que diz respeito ao método de
biodisponibilização, bem como das concentrações necessárias para estimulação
sem efeito tóxico e tempo de exposição.
O uso do PRP já está consolidado há alguns anos na área da medicina e da
odontologia, e utilizado com sucesso em diversas pesquisas, onde o PRP fornece
fatores de crescimento que aceleram o processo de regeneração óssea. Marx e
Garg (1999) utilizaram o PRP nos casos em que as chances de sucesso eram
pequenas para os enxertos ósseos convencionais e osseointegração como, por
exemplo, em edentulismo total com reabsorção avançada do processo alveolar da
maxila, em pacientes com osteoporose e em casos de doença dentária com
alteração nos tecidos adjacentes. Carlson (2000) enfatizou as perspectivas da
utilização do PRP em enxertos autólogos como um grande avanço do século XXI.
Diante dessa discussão é sabido que, para a obtenção de sucesso na
regeneração óssea, deve-se ter o conhecimento sobre as CT, o tipo de arcabouço e
as moléculas indutoras do crescimento e da diferenciação celular que poderiam ser
empregados para este fim.
 38

6 CONCLUSÃO

Após esta revisão de literatura pode-se concluir que, para se obter a

regeneração óssea, precisa-se da tríade células-tronco, arcabouço (scaffold) e
moléculas indutoras de crescimento e diferenciação celular.
As CTA apresentam a vantagem, em relação às embrionárias, de serem
obtidas de tecidos adultos sem inviabilizar um embrião e apresentarem menor
possibilidade de malignidade. Inúmeras fontes teciduais estão disponíveis para
isolamento das CTA em quantidade suficiente para estudos e/ou aplicações clínicas
e com diferentes graus de morbidade para sua obtenção.
Arcabouços fabricados com nano-materiais estão sendo bastante
pesquisados, pois, acredita-se que sejam melhores para induzir a regeneração
óssea.
As principais moléculas indutoras do crescimento e da diferenciação celular
envolvidas na regeneração óssea são: BMPs, TGF- β, FGF, IGF, VEGF, PDGF,
EGF, PTH / PTHrP e interleucinas.
Com essa revisão de literatura também se pode concluir que a regeneração
óssea com CT é algo possível de acontecer. Alguns estudos nessa área já
obtiveram sucesso, porém mais pesquisas devem ser realizadas, principalmente na
área da odontologia, para o desenvolvimento de protocolos terapêuticos clínicos
seguros e de eficácia previsível.
39

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