DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS
Reconhecer a importância dos métodos espectrofotométricos na determinação da concentração de
diferentes compostos.
Elaborar curva de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método espectrofotométrico.
Determinar a concentração de proteínas por meio de cálculos específicos envolvendo diluições.

RELAÇÃO TEÓRICO-PRÁTICA

Estrutura de proteínas

FUNDAMENTO

Espectrofotometria
A espectrofotometria é uma técnica analítica que utiliza o espectro eletromagnético para determinar a
concentração de espécies químicas. O espectro eletromagnético é um conjunto de ondas eletromagnéticas.
Uma onda eletromagnética é composta por um campo elétrico e outro magnético, que se propagam
perpendicularmente e com a mesma direção. Toda onda eletromagnética pode ser caracterizada por seu
comprimento de onda ( ), e por sua freqüência ( ). O comprimento e a freqüência de uma onda estão
relacionados ao seu conteúdo energético. Quanto MENOR o comprimento de onda e MAIOR a freqüência
de uma onda, MAIOR será sua energia. Surpreendentemente, a física moderna encara o espectro
eletromagnético também como composto por partículas, os fótons. A quantidade de energia que cada fóton
possui é denominada quantum (plural: quanta).
Na técnica de espectrofotometria, um feixe de luz atravessa uma solução ou material biológico
contendo moléculas capazes de absorver luz. Sendo assim, parte da luz incidente será absorvida, enquanto o
restante atravessará a solução e será detectado pelo aparelho. Estimando-se a quantidade de luz absorvida, é
possível determinar a concentração do composto em solução. Inúmeras moléculas biológicas tem a
propriedade de absorver luz, como: citocromos, clorofilas, proteínas, DNA, etc., o que permite sua
quantificação por esta técnica. Normalmente, a absorção de luz por um composto ocorre em vários
comprimentos de onda. Se for feita uma varredura, ou seja, a determinação da quantidade de luz absorvida
em diversos comprimentos de onda para um determinado composto, observamos que há um comprimento de
onda no qual a absorção é máxima. A faixa mais utilizada do espectro vai de 200 nm (ultravioleta) a 1.000
nm (infravermelho). O espectro visível, ou seja, aquele que é percebido pelo olho humano (cores), vai de
380 nm a 750 nm (Figura 1).
Compostos que absorvem na faixa do visível são naturalmente coloridos, mas mesmo aqueles que
não absorvem luz no visível podem ser indiretamente detectados por reações químicas especificas que gerem
produtos coloridos. A espectrofotometria, também denominada fotometria ou colorimetria, é indicada para
determinar a concentração de solutos normalmente corados, como também os incolores mas passíveis de
adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. Compostos desconhecidos podem ser
identificados por seus espectros característicos no ultravioleta, visível ou infravermelho. As concentrações
de soluções de compostos conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absorção em um ou mais
comprimentos de onda. Reações enzimáticas podem ser frequentemente seguidas medindo-se
espectrofotometricamente o aparecimento de um produto ou desaparecimento de substrato.

Figura 1 – Espectro eletromagnético.

O aparelho utilizado nesta técnica é denominado espectrofotômetro ou fotocolorímetro e seus

componentes principais são:
a) Fonte luminosa (energia radiante); b) dispositivo de focalização (ou colimador), o qual transmite
um intenso feixe retilíneo de luz; c) um monocromador (prisma ou grade) utilizado na resolução da radiação
emitida pela fonte luminosa em seus vários comprimentos de onda ( ); d) um dispositivo para selecionar o
comprimento de onda desejado; e) um compartimento para a amostra contida em um tubo de ensaio ou
cubeta; f) um detector com célula fotoelétrica, que converte o sinal luminoso em sinal elétrico; e g) um
medidor elétrico (galvanômetro) para registrar a intensidade de energia captada pelo detector (Figura 2).

Figura 2 - Componentes principais de um espectrofotômetro.

 O monocromador permite selecionar o comprimento de onda ou a faixa de comprimentos de onda
que incide sobre a solução, usando-se um prisma ou um filtro ótico (filtro colorido). O prisma acrescenta
maior poder de resolução, permitindo analises tanto na região do visível quanto do ultravioleta- caso do
espectrofotômetro. O filtro ótico deixa passar faixas de comprimentos de onda e é de uso limitado à região
do visível – caso do fotocolorímetro, uma versão simplificada do espectrofotômetro.

LEI DE LAMBERT-BEER
A espectrofotometria é uma técnica quantitativa, que permite relacionar a quantidade de luz
absorvida com a concentração da amostra. A medida da absorção de luz é dada pela ABSORBÂNCIA (A),
que é definida como:
A = log Io
It
onde:
Io = intensidade de luz incidente
It = intensidade de luz transmitida
Esta medida de absorbância em uma amostra está quantitativamente relacionada à sua concentração
de acordo com a lei de Lambert, cujo enunciado afirma que: quando um feixe de luz passa através de um
meio absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz e da lei de Beer, que afirma
que a absorção de luz é proporcional a concentração do soluto na solução.
A lei de Lambert-Beer é expressa pela seguinte equação:
A= xc xl

Onde:
= coeficiente de extinção molar, absorção ou absortividade
c = concentração da solução
l = espessura da camada absorvente (solução); também denominado “caminho ótico”

A absorbância é, portanto, proporcional à concentração e à espessura do tubo contendo a solução.

A relação inversa It/Io também é mensurável e é denominada transmitância (T). Então pode-se
afirmar que a absorbância equivale ao logaritmo do inverso da transmitância.
Resolvendo:
A = log Io A = co log T A= -log T
It

A constante , ou coeficiente de extinção molar, corresponde à absorbância de uma solução de

concentração unitária, por unidade de distância percorrida pela luz incidente, quando a concentração (c) é
expressa em mol/l e a espessura (l) é expressa em centímetros. Sua notação é
1 mol/l
1 cm
 Absorbância e transmitância são lidas em escala dupla no espectrofotômetro. A absorbância é lida
em escala logarítmica, enquanto a transmitância é lida em porcentagem em uma escala linear de zero a
100%.
Estabelecendo a relação:
A = log Io A = log 100 log 100 - log It 2 – log It
It It

Então: It(%) A
1 2
100 0
0

A transmissão é medida em termos de luz incidente e luz emergente mas, na realidade, os

instrumentos não medem luz incidente, uma vez que, se ela for considerada para efeito de cálculo, a solução
absorvente parecerá mais concentrada do que é realmente é, por causa da absorção do tubo e dos outros
reagentes eventualmente utilizados. Por isso, é necessário descontar todas as interferências possíveis durante
a medida da absorbância de um soluto específico. Para tanto, faz-se a calibração do espectrofotômetro com
uma solução contendo um sistema como o estudado, exceto o composto de análise, em um tubo ou cubeta
igual àquele que irá conter a solução-problema. Este tubo é conhecido como “branco” e com ele calibra-se o
instrumento para 100% de transmitância, o que significa zero de absorbância.

Curva-padrão ou de calibração
A determinação da concentração de um soluto em uma solução-problema pelo método
espectrofotométrico envolve a comparação da absorbância da solução-problema com uma solução de
referencia, da qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral, são utilizadas solução-padrão do
composto que se deseja quantificar, com diferentes concentrações, e sua absorbância é determinada. Com os
valores de absorbância e concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como
“curva de calibração” ou “curva-padrão”. A reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a
proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância, e a porção linear corresponde ao
limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão.
Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbância da amostra-problema no
gráfico da curva de calibração pode-se, por projeção, determinar a concentração do soluto. Esta
consideração somente será válida se as absorbâncias, tanto do padrão quanto da solução-problema, forem
determinadas usando-se as mesmas condições experimentais [comprimento de onda ( ), espessura (l) e
coeficiente de extinção molar ( )]. Considerando-se então duas soluções, padrão (P) e desconhecida (D),
tem-se que:

AP = x l x CP e AD = x l x CD

Como e l são iguais para as duas situações, tem-se que:

AD = CD
AP = CP

Então:

CD = CP x AD
AP

Determinação da concentração de proteína em uma amostra pelo Método do Biureto

O Biureto é o composto formado pelo aquecimento da uréia a 180ºC. Quando este composto é
colocado em presença de uma solução de sulfato de cobre em meio fortemente alcalino, forma-se um
composto de cor azul. A cor é devida ao complexo de interação entre o íon cúprico e os quatro átomos
adjacentes de nitrogênio. Este tipo de reação acontece com os peptídeos que contenham no mínimo duas
ligações peptídicas e com proteínas em geral. Substâncias que contenham duas carbonilas ligadas
diretamente ou por meio de um átomo de nitrogênio também apresentam coloração azulada quando na
solução alcalina de sulfato de cobre. O nome “reação do Biureto” para a formação de complexos corados na
presença de sulfato de cobre, mesma na ausência de biureto, foi mantido. Esta reação é facilmente aplicável
quando se deseja demonstrar a presença de proteínas em materiais biológicos, podendo, inclusive, ser
aplicada na quantificação, uma vez que o complexo apresenta absorção máxima a 545 nm. A concentração
de proteína e/ou peptídeos no meio influenciará na intensidade da cor: uma solução de proteína apresentará
matizes de violeta; quando a solução apresentar elevada concentração de peptídeos, a cor tenderá para o
rosa.
A sensibilidade do método é de 0,5 a 5,0 mg de proteína/ml.

TÉCNICA

Identifique durante o procedimento técnico os tubos cuja composição é descrita a seguir. Lembre
que em técnicas espectrofotométricas estes sempre estarão presentes.

Tubo branco irá conter todos os reagentes do ensaio, menos a amostra. É utilizado para “zerar”
o aparelho, descontando a cor dos reagentes utilizados no ensaio.

Solução-padrão irá conter a mesma classe de substância presente na amostra, porém de

concentração conhecida e que será utilizada para confecção da curva de calibração.

“Amostra” irá conter uma solução de substância conhecida cuja concentração pretende-se
determinar.

I – Curva de Calibração
1 – Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio.
2 – Identificá-los com números de 1 a 6.
3 – Adicionar os reagentes conforme a tabela:

REAGENTES (ml) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Solução-padrão de proteína - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

(5 mg/ml)
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -
Reagente do Biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

4 – Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.

5 – Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância em 540 nm (ou o
fotocolorímetro com filtro verde).
6 – Determinar a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6.
7 – Traçar, em papel milimetrado, o gráfico: concentração final de proteína (mg/ml) na abscissa e
absorbância (A) na ordenada. Interpolar a melhor reta possível, passando pela origem dos eixos cartesianos.

II- Determinação da concentração de proteína em amostra-problema

1 – Separar 4 tubos de ensaio.

2 – Identificá-los como tubos A, B, C e D.
3 – Adicionar os reagentes conforme a tabela.

REAGENTES (ml) Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D

Amostra - 1,0 0,5 0,4
Água destilada 1,0 - 0,5 0,6
Reagente do Biureto 5,0 5,0 5,0 5,0
 4 – Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.
5 – Determinar a absorbância das soluções desconhecidas, utilizando o tubo A para calibrar o
espectrofotômetro (100% de transmitância em 540 nm).
6 – Determinar a concentração de proteína (mg/ml) presente nas amostras-problema, utilizando o
gráfico da curva de calibração (item I).

Obs: Considere as diluições

EXERCÍCIOS

1 – Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica?

2 – Conceitue: faixa de sensibilidade do método espectrofotométrico.
3 – Determine a composição e defina a importância dos tubos branco e padrão na determinação da
concentração de um composto pela técnica espectrofotométrica.
4 – Um determinado composto apresenta um máximo de absorção em 660 nm. Para uma concentração de
0,75 mmol/ml foi obtida uma absorbância de 0,4. Sabendo-se que o limite de sensibilidade do método
utilizado é de 0,1 mmol/ml a 3 mmol/ml, calcule a concentração deste mesmo composto correspondente a
uma absorbância de 0,85.
5 – Três mililitros de uma solução de azul de metileno (sol. A) foram diluídos a 7,5 ml com água destilada
(sol. B). A absorbância da solução B a 550 nm foi de 0,4. Como você determinaria a concentração da
solução A?

INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES

LISTA DE REATIVOS:

1 – Solução-padrão de proteína: albumina de soro bovino 5 mg/ml.

2 – Solução de proteína (albumina de soro bovino) de concentração desconhecida
3 – Reagente do Biureto

PREPARO DOS REATIVOS:

1 – Reativo do Biureto
Dissolver em 500 ml de água destilada:
- 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado
- 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio
Adicionar 300 ml de solução de hidróxido de sódio 10% (p/v), com constante agitação.
Adicionar água destilada suficiente para 1 litro de solução.

2 – Solução-padrão de proteína
Pesar 250 mg de albumina de soro bovino e dissolver em 50 ml de água destilada. Aliquotar em
frações de 10 ml e conservar a -20ºC.