Recombinação V(D)J

Recombinação V(D)J, também conhecida como recombinação somática, é o mecanismo de recombinação genética (do DNA) que ocorre apenas em linfócitos em desenvolvimento durante os primeiros passos da maturação de células B e T. O processo resulta em um repertório diverso de anticorpos (Igs) e receptores de células T (TCRs), encontrados respectivamente em células B e T. O processo é uma característica marcante do sistema imune adaptativo e seu surgimento foi um evento-chave na evolução dos gnatostomados.

A recombinação V(D)J ocorre nos órgãos linfoides primários (medula óssea para células B e timo para células T) e de forma semi-aleatória rearranja os segmentos gênicos V (variable, variável), J (joining, junção) e, em alguns casos, D (diversity, diversidade). O processo resulta em novas sequências de aminoácidos nas regiões de ligação a antígeno de Igs e TCRs que possibilitam o reconhecimento de antígenos de virtualmente todos os patógenos, incluindo bactérias, vírus, parasitas, vermes e até células próprias alteradas, como as presentes no câncer. O reconhecimento pode ser também alérgico (ex: de pólen e outros alérgenos) ou "autorreativo", o que leva a autoimunidade.

Em 1987 Susumu Tonegawa recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina^[1] "pela descoberta do princípio genético para geração da diversidade de anticorpos".^[2]

Os anticorpos humanos ( e os receptores de célula B) são compostos de cadeias pesadas e leves, ambas com regiões constantes (C) e variáveis (V) codificadas por genes em três loci.

Cada gene de cadeia pesada ou leve contem múltiplas cópias de três diferentes tipos de segmentos gênicos para as regiões variáveis dos anticorpos. Por exemplo, a região de cadeia pesada da imunoglobulina contem 2 segmentos constantes (Cμ e Cδ), 44 segmentos "V",^[3] 27 segmentos "D" e 6 "J".^[4] A cadeia leve possui também 2 constantes ((Cμ and Cδ) e diversos segmentos "V" e "J", mas é desprovida de segmentos "D". Rearranjos de DNA levam a distribuição de apenas 1 cópia de cada tipo de segmento gênico para cada linfócito, gerando assim um repertório enorme de anticorpos, com aproximadamente 3x10<sup)11 possíveis (apesar de algumas serem removidas devido a auto reatividade.

A maioria dos receptores de célula T são compostos de uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Os genes do TCR são similares aos das imunoglobulinas, possuindo também múltiplos segmentos V, D e J nas cadeias beta e V e J (mas não D) nas cadeias alfa que são rearranjados durante o desenvolvimento do linfócito, dotando-o de um receptor antigênico único.

A geração de um produto mal-sucedido, que não é capaz de identificar e reagir a estímulos de MHC classe I ou II, leva a célula a apoptose. A autoimunidade é prevenida através da eliminação de linfócitos auto reativos na medula tímica, através de teste com diversos peptídeos peptídeos próprios, produzidos pela ação da proteína AIRE nas células epiteliais reticulares da medula.

Na célula B em desenvolvimento, o primeiro evento de recombinação a ocorrer é entre um segmento D e um segmento J do locus da cadeia pesada. Qualquer DNA entre esses dois segmentos é deletado. Essa recombinação D-J é seguida da junção de um segmento V de uma região à montante do complexo DJ, formando um segmento VDJ rearranjado. Todos os outros segmentos entre V e D são também excluídos do genoma. O transcrito primário (RNA pré splicing) é gerado com as regiões VDJ e ambas as cadeias "mu" e "delta" (C_μ and C_δ) (ou seja, o transcrito primário contém os segmentos: V-D-J-C_μ-C_δ). O RNAprimário é então processado, com a adição de uma cauda poli-A após a C_μ e a remoção das bases entre o segmento VDJ e esse segmento constante. A tradução desse mRNA leva a produção da cadeia pesada μ de imunoglobulina.

As cadeias kappa (κ) e lambda (λ) nos loci de cadeia leve rearranjam-se de forma muito semelhante, com a exceção que esses genes não possuem o segmento D. O primeiro passo simplesmente une os segmentos V e J, dando origem a um segmento VJ antes da adição à cadeia constante durante a transcrição primária. A tradução do mRNA processado para cadeia kappa ou lambda resulta na produção da proteína de cadeia leve κ ou λ de imunoglobulina.

A união da cadeia pesada μ com uma das cadeias leves resulta na formação da forma ligada a membrana da imunoglobulina IgM que é expressa na superfície da célula B imatura.

Durante o desenvolvimento dos timócitos, o as cadeias do receptor de célula T (TCR) são submetidas aos mesmo eventos de recombinação ordenada descritos para imunoglobulinas. Recombinação D-J ocorre primeiramente na cadeia beta do TCR. Esse processo pode envolver tanto a junção do segmento D_β1 a um dos seis segmentos J_β1 ou do segmento D_β2 a um dos sete segmentos J_β2 . A recombinação DJ é seguida, como acima, por rearranjo V - DJ, deleção de todos os segmentos entre os dois grupos e acoplamento ao gene do domínio constante. A transcrição gera, então, a fita de mRNA que permite a tradução da proteína correspondente à subunidade beta do TCR.

O rearranjo da cadeia alfa do TCR ocorre após o da cadeia beta e é semelhante à recombinação V-J descrita para cadeia leve de imunoglobulina. A união das cadeias alfa e beta resulta na produção do TCR αβ, presente na maioria das células T.

O processo da recombinação V(D)J é mediado pela V(D)J recombinase, com uma diversa coleção de enzimas. As principais enzimas envolvidas são as RAG(Recombination Activation Gene) 1 e 2, a TdT (Terminal deoxynucleotidyl tranferase) e a nuclease Artemis, que faz parte da via de reparo de DNA NHEJ (Non Homologous End Joining).^[5] Diversas outras enzimas são conhecidamente envolvidas no processo, como DNA-PK(DNA-dependent protein kinase), XRCC4(X-ray repair cross-complementing protein 4 ), DNA ligase IV, NHEJ1(Non Homologous End Joining factor 1 também conhecida como Cernunos ou fator semelhante a XRCC4) e as DNA polimerases λ e μ.^[6] Algumas enzimas envolvidas são específicas de linfócitos (ex: RAG, TdT), enquanto outras são encontradas em outros tipos de células e até de forma ubíqua (ex: componentes da via NHEJ).

Para manter a especificidade de recombinação, a V(D)J recombinase reconhece e se liga a sequências sinal de recombinação (RSSs) que flanqueiam os segmentos V, D e J. As RSSs são compostas de trÊs elementos : um heptâmero de sete nucleotídeos conservados, uma região de espaçamento de 12 a 23 pares de base e um nonâmero de nove nucleotídeos conservados. Enquanto a maioria dos RSSs variam em sequência, as sequências heptaméricas e nonaméricas são CACAGTG e ACAAAAACC respectivamente. Além disso, apesar dos núcleotídeos da região de espaçamento serem variáveis, o tamanaho é relativamente constante..^[7][8] O tamanho da região espaçadora corresponde aproximadamente a 1 (12 pbs) ou 2 (23 pbs)voltas da hélice de DNA. Os segmentos a serem recombinados usualmente são ajacentes a espaçadores de tamanho diferente (ex: um possui um 12RSS e o outro um 23RSS).^[9] Essa é um passo importante na regulção da recombinação V(D)J.^[10]

A recombinação V(D)J começa quando a recombinase V(D)J (através da atividade da RAG1) se liga a uma RSS que flanqueia um segmento codificante (V, D ou J) e cria um "nick" de fita simples no DNA entre a primeira base da RSS (logo antes do heptâmero) e o segmento codificante. Essa etapa é essencialmente energeticamente neutra ( sem necessidade de hidrólise de ATP) e resulta na formação de grupos 3'-OH e e 5'-fosfato livres na mesma fita. A hidroxila reativa é posicionada pela recombinase para atacar a ligação fosfodiéster da fita oposta produzindo duas terminações de DNA: uma terminação do tipo "hairpin", formando uma volta do lado codificante, e uma terminação de "ponta cega" no lado do segmento sinal. ^[11] O modelo atual é que o "nick" do DNA e a formação do "hairpin" ocorrem em ambas as fitas simultaneamente, em um complexo chamado de "centro de recombinação"^{[12][13][14][15]}

As terminações de ponta cega são niveladas e ligadas para formar um pedaço circular de DNA contendo todas as sequências entre os segmentos codificantes conhecida como "joint signal" ( apesar da natureza circular, não deve ser confundida com um plasmídeo).

As terminações codificantes são ligadas e posteriormente processadas em variados eventos que, em conjunto, levam a diversidade juncional.^[16] A proteína TdT, por exemplo, adiciona núcleotídeos de maneira semialeatória, contribuindo para aumento da diversidade .^[17]

Todos esses eventos de processamento levam a uma região de ligação antigênica altamente variável, até mesmo quando os mesmo segmentos gênicos são recombinados. A recombinação permite a geração de imunoglobulinas e receptores de célula T responsivas a antífenos que nem o indivíduo nem seus ancestrais precisam ter necessariamente encontrado, criando espaço para uma resposta imune adaptativa a novos patógenos que se desenvolvem ou que frequentemente se modificam (ex: gripe sazonal) . Contudo, um grande embargo para esse processo é que a sequência de DNA precisa manter seu quadro de leitura em ordem para a proteína final conversar a correta sequência de aminoácidos. Caso a sequência esteja "fora de fase", o desenvolvimento da célula será travado e a célula não conseguirá atingir a maturidade. A recombinação V(D)J é, consequentemente, um processo muito custos e deve ser regulado e controlado de forma rigorosa.