Este documento descreve o procedimento para coloração de Gram, que é usado para auxiliar no diagnóstico e avaliar a qualidade de amostras clínicas. Ele detalha os princípios, insumos, equipamentos, procedimentos e resultados esperados da técnica, que distingue bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas com base em sua estrutura celular. O documento fornece informações sobre a preparação das amostras, os reagentes usados e os achados que podem ser observados ao microscópio para auxiliar
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Este documento descreve o procedimento para coloração de Gram, que é usado para auxiliar no diagnóstico e avaliar a qualidade de amostras clínicas. Ele detalha os princípios, insumos, equipamentos, procedimentos e resultados esperados da técnica, que distingue bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas com base em sua estrutura celular. O documento fornece informações sobre a preparação das amostras, os reagentes usados e os achados que podem ser observados ao microscópio para auxiliar
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SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI
LABORATORIO CENTRAL DE SADE PUBLICA
Dr. COSTA ALVARENGA.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO - POP POP N 25.1.01.03.035 TTULO: COLORAO DE GRAM Reviso 00 Pgina 1/6
ELABORADO POR: REVISADO POR: APROVADO POR Ronaldo Costa Diretor Tcnico Ismnia Maria Ramalho Farmacutica Bioqumica
Gildevane Vieira do nascimento Farmacutica Bioqumica
Data: _____ / _____ / ______
1. OBJETIVO
Este POP estabelece critrios e procedimentos cujo objetivo seja aplicar a tcnica de Colorao de Gram.
2. CAMPO DE APLICAO
Este POP se aplica no auxlio do diagnstico e da avaliao da qualidade do material clnico.
3. REFERNCIAS
3.1. Normativas
Trabulsi, L.R. & col.-Microbiologia Oplustil, P.C.-Procedimentos bsicos em Microbiologia Clnica
3.2. Complementares
No se aplica a este documento
4. DEFINIES E SIGLAS
Para efeito deste POP, aplicam-se as seguintes definies:
4.1. Da amostra Swab de leses ou secrees especialmente colhido para este exame; Material clnico em frasco estril; Lminas de material clnico sem conservante, como formol, ou sem agente fixante, como lcool 70%; As amostras provenientes de isolamento de cultura (colnia).
4.2. Das amostras inadequadas - Lminas de material clnico com conservante como formol, ou com agentes fixantes, como lcool 70%; - Swab sem meio de transporte; colhido a mais de 4(quatro) horas.
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- Amostra de material clnico com conservante como o formol. 4.3 Dos limites de deteco - Amostras colhidas inadequadamente podero apresentar contaminao pela microbiota natural da regio. - Amostras de colnias com mais de 24 horas de crescimento podem no corar adequadamente.
4.4. SIGLAS
BACTE Bacteriologia geral POP - Procedimento Operacional Padro N A - No Aplicavel D S T - Doena Sexualmente Transmissvel C G P-Cocos Gram Positivos B G N - Bacilos Gram Negativos D G N - Diplococos Gram Negativos B G P - Bacilos Gram Positivos C G N - Cocos Gram Negativos P M N Polimorfosnucleares
5. RESPONSABILIDADES Farmacuticos Bioqumicos Tcnicos de Patologia
6. PROCEDIMENTO
6.1. Sinonmia
No se aplica a este documento
6.2. Amostra 6.2.1 Foi explicado nas definies
6.3. Princpio do Mtodo 6.3.1 Baseado na impregnao pelo cristal violeta (corante primrio) na parede celular de algumas espcies bacterianas forma um complexo com uma soluo fraca de iodo (lugol- mordente). Estas espcies, devido natureza qumica de sua parede celular, retem o cristal violeta mesmo aps o tratamento com descorante orgnico (lcool-acetona) e so chamadas de gram positivas. As bactrias que perdem a colorao primria so ditas gram negativas, sendo depois coradas pelo corante secundrio (Fuccina de Ziehl diluda),tornando a colorao rsea.Outras estruturas(leuccitos PMN), clulas, tambm podero tomar esta colorao. Alm da morfologia, de leuccitos(PMN) de hemcias, muco, filamentos de fungos ou de clulas leveduriformes.
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6.4. Insumos
6.4.1 Caso no esteja disponvel no Laboratrio a Fuccina de Ziehl para gram, esta pode ser preparada a partir da Fuccina de Ziehl para colorao de Ziehl-Neelsen (BAAR) diludo 1:20.
6.5. Equipamentos e Utenslios Reagentes
6.5.1 Equipamentos - Microscpio tico - Estufa Bacteriolgica aferida temperatura 35-37C - Refrigerador 6.5.2 - Utensilios e Reagentes - Agulha comum de nquel cromo - Ala comum de nquel-cromo - Lpis dermogrfico - Bico de Bunsen - Lminas - Salina - Cristal de Violeta (Violeta de Genciana) - Lugol para Gram - Soluo 1:3 de lcool-acetona - Fuccina de Ziehl para Gram ( Fuccina de Ziehl diluda) - Suporte de lmina para pia - leo mineral - Soluo 1:1 de lcool-ter - Hipoclorito de sdio a 2% - lcool 70% - Gazes em compressas - Papel toalha
7.0 EPI/EPC 7.1 Equipamentos de proteo individual (EPI)
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culos de segurana, mscara descartvel, jaleco, calados fechados, luvas descartveis. 7.2 Equipamentos de proteo coletiva (EPC) Chuveiro de emergncia, lava olhos, e extintores de incndio. - culos de proteo - Mscara descartvel risco 3
8.0 DESCRIO 6.7.1 (a) Antes de iniciar, limpar a bancada de trabalho com hipoclorito e lcool 70% b) Retirar a lmina imersa no lcool e secar. c) Numerar a lmina com o n do Laboratrio com o auxlio do lpis demogrfico. A numerao deve ser no verso da preparao do material. d) Sempre dentro da rea de segurana do bico de Bunsen, preparar o esfregao: - Material de cultura (colnia): Colocar 1 gota de salina sobre a lmina. Com a agulha comum de nquel-cromo flambada e fria, retirar o material (colnia) da placa e realizar uma pequena emulso com a salina. Fazer um esfregao homogneo e delgado; - Material clnico: Com o auxlio da ala comum de nquel-cromo flambada e fria , retirar o material do frasco e fazer um esfregao homogneo e delgado. Se necessrio, colocar uma gota de salina. Obs: No caso de amostra clnica de urina, homogeneizar, mas no centrifugar. - Material de Swab: Realizar um esfregao homogneo e delgado. Realizar movimentos rotatrios com o swab sobre a lmina. e) Deixar secar os esfregaos temperatura ambiente f) No final do trabalho, flambar as alas, deixar esfriar e guardar. Limpar a bancada com hipoclorito e lcool a 70%. g) Aps os esfregaos secos, fixar pelo calor atravs da chama do bico de Bunsen (passar 3 vezes pela chama sem deixar queimar o material); h) Com a lmina fria, colocar sobre o suporte para realizar a colorao; i) Cobrir os esfregaos com violeta de genciana e deixar agir por um minuto j) Lavar rpidamente com gua corrente (sem deixar sair o esfregao) ou escorrer o corante; l) Cobrir o esfregao com lugol e deixar agir por 1 minuto;
m) Lavar rpidamente com gua corrente (sem deixar sair o esfregao) ou escorrer o corante; n) Proceder a descolorao com a soluo de lcool-acetona at que a colorao violeta no se despreenda mais da lmina(tempo crtico: aproximadamente 5 segundos) e enxaguar imediatamente;
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o) Cobrir os esfregaos com fucsina de Ziehl e deixar agir entre 15 e 30 segundos; p) Lavar rpidamente com gua corrente q) Deixar secar os esfregaos temperatura ambiente; r) Proceder a microscopia em objetiva em 100X(imerso) com auxlio de uma gota de leo mineral sobre o esfregao; s) Aps a leitura, limpar a objetiva com uma soluo de lcool-ter
9.0.VALORES DE REFERNCIA 9.1 Resultados a) Material clnico: Observar, procura e quantificar (raras, algumas e numerosas) e relatar a presena de bactrias intra e /ou extracelulares ( observando morfologia, estrutura e prioridades tintoriais),leuccitos(PMN), hemcias, muco, clulas epiteliais, filamentos de fungos ou clulas leveduriforme. - Para a amostra com suspeita de uretrite, salpingite e outras DSTs: pesquisar DGN. A presena de DGNs intracelulares um achado mais indicativo de uma infeco do que colonizao, especialmente em mulheres. - Para a amostra com suspeita de Gardnerella Sp, procurar clulas epiteliais recobertas de cocobacillos gram positivos e gram negativos(gram-labeis). Estas estruturas so sugestivas de infeco por G.Vaginales e se chamam clulas-chave. Outros achados podem acompanhar a vaginose bacteriana causada por gardnerella; ausncia ou presena escassa de bacilos de Drdelein(lactobacillus), ausncia ou presena escassa de leuccitos, presena abundante de BGN curvos de colorao tnue. - A presena de clulas leveduriformes pode indicar uma infeco ou colonizao por leveduras, principalmente do gnero Cndida. Entretanto, uma quantidade elevada destas clulas e principalmente, a presena de longos brotamentos em forma de Salsicha (Pseudo-hifas) muito sugestivo de infeco. As leveduras costumam causar patologias em pacientes imunolgicamente deprimidos, diabticos e crianas. - Se no esfregao no for observada nenhuma presena de bactrias intra e/ou extracelulares, liberar o laudo: No foram observadas forma microbianas corveis pelo mtodo de Gram b) Material de cultura: Observar morfologia, estrutura e prioridades tintoriais das bactrias para o direcionamento da identificao bacteriana (Ver POP adequado para cada identificao)
10.0 CONTROLE DE QUALIDADE 10.1 Da amostra - Se a amostra enviada em lmina estiver seca e fixada, poder ser conservada temperatura ambiente por at 1 semana. - Aps colorao de uma lmina, a outra dever ser identificada e guardada em porta- lmina apropriada. As lminas devem permanecer no setor por pelo menos uma semana aps a realizao e liberao do exame.
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10.2 Dos corantes - Verificar data de validade descrita no rtulo; - Armazenamento em frasco mbar e em temperatura ambiente.
11.0 TRATAMENTO E/OU DESCARTE DE RESDUOS Materiais perfurocortantes, restos de tubos coletores tambm podem ser desprezados diretamente em caixas de papelo especialmente fabricadas para esta finalidade. Ao final do dia de trabalho, essas caixas devem ser encaminhadas para autoclavao. Colocar os materiais e resduos em sacos prprios para autoclavao e aps a esterilizao, acondicionar em sacos plsticos de cor branca devidamente identificada com o smbolo de risco biolgico. .